（生物物理学专业论文）sars+cov和bmcpv—mabfab复合物的电子显微学研究.pdf

s a r sc o v 和b m c p v m a b 用a b 复合物的电子显微学研究 专业： 博士生： 导师： 摘 生物物理学 张勤奋 张景强教授 要 病毒不但严重威胁人类的健康和生命，还引起农、林、牧、渔、蚕等的严重 流行病，造成巨大的经济损失。对病毒的研究无疑具有重要的意义。电子显微学 不但能研究病毒、组成病毒的蛋白结构与功能，而且能研究病毒与宿主细胞间的 相互作用等。传统和现代的电子显微学技术在病毒学不同的研究方向发挥着同样 重要的作用。 本文采用传统的电子显微学技术和冷冻电镜单颗粒技术分别对s a r s 相关冠 状病毒( s a r sc o v ) 和家蚕质多角体病毒( b m c p v ) 进行了研究。通过研究获 得了以下的结果： 1 ，利用电子显微学技术，通过对s a r sc o v 感染绿猴肾细胞( v e r oe 6 ) 3 h ，7 h ， 2 4 h ，4 8 h ，7 2 h 的研究，获得了s a r sc o v 在v e r oe 6 细胞中的生命周期，并 结合分子生物学信息对s a r sc o v 生命周期中的特征和有关蛋白的功能进行了 探讨。 2 ，利用冷冻电镜单颗粒技术对b m c p v ，b m c p v - - m a b 和b m c p v - - f a b 复合物 的研究，获得了b m c p v ，b m c p v - - m a b 和b m c p v - - f a b 复合物3 0 n m 分辨 率的三维结构。 3 ，通过对b m c p v 、b m c p v - - m a b 和b m c p v - - f a b 复合物的三维结构研究和分 析，确定了结构蛋白v p l 蛋白组组分定位于b m c p v 的a 突起。 4 ，通过研究，阐明了结构蛋白v p i 的单克隆抗体与b m c p v 的相互作用：单克 隆抗体可使b m c p v 的a 突起发生构型变化、膨胀，从而导致a 突起与b 突 起问的间隙变小。进而推测实验中使用的单抗的作用：可阻碍病毒释放基因组 核酸，从而阻止病毒复制。 5 ，确定了该抗体对应的抗原决定簇的位置是在a 突起的顶部，从结构生物学的 角度分析a 突起的结构与功能可能与病毒识别、入侵宿主细胞有关，进而推测 结合在a 突起上的单抗还具有阻挡病毒识别受体，从而阻碍病毒入侵宿主细 胞。并利用这些结果，推导了利用分子模拟设计抗b m c p v 药物的靶标分子的 位置。 目前，人们对s a r sc o v 的了解、研究还远不够，对该病毒引起的s a r s 疾病 的流行规律、具体传播途径、疾病的控制等还存在众多的疑问，本文的研究可为 了解s a r sc o v 的生命规律，阻碍s a r sc o v 的传播，防治s a r s 提供依据。同 时，本文为利用分子模拟设计防治家蚕质多角体病毒病的药物提供结构依据。也 为利用现代电子显微学技术开展其他病毒的免疫机制、蛋白定位、分子模拟药物 设计所需的活性中心的确定等积累了经验。 关键词：电子显微学技术，s a r s 相关冠状癀毒( s a r sc o v ) ，家蚕质多角体病 毒( b m c p v ) ，冷冻电镜单颗粒技术，单克隆抗体 i l e l e c t r o nm i c r o s c o p i c s t u d y o nt h es a r sc o va n dt h e b m c p v - m a b l f a b c o m p l e x m a j o r ：b i o p h y s i c s n a m e ：z h a n g q i n f e n s u p e r v i s o r - p r o f e s s o rz h a n gj i n g q i a n g a b s t r a c t v i r u s e sc a ni m p e r i lt h eh e a l t ha n di i f eo fm a n k i n da n dc a u s es e r i o u s e c o n o m i cl o s s e si na g r i c u l t u r e ，f o r e s t r y , p a s t u r a g e ，a n df i s h e r y t h e r e f o r e ，s t u d y o nv i r u s e si so fg r e a ts i g n i f i c a n c e t h ee l e c t r o nm i c r o s c o p i c t e c h n i q u e sc o u l db e a p p l i e di nt h e s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a ls t u d yo ft h ev i r u s e sa n dt h e i rp r o t e i n sa n d t h es t u d yo ft h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ev