（化学工程专业论文）s11菌体酶工业培养条件的研究和优化.pdf

中文摘要 l 半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及 饲料工业。本课题组在前期工作中已从富含d l a t c ( d l 2 氨基2 噻唑啉- 4 羧 酸) 的环境中筛选到一株可转化d l - a t c 合成l 半胱氨酸的菌株s 1 1 ，并且已经利 用形态学特征、生理生化特征对11 号菌株进行了初步分类鉴定，结果表明该菌株 可能属于微球菌属能够利用d l - a t c 转化合成l 半胱氨酸的一个亚种。 本论文主要从产物的鉴别、菌株生长及产酶条件的优化等方面进行了研究， 研究结果如下： 建立l 半胱氨酸产物定性、定量检测方法( 纸层析法、d t n b 显色法) 和菌 株酶活力的检测方法( 酸式茚三酮法、结晶法) 。通过考察优化了菌株的培养条 件和产酶条件。 通过对菌株的培养发现，l l 号菌株生长最适碳源为葡萄糖，最适氮源为尿素， 并采用m i n i t a b 软件的p l a c k e t - b u r m a n 设计法和二次响应面分析法对种子培养基进 行优化，得到了主要影响因素及其最佳水平值：葡萄糖1 9 2 1 6g l ，尿素4 0 0 9 g l ，转速1 3 3 9 1 0r m i n ，在优化条件下经摇瓶培养实验表明细胞生长量比优化 前提高了1 6 9 。 通过对摇瓶培养产酶条件的研究发现，d l - a t c 对酶的产生具有诱导作用， 1 1 号菌株以葡萄糖为碳源，尿素为氮源时生长量和酶活力最高，产酶最适温度为 3 0 。c ，最佳初始p h 为7 5 。采用p l a c k e t - b u r m a n 设计法和二次响应面分析法对产酶 培养基进行优化，得到了主要影响因素及其最佳水平值：葡萄糖2 7 6 9 l ，d l a t c 7 2 7g l ，转速1 4 4r r a i n 。在优化条件下经摇瓶培养实验表明细胞酶活力比优化 前提高了7 8 。 关键词：l 半胱氨酸a t c 生长量酶活力 a b s t r a c t l c y s t e i n ei sa ne l e m e n t a r ys c o n t a i n i n ga m i n oa c i d , w h i c hh a sb e e nf o u n d u t i l i t ya sm e d i c i n e ，l a wm a t e r i a l sf o rm e d i c i n e ，f 0 0 da d d i t i v e ，a d d i t i v ef o rc o s m e t i c s a n df o d d e r i no u rl a b ，ag e r m1 1t h a tc a nc o n v e r td l a t ct ol - c y s t c i n ew a ss e l e c t e d f r o mt h es o i lc o n t a i n i n gh i g hc o n c e n t r a t i o nd l a t c a n a l y z e dt h ep h e n o t y p i c ， p h y s i o l o g i c a la n dm o r p h o l o g i c a li n f o r m a t i o nt oi d e n t i f yt h et a x o n o m ys t a t u so ft h e g e r miib yu s i n gp o l y p h a s i ct a x o n o m y ，t h eg e r m1ip r o b a b l yw a sas u b s p e c i e so f m i c r o c o c c u s ，w h i c hc a nu s ed l a t ca ss u b s t r a t et os y n t h e s i z el e y s t e i n e t h ei d e n t i f i c a t i