（生物化学与分子生物学专业论文）酿酒酵母pka催化亚基的活性比较研究.pdf

中文摘要 酿酒酵母的r a s c a m p 信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化、压力 抗性以及菌丝生长过程中具有重要的作用。蛋白激酶a ( p k a ) 是r a s c a m p 信 号通路的主要靶标。p k a 催化亚基由基因t p k i 、t p k 2 和t p k 3 编码，二聚体 调节亚基由b c y l 基因编码。c a m p 和p k a 的调节亚基结合，释放出其催化亚 基而激活了p k a 。p k a 通过负调控锌指蛋白转录因子m s n 2 4 和蛋白激酶r i m l 5 来调节细胞对压力的响应。p k a 活性高的细胞对热敏感，而p k a 活性低的细胞 对热有抗性。y a k l 处于p k a 的下游，受p k a 的负调控作用，对细胞的生长有 抑制作用。缺失y a k l 基因能提高p k a 活性。三个砰k 基因有靶标特异性，但 它们在p k a 活性方面有什么差异还不清楚。 本文构建了缺失一个t p k 基因或缺失两个t p k 基因的菌株，对它们的热击 抗性进行比较研究。实验结果表明，不同t p k 基因表达产物的协同作用产生的 p k a 活性不同。在y a k l 基因缺失背景下，t p k 2 基因表达产物的p k a 活性最高， t p k 3 基因表达产物的p k a 活性最低；而在b c y l 基因缺失背景下，t p k 基因表 达产物的p k a 的活性顺序相反。同时还可以推测，y a k l 基因表达产物对于压力 抗性系统是必要的，而t p k 3 基因表达产物对压力抗性系统有正调控作用。 关键词：r a s c a m p 信号通路p k ay a k l 热击 a b s t r a c t i ns a c c h r a m y s i sc e r e v i s i a e ，t h er a s - c a m ps i g n a l i n gp a t h w a yp l a y sa l li m p o r t a n t r o l et or e g u l a t em e t a b o l i s m ，p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，s t r e s sr e s i s t a n c e a n d p s e u d o h y p h a ld i f f e r e n t i a t i o n p k ai sa ni m p o r t a n tt a r g e to ft h er a s c a m pp a t h w a y t h ec a t a l y t i cs u b u n i t so ft h ep k aa r ee n c o d e db yt p k l ，t p k 2a n dt p k 3 ，a n dt h e d i m e r i cr e g u l a t o r ys u b u n i ti se n c o d e db yb c y l c a m pc o m b i n e st h er e g u l a t o r y s u b u n i t ，r e l e a s e st h ec a t a l y t i cs u b u n i t sa n da c t i v a t e st h ep k a p k ad o w n - r e g u l a t e s t h ez n f i n g e rt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rm s n 2 4a n dp r o t e i nk i n a s er i m15t oc o n t r o lt h e r e s p o n s er e a c t i o no ft h ec e l l st oh e a t s h o c k t h ec e l l s o fh i g hp k aa c t i v i t ya r e s e n s i t i v et oh e a ts t r e s s ，a n dt h ec e l l so fl o wp k aa c t i v i t ya r er e s i s t a n tt oh e a ts t r e s s y a k l ，d o w n r e g u l a t e db yp k a a n dd o w n s t r e a mo ft h ep k a ，r e p r e s s e st h eg r o w t ho f t h ec e l l s t h ed e l e t i o no ft h eg e n e 泓k lc a ne l e v a t et h ep k aa c t i v i t y t h r e et p k g e n e sh a v es p e c i f i ct a r g e t sr e