i r u s e sa n dt h e i rh o s tc e l l s b o t ht h e t r a d i t i o n a la n dt h em o d e r ne l e c t r o nm i c r o s c o p i c t e c h n i q u e sc o u l dp l a yi m p o r t a n t r o l e si nt h ed i f f e r e n tr e s e a r c hf i e l d so f v i r o l o g y t h es a r sa s s o c i a t e dc o r o n a v i r u s ( s a r sc o y ) a n dt h eb o m b y xr o o d c y t o p l a s m i cp o l y h e d r o s i sv i r u s ( b m c p 、，) w e r es t u d i e db yt r a d i t i o n a le l e c t r o n m i c r o s c o p ya n dc r y o - e l e c t r o nm i c r o c o p y ( c r y o - e m ) s i n g l ep a r t i c l e st e c h n i q u e s r e s p e c t i v e l y s e v e r a lr e s u l t sw e r e o b t a i n e da n ds h o w nb e l o w 1 t h ev e r oe 6c e l l s ( a f r i c a ng r e e nm o n k e yk i d n e yc e l l s ) w e r ei n o c u l a t e dw i t h s a r sc o r o n a v i r u sf o r3 ，7 ，2 4 ，4 8a n d7 2h o u r s r e s p e c t i v e l y 。a n dt h e yw e r e o b s e r v e du n d e re l e c t r o n m i c r o s c o p e as c h e m eo ft h el i f ec y c l eo fs a r s i c o r o n a v i r u sw a s p r o p o s e da c c o r d i n g t ot h eo b t a i n e dr e s u l t sa n dt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fi t sr e p l i c a t i o ni nv e t oe 6 c e l l sw a sa l s od i s c u s s e d 2 s t r u c t u r e so ft h eb m c p v ，b m c p v - m a b a n dt h eb m c p v - f a bc o m p l e x a t3 0 a mr e s o l u t i o nw e r e o b t a i n e d b ya p p l y i n g t h e c r y o e ms i n g l e p a r t i c l e s t e c h n i q u e si nt h es t u d y 3 ，o n eo ft h ec o m p o n e n t so ft h es t r u c t u m lp r o t e i nv p lw a sl o c a t e d i nt h ea s p i k e s o fb m c p va f t e ra n a l y z i n gt h et h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e so ft h e b m c p v b m c p v m a ba n dt h eb m c p v f a bc o m p l e x 4 f r o mt h e3 - ds t r u c t u r e s ，i tc o u l db ei l l u s t r a t e d t h a tm o n o c l o n a la n t i b o d y a g a i n s tv p lc o u l dm a k e t h ea s p i k e ss w e l l e da n dc o n s e q u e n t l yn a r r o w t h e g a pb e t w e e nt h eas p i k e sa n dt h e bt u r r e t s t h i sw o u l dp r e v e n tt h ev i r a g e n o m e r n af r o mr e l e a s i n ga n dt h e r e f o r ec o u l di n h i b i tt h er e p l i c a t i o no ft h e b m c p v 5 。