（生物化学与分子生物学专业论文）甲状腺激素受体新亚型trβΔ的dna结合能力研究.pdf

关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密囹。 ( 请在相对应的方框内打“) 学位论文作者签名疡陋闩期：加。年蝴 钏雌扎商嗍泖哪却 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 甲状腺激素受体( t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r , t r ) 属于核受体超家族的成员， 广泛分布在各种组织中，常与类视黄醇x 受体( r e t i n o i dxr e c e p t o r , r x r ) 组成 t r s r x r 杂二聚体的形式，特异结合细胞核内靶基因序列中的甲状腺激素应答 元件( t h y r o i dh o r m o n er e s p o n s ee l e m e n t s ，t r e s ) 。t r 存在2 种主要的亚型：t i 沁 和t r 3 。豫仅和职基因的转录本( t r a n s c r i p t ) 因选择性剪接或转录起始位置的 不同而产生若干同功体( i s o f o m ) 。在已报告过的大鼠t r s ：t r a l 、t r e t 2 、t r a 3 、 t r q 1 、t r a 2 、t r 3 1 、t r l 3 2 、t r 3 3 和t r a l 3 3 等9 种亚型外，本室在研究甲 状腺激素受体过程中又发现了一个新的同功体，被n c b i 命名为t r l 3 a ，其m r n a 仅较t r i s l 的m r n a 多出了一个1 0 8 b p 的片段，t r 3 a 蛋白亦与t r i m 具有较 高同源性，仅在近氨基端多出了3 6 个氨基酸。t r 3 a 蛋白是目前唯一的加长t r s 亚型，具有非常重要的科学意义。 目的 为了检测我们新发现的一种甲状腺激素受体t r b a 新亚型与r x r a 、t r e s ( d r + 4 ) 结合的生物活性，我们设计了如下一些实验。 方法 1 p e t d u e t 1 r r x r a 重组表达载体的构建。自本室已经构建好的重组质粒 p e t d u e t 1 r t r f l a r r x r a 中获取r r x r a 的e d n a ，并将其插入原核表达载体 p e t d u e t 1 ，d n a 序列分析鉴定。 2 重组质粒在e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) q b 的诱导表达：重组表达质粒p e t d u e t 1 r r x r a 转化入e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，3 7 ，i p t g ( 1 m m o l l ) 诱导表达6 小时，s d s p a g e 鉴定表达产物大小和表达量，w e s t e r n b l o t 进一步鉴定。重组表达质粒 p e t d u e t 1 r t r p l 与p e t d u e t 1 r t r f l a 的i p t g 诱导表达，并对二者的诱导表 达产物进行s d s p a g e 、w e s t e r nb l o t 鉴定。 3 免疫共沉淀( c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，c o i p ) 鉴定t r l 31 r x r a 、t r 3 a r x r a 杂二聚体的形成。分别建立t r l 3 1 i r q ，t r l 3 a r x r a 两种重组蛋白的复合 物，分别以兔抗r x r a 抗体或小鼠抗h i s 抗体进行免疫共沉淀实验，沉淀物 以小鼠抗h i s 抗体或兔抗r x r t x 抗体进行w e s t e r nb l o t 检测。 4 t r b 与d n a 结合活性鉴定。先将a 门r 1 3 1 、t r 3 a 蛋白分别与r x r a 蛋白室 温下共同孵育，然后运用电泳迁移率改变试验( e m s a ) 检测杂二聚体的d n a l- l 户 天津医科大学硕+ 学位论文 结合能力，同时检测单独的t r i s a 、t r l 3 1 、r x r a 蛋白分别与t r e s ( d r + 4 ) 的结合情况。 结果 1 成功构建了p e t d u e t 一1 r r x r a 重组表达载体。 2 成功表达了贮承0 【融合蛋白：重组质粒p e t d u e t 1 r r x r a 转化菌、 p e t d u e t 一1 t r i l l 转化菌和p e t d u e t 。1 t r 归j 转化菌诱导表达产物的 s d s p a g e 均在约5 5 k d 附近出现深染条带( r x r a 约5 0 k d ，t r l 3 1 约5 2 k d ， t r i s a 约5 6 k d ) ，目的蛋白大小与预期基本一致，且主要存在于包涵体中。 r x rq 、t r l 3 1 、t r l 3 a 的表达量分别达到2 1 3 8 m g l 、2 5 1 0 m g l 、1 6 1 9 m g l 培养基，三种重组蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为3 2 2 、3 0 5 、2 8 8 。 3 包涵体形式的r x r a 、t r l 3 1 、t r l 3 a 重组蛋白可溶解于高浓度的尿素溶液中， 经透析后占上清液的主要部分。 