s p e c t i v e l y b u tt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h e mi np k a a c t i v i t yi su n k n o w n i nt h i ss t u d y , t h es t r a i n sw e r ec o n s t r u c t e db yd e l e t i o no n et p kg e n eo rt w ot p k g e n e s ，a n dc o m p a r et h e i rh e a tr e s i s t a n c e i t sr e v e a l e dt h a tt h ec o o p e r a t i o no f d i f f e r e n t t p kp r o d u c t sp r o d u c e sd i f f e r e n tp k a a c t i v i t y i nt h eb a c k g r o u n do ft h ed e l e t i o no f t h e 尉t h ep k aa c t i v i t yo ft p k 2p r o d u c ti sh i g h e s ta n dt h et p k 3p r o d u c ti s l o w e s t ；b u ti nt h eb a c k g r o u n do fd e l e t i o no fb c y lg e n e ，t h eh i e r a r c h yi sr e v e r s e a t t h es a m et i m e i t sa l s op r e s u m e dt h a tt h ep r o d u c to f 刚g e n ei sn e c e s s a r yt ot h e s t e s sr e s i s t a n c es y s t e ma n dt h ep r o d u c to ft p k 3u p - r e g u l a t e st h es t e s sr e s i s t a n c e s y s t e m k e yw o r d s r a s c a m ps i g n a l i n gp a t h w a y , p k a ，y a k l ，h e a t s h o c k 独创性声明 本人声明所旱交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果也不包含为获得苤盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书l n j 使用过的材料。j 我一l _ j 工作的同忠对木研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：趣峨譬 签字日期：”g年月j - 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤盗盘堂 有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫盗盘堂口j 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向圜家有关部| j 或机构送交沦文的复印件和磁盘。 ( 保密的学何论文在街犁密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：趣胀生 导师签名： 签字日期：歹卯9 年6 月4 - t 9 b 毛过 签字日期：彩髟年月多曰 第一章文献综述 1 1 细胞信号转导概述 第一章文献综述 生物体的新陈代谢和生长发育主要受遗传信息及环境变化信息的调节控制。 遗传基因决定代谢和生长发育的基本模式，其实现在很大程度上受控于环境的刺 激；环境刺激在控制细胞的基因表达及增殖、分化、发育等方面起着重要的调节 作用。 “细胞信号转导”的具体内容简单说就是：外界环境刺激因子和胞间通讯信号 分子等，作用于细胞表面( 或胞内) 受体后，跨膜转换形成胞内第二信使，以及 经过其后的信号通路组分级联传递、引起细胞生理反应和诱导基因表达的过程。 1 2 酿酒酵母的r a s c a m p 信号通路 酿酒酵母的c a m p 信号通路，l l p r a s c a m p 信号通路在调控酵母细胞代谢、 增殖、分化、压力抗性以及菌丝生长过程中具有重要的作用。该通路的信号传导 过程为：鸟苷酸交换因子( g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c t o r ，g e f ) c d c 2 5 s d c 2 5 使r a s 蛋白由r a s g d p 的无活性状态变为r a s g t p 的有活性状态。被激活的r a s 蛋 白激活腺苷环化酶c y r l ，c y r l 催化a t p 生成c a m p 。