t h ee p i t o p eo fm a bw a sl o c a t e d o nt h et o po ft h eas p i k e s a n di tw a s d e d u c e da c c o r d i n gt ot h es t r u c t u r ea n a l y s i st h a tt h e a s p i k e sm a yp l a yi m p o r t r o l e si nr e c o g n i z i n ga n di n v a d i n gt h eh o s tc e l l s b e c a u s et h em a ba g a i n s t v p lw a sl i n k e do nt h et o po ft h eas p i k e s ，i tw a s d e d u c e dt h a tt h em a bc o u l d b l o c ko f ft h ev i r u sr e c o g n i z i n gh o s tc e l l sa n dc o n s e q u e n t l yp r e v e n tt h ev i r u s f r o mi n v a d i n gt h eh o s tc e l l s i tw a s a l s op r e s u m e dt h a tt h et o po ft h ea s p i k ei s t h et a r g e tf o rt h ec o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g n t h e r ea r el o t so fu n c e r t a i n t i e sc o n c e r n i n gt h es a r se p i d e m i o l o g i c a lr u l e s ， p e s t i f e r o u sr o u t e sa n d t h ec o n t r o lm e t h o d st i in o w t h e r e f o r e i t si m p o r t a n tt o u n d e r s t a n dt h el i f e c y c l e o fs a r sc o vs i n c e i tc o u l d p r o v i d e u ss o m e i n f o r m a t i o no np r e v e n t i o no ft h es a r s o nt h eo t h e rh a n d ，t h i s p a p e rc o u l d p r o v i d e s o m es t r u c t u r a li n f o r m a t i o nf o r t h ec o m p u t e r - a i d e d d r u gd e s i g n t o p r e v e n tt h eb m c p v t h ee x p e r i e n c e sg a i n e di nt h i sr e s e a r c hw o u l db e n e f l tt h e s t u d i e so nv i r a li m m u n e m e c h a n i s m ，p r o t e i n l o c a t i o na n d d r u gt a r g e t d e t e r m i n a t i o no fo t h e rv i r u s k e y w o r d s ：e l e c t r o n m i c r o s c o p y ，s a r sc o r o n a v i r u s ，b o m b y xm o r ic y t o p l a s m i c p o l y h e d r o s i s v i r u s c r y o e l e c t r o n m i c r o c o p ys i n g l ep a r t i c l e s t e c h n i q u e s ， m o n o c l o n a la n t i b o d y ( m a b ) v 中山大学博士论文 s a r s c o x 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的1 u 了显微学研究张勤奋 1 1 电子显微学与病毒学 第1 章绪论 病毒不但严重威胁人类的健康和生命，还引起农、林、牧、渔、蚕等的严重 流行病，造成巨大的经济损失。在人类急性传染病中，绝大多数都是病毒性传染 病( 据保守统计在7 0 ) ，而且病毒性传染病的发病率、死亡率都很高。据统计每 人一生中平均起码有2 0 0 次以上的病毒感染( 黄祯祥等，1 9 9 0 ) 。而且现在新的病 毒不断出现，如1 9 8 0 年发现的免疫缺损综合症( 艾滋病，a i d s ) 已变成了现代瘟 疫，遍布全球。