（生物物理学专业论文）大豆肽的制备、分离及特性研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 摘要 大豆肽是大豆蛋白质经过控制性的水解、精制以后得到的一类活性肽。本试验研究 了采用a l c a l a s e 碱性蛋白酶和f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽 的水解工艺、分离方法和产品特性。分析了预处理、温度、p h 值、底物浓度、酶与底物 比和时间对酶水解的影响，通过均匀设计和统计分析建立了酶水解的数学模型。并以此 模型得到了酶水解大豆分离蛋白的最佳水解工艺：单酶水解的工艺参数为：温度6 0 。c 、 p h 8 0 、底物浓度8 3 8 、酶与底物比为4 5 、水解时间2 h 。双酶水解的工艺参数为： 温度5 5 0 c 、p h 7 5 、底物浓度为8 3 8 、a l c a l a s e 碱性蛋白酶与底物比为4 5 ， f l a v o u r z y m e 酶与底物比为5 ，水解时间4 h 。双酶水解所得混合肽分子量较小，口感 较好。按此工艺水解，得到了最佳的水解效果，制备了大量混合肽。 对所得到的单酶水解混合肽和双酶水解混合肽采用柱层析和超滤的分离方法进行 分离，得到1 1 种不同分子量的肽产品。并分别检测了他们的部分生理活性，其抗氧化 净 生以层析组分4 的最强；层析组分6 次之；层析组分8 和层析组分9 活性较高；值得 注意的是双酶水解混合肽抗氧化能力也较强，未经分离而能有如此之高的活性，极具应 用价值。 通过对部分大豆肽样品的理化性质的检测表明：大豆肽溶解度、热稳定性扣粘度特 性均优于大豆蛋白。 研究了以真空冷冻干燥、喷雾干燥和流化床干燥方法处理不同组分肽样品的最佳工 艺，得到了应用领域不同的肽产品。真空冷冻干燥对产品性质影响最小，用于制备分析 的样品；喷雾干燥可获得较为丰富的精细的大豆肽粉末状产品，适用于保健品和精细化 工；流化干燥处理效率最高，但需引入淀粉，适宜应用在食品当中。 关键词：大豆分离蛋白酶大豆肽 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 a b s t r a c t t h es o y b e a np e p t i d e sa r eag r o u po fa c t i v ep e p t i d e sg o t t e nf r o ms o y b e a np r o t e i n sb y c o n t r o l l e dh y d r o l y s i sa n dr e f i n e m e n t t h ep r e p a r a t i o nt e c h n i q u e so fs o y b e a n p e p f i d e st h r o u g h h y d r o l y z i n gs o y b e a ni s o l a t e dp r o t e i n sb ya l c a l a s ea n df l a v o u r z y m ea n dt h eq u a l i t y a n d a p p l i c a t i o n o fp r o d u c t i o n sw e r es t u d i e d t h r o u g hs t a t i s t i c sa n da n a l y z e s ，t h ee f f e c t so f p r e t r e a t m e n t s ，t e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t r a t u m ，p r o p o r t i o n s o f e n z y m e t o s u b s t r a t u ma n dt i m eo ne n z y m i ch y d r o l y s i sw e r es t u d i e d t h r o u g hu n i f o r md e s i g n sa n d s t a t i s t i c a la n a l y z e s ，am a t h e m a t i c a lm o d e lw a ss e tu pa sf o u o w ： b a s e do nt h i sm o d e l ，t h eo p t i m u mm o n o e n z y m eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s ：6 0 。( 3 ，p h 8 0 ， s u b s t r a t u mc o n c e n t r a t i o n8 3 8 ，p r o p o r t i o no fa l c a l a s et os u b s t r a t u m4 5 ，p r o p o r t i o no f e n z y m e t os u b s t r a t u m 4 5 h y d r o l y s i st i m e2 h ；t h eo p t i m u md i e n z y m eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s ： 5 5 。