4 免疫共沉淀证实t r b 及t r l 3 1 均能够与r x r a 蛋白分别形成t r i s a r x r a 、 t r l 3 1 r x r a 杂二聚体。 5 t r i h 、t r l 3 a 两种蛋白与r x r o t 形成杂二聚体后均能够结合t r e s ( d r + 4 ) ， 而且单独的r x r t t 、t r l 3 1 、t r l 3 a 蛋白也分别能够结合t r e s ( d r + 4 ) 。 结论 本文通过构建p e t d u e t 1 r r x r a 重组表达载体成功表达了r x r c t 蛋白。结 果证实甲状腺激素受体t r l 3 a 同t r i s l 一样，能与阳承仅形成杂二聚体结合d n a ， 而且t r l 3 a 、t r l 3 1 和r x r a 三者均具有d n a 结合活性。我们的研究结果与 w i l l i a m s 报道有所不同，据w i l l i a m s 其文中报道单独的t r l 3 1 、r x r a 蛋白均不 能够结合t r e s ( d r + 4 ) ，只有在t r l 3 1 和r x r a 共同孵育形成t r i b i r x r a 杂 二聚体之后才能与t r e s ( d r + 4 ) 结合。而本文显示t r l 3 a 、t r l 3 1 甚至r x r a 本身单独也能结合d r + 4 ，但它们是以单体抑或是同二聚体与d n a 结合有待于 进一步研究。 关键词：甲状腺激素受体类视黄醇x 受体新亚型免疫共沉淀 电泳迁移率改变实验 天津医科大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r s ( t r s ) b e l o n gt o t h es t e r o i d t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r s u p e r f a m i l yo fl i g a n d d e p e n d e n tt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n da r ed i s t r i b u t e di na l m o s ta l l o 唱a n so ft h eb o d y t r so f t e nm o d u l a t et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo ft a r g e tg e n e sv i a h e t e r o d i m e r i z e d 诵t ht h e9 - c i sr e t i n o i ca c i dr e c e p t o r ( r x r ) o np o s i t i v et h y r o i d r e s p o n s ee l e m e n t s ( t r e s ) ，r x rf a v o r sb i n d i n go ft h et r - r x rc o m p l e xt od n a a n d s t i m u l a t e st r a n s c r i p t i o n t r sa r ec o d e db yt w og e n e s ，t r aa n dt r f l b e c a u s eo f d i f f e r e n tt r a n s c r i p ts t a r tp o s i t i o na n da l t e r n a t i v es p l i c i n g ，e a c hs u b t y p eh a ss e v e r a l i s o f o r m s ，i n c l u d i n gt r a l ，t r a 2 ，t r a 3 ，t r a a l ，t r a a 2 ，t r i bi ，t r l 3 2 ，t r 3 3 ，t r a p 3 t r l 3 ai s t h eu n i q u ee x t e n d e d - p a t t e r nt ri s o f o r m sw h i c hw a sf o u n db yo u r l a b o r a t o r ya san o v e lt r l 3i s o f o r m i t sm r n a c d n ai so n l y10 8 b p sl o n g e rt h a nt h a t o ft r l 31 t h eo n l yd i f f e r e n c eb e t w e e nt r l 3 aa n dt r 31i sa na d d i t i o n a l3 6a m i n o - a c i d r e s i d u e so ft r p a o b j e e t i v e ： i no r d e rt od e t e c tt h en o v e lt h y r o i dh o r m o n er e c e p t o ri s o f o r m - t r l 3 ac o u l db i n d w i t l lr x r aa sf o r m i n gah e t e r o d i m e r , a n dt r l 3 a r x r ah e t e r o d i m e rh a sb i o l o g i c a l a c t i v