又如去年让所有中国人谈之色变的s a r sc o v 。还有些病毒在不停 的发生突变，使人防不胜防，如：流感病毒，禽流感病毒等。所有这些都让人不 得不重视对病毒的研究。 病毒自1 8 世纪末( 1 8 9 2 ) 俄国化学家1 w a n o v s k i 发现了烟草花叶病病原的可 滤过性之后，逐渐被世人所认识。然而，在发现病毒后几乎半个世纪里，人们都 只把它们看作是一种过滤性的致病因子，对病毒的概念也非常含糊。原因是病毒 太小，人们无法用肉眼观察，甚至无法用光学显微镜观察，只能通过间接的方法 来证实其存在。电镜以及相关技术的出现改变了人们对病毒概念的认识，才出现 了病毒学这学科。电子显微学技术，不但能观察原子、分子的结构，也能观察微 米级的细胞等，这是至今为止，别的技术所不能做到的。这使人们不但可以利用 电镜研究病毒及其蛋白的结构和功能，而且可以利用这项技术研究病毒与宿主细 胞间的相互作用、病毒引起疾病的过程、机理等。因此，直到今天，电子显微学 仍然在病毒学的各个研究方向发挥着重要的作用，可以说没有电子显微学技术， 也就没有病毒学的今天，病毒学的发展离不开电子显微学。 1 2 电子显微学在当今病毒学中的应用 虽然随着免疫学、分子生物学等学科和技术的发展，对已知的病毒性疾病， 经过一定的生物学方法尤其是免疫学方法可以鉴定出引起疾病的病毒。然而，有 些情况下，用一般的光学显微镜和血清学等方法感到无能为力时，尤其对未知病 毒或者那些不易被发现的病毒，传统的电镜技术往往起着举足轻重的作用。许多 中山人学博士论文s a r s c o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的i u 子盟微学研究张勤奋 病毒仅仅根据其微细结构特征就足以用电镜进行鉴别，有的病毒在它的致病作用 远未搞清以前就被电镜发现了，这种情况无论在体外或体内都有不少先例可借鉴。 很多的实践已证明应用电子显微学技术，根据电镜下病毒的形态学和形态发生学 超微结构特征可以明确诊断、鉴定病毒种科( f a m i l y ) ，再进一步结合免疫学和分 子生物学技术鉴定已知病毒到属( g e n u s ) 、种( s p e c i e s ) 或株( s t r a i n ) ( 陈德蕙， 2 0 0 4 ) 。这些都说明电子显微学在当今的病毒学发展中，仍具有不可替代的重要作 用。尤其是传统的电子显微学技术( 包括负染色技术、超薄切片技术、免疫电镜 技术和电镜细胞化学技术等) 在病毒的诊断、鉴定和病理等方面有着不可替代的 优势，仍大大促进相关领域尤其是病毒新种的发现、病毒变异的研究、病毒引起 的病理学等领域的发展； 另一方面，现代电子显微学技术是研究病毒及其蛋白的结构与功能的最重要 的技术。病毒的结构与功能研究对控制病毒、防治病毒性疾病等具有很重要的意 义。对于防治病毒性疾病来说，最有效的方法就是使用疫苗。然而，有些病毒， 至今仍无法使用安全的疫苗来对付。如：艾滋病，由于艾滋病毒( h l v ) 侵染人体， 破坏人体的免疫系统，因此至今仍没有有效的疫苗。又如登革病毒，由于登革病 毒能引起抗体依赖性增强作用，使病症加重，因此至今也还没有安全的疫苗。有 些具有重要价值的动植物，如虾、名贵鱼类或一些重要的经济植物等，由于其没 有象人类那样的完善的免疫系统，在受到病毒侵染后，也没有有效的治疗和防治 方法，造成了重大的经济损失。对于这些病毒的防治，尽管己进行了大量的分子 生物学等的研究，但仍无有效的疫苗和药物。而病毒的生命周期是一个不可逆的 生命过程，只要阻碍其中的一个环节就可以阻碍病毒的繁殖，达到控制病毒的目 的。只要设计某种药物能阻碍其中的环节，就可达到抗病毒的目的。目前，治疗 艾滋病的较有效的药物s a q n i n a v i r 等就是根据艾滋病病毒生命周期中起重要作用 的蛋白酶分子的结构，利用分子模拟技术设计的一种药物，该药物较有效地抑制 了艾滋病的蛋白酶，从而达到治疗的目的。而分子模拟设计药物的前提就是获得 病毒活性位点的结构。因此，对病毒及其病毒蛋白的结构和功能的研究，可为设 计防治病毒的药物提供结构依据。 蛋白结构的研究技术主要包括x r a y 衍射晶体学技术，核磁共振技术以及现 代电子照微学技术( 包括电子晶体学技术，单颗粒技术等) 。x r a y 射线晶体学技 中山人学博上论文s a r sc o x 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的咀予娃微学研究张勤奋 术是使用最广，最重要的结构生物学研究技术，但x r a y 技术需要样品进行结品， 这对于很多病毒来说是一件很困难的事。核磁共振技术目前只能对小分子蛋白进 行研究( 张景强等，2 0 0 1 ) 。现代电子显微学目前虽还不能获得前穗者技术所达到 的分辨率，但该技术有其特有的优势，在病毒的结构与功能的研究中起着不可替 代的作用( 详细论述见综述) 。 可见，由于电子显微学不但能研究病毒、组成病毒的蛋白的结构与功能，而 且电镜能研究病毒与宿主细胞阃的相互作用等。传统和现代的电子显微学技术在 病毒学不同的研究方向发挥着同样重要的作用，并主要体现在两个领域：一、诊 断病毒学：二、高分辨的病毒及其病毒蛋白的结构与功能研究。 