o no fg e r m , v e r i f i c a t i o no fp r o d u c t s ，c o n d i t i o n so fg r o w t ha n d e n z y m ep r o d u c i n gw e r es t u d i e di nd e t a i l t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w t h eq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i n gm e t h o do fl c y s t e i n e ( t h ep a p e r d e v e l o p i n gc o l o rm e t h o da n dt h ed t n b ) a n de n z y m ea c t i v i t y a r ee s t a b l i s h e d c o n d i t i o n so fg r o w t ha n de n z y m ep r o d u c i n gw e r es t u d i e di nd e t a i l t h r o u g hi n v e s t i g a t i n go ft h eg r o w t hc o n d i t i o nw ef o u n dt h a tg l u c o s ei st h em o s t s u i t a b l ec a r b o ns o u r c eo fg r o w t ha n du r e ai sm o s to p t i m u mn i t r o g e ns o u r c e t w o l e v e lf a c t o r i a l sd e s i g n so fp l a c k e t b u r m a nw e r ec o n s t r u c t e dt os e l e c tc u l t u r em e d i u m c o m p o n e n t so f11 t h r e ei m p o r t a n tc o m p o n e n t s ，w h i c hw e r eg l u c o s e ，u r e aa n dr o t a t e s p e e dw e r es c r e e n e d t h eo p t i m i z e dl e v e lo f t h e s ef a c t o r sw a sd e t e r m i n e db yr e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s t h es h a k ef l a s kc u l t i v a t i o n ss h o w e dt h ec e l lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d 16 9 a to p t i m i z e dc o n d i t i o n w ea l s of o u n dt h r e ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so ft h ee n z y m a t i cp r o d u c t i o ns e e d , w h i c hw e r eg l u c o s e ，d l - a t ca n dr o t a t es p e e d t h es h a k ef l a s kc u l t i v a t i o n ss h o w e d t h a ta n dg n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e d7 8 a to p t i m i z e dc o n d i t i o n t h eo p t i m i z e d e n z y m ey i e l dc o n d i t i o n sw e r e ：i n i t i a lp h7 0 7 5 ，3 0 。