i t yo fb i n d i n gt a r g e td n a ，s o m ee x p e r i m e n t sa r ed i s i g n e da sf o l l o w i n g m e t h o d s ： 1 c o n s t r u c t i o no fm c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp e t d u e t 1 r r x r a r x r at a r g e t g e n ew a so b t a i n e df r o mr e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t d u e t 1 r t r f l a r r x r a ，a n dt h e n i n s e r t e di n t op r o k a r y o f i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t d u e t 一1 ，a n dt e s t e db yd n a s e q u e n c i n g 2 t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d s w e r et r a n s f o r m e di n t oe c o l i b l 21 ( d e 3 ) a n d e x p r e s s e d t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t d u e t 一1 r r x r aw a st r a n s f o r m e di n t o e c o l ib l 21 ( d e 3 ) a n di n d u c e dw i t hi p t g ( 1m m o l l ) a t37 f o r6 h i t sa m o u n t a n dm o l e c u l a rw e i g h to ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw e r et e s t e db ys d s p a g ea n d w e s t e r nb l o t a tt h es a m et i m ew ea l s oc o m p l e t e di n d u c e de x p r e s s i o n ，s d s - p a g ea n dw e s t e r nb l o to fp e t d u e t - 1 r t r f l la n dp e t d u e t - 1 r r r f l d 3 h e t e r o d i m e r so ft r l 31 r x r aa n dt r p a r x r aw e r ed e t e c t e d b y c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n c o m p l e x e s o ft r b1 r x r aa n dt r l 3 a - r x r aw e r e 天津医科大学硕士学位论文 c o i m m u n o p r e c i p i t a t e dw i t i lr a b b i tp o l y c l o n a lt or e t i n o i dxr e c e p t o ra l p h ao r a n t i h i sa n t i b o d y t h ei m m u n o c o m p l e x e sw e r ed e t e c t e d b yw e s t e r nb l o tw i t h a n t i h i so rr e t i n o i dxr e c e p t o ra l p h aa n t i b o d yt oi d e n t i f yt h ef o r m a t i o no f h e t e r o d i m e r s 4 b i o l o g i c a la c t i v i t ya s s a yo ft r l 3 a f i r s tt r l 31a n dt r p w e r ei n c u b a t e d s e p a r a t e l y w i t hr x r aa tr o o mt e m p e r a t u r e t h e nt h e i rb i o l o g i c a l a c t i v i t yo f b i n d i n gt a r g e td n aw a sc o n f i r m e db ye l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y ( e m s a ) r e s u l t s ： 1 w ec o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp e t d u e t 一1 r r x r a 2 w ee x p r e s s e dr e c o m b i n a n tr x r t tp r o t e i n r x r 俚t r i lla n dt r l 3 af u s i o n p r o t e i n sw e r ee x p r e s s e di ne c