( 3 ，p h 7 5 ，s u b s u a t u mc o n c e n t r a t i o no fd i e n z y m eh y d r o l y s i s8 ，p r o p o r t i o no fa l c a l a s et o s u b s t r a t u m4 5 ，p r o p o r t i o no ff l a v o u r z y m et os u b s t r a t u m5 h y d r o l y s i st i m e4 h t h e m i x e d p e p t i d e so fd i e n z y m eh y d r o l y s i sh a dc o m p a r a t i v e l yl i t t l em o l e c u l a rw e i g h t sa n dt a s t e d w e l l a c c o r d i n g t ot h i st e c h n i q u e ，t h eb e s th y d r o l y s i se f f e c t sw e r e g o t t e na n d a l a r g en u m b e r o fm i x e d p e p t i d e sw e r ep r e p a r e d t h ed i e n z y m i ca n d m o n o e n z y m i cm i x e dp e p t i d e sw e r ei s o l a t e db ym o l e c u l a rs i e v e sa n d u l t r a f i l t r a t i o n s ，a n d 11k i n d so fp e p t i d e p r o d u c t sw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t sw e r e g o t t e n t h r o u g hm e a s u r i n g t h e p h y s i c a l a n dc h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r s ，i tw a s t e s t i f i e dt h a tt h el e v e l so ft h es o l u b l es t a b i l i t y ，t h e r m a ls t a b i l i t ya n d v i s c o s i t yw e r eh i g h e r t h a n t h o s eo fs o y b e a np r o t e i n sa n dh a dt h e p h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e so fr e s i s t i n go x i d a t i o na n d i m p r o v i n g f e r m e n t a t i o n t h eo p t i m u m t e c h n i q u e so fd e s i c c a t i o n sb yv a c u u l nf r e e z i n g ，s p r a y i n ga n df l u i db e d s w e r e r e s p e c t i v e l ys t u d i e d t og e td i f f e r e n t p e p t i d ep r o d u c t sa c c o r d i n gt od i f f e r e n ta p p l i e da r e a s t h ev a c u u m f r e e z i n gd e s i c c a t i o n sh a dt h el e a s te f f e c t so np r o d u c tc h a r a c t e r sa n dw e r ef i tf o r p r e p a r i n ga n a l y t i cs a m p l e s ；s p r a y i n gd e s i c c a t i o n sc a ng e tc o m p a r a t i v e l ya b u n d a n tf i n e d s o y b e a np e p t i d ep o w d e r sa n da p p l i e d t o h e a l t h yp r o t e c t i n gp r o d u c t sa n df i n ec h e m i c a l i n d u s t r y ；f l u i db e dd e s i c c a t i o n sh a dt h eh i g h e s te f f i c i e n c y ，b u tw h i c hn e e d e da m y l u ma n d w h o s e p r o d u c t sw e r ec o m p a r a t i v e l yr o u g h ，s ow h i c hw e r ef i tf o rf o o d p r o d u c t i o n s k e y w o r d s ：s o yp r o t e i ne n z y m e s s o yp e p t i d e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文足本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位征书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：乡蜀时务 签字日期：2 f ! 