c k e y w o r d s ：l c y s t e i n e ，a t c ，c e l lc o n c e n t r a t i o n , e n z y m ea c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：王吼罗签字日期：凹四年6 月f 矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 王吼多 签字日期：如。7 年6 月i 日 导师签名： 签字日期：夕和声厂月f 矿日 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1l 半胱氨酸的分子结构 l 一半胱氨酸阻- c y s t e i n e ) 是组成蛋白质的2 0 种氨基酸中的一种。属于脂肪族 氨基酸。在蛋白质中l 半胱氨酸常以其氧化型的l 一胱氨酸形式存在，由两个l 半胱氨酸侧链上一s h 基氧化成共价的二硫桥( d i s u l f i d eb r i d g e ) 连接而成。l 半胱氨 酸的化学名称为l 氨基b 蔬基丙酸晟早是于1 8 1 0 年从膀胱结石中以胱氩 酸的形式发现鸭其结构式与立体结构式见图l - 1 和图l 一2 。 0 n h i c t m l j 图】i l 一半胱氧酸结构式 图i - 2l 芈胱氨酸立体结构 f i gl - l t h es t t u c t u t e o f l - c y s l e i n f i gi - 2 t h e t h r e e _ d j m e n s i o n a ls b r u c t u t e o f l - c y s t e i n c 1 2l - 半胱氨酸的理化性质 h 】 名称 相对分子质量 分子式 颜色性状 呈昧性 溶解性 旋光度 稳定性 l 半胱氨酸 1 2 1 1 2 c 3 h t n 0 2 s 白色粉末状晶体 异臭味酸 易溶于水 fo ( h z o ) = 一i 【d ( s m 帆阳) + 6 j 在中性和碱性溶液中易披空气氧化为胱氨酸 第一章文献综述 等电点( p i ) 保存方式： 化学反应性： 5 0 2 l 半胱氨酸盐酸水合物( c 3 h 7 n 0 2 h c i h 2 0 ) 由于l 半胱氨酸侧链上的巯基( s h ) 极性很强，除具有所有氨基酸能够发生 的化学反应外，还有一些特殊的化学反应： ( 1 ) 与卤化烷如碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等迅速反应生成相应的稳定烷基 衍生物； ( 2 ) 巯基可以与各种金属离子形成稳定程度不等的络合物； ( 3 ) 可与二硫硝基苯甲酸( d t n b ) 或称e l l m a n 氏试剂发生硫醇一二硫化物 交换反应； ( 4 ) 两分子l 半胱氨酸自身氧化成一分子l 胱氨酸。 1 3l 半胱氨酸的应用 目前，l 半胱氨酸已在医药、食品、饲料、化妆品等行业广泛应用。根据构 型的不同，半胱氨酸有l 型、d 型和d l 型之分，而在体内具有生理活性的为l 型的半胱氨酸。l 半胱氨酸是组成蛋白质的成分之一，是一种伍氨基酸，它的存 在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个半胱氨酸残基间以二硫键 ( s s ) 连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构体。半胱氨酸是构成蛋白质的2 0 多种氨基酸中具有活性硫( 巯基) 的氨基酸。 1 3 1 在医药中的应用 在医药上【4 习，l 一半胱氨酸盐酸盐具有促使肝功能旺盛的作用，可用于治疗 放射性药物中毒、锑中毒、肝炎、血清病；n 乙酰半胱氨酸是粘液溶解性祛痰剂， 通过其分子中的s h 能将痰液中粘蛋白的s s 键断裂，粘度迅速下降，在几分钟 内，使痰液易于咳出或吸出，改善呼吸状况，适用于肺合并症的治疗及急慢性支 气管炎、支气管哮喘、支气管扩张、肺结核、肺炎、肺气肿等引起的痰液稠厚、 咳痰困难、气管阻塞等。