o l lf u s i o np r o t e i n sw e r ea n a l y z e db ys d s p a g e a n dw e s t e r nb l o t t h er e s u l ts h o w e dt h a tf u s i o np r o t e i n sw e r es t a i n e dn e a r55 k d ( r x r a5 0 k d ，t r l 3 15 6 k da n dt r l 3 a5 k k d ) a n df u s i o np r o t e i n sw e r em a i n l yi n i n c l u s i o nb o d i e s t h ey i e l do fr x r a ，t r i lla n dt r l 3 ar e a c h e d213 8 m g l 、 2 5 1 o m g l 、1 6 1 9 m g lm e d i u ma n da c c o u n t e df o r3 2 2 、3 0 5 、2 8 8 o f t o t a l p r o t e i ni ne c o l ib l 2l ( d e 3 ) 3 i n c l u s i o nb o d yo fr x r a ，t r bia n dt r i ad i s s o l v e di nah i g hc o n c e n t r a t i o no f u r e as o l u t i o na n da c c o u n t e df o rt h em a j o rp a r to ft h es u p e m a t a n t 4 c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o nc o n f i r m e dt h a tr e c o m b i n a n tp r o t e i nt r l 3 a ，l i k et r l 31 ， c o u l db i n dw i t hr x r aa sf o r m i n gah e t e r o d i m e r 5 c o m p l e x e so fr x r aw i t ht r b lo rt r l 3 ar e s u l t e di nb i n d i n go ft r i 1 r x r c ta n d t r l 3 a r x r c th e t e r o d i m e r s ，c o u l db i n dd n aw h e ni n c u b a t e dw i t ht h ee l e m e n t r x r a ，t r i l la n dt r l 3 ac o u l da l s ob i n dd n aw h e ni n c u b a t e da l o n ew i t ht h e e l e m e n t c o n c l u s i o n ： i nt h i ss t u d yw ec o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp e t d u e t 一1 r r x r a a n de x p r e s s e df u s i o np r o t e i nr x r a o u rr e s u l ts h o w st h a tt r i l a ，l i k et r 3 1 ，c o u l d b i n dw i t hr x r aa sf o r m i n gah e t e r o d i m e ra n dc o m p l e x e so ft r i l a r x r aa n d t r l 31 r x r ac o u l db i n dw i t hd n a i n t e r e s t i n g l y , t r i b a ，t r i lla n dr x r aa l s oh a v e l v 天津医科大学硕十学位论文 t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fb i n d i n gt a r g e td n aw h e ni n c u b a t e da l o n ew i t ht h e e l e m e n t o u rr e s u l t sa r ed i f f e r e n tf r o mw i l l i a m s sr e p o r t w i l l i a m sr e p o r t e dt h a t r x r aa n dt r i llf a i l e dt ob i n dd n aw h e ni n c u b a t e da l o n ew i t ht h ee l e m e n t 。