。年f ! ，月九r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 硒日弓 签字同期： 一，。 年月j 二同 学位论文作者毕业后去向 ，1 作单位： 通汛地址： 导师签名： 签字同期： 电话 邮编 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肤的制备、分离及特性研究 1 前言 1 1 生物活性肽概述 生物活性肽( b i o l o g i c a l a c t i v e p e p t i d e s ，b a p s ) 是具有氨基酸顺序的多肽， 通过体内消化释放，并在动物的肠道消化过程中，充当新陈代谢的潜在生理效应物。 人们研究发现，人类摄人的蛋白质经消化酶作用后，不是象以前认为的那样仅以 氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽( 如二三肽等) 的形式吸收。以游离氨基酸形式吸 收的比例很小，且肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多”1 。这表明肽的生物效价和 营养价值比游离氨基酸更高。自此，肽被吸收的观点引起人们的重视，及其生理功能 研究也变得活跃起来。 许多小分子肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质与能量，而且还具有防 病治病、调节人体生理机能的功能。这些功能是原蛋白质和其组成氨基酸所不具备的， 目前，生物活性肽引起食品学术界的广泛重视，而对蛋白质营养价值的评价也从蛋白 质的消化性、氨基酸组成及含量发展到蛋白质序列中某些特定小肽的生理保健功能上 来，实现了蛋白质生物化学、生理学与营养学的一大飞跃。1 9 8 6 年的诺贝尔生理学奖 颁给了第一位发现多肽生长因子的科学家，以表彰他为基础科学研究开辟了一个具有 广泛重要性的新领域“3 。 1 1 1 生物活性肽的性质及生理功能 无论是从结构还是从功能来说，生物活性肽都是自然界中存在种类最多，功能最 复杂的一类化合物，广泛的存在于细菌、真菌、植物和动物中。这些活性肽包括从简 单的二肽到复杂的线性、环形多肽，有的多肽其氨基酸残基还进一步被糖苷化、磷酸 化，以不同的形式参与生物体的生命活动。结构的多样性和复杂性正反映了活性肽在 细胞生理与调节代谢功能等方面的重要性，大量的研究证实了活性肽有促进免疫功能、 提高激素活性、抑制酶活、抗菌、抗病毒、降血脂、降血压等作用。表1 列出了目前 研发的几种主要的生物活性肽。 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 类吗啡肽 类吗啡拮抗肽 抑制胆固醇肽 促钙吸收肽 降血压肽 免疫调节肽 机体防御肽 高f 值寡肽 醒酒肽 人或患者的蛋白质营养 具镇痛( 静) 、调节人体情绪、呼吸脉搏、体温、消化系统及分泌作 用等 用于治疗因类吗啡肽活性亢进引起的各种疾病如休克等 降低血液胆固醇 保持钙质的可溶状态，利于钙质吸收 降低人体血压等 调节免疫机能 增强机体防御机能 利于保肝护肝 促进血液酒精代谢 随着对活性肽功能研究的不断深入，人们发现当人体缺乏某些调节人体生理机能 肽时会导致人体机能的失调，因此，在以营养为基础的食物能满足人体必需氨基酸的 需要后，适当补充某些活性肽则可提高体质、增强防病抗病的能力，从而改善人们的 生活质量。 1 1 2 生物活性肽的制备 人类获得活性肽的方法主要有三种：提取存在于生物体中的各类天然活性肽 ( 激素类、酶抑制剂等) ；分离消化过程中产生的或体外酶解蛋白质产生的肽； 通过化学法( 液相或固相) 、酶法或重组d n a 技术合成的肽。合成法虽可按人们的意 愿合成任意活性肽，但目前大都因成本高、副反应物多以及残留化合物等问题而受到 制约，其中，重组d n a 技术如果成功，将会有广阔前景，但其安全性还需要进行研究“1 。 目前生物活性肽的生产主要采用酶水解法。酶法水解可以在不降低营养价值的前 提下改善蛋白质的理化和功能性质，扩展在食品加工中的应用范围。而且酶解法生产 活性肽安全性极高、价格低廉、易于推广。有关酶法有限水解制得肽类的研究在近十 多年内受到广泛重视”1 。过去对利用贮藏蛋白如大豆、玉米、小麦等种子蛋白和动物 营养蛋白及乳蛋白水解制备生物活性肽一直未给予应有的注意，但是现在，人们逐渐 注意到在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这些 多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生物活性肽。较之酸水解和碱水解， 2 酶法水解蛋白质具有多种优点：蛋白质的酶水解是一种不完全、不彻底的水解，其产 物主要是肽而不是氨基酸；反应条件温和，反应时问短，效率高，不产生消旋作用， 也不破坏氨基酸；产品纯度高，产物易分离，成本低廉等”。 