此外，它的3 水溶液可治疗角膜炎。l - 半胱氨酸还具 有消炎、止痛、抑制细菌和癌细胞生长等作用。 近年来人们发现l 半胱氨酸在生物体内具有一些重要的生理功能。研究表 明，l 半胱氨酸及其复合体在人和动、植物体内是普遍存在的，它可以增强各组 织和细胞对外来有害物质的抵御能力，另外它还可以增加细胞和组织的活力p j 。 鉴于l 半胱氨酸及其复合体的功效，已引起人们对它的关注，近年来研究认为 2 第一章文献综述 l 半胱氨酸具有以下几种生理功能： 1 、在生物体内l 半胱氨酸对许多有害物质和毒素如甲醛、乙醛、乙醇、氯 仿、四氯化碳、铅、氯化汞、过氧化f 3 6 、河豚毒素等具有有效的解毒作用； 2 、用l 半胱氨酸可以有效地预防和改善放射性物质对机体的伤害； 3 、l 半胱氨酸在皮肤蛋白的角蛋白生成中具有维持巯基( s h ) 酶的活性， 并且可以补充巯基，维持皮肤的正常代谢。还可以用于治疗人的多种皮肤病( 如 通常的痤疮、麻疹、中毒疹、湿疹及肝斑等等) ，另外对农药导致的皮肤炎、农 药中毒及病毒性肝炎等也都具有一定的疗效； 4 、当炎症、过敏时，机体内胆碱酯酶等巯基酶的活性降低，补给l 半胱氨 酸可维持巯基酶的活性，改善炎症和过敏的皮肤症状； 5 、由于l 半胱氨酸具有软化和溶解角质的作用，所以对角质肥厚的皮肤病 也有效； 6 、l 半胱氨酸还具有防止生物体衰老的功能。 根据国内外文献报道【7 1 ，l 半胱氨酸衍生物在医药上也有着广泛的用途，如 作为镇咳、祛痰、消炎、退烧、止痛药物及抑制细菌和肿瘤的生长等等。因此， 引起国内外医药界极大的关注。近年来，在医药上应用比较多的衍生物有以下几 种： 1 、半胱氨酸甲酯盐酸盐l 半胱氨酸甲酯盐酸盐是一种疗效明显的镇咳、 祛痰药物； 2 、n 乙酰l 半胱氨酸【8 9 1n 乙酰l 半胱氨酸也是一种有效的祛痰剂， 此外3 n 乙酰一l 一半胱氨酸的水溶液可作眼药水( 国外称为“阿西丁”) 治疗角膜 炎，还可以在氨基酸大输液中作为稳定剂； 3 、n 巯乙酰l 半胱氨酸【1 0 1 据1 9 7 9 年日本专利报道，n 巯乙酰l 半胱氨 酸在体外能降低鸡蛋白和粘蛋白的粘度，因此也可以作为一种祛痰剂； 4 、n - d ( 6 一甲氧基2 萘) 丙酰】l 半胱氨酸 1 9 8 1 年欧洲专利报道，n - 【d - ( 6 一 甲氧基2 萘) 丙酰】l 半胱氨酸能抑制老鼠组织和器官的红肿及炎症等疾病。使用 剂量为5 0 毫克公斤体重时，抑制率达5 7 ； 5 、n 乙酰s 水杨酰l 半胱氨酸1 9 8 3 年欧洲专利报道，由阿斯匹林( 又称 乙酰水杨酸) 和n 乙酰l 半胱氨酸合成n 乙酰s 水杨酰l 半胱氨酸，既具有阿 斯匹林的退烧、消炎、止痛等作用，又具有n 乙酰l 半胱氨酸的祛痰作用，而 且这两种作用都有所增强； 6 、s 噻吩甲基( 或呋喃甲基) 硫代氨甲酰l 半胱氨酸该化合物由异硫氰酸 酯和l 半胱氨酸反应制得，1 9 7 4 年日本专利报道该化合物具有抗菌和抗癌的作 用： 第一章文献综述 7 、s 甲基- l 半胱氨酸s 甲基l 半胱氨酸可作为抗氧化剂抑制蛋白质和肽 的氧化【7 1 ，可作为一种必需氨基酸蛋氨酸的代用品，无毒，目前被应用于食品添 加剂、化妆品添加剂、医药等各个领域中； 其它的l 半胱氨酸衍生物如s o m 二甲氨乙基硫代氨甲酰) l 半胱氨酸( 具 有治疗白血球减少症和关节炎治疗的辅助药物) 、s 磷氯l 半胱氨酸( 用于皮脂 分泌过剩症的治疗) 、半胱氨酰肼盐酸盐( 可作为免疫抑制剂) 等，在医药和临床 治疗中都有所应用【7 j 。 1 3 2 在食品工业中的应用 在食品工业中，l 半胱氨酸可用作食品增香剂、发色剂、面包添加剂、油脂 抗氧化剂、保鲜剂。此外，它还可防止食品褐变即抑制褐色素形成。 ( 1 ) 食品增香剂与发色剂 l 半胱氨酸与六碳糖共热进行m a i l a r d 反应可产生牛肉、猪肉的肉香味，用作 调味剂；在玉米食品加工中加入少量l 半胱氨酸可使玉米香味增：0 n 1 0 - 4 0 倍。在 肉食加工中加入l 半胱氨酸其发色效果优于传统的亚硝酸盐，并可防止具有致癌 作用的二甲基亚硝胺( d m n a ) 的产生。