1 3 本论文的主要研究内容和意义 本论文将通过传统的电镜技术和现代电子显微学技术( 冷冻电镜单颗粒技 术) ，进行两方面的研究： 1 3 1 由于s a r s c o v 是引起去年爆发的严重急性呼吸道综合症( s e v e r e a c u t e r e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，s a r s ) 的主要病原，是一种新的冠状病毒。人们对该 病毒的了解、研究还远不够，对该病毒引起的s a r s 疾病的流行规律、具体 传播途径、疾病的控制等还存在众多的疑问。去年，s a r s 在我国爆发流行 时，实验室的科研人员积极地利用电子显微技术投入了对s a r s 病原的研究， 也较早地分离到了s a r sc o v ，并对该病毒的形态结构、病理情况等做了一 定的研究。本论文的第一部分内容即在此基础上，采用传统的电镜技术对 s a r s 病毒进行了更进一步的研究。通过研究获得s a r s 相关冠状病毒 ( s a r sa s s o c i a t e dc o r o n a v i r u s ，s a r sc o v ) 的生命周期，并结合分子生物 学信息对s a r sc o v 生命周期中的特征和有关蛋白的功能进行了探讨。这将 为了解s a r sc o v 的生命规律，阻碍s a r sc o v 的传播，防治s a r s 提供依 据。 1 3 2 家蚕质多角体病毒( b o m b y xm o r ic y t o p l a s m i cp o l y h e d r o s i sv i r u s ，简称 b m c p v ) 足种双链r n a 呼肠孤病毒，它结构稳定，对人箭无害，是研究 中山人学博上论文s a r sc o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的i u 子娃微学研究张勤奋 病毒结构与功能的理想的模型材料，同时也是一种很好的林业害虫生物防治 药物。实验室成员己对该病毒的三维结构进行了研究，并取得了较多的成果 ( z h a n g ，z h a n g c ta 1 1 9 9 9 ；z h a n g ，y ue ta 1 2 0 0 2 ；z h o u ，z h a n ge ta 1 2 0 0 3 ) 。本论 文即在这些工作的基础上，以家蚕质多角体病毒为模型，利用冷冻电镜单颗 粒技术对该病毒与其单克隆抗体( 和抗体片段) 的复合物三维结构进行研究， 从而对单克隆抗体对应的蛋白进行定位，并对病毒的结构与功能进行更进一 步的研究，获得其抗原决定簇的位嚣和大致结构，并推导其功能，从而为利 用分子模拟设计防治家蚕质多角体病毒病的药物提供结构依据。也为利用现 代电子显微学技术丌展其他病毒的免疫机制、蛋白定位、分子模拟药物设计 所需的活性中心的确定等积累经验。 p 山人学博1 ：论立 s a r s c o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的i u 子址微学研究张勤奋 第2 章s a r sc o y 的生命周期 2 1 前言 2 0 0 2 年底在广东省发现了一例致命的但却不明原因的呼吸道疾病的感染病人， 病症包括发热( 体温超过3 8 。c ) 、头痛、关节肌肉酸痛、全身乏力、腹泻、咳嗽( 多 为干咳、少痰) 、胸闷、呼吸困难；实验室检查发现外周血自细胞计数不升高或有 所f 降；胸部x 射线检查发现病人肺部有不同程度的片状、斑片状浸润性阴影或 呈网状变化，甚至呈大片状阴影；抗菌药物治疗无明显效果。随后这种被称为非 典型肺炎的疾病竟以其惊人的传染力迅速向抢救过病人的医护人员和与病人接触 的入群扩散，终于导致了该病在全球不同地区的流行，广东省，香港特别行政区， 新加坡，加拿大多伦多，越南河内，北京，山西省先后成为该病的重灾 基( k e n n e t h ， p a l ( e la 1 2 0 0 3 ；l e e ，h u ie la 1 2 0 0 3 ) 。2 0 0 3 年2 月底世界卫 三组织正式将这种疾病 命名为严重急性呼吸道综合症( s a r s ) ，并在3 月1 2 日向全球发出s a r s 警报， 动员全球开展对s a r s 的研究和阻止其进一步扩散。 在病原学研究方面，2 0 0 3 年2 月18f l 我国研究人员通过盟观察，在两份 死于本次肺炎病人的尸检肺标本中，发现了典型的衣原体的包含体，而肺细胞浆 内友原体颗粒十分典型，据此宣布广东非典型肺炎病因基本确定。虽然现在看来 这个论断并不正确，但它毕竟拉开了寻找s a r s 病原的序幕也揭开了s a r s 神 秘面纱的一角。2 0 0 3 年3 月1 5 同世界卫生组织组织了国际研究网络，集合全球有 s a r s 发生的国家的力量来研究s a r s ，此后s a r s 病原研究工作进展大大加速。 3 月1 8f 德国用重萤在咽拭子标本中观察到副粘病毒，而同一天香港中文大学获 得m e t a p n e u m o 病毒的基因扩增产物。3 月1 9 同新加坡从病人呼吸道标本中发现 剐粘病毒颗粒并使用香港中文大学的m e t a p n e u m o 病毒扩增引物获得较微弱的病 毒基因扩增产物。