1 1 3 生物活性肽的研究现状和开发价值 活性肽是一类多功能因子，它涉及了一系列身体代谢和生理调节功能。自从生物 化学家用人工方法合成多肽4 0 多年以来，伴随着分子生物学、生物化学技术的飞速发 展，人们已发现数万种多肽。近年来在日本和中国已开始使用糖肽辅助治疗肿瘤，其 作用机理就是使淋巴系统活化。生物活性肽也已成为食品学界研究最为热门的课题之 一”】。日本以活性肽为功能因子开发出了低抗原食品、婴儿食品、流动食品、运动食 品、促钙吸收食品、降压食品、醒酒食品等一系列的产品“，取得了良好的社会效益 和经济效益。在我国，肥胖、心脑血管疾病等“富裕病”及由于人口老龄化而致的各 种“老年病”已成为严重的社会问题“，急需功能性保健食品进入市场。 用于食品的活性肽一般由蛋白质酶解制得，因原料蛋白、所用酶类及分离精制方 法的不同可得到不同的产品。除各种生物活性功能外，它们还具有较好的酸、热稳定 性和水溶性，以及粘度随浓度变化不明显等优点，因而易于作为功能添加剂用于各种 食品，故乐于被生产厂家和消费者所接受，极具市场前景。目前已从酪蛋白、乳清蛋 白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、卵白蛋白、丝蛋白、胶原蛋白、水产蛋白等的 酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。 我国有丰富的蛋白质资源，但目前我国对蛋白资源资源的利用率并不高，蛋白质 资源大部分还集中于用传统的技术进行生产加工，利用生物技术进行蛋白质资源的深加 工显得薄弱。以此为突破口，加强高新技术对蛋白质资源的研究开发，将会有广阔的社 会前景和良好的经济效益。 1 2 大豆肽概述 大豆功能性低聚肽是大豆蛋白质经酶水解作用后，再经过特殊处理而得到的低肽 混合物。它由大豆蛋白质水解后的许多种肽分子混合物所组成，产品中还含有少量的 游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆功能性低聚肽通常由3 6 个氨基酸组成，其 分子量分布趴低于1 0 0 0 的为主。主要分子量在3 0 0 7 0 0 的范围内“。与大豆蛋白相 比，大豆肽往往具有更良好的物理性质。 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肢的制备、分离及特性研究 1 2 1 大豆分离蛋白 大豆肽可由大豆分离蛋白酶解制得，大豆分离蛋白在所有的大豆蛋白制品中是纯 度最高的一种，其蛋白质含量在9 0 以上“”，营养价值极高，l k g 大豆蛋白所含蛋白 质相当于2 k g 牛肉或4 5 k g 猪肉。而且大豆蛋白几乎是完全蛋白质，富含氨基酸并平 衡良好“”“。最近人们越来越重视大豆分离蛋白的营养价值，将之用作蛋白质的强化 或者用以替换蛋白质食品的一部分，进而用大豆分离蛋白作为人造肉的主要原料。在 日本大豆分离蛋白的生产量急剧增长，年产量已达5 0 0 0 吨以上；美国等发达国家也特 别重视对大豆蛋白和植物蛋白的开发利用，将大豆蛋自用于强化食品、快餐食品及仿 生模拟食品等；香港也已立法，要求在成品粮小麦粉中必须加入大豆蛋白并标出添加 量“”。 我国大豆资源丰富，其价格相对较低，如能将大豆中蕴藏的营养充分利用，则可 大大提高人民的生活水平。但由于大豆蛋白质分子结构复杂，8 0 的蛋白质分子量在 1 0 万以上，大多数分子内部呈反行p h e l i x 非有序结构，分子结构高度压缩、折叠， 从而使得大豆蛋白质溶解性较差，消化率和生物效价远不及牛乳蛋白和鸡蛋蛋白等动 物蛋白质“”1 。而蛋白质的酶解是改善蛋白质特性的一种很好的方式，大豆蛋白经酶 解后，易于被人体消化吸收，因而可以说是大豆蛋白的最佳营养方式。同时其理化性 质也大幅改善，有利于在食品中进一步的加工利用。同时，大豆蛋白水解生成的多肽， 具有多种生物功能。所以近年来通过酶法水解大豆蛋白来生产大豆肽，改善消化吸收性 能，从而提高大豆蛋白的营养保健价值，并改进其加工特性已成为热点研究课题”3 。 在欧美等国大豆蛋白水解物的补剂、饮料已成为时尚8 ”，在我国大豆蛋白经蛋白酶水 解后产生的短肽的生产及其理化特性和营养功能也已逐步得到认识”“。 1 2 2 大豆肽研究现状 对于大豆肽的开发和研究，美国和日本处于世界领先地位。美国在7 0 年代初就 已研究出大豆肽。日本8 0 年代开展此方面的研究，目前日本的大豆肽开发已进入生产 阶段，而且据报道已克服了水解物产生苦昧和蛋白酶菌种选育的难点3 。不二制油公 司、雪印、森永等乳业公司均已成功地将大豆肽应用于食品工业领域。我国大豆肽的 研究虽起步较晚，但近年来发展较快。江南大学食品学院已在进行大豆蛋白肽的研究； 武汉食品工业学院也在蛋白酶的选择、酶解工艺参数、水解液的脱苦、脱盐、分离精 制等方面进行了研究。哈高科大豆食品有限责任公司已研制成功经济价值高于大豆 4 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 i 0 0 倍以上的大豆蛋白肽”1 。盛国华、赵新淮”“”利用蛋白水解酶制备大豆蛋白水解 物，并用于生产酸性饮料；郭凯”“等发明并申请了大豆肽氨基酸口服液及其制备方法 的专利；1 99 7 年张延坤”7 1 等报道了大豆肽在食品工业中的应用研究；同年李书国” 报道了大豆肽食品的开发。