猪肉香肠用l 半胱氨酸和氯化钙混合浸渍 处理后，发色效果优于亚硝酸盐 1 3 】。 ( 2 ) 面包添加剂 l 半胱氨酸的活性基团一巯基( s h ) 具有特殊的闭塞剂作用，可以使面团形 成立体网状结构。一般面团的成熟必须经过3 5 个小时的酵母发酵，才可使面粉 蛋白质中s s 基产生交换反应形成网状结构，还原剂和氧化剂都可以促进面筋 s s 基的交换反应，利用l 一半胱氨酸的还原作用，可以促进面团谷蛋白的形成及 促进发酵和出模，防止老化( 保鲜) 等【1 4 1 。目前，美国、日本等均已采用。 ( 3 ) 油脂抗氧剂和保鲜剂 1 5 , 1 6 用l 胱氨酸、l 半胱氨酸及l 缬氨酸与葡萄糖共加热得到褐色物质，具有供 氢性与还原能力，并且能与铝和锌等离子发生鳌合作用，从而封锁金属离子对油 脂氧化的触酶活性作用，有效地防止食品中油脂的氧化变质。例如，油脂中加入 0 0 5 胱氨酸在1 8 0 c 加热3 0 分钟后能防止油脂氧化。l 半胱氨酸的添加可以有效 地防止和降低食品的褐变，保持维生素c 不受破坏。在压榨果汁时添 f l l 半胱氨 酸，可防止维生素c 氧化、果胶沉淀，延长果汁的保存期；日本在奶粉中使用l 半胱氨酸，防止奶粉变质。 ( 4 ) 防止食品褐变 l 半胱氨酸可抑制褐色物的生成、变黑反应的中间体还原或者l 半胱氨酸钝 化褐变反应，以性质稳定的l 半胱氨酸作为添加剂可使产品的营养价值保持稳 4 第一章文献综述 定，可使食品的质量、味道、香味在短时间得到改善。另外l 半胱氨酸对含有硫 化物的洋葱、大蒜等也有增强风味的效剿1 7 1 。 1 3 3 在化妆品中的应用 最近，光医学、光生物学的研究表明：在表皮最下层的色素细胞可产生底层 黑色素造成黑色素沉着，使表皮出现黑斑。色素细胞中所含有的具巯基( s h ) 基 团的l 半胱氨酸，可调节黑色素的生成，基于l 半胱氨酸的巯基( s h ) 具有还原 能力和化学反应活性。所以，用l 半胱氨酸可以生产美白化妆品【1 3 】。 l 半胱氨酸盐酸盐、l 半胱氨酸酯盐酸盐、l 半胱氨酸酯有机酸盐等均可用 于外涂美白化妆品的生产，效果具佳。尤其是l 半胱氨酸酯二羧酸盐，其美白效 果几乎达到百分之百。目前含l 半胱氨酸的美白化妆品己引起人们的重视，着力 进行商业研究和开发。 烫发液的第一液以半胱氨酸为主要成分，起还原作用，切断人发中胱氨酸的 二硫键，使头发具有可塑性。经人工卷曲赋形、氧化后又恢复到毛发角蛋白原来 的胱氨酸二硫键结构，外形却形成了种种波浪状。以往使用的还原剂以巯基乙酸 为主，但有恶臭味，并损伤发质及操作者的手指。目前高级卷发液多数改用半胱 氨酸，其优点是臭味低不伤发质，卷曲后发质柔润，颇受欢迎【1 4 1 。 1 3 4 在饲料中的应用 1 8 , 1 9 】 在饲料添加剂方面，除了赖氨酸、谷氨酸与蛋氨酸以外，以l 广半胱氨酸的 用量为最大。但由于l 一胱氨酸的溶解度太小( 0 1l g m 1 ) ，所以需制备成l 半胱氨 酸才能添加到饲料中予以使用 1 2 , 1 3 。 综上所述，l 一半胱氨酸在改善机体的生理功能、医疗药物、食品和饮料工业、 化妆品行业、饲料添加剂行业具有广泛而实际的应用价值，l - 半胱氨酸的研究和 制取己经引起人们极大的兴趣和关注。 1 4l 半胱氨酸生产的国内外现状和技术发展趋势2 0 】 胱氨酸和半胱氨酸是人和动物不能自身合成的必需氨基酸之一，具有d 型 和l 型对映体。在人和动物体内可以吸收利用的是l 型。目前l 型半胱氨酸和 胱氨酸的主要生产方法有： 1 酸解法【2 1 】：是将含有l - 半胱氨酸和胱氨酸的天然物料( 人发、动物毛、羽 毛等) 进行酸分解，然后进行分离提纯。目前我国主要采用此法生产，但是该法 第一章文献综述 收率低，最高不过4 - - - 5 ，产品品质差，而且能耗高，成本贵，污染严重。且 由于人和动物疾病的发生，使其生产的l 半胱氨酸胱氨酸产品用于食品、医药 等领域的安全性很难保证。因此很多国家如欧盟国家，已立法于1 9 9 9 年7 月1 日起禁止使用生物毛发生产的l - 半胱氨酸。这样目前酸解法 2 2 。3 1 的市场正不断 萎缩，其工艺正在失去存在的价值。 