a n d c o i n c u b a t i o no fr x rw i t ht r l 31r e s u l t e di nb i n d i n go ft r i si - r x rh e t e r o d i m e r s t h e r e f o r e ，i ti sn e e dt os t u d yt h ed n a - b i n d i n go ft r l 3 a ，t r l 31 ，a n de v e nr x r a a l o n ef u r t h e r m o r e k e y w o r d s = t h y r o i dh o r m o n er e c e p t o r c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n r e t i n o i dx r e c e p t o r i s o f o r m e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y 卜 i i 天津医科火学硕士学位论文 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i i 符号说明 前言l刖吾l 研究现状、成果1 研究目的、方法6 实验流程6 甲状腺激素受体新亚型t r l 3 a 的d n a 结合能力研究7 对象和方法7 1 1 实验材料7 1 2 实验方法8 结果2 1 1 1 重组p e t d u e t 1 r r x r a 表达质粒的构建2 l 1 2 重组表达质粒在e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) 中的表达与鉴定2 1 1 3h i s 融合蛋白t r b i 和t r p a 的表达与鉴定2 3 1 4 重组质粒表达效率的测定2 4 1 5 包涵体处理后s d s p a g e 鉴定2 5 1 6 融合蛋白产量和浓度测定与估算2 5 1 7 免疫共沉淀鉴定杂二聚体的形成2 5 1 8 电泳迁移率改变分析( e m s a ) 鉴定重组蛋白d n a 结合能力2 7 讨 仑一2 8 1 1 融合蛋白r x r a 的表达2 8 1 2t r 3 a 与r x r a 的结合2 9 1 3 免疫共沉淀2 9 1 4 电泳迁移率改变实验检测蛋白质一d n a 相互作用3 0 1 5t r 3 a 与d n a 的结合3 1 结论3 3 参考文献3 4 发表论文和参加科研情况说明3 9 v i k l f ， l - j l 天津医科大学硕士学位论文 缩写 a b a c r a p b c a b i s b m eb b p b s a d a b d b d d d h 2 0 d n a d n t p e b e c o l i e d t a e r h i s h i s t a g h r p i p t g k d l b d n c n t a p b s p p a r 符号说明i i i tl it r1 4 英文全称 a n t i b o d y a c r y l a m i d e a m m o n i u mp e r s u l f a t e b i c i n c h o n i m i ca c i d n n - m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e 1 3 一m e r c a p t o e t h a n o l b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n 3 3 - d i a m i n o b e n z i d i n et e t r a h y d r o c h l o r i d e d n a b i n d i n gd o m a i n d i s t i l l e dt w i c ew a t e r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 2 - d e o x y n u c l e o s i d e - 5 - t r i p h o s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e ， e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e s t r o g e nr e c e p t o r h i s t i d i n e h i s t i d i n et a g h o r s e r a d i s hp e o x i d a s e i s o p r o p y l1 3 - d - 1 一t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l od a l t o n l i g a n db i n d i n gd o m a i n n i t r o c e l l u l o s e n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r a c t i v a t e dr e c e p t o r v l i l 中文全称 抗体 丙烯酰胺 过硫酸铵 二辛可酸 n ，n 二甲基酰胺 巯基乙醇 碱基对 牛血清白蛋白 二氨基联苯胺 d n a 结合区域 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 雌激素受体 组氨酸 组氨酸标签 辣根过氧化物酶 异丙基b d 硫代 半乳糖苷 千道尔顿 配体结合区域 硝酸纤维素 氮基三乙酸氮基二厶酸 磷酸盐缓冲液 过氧化物酶体增生物 l ) l 天津医科人学硕士学位论文 激活受体 p v d f p o l y ( v i n y l i d e n ef l u o r i d e ) 聚偏二氟乙烯 r a rr e t i n o i ca c i dr e c e p t o r视黄酸受体 r t h r e s i s t a n c et ot h y r o i dh o r m o n e甲状腺激素抵抗综合征 r x