其生产大豆肽的酶有胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶。开发出的食品包括饮料、恢复营养食品、老年人保健食品、运动员食品、 新型发酵类食品。2 0 0 1 年易维学”报道了大豆低聚肽的功能性质及其应用，指出大豆 肽可用于制作酸奶、婴幼儿食品、运动员食品、老年食品及患者素质食品，是有效的 a c e 抑制剂、减肥食品配料等。同年张玲华等”报道了大豆肽的制备工艺研究，采用 的水解酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等等。 1 2 3 大豆肽制备 大豆肽的生产主要是将大豆蛋白质进行控制性的水解，再分离精制而成。对蛋白 质的水解一般有两种方法，即酸水解和酶水解。酸水解操作简单、成本较低，但是对 设备的材料要求高，并且在生产中不能按规定的水解程度进行水解，同时水解产物杂， 可能导致氨基酸受到一定程度上的破坏而降低产品的营养价值；酶是一种生物催化剂， 是一类能够改变生化反应速度的蛋白质。与酸水解相比，酶水解则是在比较温和的条 件下进行的，容易按一定的规则进行水解，能很好的保存氨基酸的营养价值。因此，在 2 0 世纪7 0 年代以后酶水解逐渐得到广泛的应用。 现今，大豆肽的生产主要采用酶水解的方法。从理论上讲，无论是动物蛋白酶、 微生物蛋白酶还是植物蛋白酶都可以用于水解大豆蛋白质生产大豆肽，在实际生产中 常用的有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、细菌蛋白 酶、霉菌蛋白酶等。 目前，在大豆肽的生产当中还存在着一些急待解决的问题，主要是水解过程的工 艺复杂、控制困难、苦味、不良风味及抗营养因子有待去除等，同时还需扩大生产规 模、提高生产效率、降低成本，从而扩大大豆肽的市场。 1 2 4 大豆肽理化性质 与大豆蛋白相比，大豆肽往往具有更良好的理化性质。例如：大豆蛋白的粘度随 浓度增加迅速升高，但低分子量的大豆肽即使在5 0 的高浓度下也仍然保持流动性。 大约1 0 浓度的大豆蛋白水溶液，一经加热就会凝固，而大豆肽就不会；在溶解性方 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 面，大豆蛋白在其等电点会形成沉淀，但大豆肽仍然会保持溶解状态”。不仅如此， 大豆肽还具有抑制蛋白质形成凝胶的能力。这些性质对大豆肽的开发利用是非常有利 的“。 1 2 5 大豆肽生理活性 研究人员发现从食物蛋白的酶水解产物中分离出的多种小肽具有调节植物神经系 统，活化细胞免疫功能，改善心血管功能和抗衰老等生理活性；近年来研究表明，大 豆肽也具有许多生理功能，如降低胆固醇、抑制血压升高、非过敏性、增强免疫功能 和抗自由基损伤( 延缓衰老) 等”。 1 2 5 1 大豆肽的易消化和易吸收性 用酶水解大豆蛋白质制得的大豆肽，其吸收性与蛋白质和氨基酸混合物相比，大 豆肽从胃向肠的移行速度明显加快，吸收率也高，显示其易消化和易吸收性。 大豆肽具有易消化吸收、能迅速给机体提供能量、促进脂质代谢和恢复体力等功 能，故它可用于制备运动员特殊用食品，其中包括体育运动员用的粉、片和颗粒状食 品，蛋白质强化食品和能量补饮品等。日本不二制油公司已用大豆肽制成强化运动饮 料，该饮料清爽可口，连续饮用明显增强运动员的体力和耐力，能使肌肉疲劳迅速消 除，并恢复体力。据统计，日本运动员用的大豆肽食品的年销售额已高达3 0 亿日元， 今后仍有上升趋势”。 1 2 5 2 大豆肽的降血压活性 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n g e n z y m e ，a c e ，e c 3 4 15 1 ) 在人体内通 过肾素一血管紧张素系统( 简称r s a ) 和激肽释放酶激肽系统( 简称k k s ) 参与血压的 调节，通过a c e 作用于血管紧张素i ，从其c 末端去掉h i s l e u 生成的血管紧张素， 作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效应。服用a c e 的抑制剂，则可减少血 管紧张素的生成，降低血压，从而达到治疗的目的。大豆肽能抑制a c e 活性，因而 可防止血管收缩，达到降血压作用。而大豆肽对正常血压没有降压作用，所以它对心 血管疾病有显著疗效，而对正常人体又无害处，安全可靠”“。 6 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 1 2 5 3 大豆肽的降血脂活性 国内外一些学者报道，大豆蛋白具有降低血浆低密度脂蛋白及提高高密度脂蛋白 的作用。在不同人群应用中，也证实了大豆蛋白对高脂蛋白血症等人群的血脂有降低 作用。日本报道大豆蛋白的胰蛋白酶分解产物有降低胆固醇的作用。国内外研究工作 充分证实了大豆蛋白特别是大豆肽在降低血脂方面的功能。 1 2 5 4 大豆肽的促进能量代谢和抗肥胖作用 齐藤等用大鼠研究，报告称大豆肽能增加掌管产生热的褐色脂肪组织的活性；小 松等给小儿肥胖患者食用大豆肽、可减少皮下脂肪和增加饮食诱导产热，并与基础代 谢的提高有联系。石原等用小鼠游泳运动负荷试验发现，给予大豆肽可减少小鼠腹腔 内脂肪。e l 本小松龙夫等给患肥胖症儿童低能量饮食，并以大豆肽作为补充食品，发 现比单用低能量饮食的儿童皮下脂肪减少速度快。大麦多肽却未曾发现抑制机体脂肪 的蓄积作用，显示大豆肽抗肥胖功效的有效性”。 