2 化学合成法【3 2 j ： 目前有多种化学合成法生产d l 半胱氨酸，如德国的d c g u s s a 法，但这些方 法生产的产品都是d l 混旋体，必须经过拆分才能得到l 型产品。而光学异构体 拆分技术难度较大，因此目前很少使用。 3 酶法生产： 酶法生产l 半胱氨酸和胱氨酸是目前国际上研究的重点。各国相继开发了一 些将前体经茵酶转化制备l 胱氨酸和半胱氨酸的工艺，如k u m a g a i 等以1 3 氯l 丙氨酸为前体经( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) 菌产生的酶作用催化制备l 半胱氨酸。但 目前最具有经济价值的是i c s a n o 等人开发的以d l a t c 为前体，用假单胞菌体 直接酶法转化制备l 半胱氨酸法。该法收率高，可达9 0 左右，反应条件温和， 不需耐腐蚀设备，对环境的污染很小，试剂用量少生产费用低廉，可大规模连续 生产。目前日本和韩国都实现了工业化，其选用的假单胞菌是个多酶体，参与 l 半胱氨酸生产的酶有d a t c 消旋酶，l a t c 水解酶，羟氨水解酶和l 半胱氨 酸脱硫酶。前三种酶对生产是有利的，脱硫酶对生产是不利的。由于胱氨酸溶解 度很小，容易从反应液中分离，所以工业生产中一般直接将生成的l 半胱氨酸 氧化成胱氨酸。而胱氨酸经过还原又可以生成l 半胱氨酸。其具体反应过程如 下图。 i i i h 2 厂丁一 s 丫n , n i l 2 i c h 2 c c h o o h i s c o n h 2 卜酶 , n 8 2 i c h 2 c c h o o h i s h l - 卜c v s h 脱黧l - - c y s ；= = = = = = 图i - 3 酶法转化d l - a t c 合成l 半胱氨酸的途径 f i g l 一3 t h ep a t hw a yo f b i o c o n v e r s i o nf r o md ，l - a t ct ol - e y s t e i n e 6 o o h 0 0 hhc _)i 2 、 s 第一章文献综述 目前世界上l 半胱氨酸主要生产国日本和韩国采用的就是酶法生产。 日本早在1 9 7 7 年就从土壤中分离出能够转化d l a t c 生产l 半胱氨酸的野 生假单胞菌a j 3 8 5 4 ( p s e u d o m o n a st h i a z o l i n o p h i l u m ) ，1 9 7 8 年又对a j 3 8 5 4 进行化 学诱变得到转化率更高的a j l1 0 7 1 ( p s e u d o m o n a sd e s m o l y t i c a ) 。据文献报道，2 0 0 0 年日本仍然采用a j l1 0 7 1 为菌种进行工业化生产，其产物的收率在9 0 左右。 韩国工业生产中采用的菌种也是假单胞菌。韩国科学家对筛选出来的野生菌 株p s e u d o m o n a ss p c u 6 进行紫外线诱变得到了转化率高的突变菌株 p s e u d o m o n a sm 3 8 。而其工业生产中用到的就是后者。据报道，以该菌作为酶源 转化d l a t c 生产l 胱氨酸的收率在8 5 左右。 可见，日韩两国的菌种都是从野生假单胞菌中筛选出来的并通过常规的诱变 得到了性能优良的生产工程菌株。 国内南开大学杨文博等人2 0 0 1 年从土壤中分离得到能转化d l a t c 生产l 半胱氨酸的菌株t s 1 1 3 8 ，并通过生理生化实验以及1 6 s r n a 鉴定表明该菌为恶 臭假单胞菌的一个亚种。通过对t s 11 3 8 中参与转化d l a t c 生产l 半胱氨酸 的相关酶进行研究发现与日本的报道有明显的差异。对t s 1 1 3 8 的产酶培养基优 化后，在o 6 的底物浓度下，其最高摩尔转化率只有5 9 9 ，与国外仍有很大 差距，无法满足工业生产的要求。 1 5l 半胱氨酸的测定方法 l 半胱氨酸的定性和定量测定方法有分光光度法、纸层析法【3 3 1 、生物测定法 3 4 , 3 5 1 、电化学检测法( 包括停留流动注射动力学测定法【3 6 1 、硅钼杂多酸单扫示波 极谱法鲫和银微盘电极溶出伏安法【3 8 】等) 、氨基酸分析仪和高效液相色谱法等 【3 9 】 o 1 5 1 分光光度法( d n 婚法，酸式茚三酮法) 分光光度法是利用l 半胱氨酸与特定的显色试剂发生反应，通过测定反应溶 液的光吸收来测定l 半胱氨酸浓度的方法，该方法简单易行、快速准确。