c a m p 结合c a m p 依赖的蛋白 激酶a ( p r o t e i nk i n a s e a ，p k a ) 的调控亚基( r ，由基因b c y l 编码) ，释放出催 化亚基( c ，由基因口k ，、t p k 2 、t p k 3 编码) 。被激活的p k a 再作用于其他一 些蛋白激酶，并最终调节一些压力抗性基因的表达。r a s c a m p 信号通路如图 1 1 所示。细胞内的c a m p 水平既受磷酸二酯酶p d e l 和p d e 2 的抑制，又受p k a 的 反馈抑制。p k a 负调控锌指蛋白m s n 2 m s n 4 和蛋白激酶r i m l 5 。m s n 2 m s n 4 通过 作用于压力响应基因启动子里的s t r e 元件( s t r e s s r e s p o n s i v ee l e m e n t ) 调节基因表 达。受r i m l 5 正调控的锌指蛋白g i s l 通过作用于基因启动子区的p d s ( p o s t d i a u x i c s h i r ) 元件来调节相关基因的表达。 酿酒酵母的r a s c a m p 通路对于细胞生长，细胞周期进程和正确调控营养响 应是必需的。p k a 活性有缺陷的细胞停止生长并进入g 1 期，表现出与营养饥饿时 相似的生理变化。这些变化包括海藻糖和糖原积累、各种基因( 如s s a 3 ，h s p l 2 ， 第一章文献综述 h s p 2 6 ，c 仃y ，u b l 4 和a d h 2 ) 表达增强及压力抗性增加。相反，具有高p k a 活性的突变株不能停滞在gz 期，海藻糖和糖原积累有缺陷，并且在营养饥饿时对 压力仍具有高敏感性。这些结果表明，酵母的r a s - e a m p 通路在传递营养状况信 号时起了中心作用，并参与决定细胞进，g 1 期。相应的，低p k a 活性使细胞退出 减数分裂期并进入g o 期，而高p k a 活性使细胞不能进入g o 期。 。 厕 弗鼍委 一句q 图i - l 酿酒酵母中的g a s - c a m p 通路 f 蟾啪i - 1t i l e p , a s a m ps i g n a l 吨p a t h w a y i n s c e 删i s i a e 1 3r a s c a m p 信号通路的主要元件 1 3 1 鸟苷酸交换因子c d c 2 5 和s d c 2 5 c d c 2 5 最初是作为温度敏感型突变株而被确定的，该突变株在限制性温度 下使细胞周期停止在g 1 期。c d c 3 5 c y r l 的温度敏感型的等位基因也使细胞周期停 止在g 1 期。c d c 2 5 在r a s - c a m p 通路中发挥作片j 的最韧生物化学及遗传学证据是： 加入外源c a m p 能使c d c 2 5 突变株的温度敏感性受到抑制，并且r f l s 突变的抑制物 也能抑制c d c 2 5 突变”i j 】。 支持c d c 2 5 作为r a s 蛋白的鸟苷酸交换因子( g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g e 第一章文献综述 f a c t o r ，g e f ) 在r a s c a m p 通路中发挥作用的重要实验证据有：具有显性组成型 活性的r a s 2 t m 拶等位基因能够解除酵母细胞对c d c 2 5 的需求，然而增加野生型 r a s 2 等位基因的表达却没有这种作用。野生型的c d c 2 5 基因是通过对c d c 2 5 船突 变株的互补实验克隆到的。m u n d e r 等人利用融合蛋白体系表明：r a s l 和r a s 2 能 直接与c d c 2 5 的c 端发生作用，但剐鼬吲佃却不能。在w 3 0 3 菌株背景下，c d c 2 5 活性对于葡萄糖碳源上生长的细胞是非必须的，但是对于生长在半乳糖和非发酵 碳源的细胞是必须的i 6 i 。 s d c 2 5 是作为c d c 2 5 5 突变的抑制子被分离出来的。它编码一个有1 2 5 1 个 氨基酸残基的蛋白，该蛋白与c d c 2 5 有同源性。s d c 2 5 的c 端与c d c 2 5 的c 端 具有广泛的同源性。当过度表j j s s d c 2 5 基因或在c d c 2 5 基因座的转录控制下表 达s d c 2 5 时，它可以完全取代c d c 2 5 基因的功能。因此s d c 2 5 产物是r a s 的鸟 苷酸交换因子1 4 j 。 s d c 2 5 被认为是在非发酵碳源上或者在葡萄糖耗尽的情况下才表达【5 j 。因为 缺失了c 端的c d c 2 5 突变株在二次生长期可以消耗乙醇和氧而获得生长，因此人 们认为该突变株在醋酸和甘油上不能生长并不是因为其丧失了呼吸的能力，而是 因为其丧失了糖异生的能力【6 】。缺失c d c 2 5 在一些酵母细胞中是致命的，但是无 义突变可以通过过量表达s d c 2 5 来补偿例2 4 】【2 5 】。 酿酒酵母c d c 2 5 基因编码的蛋白含有1 5 8 9 个氨基酸，是分子量为1 8 0 k d a 的质膜结合蛋白。互补c d c 2 5 功能缺陷的是基因的3 端( 是8 7 7 1 5 8 9 位氨基酸 残基) 。