r r e t i n o i d x r e c e p t o r 视黄醇类x 受体 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 s d s p a g e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 t e m e dn ，n ，n n - t e t r am e t h y le t h y 1 e n ed i a m i n en ，n ，n n 四甲基乙二胺 t h t h y r o i dh o r m o n e 甲状腺激素 t r e s t h y r o i dh o r m o n er e s p o n s ee l e m e n t s 甲状腺激素应答元件 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 t 黜t h y r o i d h o r m o n er e c e p t o r s甲状腺激素受体 v d rv i t a m i nd r e c e p t o r 维生素d 受体 天津医科大学硕十学位论文 对象和方法 月i j 舌 研究现状、成果 甲状腺激素通过与广泛分布在各种组织中的甲状腺激素受体( t r s ) 结合作 用于转录过程，实现对靶基因的正性负性调节，对于机体的正常分化发育和代 谢平衡具有十分重要的作用【l 】。目前认为，t r 与雌激素受体( e r ) 、孕激素受体 ( p r ) 、糖皮质激素受体( g r ) 、盐皮质激素受体( m r ) 、雄激素受体( a r ) 、维生素 d 受体( v d r ) 、视黄酸受体( r a r ) 和孤儿受体( o r ) 同属类固醇核受体的超家 族，故有类似的结构和功能。它们都能够识别某段特异的d n a 序列，即激素应 答元件( h o r m o n er e s p o n s i v ee l e m e n t ，h r e ) ，并可与之结合而调控靶基因转录【2 j 1 。 t r s 同所有核激素受体一样，具有相似的结构和功能分区。t r s 在结构上可 分为6 个区，从氨基端到羧基端依次为a f 区，它们组成4 个功能区域( 如 图1 ) 。氨基端a 区和b 区合称b 区，与转录激活有关，转录激活的区域称 为a f l 区；c 区形成d n a 结合区域( d b d ) ；d 区为铰链区；羧基端e f 区含 有配体结合区域( l b d ) ，该区含有与配体依赖的转录激活有着重要联系的a f 2 区【4 】。 c o n s t i t u t i v e h 黜引b h | n g e l i g a nd b 棚n g td i m e r l sa 1 。n | a b lc | d | e 厣 t，。上一。，。o，。，。j 图lt r s 的功能分区示意图 以大鼠t r p l 为例，该蛋白区d 4 6 1 个氨基酸组成。其中1 1 0 6 相当于b 区。 1 0 7 1 7 4 是d n a 结合区域，与t r e 的识别关系最为密切的d n a 结合特异区位于 1 0 7 1 3 2 。1 7 8 1 8 6 是与t r s 的核定位相关的区域，即d 区。2 1 1 - 4 6 1 是配体结合区 域，其中2 8 6 3 0 5 ，3 6 2 4 6 1 是与受体的杂二聚化密切相关的区域( 如图2 ) 。 天津医科大学硕士学位论文对象和方法 t r b l d 、a b i n d i n gs p e c i f i c i t v l u ：l p a ri ，e 1 ) t a l i z a t i o n i 3 b i n d i n g h p l c r o d i m c r i z d t i n n 1 0 ，二 i ：i9 h ? 4 h 一 2 抖nj ，n ：j “ 一一 图2 t r 3 1 的功能分区 d n a 结合功能区( d b d ) 位于t r s 的中心位置，是受体最保守的区域，具有 识别特异性靶基因序列，激活靶基因的作用。与雌激素受体( e r ) 、视黄酸受体 ( r a r ) 、类视黄醇x 受体( r x r ) 、维生素d 受体( v d r ) 相类似，t r s 的d b d 由2 个锌指结构和羧基侧的羧基端延伸区构成。保持锌指结构的完整性对于t r s 结 合d n a 和激活转录的功能十分重要( 如图3 ) 。 在t r 的第一个锌指后有一个0 【螺旋，可特异识别t i 辽s 并与大沟内的核酸磷 酸根基团相作用。其中有3 个氨基酸最为重要被称为“p b o x 。可特异识别d n a 序列“a g a a c a ”，决定与t r 相互作用的d n a 序列的特异性。“p b o x ”中的 第1 、2 个氨基酸最为重要，突变后将显著降低其与t r e s 的亲和力。s h i b u s a w a 等 p j 构建了将t r l 3 2p - b o x q b 前两个氨基酸突变( 由e g g 到g s g ) 的突变体g s l 2 5 。研 究结果显示，含有g s l 2 5 1 拘t r l 3 与正性和负性甲状腺激素应答元件( t r e s ) 的亲和 力都下降。g s l 2 5 突变体未能产生对所有负性t r e s ( 包括同向重复结构、反向回 文结构和回文结构) 的反式激活。但是失去t r s 结合d n a 能力的小鼠听力的发育 和维持也可以正常1 6 j 。p b o x 中的第3 个氨基酸可被很多氨基酸替代而不显著影响 其与t r e 的亲和力。但是如果替换的是那些有庞大侧链的氨基酸或酸性氨基酸 ( ! i p ，f ，w ，y ，h ) 则仍会影响亲和力。