准确性 较高的有d t n b 法和酸式茚三酮法。 第一章文献综述 c o o 珏 e 哂前+ 。科 n 苴3 半t 氯曩 c o o 强 。扣 c o o 越 葛o 舒生产榜 麓麓基苯甲曩 图1 - 4d t n b 和半胱氨酸的反应方程式 f i g1 - 4 t h er e a c t i o ne q u a t i o no f d t n ba n dc y s t c i n d n 旧法m 】：d t n b ，全称5 ，5 - z 硫硝基苯甲酸( d i t h i o n i t r o b e n z o i ca e i m ，或 称为e l l m a n 氏试剂，可与l 半胱氨酸发生硫醇二硫化物交换反应( 反应如图1 4 ) 。 反应中一分子的l 半胱氨酸引起一分子的硫硝基苯甲酸的释放。它在p h = 8 0 时， 在4 1 2 r i m 波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定s h 基。该方法比 较特异，在没有其它巯基化合物存在条件下，是一种比较简单可行的方法。它由 g e o r g e l e l l m a n 首先使用，对包括l 半胱氨酸在内的一些巯基化合物进行了测 定，结果良好。 酸式茚三酮法【4 1 】：茚三酮法是测定洳氨基酸的经典方法之一，它是利用a 氨基酸与水合茚三酮共热产生紫色化合物来测定氨基酸【4 2 】。酸式茚三酮法对含巯 基的氨基酸l 半胱氨酸的检测具有特异性高的优点而被广泛应用。使用该方法 对各种组织( 包括脑、肝、血液等) e e 的l 半胱氨酸进行测定，结果良好，回收率 均在9 5 以上。 1 5 2 纸层析测定法4 3 】 纸层析法几乎可以对所有2 0 种基本氨基酸进行定性和半定量测定，常用展开 剂为不同比例的“正丁醇：乙酸( 或甲酸) ：水”，样品组分简单时可用单向层析， 复杂时可用双向层析。展层结束后喷洒5 9 l 的茚三酮的丙酮溶液，在5 0 c - 8 0 ( 2 显色，根据i 浦对l 半胱氨酸定性。将色斑剪下后溶解于乙醇中即可测定吸光度， 根据标准曲线和回归方程可计算l 半胱氨酸的含量。 1 5 3 生物测定法 生物测定法也是一种定性和半定量测定l 半胱氨酸的方法。其原理是利用啤 擎 第一章文献综述 酒片球菌( p e d i o c o c c u sc e r e v i s i a e ) a t c c8 0 8 l 为测试菌株，该菌株不能合成l 一半 胱氨酸，只能利用l 型的半胱氨酸，其生长量( 以6 0 0 n m 的吸光度计) 与l 一半胱氨酸 的加入量呈一定的线性关系。该方法准确性较低，只能作为定性和粗略定量。 1 5 4 电化学检测法 由于l - 半胱氨酸含有活性巯基，具有良好的电化学活性【3 5 1 ，目前已建立了多 种电化学检测方法m ，绷。由于电极易老化致使重现性差，而且需要特殊的电极和 电化学检测器，因此限制了该方法在常规检测中的广泛应用。 1 5 5 氨基酸分析仪和高效液相色谱法 3 6 , 3 9 氨基酸分析仪是将氨基酸在色谱柱内分离后进行茚三酮柱后衍生，利用紫外 一可见检测器进行检测。高效液相色谱对氨基酸的测定通常使用一些柱前衍生 试剂如p i t c ( 异硫氰酸苯脂) 【4 5 】、f d n b ( 2 ，4 - 二硝基氟苯) 、d a n s y l - c i ( 丹 酰磺氯) f m o c ( 甲酸芴甲脂) 等对氨基酸进行柱前衍生，衍生产物经高压色谱柱分 离后用紫外一可见检测器或荧光检测器检测，可对l 半胱氨酸进行定性和定量测 定m 。高效液相色谱法对l 半胱氨酸定量准确，尤其对于复杂成分中的半胱氨酸 进行测定灵敏度高，测定结果准确。 1 6 论文立题背景及主要内容 1 6 1 立题背景( 研究目的、意义和必要性) 半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的2 0 多种氨基酸中 少数具有还原性基团巯基( s h ) 的氨基酸之一。