序列分析表明，只有一个短的疏水区域( 1 4 5 9 1 4 7 1 位残基) 而没有其他 序列参与翻译后酰化。 c d c 2 5 能形成同型二聚体，和s d c 2 5 能形成异型二聚体，二聚化区域就是在 催化和膜定位的位置1 7 j 。双杂交系统表明c d c 2 5 的c 末端( c d c 2 5 c t ) 能和c d c 2 5 和s d c 2 5 c t 作用【7 】。突变分析表明，c d c 2 5 分子内和分子间的相互作用可能参与 调节c d c 2 5 活性i7 j l 引。 研究表明c d c 2 5 是一个不稳定的多肽，半衰期是1 5 2 0 分钟。这种不稳定性 主要是由于c d b 的存在。c d b 是c d c 2 5n 末端的一个依赖泛素化降解c d c 2 5 的细胞周期蛋白破坏盒模块( c y c l i nd e s t r u c t i o nb o xm o t i f ，c b d ) 。c d b 好像不 受细胞周期调节，即c d c 2 5 的降解与各个细胞周期停止点无关。c d c 2 5 快速的降 解速度表明酵母中的r a s c a m p 信号通路可能通过c d c 2 5 的细胞含量来进行直接 调节，而不是通过c d c 2 5 的不同活性或者定位来控制。： c d c 2 5 的c 末端( 11 2 2 1 5 7 3 位残基) 区域包含催化区域和一个膜定位信号 【9 】【l o 】。c d c 2 5 的c 末端足以表现全部的生物活性，对于正常的生长和生存是必须 的1 2 】【9 】。虽然c d c 2 5 非催化的n 末端和来自其他生物的蛋白没有相似性，但是c 末 第一章文献综述 端和许多r a s g e f s 的催化区域同源。 c d c 2 5 同源物包括鼠科的c d c 2 5 m m ，果蝇s o s 和人类的r a s g r f i ( o m i m ) 和s o s l ( o m i m ) 】【1 2 】【1 3 】。在不同碳源条件- f c d c 2 5 参与调节细胞大小，并且 产生8 7 6 1 1 0 0 氨基酸残基片段能够提高野生型菌株的抗热击能力，减少对i r a l 厶菌株的热敏感性。 c d c 2 5 非催化的n 末端( 1 11 2 1 位氨基酸残基) 和其它的r a s g e f s 没有同源 性【1 3 1 。c d c 2 5 的n 末端的功能的发现源于下面的实验：在葡萄糖的刺激下，11 4 3 4 8 位的残基被磷酸化，c d c 2 5 和膜的结合能力降低，并且减少了和r a s 的接触机会 1 1 7 1 。这些磷酸化残基可能是p k a 的底物。这种磷酸化可能是负反馈调节环的一部 分，因为在酵母中p k a 的活性是由r a s 调节的。c d c 2 5 的l1 4 3 4 8 位残基缺失后， 会使c a m p 有一个较高的组成性水平，这可能是因为和r a s 的接触机会提高的缘故 【1 8 1 o c d c 2 5 的n 末端作为显性负突变在胞内抑制c d c 2 5 的功能可能是通过和胞内 c d c 2 5 相互作用来实现，所以干扰他的能力能够激活r a s ；除此之外，热击敏感 型c d c 2 5 的突变体c d c 2 5 h s 2 0 1 2 4 j 的激活突变是在于n 末端的第3 6 5 位残基。这 些数据表明，n 末端在调节c d c 2 5 和r a s 活性方面起到了重要的作用。 n 端的一个代表性区域是有6 0 个氨基酸长度的模块蛋白序y l j s h 3 ( 6 0 1 3 0 位氨基酸残基) 。s h 3 和s i c 原癌基因的一段序列相关，所以n q ( 故s r c 同源物3 e 1 9 】【2 0 1 ( t h es r ch o m o l o g y3d o m a i n ) ，在许多信号分子的调节区域都有这种序列。s h 3 区域的配基包含中心识别一致序列p x x p ( p 指脯氨酸x 为任意氨基酸) 1 2 1 1 。s h 3 是和腺苷环化酶结合，来增强r a s 对腺苷环化酶的激活【1 4 1 1 1 5 1 。s h 3 区域不参与 c d c 2 5 的膜定位【l o j ，与c d c 2 5 蛋白定位有关的残基是1 4 4 1 1 5 5 2 1 1 。 细胞内的c d c 2 5 含量会根据热击，氧化和乙醇压力等不同的压力条件而降 低，但是它的磷酸化水平和细胞定位并不会受到影响。和c d c 2 5 含量减少相比， 当消除c a m p 的反馈抑制调节时，细胞积累c a m p 的最大能力也减少。缺失c d c 2 5 会防止这种减少发生。在有正常反馈调节的野生型细胞里，c a m p 的水平更低， 在压力条件下，它的水平不但不降低反而提高。这表明，c d c 2 5 在感受和向下游 靶标传递压力信号中，它或者通过独立于c a m p 信号通路，或者通过胞内c a m p 含量的大的波动来实现它的调节作用1 2 3 。 c d c 2 5 是一种磷酸蛋白，在响应葡萄糖的数秒钟内，被依赖于c a m p 的蛋白 激酶超磷酸化【1 7 】。伴随着超磷酸化作用，c d c 2 5 倾向于定位于细胞质内，减少了 与质膜结合的r a s 的接触【1 7 1 ，降低了蛋白和膜，r a s g t p a s e s 的相互作用 1 7 o 这个 区域潜在磷酸化位点的突变会使细胞对葡萄糖的响应发生改变【26 i 。