1 2 5 5 大豆肽的恢复疲劳效果 新市等进行小鼠运动负荷试验，给予大豆肽组比对照组恢复疲劳快，报告中还提 出疲劳恢复效果具有大豆肽的浓度依赖性，并确认在相同组成的氨基酸混合物中未见 此现象。新浦等人以摇动器和旋转取数器测定小鼠服用大豆肽和混合氨基酸后恢复疲 劳的效果，发现服用大豆肽的各组恢复疲劳的效果均高于服用混合氨基酸各组”。 1 2 5 6 大豆肽的增强肌肉作用 村松等在大学柔道部以大学生为对象进行研究，在训练后适时摄取大豆肽有增加 最大无氧能量的倾向，与肌肉增强有联系。三浦等人在举重运动员中进行的试验也证 明了服用8 的大豆肽的运动员其最大肌力( 举重、深蹲、卧推、硬举等合力) 比对 照组明显增大”。 1 2 5 7 大豆肽的抗过敏性 一般将有过敏原性蛋白质水解，使之低分子化，可降低蛋白质的过敏性，大豆肽 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 与大豆蛋白质相比其抗原性也可降低至约1 1 0 0 1 1 0 0 0 。岩岐等在大豆过敏患者 为对象的临床试验中已确认大豆肽的有效性。 1 2 5 8 大豆肽的降胆固醇作用 大豆肽能与机体中的胆酸结合，具有降低人体血清胆固醇功能。人每日食用3 0 4 0 9 大豆肽，其胆固醇和甘油三脂水平均明显降低。给大鼠分别饲喂大豆蛋白和大豆 肽试验结果表明，其血清胆固醇浓度( m g d 1 ) 和肝脏内胆固醇含量( m g g ) 是：大 豆蛋白组分别为3 4 0 2 0 和6 9 5 2 7 而大豆肽组则分别为9 9 4 士6 6 和7 7 0 0 9 7 ， 这表明大豆肽能明显降低血清和肝脏中胆固醇的浓度。同时还发现，饲喂大豆肽的动 物粪便中胆固醇含量明显高于大豆蛋白组，从而推知大豆肽能降低胆固醇的再吸收， 并能促使其排出体外”“。 1 2 5 9 大豆肽的抗氧化作用 研究表明，大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，这类活性肽能抑制机 体内自由基的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效。从而能在一定程度上消 除机体内多种生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生”“7 “。 1 2 6 大豆肽的营养功能 功能性食品应该是具有合理营养和保健功能的营养健康食品。大豆蛋白是营养价 值很高的植物蛋白，也是目前唯一能取代动物蛋白的植物蛋白。它的酶水解产物由多 种多肽分子构成，富含人体必需氨基酸，氨基酸组成几乎和动物蛋白相同1 ，故具有 较高的营养价值。 1 2 7 大豆肽开发价值和应用前景 自从生物化学家用人工方法合成多肽4 0 多年以来，多肽的研究取得了划时代的进 展。今后相当一段时间，人类对多肽的研究将出现一个辉煌时期，可以说2 1 世纪是一 个多肽的世界，多肽在改善和调整人们的生活方式方面将发挥极大的作用。近年来， 替代医学、天然药物、自然疗法已开始被西方社会认识，1 9 9 9 年美国f d a 开始允许大 豆蛋白制品标注可以预防心血管疾病的功能，这就意味着健康与保健品将被人类社会 8 吉林农业大学硒士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 重新认识；预防医学家告诉我们，投资健康将有至少6 倍的收获，把一切疾病控制在 萌芽状态是健康行业的重任，而肽类生化保健品的商业化开发将是这个行业的最精彩 篇章。 大豆肽不仅具有良好的营养特性，能提供极易吸收的肽类化合物，而且具有极佳 的生理功能和加工特性，是一种非常有前途的功能性食品原料。开发大豆蛋白系列产 品，对于充分利用我国的现有食品资源，改善我国人民的膳食结构有着重要的意义。 1 3 本试验研究意义 中国素有“大豆王国”之称，年产量约为1 6 4 0 万吨【3 ”，占世界总产量的9 ，居 第三位，吉林省更是全国著名的大豆主产区，大豆资源丰富。但因未能进行精深加工( 豆 粕等蕴藏着巨大经济价值的副产品大都作为饲料和肥料) 口9 ，使大豆生产的经济效益并 不显著。我国大豆种植的高产出低收益与美日等发达国家的高产出高收益甚至低产出 高收益形成了鲜明的对比。本试验旨在研究大豆肽的制备工艺、分离方法、产品特性 及其应用领域，从而加强高新技术在大豆深加工中的作用，提高大豆产品的附加值， 使大豆肽作为新一代质优价廉的超级蛋白营养素和多功能的生理活性物质，广泛的应 用于保健品和食品领域，为人们的健康和经济的发展贡献力量。 9 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肢的制备、分离及特性研究 2 试验材料和方法 2 1 试验材料 a l c a l a s e 碱性内切蛋白酶( 液态) 酶活力为2 9 9 5 6 u f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶( 固态) 酶活力为2 5 5 4 4 u 金龟2 2 0 0 大豆分离蛋白 考马斯亮兰g - 2 5 0 葡聚糖凝胶s e p h a d e xg - 2 5 、g - 5 0 胰岛素注射液 其它试剂 2 2 试验仪器 k f 一5 l 发酵罐 快速水分测定仪 7 2 2 分光光度计 s a r t o r i u s 电子天平 s h z 一8 8 水浴恒温振荡器 电热恒温水浴锅 恒温磁力搅拌器 k d n 一0 4 