3 月2 0r 香港中文大学在鱼箧下发现副粘病毒颗粒，同r 国际 ：污先发现m e t a p n e u m o 病毒的荷兰鹿特丹实验室检测到副粘病毒，但是 m e t a p n e u m o 病毒基因扩增为阴性。3 月2 1f 香港中文大学在猴肾细胞培养物中分 离到病毒，随即研制了相应的血清学诊断试剂。3 月2 2 | 香港病毒实验室的研究 人员经鱼篷观察发现冠状病毒样颗粒( 7 0 n m ) 。美囤从j j j 豢国病人标本感染培养 中山人学博：1 二论文 s a r s c o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的i 乜了娃微学研究张勤奋 细胞，引起细胞病变的产物中发现冠状病毒样颗粒( 7 0 1 0 0 n m ) ，并在同一份标本 获得h m p v 病毒p c r 阳性结果。与此同时加拿大，法【= ! i j ，新加坡等地开始使用 p c r 和鱼筐方法检测副粘病毒和h m p v 病毒。加拿大发现病毒样颗粒并且发布 h m p v 病毒的基因进化树。3 月2 3 门香港病毒实验室在8 份标本中发现其中2 份 含有冠状病毒r n a ；美国报道在香港标本中发现冠状病毒，同时建立免疫荧光检 测病人血清的方法并将冠状病毒的基因扩增引物在网络公布。在新加坡和香港开 始用鼻咽拭子支气管感染的方式进行非人类的灵长类动物实验。加拿大和法国分 别在鱼匿和p c r 方法发现冠状病毒。德国，r 本，新加坡在v e r o 细胞中分离到 病毒。英国实验室在可疑病例呼吸道和尿标本检测到鸡肺炎病毒( a v i a n p n e u m o v i r u s ) 的序列。3 月2 4f = 1 到2 6 日更多的实验室通过重赣和p c r 方法检测 到冠状病毒，3 月2 7 同到3 1 日继续进行猴子实验，香港和美国实验室分别证实正 常人血清与新分离病毒的免疫荧光反应为阴性反应。加拿大在病人标本中发现人 类m e t a 病毒。4 月1f | 到8f _ i 用副粘病毒和m e t a 病毒共同感染猴子，出现临床症 状。小白鼠实验开始肩动。更多实验室在v e r o 细胞中分离到冠状病毒。又有一些 血清学实验证实s a r s 有可能为副粘病毒和冠状病毒的复合感染引起。冠状病毒 的新序列继续在荷兰，德国，香港和美国被报导( k e n n e t h ，p a ke ta 1 2 0 0 3 ；l e e h u ie t a 1 2 0 0 3 ；z h o n g n s2 0 0 3 ，；p o u t a n e n ，l o w e ta 1 2 0 0 3 ) 。德国科学家在标本中发现农原 体( a v a i b l ea th t t p ：w w w c h i n a c d c n e tc n f e i y a n b i n 9 4 1 5 1 h t m ( 2 0 0 3 年4 月3 0i t ) ) 。4 月1 4 同加 拿大及美国已绘制出了怀疑与s a r s 相关的新型冠状病毒的基因组序列图，证实 了怀疑与s a r s 相关的病毒是一种全新的冠状病毒( m a r r a , j o n e s e ta 1 2 0 0 3 ) 。在一 系列有利证据的支持下，世界卫生组织负责传染病的执行干事戴维嗨曼4 月1 6 日 宣布，经过全球科研人员的通力合作，终于正式确认冠状病毒的一个变种是引起 s a r s 的病原体。这种新型冠状病毒( s a r sc o v ) 被证明符合科赫法则( k o c h s p o s t u l a t e ) ，因此被认定为s a r s 的病原( f o u c h i e r , k u i k e ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 可见，不论在哪个国家，用电镜技术检测、鉴定一直伴随着整个s a r sc o v 发 现的过程。电镜技术是s a r sc o v 的发现过程中不可缺少的技术。 至2 0 0 3 年8 月7h 止，全球共有2 9 个国家和地区报告了8 4 2 2 宗疑似病例， 其中9 1 6 人死亡。感染s a r s 的病人。卜有约3 0 足医护人员。全球累计的s a r s 死r 率达到1 1 as a r s 对中困旅游、餐饮、商贸、客运等服务行业造成严重影 中山大学博士论文s a r sc o y 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的电子显微学研究张勤奋 响。 目前，虽然已经确定s a r sc o v 是s a r s 的元凶，并进行了相当多的分子生物 学、免疫学研究，如对不同地区分离到的s a r sc o v 序列的测定、分析和比较， s a r sc o v 某个蛋白的表达，结构分析等。但至今世界上对s a r s 的流行规律， s a r sc o v 的宿主来源，s a r sc o v 的生活周期及其生命活动特征等都没有完整的 资料，而这些对防治s a r s ，研制抗s a r sc o v 药物等的研究无疑具有重大意义。 此前我们已在s a r s 病原体的分离、鉴定等方面开展了研究，从s a r s 患者的 鼻咽拭子等标本中分离到了s a r s 病毒，并对此病毒的形态结构等进行了研究 ( z h a h gq i n - f e n ，c u ij i n m i n ge la 1 2 0 0 3 ，) 。