另外，当葡萄 糖被非发酵糖如乙醇代替时，c d c 2 5 的整体水平也会稍微降低1 5j 。当细胞处于如 第一章文献综述 热和乙醇击和氧化压力下，蛋白水平不依赖碳源也会降低2 3 1 。 1 3 2 酵母的小g 蛋白r a s 酿酒酵母中存在两个删s 基因，分别为r a s 和r a s 2 。它们是在与哺乳动物 r a s 基因制作的探针杂交中被确认的，它们编码的蛋白与哺乳动物的r a s 蛋白具 有高度同源性。酵母的r a s l 和r a s 2 蛋白也是高度同源的，它们起始的1 8 0 个氨 基酸残基中大约8 6 都是相同的。在此同源氨基酸序列之后，两类哺乳动物r a s 蛋白开始出现歧化，而几乎在同一位置，两个酵母r a s 蛋白也出现歧化 2 7 1 。对酵 母的这两个r a s 基因进行遗传学分析表明：单个见4 s ，或见4 & 基因都不是必需基 因。 基于r a s 突变株和c a m p 代谢突变株表型的相似性，人们认为酵母r a s 蛋白的 功能是激活腺苷酸环化酶1 2 8 1 。研究表明，酵母r a s 蛋白在响应胞外葡萄糖和胞内 酸化过程中介导激活腺苷酸环化酶【2 引。根据r a s 蛋白的g 蛋白特性以及大量的遗 传学和生物化学证据，人们确定：在酿酒酵母中r a s 蛋白替换经典的g 蛋白作为 腺苷环化酶的调控物1 3 0 】1 3 1 1 。 r a s 蛋白必须定位在膜上才能发挥适当的作用，然而所有的r a s 蛋白都是以 可溶蛋白的形式合成的，不含长的疏水性残基。酵母r a s 蛋白与g t p 形成复合 体而被活化，它激活靶蛋白的同时g t p 水解成g d p ，由活化状态变成失活状态。 r a s 蛋白释放g d p 结合g t p 会重新启动这一循环。所有r a s 蛋白都特异性地结 合g t p 或g d p ，结合的亲和力也基本相同。它们具有很缓慢的g t p 水解活性。 g t p 酶活性、鸟苷酸结合位点以及效应物的作用位点都位于r a s 蛋白高度保守 的n 端区。 酵母细胞中r a s l 和r a s 2 蛋白分别具有不同的作用【2 7 j 1 32 | 。缺失两个剧s 基因 中的任何一个对生长在丰富培养基上的酵母菌株都没有明显影响，然而两个基因 同时缺失却是致死 拘1 3 2 1 ，这表明r a s l 和r a s 2 两个蛋白在功能上是可以互换的。 如果这些菌株在非发酵碳源上生长，情况就完全不同：r a s l r a s 2 菌株生长正常， 而r a s l r a 5 2 菌株则不能生长【3 3 】【3 4 】【3 5 1 。有分析认为，在此生长条件下对两个r a s 基因的不同需求是基因表达调控差异的结果，而不是基因编码的蛋白具有不同的 作用。另一方面，某些实验证据指出，r a s 蛋白除具有激活腺苷环化酶的功能外， 在酵母细胞中可能还具有其它的作用。 1 3 3r a s 蛋白的g t p 酶激活蛋白i r a l 和i r a 2 1 9 8 7 年，t r a h e y 和m c c o r m i c k 在哺乳动物细胞中首次发现t g t p 酶激活蛋白 ( g t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n ，g a p ) ，它能促进r a s 蛋白上的g t p 发生水解。1 9 8 9 第一章文献综述 年，t a n a k a 等人克隆到野生型i r a l 基因【3 酬，破坏1 r a l 基因使细胞对氮源饥饿和 热休克敏感，并且其二倍体纯合子不能产孢。破坏上黝j 基因能抑常l j c d c 2 5 突变引 起的致死性，但不能抑制r a s l r a s 2 以及c y r l 突变引起的致死性。基于这些结果， t a n a k a 等人【3 6 1 得出结论：i r a l 作用于r a s c a m p 通路中r a s 蛋白的上游，可能对 c d c 2 5 蛋白有拮抗作用。i r a 2 基因是作为i r a l 突变株热休克敏感表型的多拷贝抑 制因子被发现的。破坏1 r a 2 会产生与破坏删，相同的表型，同时破坏两个i r a 基因会引起更加严重的后果。目前认为i r a l 和i r a 2 蛋白在功能上是重合的，协同 负调控r a s c a m p 通路的活性。 i r a l 和1 r a 2 基因编码的蛋白分别由2 9 3 8 和3 0 7 9 个氨基酸组成，两者的氨 基酸序列间具有4 5 的同源性。有人提出，酿酒酵母中i r a 基因产物可能通过 激活r a s 蛋白的g t p 酶活性来负调控r a s 蛋白活性，这一假说得到大量证据的 支持。在i r a 突变株中，过量表达的r a s i 和r a s 2 蛋白以结合g t p 的形式积累， 而在野生型菌株中，这两种蛋白主要是以结合g d p 的形式积累。i r a 2 在胞外直 接表现出r a s 蛋白的g a p 活性。 m i t t s 等人 37 】提出，i r a l 可能与将腺苷环化酶锚定于膜上有关。