型蛋白质测定仪 h y p 一型消化炉 r e 一5 2 a 旋转蒸发器 b c r 2 0 0 1 旋转蒸发器 循环水式多用真空泵 w b f l 多功能流化床试验机 1 0 丹麦n o v o 公司生产 丹麦n o v o 公司生产 吉林不二蛋白有限公司 f l u k a 进口分装 p h a r m a c i a 进口分装 中国江苏万邦生化医药股份有限公司 均为国产分析纯试剂 韩国k o b i o t e c hc o ，l t d 上海精科天平厂 山东高密彩虹分析仪器有限公司 德国赛多利斯股份公司 江苏省金坛市医疗仪器厂 北京国华医疗器械厂 金坛富华仪器有限公司 上海纤检仪器有限公司 上海纤检仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 上海贝凯生物化工设备有限公司 郑州长城科技有限公司 重庆英格制药机械有限公司 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离_ 艮特性研究 a g i l e n ti i 0 0 高效液相色谱仪 微型高速万能试样粉碎机 电子微量泵 h d2 i c a 核酸蛋白检测仪 o a 0 0 1 c 1 2 切向流膜包 p h s 一2 5 型酸度计 t d l 一5 型离心机 a l p h a 一1 4 真空冷冻干燥机 r z 一2 真空泵 2 3 大豆肽的酶水解 2 3 ，l 测定指标 2 3 ，1 1 酶活力的测定 福林* 酚法“” 2 3 1 ，2 水分含量的测定 常压烘干法“ 2 3 1 3 氮含量的测定 微量凯氏定氮法“2 1 2 3 1 4 水解度( d h ) 的测定 安捷伦科技有限公司 河北黄骅科学仪器厂 浙江新昌国康仪器厂 上海康华生化仪器制造厂 美国p a l l 公司 上海雷磁仪器厂 上海安亭科学仪器厂 c h r i s t 公司 c h r i s t 公司 p h s t a t 法“” 大豆蛋白水解度( d h ) 以水解断裂的肽键数目( h ) 占总肽键数目( h t o t ) 的百分 数来确定，即d h = h h t o t 1 0 0 。 当蛋白质的酶解在p h 7 0 以上的条件进行时，释放的氨基酸使溶液p h 值明显下降， 吉林农业大学硕士学位论文 大豆歇的制备、分离及特性研究 通过流加碱液使体系保持固定的p h 值，根据消耗的碱量计算水解度。 d h 计算方式如下： d h = b * n b * ( i d ) t ( i m p ) + ( i h t o t ) * 1 0 0 式中： b - - - 水解过程中所消耗的n a o h 溶液量( m 1 ) 每滴0 0 6 9 4 m i n b n a o h 溶液的当量浓度c 4 ) o l 为o c 一氨基解离度，d = 1 06 ( p h p k ) i + i 0 “( p h p k ) ， p k 为大豆蛋白质a 一氨基的p k 值 m p 底物蛋白质的总量 h t o t 每克蛋白质中肽键的克当量数( 取为8 3 8 ) 2 3 1 5 分子量分布的测定 s d s p a g e 不连续电泳”2 “。”6 6 ” 综合文献中的各方法，得出本试验所采用的方法，如下所示： 按表3 ，表4 ，表5 ，表6 配制阳极、阴极、胶缓冲液、一定浓度的丙稀酰胺储液 和样品缓冲液( 置4 气冰箱保存) 备用。 表2 电泳缓冲液 t a b l e2b u f f e mf o re l e c t r o p h o r e s i s 1 2 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 表4 样品溶解液 t a b l e4 s a m p l es o l u t i o n 固定液：5 0 甲醇4 5 4 m l 与冰乙酸4 6 m l 混匀。 染色剂：考马斯亮蓝r 2 5 00 2 5 9 加上述固定液定溶2 5 0 m l ，过滤后备用。 脱色液：冰乙酸7 5 m l ，甲醇5 0 m l ，加蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 。 以标准蛋白和胰岛素为分子量标准，绘制标准曲线。根据标准曲线方程求出样品 分子量。 2 3 2 酶解单元操作 按一定的底物浓度( 1 0 ) 准确称取大豆分离蛋白，加入适量蒸馏水，在7 0 一9 0 水浴搅拌预处理1 5 m i n ，然后加入反应器4 0 0 r m i n 搅拌至均质并冷却到酶解反应温度 ( 6 0 ) ，用4 m 的n a o h 和4 m 的h c l 调节酸碱度至酶的最适p h ( 8 0 ) ，依据所用酶的活 力，准确量取蛋白酶( 5 ) 加入水解反应器中，反应过程中及时滴加4 m 的n a 0 h 和4 m 的h c l ，使p h 稳定在酶的最适p h ，并使温度始终保持在酶解的最适温度。反应到预定 时间( 1 2 0 m i n ) ，即用4 m 的h c l 调节p h 至p h4 3 ，停止搅拌，移出反应器，迅速升温 到9 0 ，加热1 5 m i n ，钝化蛋白酶。记录水解过程中各时段消耗的碱液量d ，按照p h s t a t 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 法计算水解度d h 。 2 3 3 水解酶的选择 酶解反应的特点是反应条件温和，而且具有较高的底物及反应特异性，产物不产生 消旋作用，而且不发生副反应”】。