本论文用传统的电镜技术进一步对 s a r s 冠状病毒的整个生命过程进行了研究，并对其有关的分子机制进行了探讨。 2 2 材科和方法 2 2 1 生物安全防护： 按照世界卫生组织关于处理s a r s 标本的生物安全指南以及中国疾病预防 控制中心关于非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南的要求，以下步骤 中的细胞收集和固定均在三级生物安全实验室进行，而脱水和渗透步骤在二级 生物安全( b s l 2 1 设备内按照b s l - 2 程序进行，在实验操作过程中穿戴保护装 备，包括一次性手套、紧袖的后开口的大衣、实验室专用鞋、外科口罩和帽子。 2 2 2 细胞、试剂等： 非洲绿猴肾细胞( v e r oe 6 细胞) 为广东省疾病预防控制中心( c d c ) 保 存的细胞株，m e m 培养基和新生小牛血清为g i b e o b r l 公司产品，电镜用戊 二醛，锇酸和s p u r t 包埋剂均为s i g m a 公司产品。 2 2 3 细胞培养： 将v e r o e 6 在m e m 生长培养液中3 6 5 ，二氧化碳培养箱中培养大约2 3 天后，将生长良好的单层细胞，用o 0 2 v e r s c n e 溶液和o 2 5 胰酶溶液作用 o 5 - 1 分钟，使细胞自瓶壁完全脱落成悬浮状态，加入4 0 5 0 m l 生长培养基， 分装细胞。 2 2 4 病毒分离和培养： 病毒分离方法参考以往办法( z h a n gq i n - f e n , c u ij i n - m i n g e ta 1 2 0 0 3 ，) 。 中山大学博士论文s a p s c o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的i 乜于显徽学研究 张勤奋 将分离得到的病毒株连续传3 代后，将病变达+ + + 以上的培养物，冷冻裂解， 悬浮液以1 0 0 u l s m l m e m 基础培养液的浓度，加在生长良好的单层培养细胞中， 3 6 5 分别培养3 h ，7 h ，2 4 h ，4 8 h ，7 2 h 后，按2 中方法，使细胞悬浮，4 c ， 1 0 0 0 0 9 离心4 5 m i n ，取沉淀的细胞团用于超薄切片研究，取上清用于负染色研 究。 2 2 5 病毒的负染色： 收集已出现病变的培养细胞上清，1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，去除细胞碎片， 取5 u l 上清滴加于新制备的铜网，停留片刻后，去除多余液体。在此同时将 5 0 0 p p m 的戊二醛和3 的磷钨酸等体积混匀，并迅速取此混合物约5 u l 滴加于 上述铜网，停留片刻，吸干多余液体。将铜网置于密封铁盒内，9 0 加热l 小 时，透射电镜观察。 2 2 6 超薄切片研究： ( 1 ) 戊二醛和锇酸双固定： 用2 5 戊二醛固定沉淀下来的细胞团9 0 分钟，吸去戊二醛固定液， 用o 1 m 的p b s 洗3 次，每次5 1 0 分钟，将经戊二醛固定的细胞团再用1 锇酸固定9 0 分钟，除去锇酸固定液，同样也用0 1 m 的p b s 洗3 次，每次 5 1 0 分钟。 ( 2 ) 酒精梯度脱水： 按3 0 、5 0 、7 0 、8 0 、9 0 酒精的顺序给固定后的细胞团脱水， 每一个梯度1 0 分钟。随后用新开封的无水乙醇彻底脱水3 0 分钟，中间更 换2 次新鲜的无水乙醇。 ( 3 ) 渗透： 将脱水后的细胞团置于无水乙醇和s p u n 包埋剂的混合溶液( 1 ：1 ) 中6 0 分钟，吸去混合溶液，加入s p u r t 包埋剂静鼍渗透3 小时，其中更换 新鲜s p u r t 包埋剂2 次。 ( 4 ) 包埋： 将被s p u r r 包埋剂充分渗透的细胞团块转移到包埋板上，放入7 0 c 的 恒温烘箱中聚合8 小时。 中山人学博 ：论文s a r s c o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的i u 子显微学研究张勤奋 ( 5 ) 切片和染色： 使用l k b 公司的l k b 2 0 8 8 超薄切片机将包埋好的样品块进行超薄切 片，切片厚度约6 0 - 9 0 n m ，用覆盖f o n v e r 膜的铜网捞取后，置于饱和的醋 酸铀溶液中染色3 0 分钟，流水清洗铜网，洗去多余染液，再用柠檬酸铅染 色1 5 分钟，同样也用流水清洗掉多余染液。 2 2 7 电镜观察及拍照： 使用j e o l 公司的j e m1 0 0 c x i i 透射电镜进行观察，工作电压为1 0 0 k v 。 使用乐凯公司的透射电镜专用底片进行拍片，记录。 2 3 结果( l e e ，h u i e ta 1 2 0 0 3 ) 2 3 1s a r s c o v 的负染色 用s a r sc o v 感染的v e r oe 6 细胞上清经负染色技术处理后，通过透射电 镜可看到病毒粒子大小不等，直径在6 0 1 2 0 n m 之间，病毒粒子的形状大多呈 近似圆形、椭圆形，外面的囊膜上有长1 0 2 0 n m 的纤毛状突起，这些纤突排 列较整齐，纤突之间有较宽的间隙( 图2 1 ) 。 