首先，i r a l 基因破坏的突变株具有非常缓慢的膜结合腺苷环化酶活性；其次，来自这些突变 株的质膜在胞外不能结合腺苷环化酶；第三，i r a l 的抗体抑制腺苷环化酶与膜的 结合；最后，i r a i 和腺苷环化酶在s e p h a r o s e4 b 中发生共迁移。这些结果说明， i r a l 蛋白不但能激活r a s g t p 酶活性，而且它对腺苷环化酶具有直接的调控作用。 1 3 4 腺苷环化酶c d c 3 5 c y r l 和腺苷酸环化酶相关蛋白c a p s r v 酿酒酵母细胞膜提取物中含有c d c 3 5 c y r l 编码的g t p 激活的腺苷环化酶。 除g t p 之外，：在m 9 2 + - a t p 存在的条件下，其非水解类似物g p p ( n h ) p 也能刺激腺 苷环化酶。通过互补c d c 3 5 和c y r l 突变，克隆到编码腺苷环化酶的基因 c d c 3 5 c y r l 。 w i g l e r 实验室的研究首次揭示了酵母的腺苷酸环化酶活性受r a s 蛋白调控， 他们证明t r a s l r a s 2 b c y l 菌株的膜缺乏g t p 酶激活的腺苷环化酶活性，而该酶活 性在野生型菌株的细胞膜中却存在。显性剐盟删9 突变株的膜在不力i i g t p 的情况 下提高t m 9 2 + - a t p 依赖的腺苷环化酶活性水平。将r a s l r a s 2 b c y l 菌株的膜与腺苷 环化酶缺陷菌株的膜混合，又重新具有了g t p 依赖的腺苷环化酶活性【7 】：在效应 物作用区发生氨基酸替换的r a s 突变株，在酵母细胞中表达不能激活腺苷环化酶， 这一结果使腺苷环化酶在酿酒酵母中作为r a s 蛋白效应物的假说得到进一步支 持。 据文献报道，r a s 蛋白与腺苷环化酶之间不会发生直接作用，r a s 蛋白激活腺 第一章文献综述 苷环化酶需要一个中间物，该中间物才可能是r a s 蛋白的真正效应物。中间物之 一是一个分子量为7 0 k d a 的蛋白，它作为酵母腺苷环化酶复合体的一个亚基被纯 化，并被命名为环化酶相关蛋白p 引( c y c l a s e a s s o c i a t e dp r o t e i n ，c a p ) 。1 9 9 0 年 w i g l e r 实验室克隆n e a p 基因，并发现与。s 卯d 3 9 j 和s r v 2 基因相同，后者是作为 r a s 2 v a 拶菌株的热休克敏感性表型的抑制物被发现的。另有证据表明，r a s 蛋白 激活腺苷环化酶需要c a p 的作用1 3 引。因此，遗传学和生物化学证据认为，c a p s r v 2 与腺苷环化酶相关，完整的r a s 响应需要c a p s r v 2 的存在。 c a p s r v 2 是一个多功能蛋白。其n 端的第三个氨基酸结合到腺苷环化酶上， 这可能涉及到胞内r a s 蛋白对腺苷环化酶的激活。c a p s r v 2 蛋白的c 端部分可能 对正常的细胞形态以及对营养缺乏和营养过量的响应方面是需要的【3 引。酵母c a p 蛋白在其功能不同的n 端与c 端区之间具有脯氨酸丰富区，此脯氨酸丰富区在共 定位c a p 蛋白与f 肌动蛋白或含肌动蛋白的皮质层结构方面发挥作用。 1 3 5c 创汩磷酸二酯酶p d el 和p d e 2 酿酒酵母细胞包含两类c a m p 磷酸二酯酶，分别为低亲和力( k m = 2 0 2 5 0 9 m ) 的磷酸二酯酶p d e l 和高亲和力的( k m = 1 7 0 n m ) 磷酸二酯酶p d e 2 。编 码p d e l 和p d e 2 的基因分别为p d e l 和p d e 2 ，二者都是作为r a s 2 t m 拶热休克敏感 表型的抑制物被克隆到的 4 0 1 4 。 在c a m p 磷酸二酯酶的作用下，胞内c a m p 会发生分解。遗传学及酶学分析 表明，p d e l 和p d e 2 一起编码酿酒酵母细胞抽提物中可检测到的所有c a m p 磷酸 二酯酶活性5 2 1 。基因破坏实验表明，p d e l 和p d e 2 二者均为非必需基因1 4 0 州】。 双缺失尸d e 基因仍可得到可生长的细胞，只是具有严重的表型缺陷，胞内c a m p 浓度较缺失前高二到三倍，其表型n r a s 2 v a 拶突变株类似【4 0 1 。另外，p d e 功能的 丧失会拯救r a s l r a s 2 双缺失突变株的致死性【4 0 】【4 。 以前高亲和力的c a m p 磷酸二酯酶p d e 2 比低亲和力的p d e l 具有更加突出的 作用。迄今为止，人们通过对r a s c a m p 通路的分析认为，该通路调控的所有表 型特征，p d e 2 的缺失总是具有强烈的影响，而p d e l 缺失的影响n d , 得多。破 坏p d e 2 基因虽然只稍稍增加胞内c a m p 浓度，贮糖积累也较少，但能恢复 r a s l r a s 2 菌株在非发酵碳源上的生长，甚至能使r a s l r a s 2 菌株在极限培养基上生 长，只是生长的很缓倒4 0 1 。另一方面，单破坏p d e l 基因却观察不到上面提及的 p d e 2 基因破坏时的种种表型一。 