大豆蛋白酶解技术我国尚处在起步阶段，与国外相比 还有很大的差距。在大豆蛋白酶解研究中多数选用动物蛋白酶，少量的为微生物蛋白 酶。植物蛋白酶中以木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶居多，其效率低，反应周期长，受外界 环境因素影响大，成本高，不适合工业化生产；动物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶等 酶解效果较好，但是价格太高，副反应多，同样也不适合工业化生产”。本试验对2 7 0 9 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、a l c a l a s e 碱性蛋白酶、f h v o u r z y m e 复合风味蛋白酶、 p r o t a m e x 复合蛋白酶对大豆蛋白的酶解效果进行探讨，试验中分别检测了五种酶的酶 活性，并以水解1 5 m i n 的水解度d h 值描述各酶对大豆蛋白的水解能力。从而选择一种 高效、安全、低成本的蛋白水解酶，确定合理、可靠的水解工艺条件。 2 3 4a l c a l a s e 碱性内切聋白酶单酶水解条件的初步确定 试验以温度、p h 值、底物浓度、酶与底物比及时间为因素，确定a l c a a s e 碱性 内切蛋白酶单酶水解条件。 2 3 4 1 最适温度的确定 根据文献，多数试验者认为a l c a l a s e 碱性内切蛋白酶的最适温度为6 0 。c 一5 5 。c “”“，本试验在5 5 、5 7 5 、6 0 。c 、6 2 5 条件下进行水解，其它同单元操作( 2 3 ，2 节) ，水解2 h 。以d h 为指标，确定a l c a l a s e 碱性内切蛋白酶单酶水解大豆蛋白的最 适温度。 2 3 4 2 最适p h 值的确定 对于a l c a l a s e 碱性蛋白酶的最适p h 值不同研究者的观点较统一，都认为是 p h 8 0 “1 ，本试验应用a l c a l a s e 碱性蛋白酶分别在p h 为6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 的条件下进行水解，其它同单元操作，水解1 2 0 m i n 。以d h 为指标，进一步确定a l c a l a s e 碱性内切蛋白酶单酶水解大豆蛋白的最适p h 值。 1 4 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 2 3 4 3 底物浓度的确定 根据文献“，大豆蛋白浓度以8 为宜，本试验在底物浓度为3 、6 、9 、1 2 的条件下进行水解，其它同单元操作，水解1 5 0 m i n 。以d h 为指标，确定a c a l a s e 碱 性内切蛋白酶单酶水解大豆蛋白的最佳底物浓度。 2 3 4 4 酶与底物比的确定 分别在酶与底物比为2 、3 、4 、5 、6 的条件下进行水解，其它同单元操作， 水解1 5 0 m i n 。以d h 为指标，确定最佳的酶与底物比。 2 ，3 4 5 水解时间的确定 分别测定水解5 m i n 、1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n 、4 5 m i n 、6 0 m i n 、75 m i n 、 9 0 m i n 、1 0 5 m i n 、1 2 0 m i n 、13 5 m i n 时的水解度，以d h 为指标，确定最佳的水解时间。 2 3 4 6 均匀试验设计优化单酶水解条件 在上述试验的基础上，利用均匀设计试验和回归分析，以d h 为指标，确定大豆肽 最优水解工艺参数。 根据文献”1 和单因素试验，确定温度6 0 。c ，p h 8 0 为a c a l a s e 碱性蛋白酶的最 适条件，在此条件下迸一步讨论底物浓度，酶与底物比和反应时间的最佳组合及三者之 间的关系。采用三因素十水平均匀设计，选择底物浓度为8 - 1 2 、酶用量为底物用量 的2 5 - 4 5 、时间为9 0 1 5 0m i n ，进行三因素十水平均匀试验设计。并用p h s t a r 法计算各试验水解度d h ，以之作为水解效果评价指标y 。 选择底物浓度( x 。) 、酶与底物比( 弛) 、水解时间( x ，) 作为影响目标函数水解 度( y ) 的决策变量，各因素的设计水平见表6 ，均匀设计可对各因素的处理直接设定， 不需量纲变换，因此本表也是试验方案。 吉林农业大学硕士学位论文 大豆肽的制备、分离及特性研究 表6a l c a l a s e 碱性蛋白酶单酶水解均匀试验设计 t a b l e6 e x p e r i m e n h a lp l a no f t h ea l c a l a s ea k a l i n ep r o t e a s e 2 3 5a l c a l a s e 碱性蛋白酶和f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶双酶水解条件的确定 a l c a l a s e 碱性蛋白酶对于大豆分离蛋白有很好的水解能力，但其产物苦味较重， 不利于后续加工利用。本试验采用f l a v o u r z y m e 进一步水解，以调整产品风味。 2 3 5 1 双酶水解p h 值的确定 f l