2 3 2 病毒入侵细胞 对已感染s a r s 冠状病毒3 h 的培养细胞进行电镜观察，可观察到s a r s 病毒粒子入侵细胞的过程( 图2 2 、图2 3 ) 。从图可看到，s a r s 冠状病毒首先 吸附在v e r oe 6 细胞表面，病毒的囊膜与宿主细胞的细胞膜融合，随后核衣壳 进入细胞。图中还可看到刚通过细胞膜的s a r s 冠状病毒的核衣壳边界模糊， 没有明显囊膜结构，整个粒子的电子密度均匀。说明s a r sc o v 进入细胞后， 已去除了外面囊膜的结构，只有病毒的核衣壳进入了宿主细胞。经大量观察， 没有发现胞吞现象。 2 3 3 病毒组装与成熟 核衣壳解体后，病毒进行核酸的复制和蛋白合成。首先在感染病毒7 小时 后的样品内，可观察到膨胀的粗面内质网中出现已装配的病毒核衣壳( 图2 4 ) ， 9 中山大学博士论文s a p sc o y 和d , m c p v - - m a b f o b 复合物的电子显微学研究张勤奋 这些病毒核衣壳与结果2 3 2 中在细胞质中观察到的粒子相比，清晰很多，粒 子的中间电子密度低，呈透亮状，似乎还没有核酸或核酸装配没有完全完成， 因此，可以断定：这些粒子是子代的未成熟的病毒核衣壳，而非母代病毒粒子。 粗面内质网膜上的部分核糖体颗粒已脱落，此时的粒子中央染色较浅，粒子周 围无囊膜。随着感染时间增加，此类含有病毒的内质网越来越多，内含的病毒 核衣壳数量也增多，膨胀了的内质网上的核糖体颗粒逐渐减少甚至观察不到 ( 图2 5 ) ，也就是说此时的内质网上的核糖体已全部脱落，形成了病毒发生基 质包( v i r u sm o r p h o g e n e s i sm a t r i xv e s i c a e ，v m m v ) 。 另一方面，感染病毒7 小时的样品中能观察到高尔基体膨胀成空泡( 图 2 6 ) ，随着感染时间的增加，此类空泡数量增加，造成病变细胞严重空泡化， 这是s a r sc o v 感染细胞造成的最典型也是最明显的细胞病变。在感染2 4 小 时以后的样品中，发生基质包中的病毒核衣壳以出芽的方式进入上述空泡，箭 头所指显示从病毒发生基质包进入空泡后获得囊膜( 图2 7 ) ，进入空泡内的病 毒粒子直径约1 0 0 r i m ，形态与成熟的病毒粒子吻合。此类空泡与以往报导的光 滑泡( s m o o t hv e s i c l e s ) ( z h a n gq i n f e n ，c u ij i n m i n ge ta 1 2 0 0 3 ，) 一致。 2 3 4病毒释放 感染末期，光滑泡逐渐向细胞边缘移动，将内含的病毒粒子运送到细胞边 界，而后光滑泡的膜与细胞膜发生融合( 图2 8 ) ，膜融合处裂开，细胞膜产生 缺口( 图2 9 ) ，成熟的病毒粒子可由此释放。实验中未发现病毒以出芽方式释 放到细胞外。 2 3 5 病毒发生过程中的特殊现象 在感染4 8 小时后，在细胞核中也观察到了形态似病毒的粒子( 图2 1 0 ) 。 在以往冠状病毒的报导中，未在细胞核中发现过这种现象。因此，这是s a r s 冠状病毒生命过程中的特殊现象。 此外，在一些病变的细胞中，核膜扩张成泡( 图2 1 1 ) ，内含病毒核衣壳 粒子，这些粒子的数目有多有少，少则只有l 颗，多则可达上百颗。这些核膜 小泡阿的病毒核衣壳没有明显的囊膜，小泡可脱落形成病毒发生基质包。 1 0 中山大学博士论文 s a p sc o v 和b m c p v - - m a b f a b 复合物的电子显微学研究张勤奋 2 3 6 s a r s 冠状病毒的生命周期 根据上述结果，我们推导了s a r s 冠状病毒的生命周期，并用以下模式 图表示( 图2 1 2 ) 。首先，s a r s 冠状病毒通过膜融合的方式进入细胞，然后开 始核酸复制和蛋白合成。n 蛋白和核酸先在粗面内质网内装配成核衣壳，随着 感染时间增加，粗面内质网的核糖体脱落，逐渐形成病毒发生基质包( v m m v ) 。 同时，高尔基体膨胀形成光滑泡。v m m v 中的病毒核衣壳以出芽的方式进入 光滑泡并获得囊膜，完成病毒装配。光滑泡携带病毒，并将它们运输至细胞边 缘，最后光滑泡膜与细胞膜融合，释放其携带的成熟病毒粒子。s a r sc o v 完 成了一个生命周期 2 4 讨论 2 4 1s a r sc o x 引起的s a r s 是一种传染性极强的疾病。在对这种空气传播 的、传染性强的病原微生物进行研究时，一个很重要的问题是生物安全问题。 对于超薄切片技术来说，制备这一类样品时，在生物安全3 级实验室( p 3 实 验室) 完成制各的初始阶段，就能保证病毒已被灭活。而对于负染色技术来说， 一般的制备技术不能保证病毒在进电镜之前已被灭活。这对于应用负染色技术 直接观察未知传染病病原时是个很大的限制。本研究中，对一般的负染色技术 进行了改进，在用磷钨酸染色时，新鲜加入5 0 0 p p m 的戊二醛。一般她，用一 定浓度的戊二醛能达到很好的灭活病毒的效果，但使用戊二醛时，浓度的控制 对负染色效果差别很大。实验中发现，只要戊二醛浓度稍偏高时，观察到的病 毒周围就容易出现很黑的背景，所看到的s a r sc