1 3 6g 蛋白偶联的受体体系g p c r ( g p r l 一g p a 2 ) 酿酒酵母表达两个哺乳动物g a 蛋白同系物，g p a l 和g p a 2 。有关g p a l 蛋白 第一章文献综述 功能的广泛研究认为，该蛋白在单倍体细胞中涉及交配信息素介导的信号转导， 对g p a 2 功能的研究未发现其在葡萄糖诱导的c a m p 信号中发挥作用，尽管这一蛋 白( g p a 2 ) 的过量表达抑带l j r a s 2 捃突变表型，并且在野生型细胞中加入葡萄糖之 后导致更高更持久的c a m p 信号。有报道称，g p a 2 基因产物以c a m p 依赖的机制 调控酵母假菌丝生长1 3 9 】。后来的研究结果表明，g p a 2 编码的g a 蛋白是葡萄糖诱 导的c a m p 合成激活通路的必要元件。 葡萄糖激活c a m p 的合成需要g 蛋白偶联受体体系( g p r o t e i nc o u p l e d r e c e p t o rs y s t e m ，g p c r ) 的作用【4 2 1 。葡萄糖诱导的胞i 为c a m p 信号完全依赖g p a 2 蛋白的存在，并且缺失g p a 2 蛋白也会影响许多c a m p p k a 通路的靶标，这与 c a m p 水平下降和p k a 活性减弱对c a m p p k a 通路靶标的影响结果相一致。有关 g p a 2 对假菌丝生长影响的研究进一步提供了g p a 2 调控c a m p 水平的证据1 4 2 l 。 应用酵母双杂交体系和g p a 2 作诱饵分离到与g p c r 结构和功能上同源的七次跨 膜蛋i 刍g p r l 的c 端部分【4 3 】【4 4 儿45 i 。观察g p r l 和g p a 2 双缺失突变株的生长特性并 确定在此双缺失突变株中p k a 调控特征，所得结果与在调控c a m p 合成过程中 g p r l 作为g p a 2 的激活物的作用结果相一致。通过实验可以证实缺失g p r l 会消 除葡萄糖诱导的c a m p 信号1 55 | 。然而，g p r l 和g p a 2 缺失对p l 靶标的影响只限 定在葡萄糖上生长的转换时期，在二次生长期p k a 调控的特性不受影响1 5 5 。这一 重要结果对确定在葡萄糖上生长的细胞和在不含葡萄糖的培养基上生长的细胞 之间在p k a 调控特征方面存在的差别具有重要的意义。 根据g p r l 和g p a 2 缺失突变株所得结果表明，g p r l 蛋白和g p a 2 蛋白组成了 g p c r 体系并在响应葡萄糖的过程中激活腺苷环化酶，起到了葡萄糖感应器的作 用【4 2 】。19 9 9 年，k r a a k m a n 等人【4 3 证明了葡萄糖激活c a m p 通路需要g 蛋白偶联 受体g p r l 的作用。他们认为葡萄糖诱导的c a m p 信号依赖于g 一蛋1 白g p a 2 ，葡萄 糖刺激c a m p 的合成需要g 蛋白偶联受体g p r l 和g p a 2 的作用，并证实胞外感应 葡萄糖过程需要g p r l 的参与。2 0 0 0 年，r o l l a n d 等人进一步证明葡萄糖诱导的 c a m p 信号需要g 蛋白偶联受体g p r l 的作用，葡萄糖激活c a m p 的合成需要g 蛋 白偶联受体体系g p r l g p a 2 与糖的吸收和磷酸化，并认为激活葡萄糖诱导的 c a m p 合成的两个必要需求，即胞外葡萄糖检测和胞内葡萄糖感应。胞外葡萄糖 检测过程依赖于g 蛋白偶联受体g p r l ，胞内葡萄糖感应过程需要己糖激酶( h x k ) 的作用。 1 3 7r a s c d 山心通路的主要靶标是蛋白激酶a ( p k a ) 蛋白激酶a ( p k a ) 是r a s c a m p 通路的主要靶标。同其它真核生物c a m p 依赖的蛋白激酶一样，酵母p k a 也是由两个催化亚基和两个调控亚基组成的四 第一章文献综述 聚体蛋白。其两个催化亚基由基因t p k l 、t p k 2 和t p k 3 编码，二聚体调控亚基 由b c y l 基因编码。当c a m p 与p k a 的调控亚基结合时，催化亚基会从调控亚 基上解离下来激活下游靶蛋白。p k a 主要通过调控锌指蛋白转录因子m s n 2 4 和 蛋白激酶r i m l 5 来调控下游靶基因。 酵母细胞的调节亚基b c y l 可以认为是由三个区域组成，包括含有1 6 0 个氨 基酸的c 末端区域，该区域与二聚化和磷酸化有关系。另外两个区域有内部基 因重复的特点。b c y l 的n 末端区域和r i ，r i i 同源，1 4 5 位丝氨酸有催化亚基 的磷酸化位点。这个丝氨酸残基能被p k a 全酶磷酸化。b c y l 的1 9 4 到2 9 5 的氨 基酸残基和3 0 2 到4 1 2 的氨基酸残基产物3 5 一样。尽管酵母和牛的调节亚基很 相似( 有4 0 的积累相似性) ，但它们在n 端有很大的结构差异。b c y l 蛋白n 端比牛的至少多4 7 个氨基酸。 b c y l 基因突变菌株对热击和氮源饥饿敏感，在除了葡萄糖之外的其他碳源 如棉子糖，半乳糖，甘油，丙酮酸盐和乙酸盐上均不能生长。b c y l 基因缺失的 二倍体纯合子不能产孢。