t r s 与类视黄醇x 受体组成的t r s r x r 杂二 聚体则可极大地扩展可被替代的氨基酸的范围和类型，此外，替换第3 个氨基酸 后t r 与d n a 结合区的适合性还决定于半位( h a l f - s i t e ) 的第四个碱基即： “a g a n c a 1 7 j 。t r s 的d b d 的第二锌指内有“d b o x ”，决定反应元件两半位 ( h a l f - s i t e ) 的间隔并参与受体二聚体的形成。在第二锌指的羧基侧有羧基端延伸 区( c t e ) ，约由2 5 个氨基酸残基组成，其内有“a b o x 和“t b o x ”，与t r e s 的小沟相作用。c t e 具有重要的功能，它既参与受体与d n a 的相互作用，也 参与受体与其它蛋白质的相互作用。t r r x r 的杂二聚化对于t r s 结合t r e s 具有 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 1 7 1kro ，拿一l ，t j 日 冬二c i 河，眦。i h g k k 7 z 2 0 e 。 l c 八j z 乏璐，三h f 4 。i o k n l l t p 二s 三f v g 缸：孟。 当 蟹。 一 卟。 g s d 对 。 皇i 憎5 1 2 a p 7 k lh - g i s k o l e e r f i c l k e b e 。l 2 + 琶j 卜卜 a g 3 t c a n n n a g g t c a i n v e r t e dp a l i n d r o m et g c c t n n n n n n a g g t c a 图4t r e s 的排列方式 天滓医科大学硕十学位论文对象和方法 有人认为t r e s 有正性和负性之分：p t r e s ( p o s i t i v et r e s ) 和n t r e s ( n e g a t i v e t r e ) ，分别介导t h s 对基因转录的正性和负性调节，如在垂体细胞t 3 通过p t r e s 诱导g h 基因表达，而在非垂体细胞却是n t r e s 在起作用，使得g h 基因的表 达被阻遏1 9 , 1 0 。 t r s 可与多种t r e 结合，同时在其介导t h s 转录调节的过程中还需要多种 辅助调节物的参与以及染色质构象的改变。p l a t e r o t i 掣1 1 】在研究t r a l 调节肠上 皮细胞的p 2 连环蛋白基因转录中表明，尽管t r s 可以单体、同二聚体和杂二聚 体三种形式与t r e s 结合，但t r s r x r 杂二聚体最为重要，它不但可以促进t r s 与d n a 的结合，还可以促进t r s 与多种辅助调节物相互作用，从而调节转录 【1 2 ，1 3 】 o 我们在研究甲状腺激素受体的过程中发现一个新的甲状腺激素受体同功体 t r 3 a 。它不同于人们熟知的t r b l 和p 2 ，也不同于w i l l i a m s 2 0 0 0 年报告的t r 3 3 和a i b 3 h j 。在t r i l l 基因的第3 ，4 外显子( e x o n ) 之间多出了一个1 0 8 b p 的片 段( 图5 ) ，已于2 0 0 5 年获准于g e n b a n k 登记注册，编号为d q l 9 11 6 5 。经过对 t r f l a m r n a c d n a 的序列分析发现，较t r i l l 多出来的这一段序列( 1 0 8 b p ) 的 位置并不影响其前后序列的读码框。t r f l d 可翻译出比原t r l 3 1 多3 6 个氨基酸残 基的新的受体蛋白( 图6 ，黑体字示加长的3 6 a a ) 。该氨基酸序列同样经g e n b a n k 登记注册，获编号为a b a 3 9 2 9 4 。这3 6 个氨基酸残基是t r 3 a 与t r d l 的唯一 区别，它是t r 家族中唯一的加长型受体亚型。它的产生很可能是可变剪接的结 果，更可能是本来存在又一个 0 8 b p 的外显子。而且此新受体具有d n a 结合区 ( d b d ) 和配体结合区( l b d ) ，只是在原t r l 3 1 的d b d 中间部分多出3 6 个氨 基酸( 图7 ) 。t r l 3 a 当属甲状腺受体家族的第1 0 个成员，是本实验室在世界范 围内最新发现的，迄今由国内作者在国内发现和鉴定的唯一的新受体。 5 t g a a g a g g a c c c a g c a t r a c t a c t a a c c c l i 回一c c t t c t c a c a c c a g a g a c g a g a a g a c a g g g a t t t g g t t c c a t a c a g a c a c c a g t t c t a c c t c t c t g c a t t c g g t c t g g a t g t t g t c c t c a a g g c a g t g g g a c c c t g a g 图5 本实验室克隆的t r p a c d n a 全序列 注：下划线部分为上、下游引物；黑体字部分为多出的1 0 8 b p 序列， 其余序列与t r l 3 1 e d n a 完全相同，编码序列共1 4 9 4 b 0 。 4 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 n h 2 - 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