b c y l 基因的突变体表现出组成性高的p k a 活性，不会 积累保存碳水化合物，对压力敏感，在静止期有很低的存活能力。 在氮源饥饿时，二倍体的酿酒酵母细胞，分化为纤维化生长形式，叫做假性 分化。纤维化生长是受信息素有丝分裂原激活蛋白激酶级联反应和r a s c a m p 信 号途径组分调节的。p a n j 等人研究表明g p r l g p a 2 c a m p 信号途径是通过p k a 来调节假性分化的。b c y l 调节亚基突变而激活的p k a 能增强纤维化生长。突变 或者过量表达p k a 催化亚基表明，t p k 2 能激活假性生长，而t p k l 和t p k 3 催化亚 基抑制纤维化生长。 缺失b c y l 基因能够严重减少c a m p 的基础水平和随后的葡萄糖诱导的 c a m p 水平的的增加，臣p p k a 活性可以反馈抑带t j c a m p 的合成【4 7 1 。 酿酒酵母b c y l 的亚细胞定位是依赖碳源的【4 引。在葡萄糖上生长的细胞，b c y l 几乎只定位在细胞核内，而在碳源去抑制的细胞内，它在细胞质和核之间能更平 均的分配。b c y l 的n 末端的磷酸化指导b c y l 进入细胞质。生物化学分析表明细 胞质内的组分主要是磷酸化的b c yl ，而未修饰的b c y l 主要存在于细胞核内。 b c y l 的亚细胞定位还表明不同信号转导途径在p k a 处的整合，除了c a m p 激活p k a 外，其他途径可能通过磷酸化调节亚基来调节它的亚细胞定位。b c y l 修饰是依赖y a k l 激酶的，b c y l 的亚细胞定位是通过y a k l 磷酸化其n 端来调节 的。并且在乙醇上生长的y a k l 基因缺失细胞，b c y l 仍然在细胞核内。把n 端 附近c l u s t e r i 和c l u s t e ri i 的丝氨酸定点突变为丙氨酸，使乙醇上生长的细胞的 b c y l 在核里的积累增加。相反，用天冬氨酸来取代丝氨酸，使葡萄糖上生长的 细胞的b c y l 在细胞质内的明显增多。在指数生长期和静止期，b c y l 的n 末端 第一章文献综述 准确的确定其细胞定位。 砰k ，t p k 2 和t p k 3 基因编码的催化亚基蛋白有很大的同源性，t p k l 和 t p k 3 在氨基酸序列上有8 4 相同，和t p k 2 的相同率分别为6 7 和7 6 。用蛋 白芯片来测定它们和底物的反应表明，t p k l ，t p k 2 和t p k 3 分别能识别2 5 6 ，2 9 ， 和7 9 种底物，而它们共同识别的底物只有8 种，两个t p k 基因表达产物能共同 识别的有3 9 种，大部分( 8 7 7 ) 只被一个t p k 基因表达产物识别，这表明每 个t p k 基因表达产物有自己的特异性底物。三个砰k 基因的表达产物中的任何 一个都不是必需的，但其中至少一个对于生存是必需和足够的。 因为对饥饿的抗性，热击压力，在非葡萄糖碳源上的生长和对r a s l r a s 2 聒的表 型抑制而表现出的一些不同的底物特异性和或磷酸化活性在b c y l 缺失背景但 只有一个功能砰! 硅因的菌株里有很大不同【4 引。基因型为t p k l t p k 2 t p k 3 b c y l 菌株 和基因型为t p k l t p k 2 t p k 3 b c y l 或者t p k l t p k 2 t p k 3 b c y l 相反，它对氮源饥饿有抗性， 能在半乳糖和非发酵碳源上生长【5 0 1 ，并通过磷酸化转录因子a d r l i s j 不受去阻遏 的乙醇脱氢酶的影响。有报导称基因型为t p k l t p k 2 t p k 3 b c y l ，菌株里海藻糖酶活 性降低很多，加入葡萄糖后对c a m p 合成的反馈抑制也有很大降低【52 | 。这些差异 表明t p k 3 基因表达产物有独特的底物特异性或者一个较低的磷酸化活性程度。 在快速生长的细胞内，t p k l 主要定位在细胞核内。，c a m p 激活细胞核p j 认 使t p k l 快速进入细胞质内，调节亚基仍然在细胞核内。和快速增殖的细胞相反， 当细胞生长在非发酵碳源上时或者处于静止期的细胞，t p k l 分布在细胞核和细 胞质内。这些结果表明至少存在两个不同的机理决定p k a 的亚细胞定位：c a m p 控制着t p k l 的定位，而碳源决定着b c y l 的定位。 c a m e r o n l 5 0 表n f j t p k l 和t p k 2 参与异柠檬酸裂合酶的短期和长期失活过程。 只有t p k 3 作为唯一功能弘k 的菌株里面，用葡萄糖培养的4 小时并未观察到失 活现象。 t p k 2 基因编码的p k a 表明它是对于纤维化生长是必须的，尽管纤维化形成 是被t p k 3 和t p k l 抑制1 5 l 】【5 2 】。近来，s nl 蛋白表明和酿酒酵母的t p k 2 蛋白相互 作用，处于t p k 2 的下游，调节编码和假性状态形成相关的细胞表面组分 f l o l l 5 1 】；除此之外，p k a 是通过转录因子f l o l 8 蛋白1 5 4 j 【5 5 】激活f l o l l 。 s o n n e b