目前已在医药、食品添加剂和化 妆品行业中广泛应用。目前，它在世界各国需求量不断增加，供应缺口很大，国 内很多生化药厂、大药厂也在收购用于制药。其市场价格居高不下。 半个世纪以前，日本等发达国家就开始致力于胱氨酸和半胱氨酸的工业化生 产方面的研究，他们一直希望用化学合成或者酶法制取l 半胱氨酸和胱氨酸。 随着科技的发展，世界各国相继开发了不少酶法生产的新工艺，其中尤以日本的 a t c 假单胞菌工艺最具经济潜力。现在，日本、韩国均采用a t c 假单胞菌的工 艺于工业规模上生产l 半胱氨酸和胱氨酸。 中国是l 半胱氨酸和胱氨酸生产的大国，市场占有率很高。但是，采用的是 落后的毛发酸解生产工艺，该方法污染严重，产品的产率只有4 5 ，产品的 9 第一章文献综述 品质低。加之现在动物疾病的泛滥，人们对用动物毛发生产的l 半胱氨酸和胱 氨酸用于食品、医药、化妆品领域的安全性提出了疑问。因此，必须刻不容缓的 采用新的技术新的工艺以保住和扩大原有的l 半胱氨酸和胱氨酸市场。 目前，日本酶法生产l 半胱氨酸和胱氨酸的原料d l a t c 很大一部分是由 我国供应的，仅我市的供应量就有1 0 0 0 吨年。但由于国内没有后续的生产条件， 所以原料出口的价格被压得很低，在0 5 万美元吨。而生产出来的高品质胱氨酸 以每吨4 7 万美元、l 半胱氨酸以每吨5 1 万美元的高价返销到我国。 鉴于此情况，作为拥有世界1 5 人口的我国和重要的氨基酸生产基地的我市， 必须拥有先进的、有自主知识产权和相应规模的l 半胱氨酸和胱氨酸工业，摆 脱现在在胱氨酸产业链中所处的生产前体或低品质产品的低端地位。因此，开展 由d l a t c 酶法生产l 半胱氨酸、胱氨酸研究是非常必要的，而且意义重大。 一旦该项研究成功，放大到工业规模，仅按目前原有的生产能力计算一年可净增 产值2 6 4 亿元人民币，获利1 6 亿元人民币，使我市成为世界上l 半胱氨酸和 胱氨酸的主要生产基地之一，成为以l 半胱氨酸和胱氨酸为原料继续开发后继 产品的基地。 1 6 2 本论文主要研究内容 s 1 1 菌体酶工业培养条件的研究和优化： s l l 的工业化培养分为两个步骤：一是菌体的大量增殖；二是菌体中酶的诱 导。前者以获得大量的菌体为目的，后者以获得较高的菌体酶活力为目的，二者 的培养条件一般是不相同的。 在保证培养基能够较好的满足菌株s 1 1 的生长的前提下，选择满足工业生产 的经济型培养基，作为菌体大量增殖的初始培养基。测定s l l 在初始培养基中的 生长曲线，以确定其最大生物量出现的时间段。用p l a c k e t b u r m a n 设计法设计实 验。以菌体的生物量为指标，每组实验方案重复3 个平行，完成实验后，用m i n i t a b 软件【5 0 】对实验数据进行处理，从众多考察因素中选出对菌体生物量影响最大的几 个因素。以m i n i t a b 软件对这几个重要因素设计多水平正交实验，同样每组实验 方案3 个平行，完成实验后运用响应曲面法对实验结果进行分析，得出各个因素 的最优化条件( 如果因素水平选取不合适则要重新选取水平进行实验) 。在最优条 件下对s 1 1 进行培养测定其最大生物量，验证与预测值是否相符合。 茵体酶活力的诱导选择d l a t c 作为诱导物，以葡萄糖为例作为碳源。测定 s 1 l 在该培养基中的产酶曲线，确定酶活力最高的时间段。采用m i n i t a b 软件的 p l a c k e t b u r m a n 设计法和响应曲面分析法以茵体酶活力为指标对s l l 的产酶条件 进行优化，确定最优的产酶条件。 1 0 第二章菌株的筛选及初步分类鉴定 第二章菌株的筛选及初步分类鉴定 2 1 菌株的筛选 2 1 1 引言 从d l - a t c 酶法转化合成l 半胱氨酸是一种比较特殊的代谢机制，能够代谢 d l a t c 化合物的细菌，就有可能在富含这种化合物的环境中生长。一般常用的 菌种筛选方法有：控制营养成分、控制培养温度和酸碱度、添加抑制剂、控制通 气条件和目的产物的定性与定量分析等 5 1 , 5 2 。根据l 半胱氨酸的酶法合成机制推 测，从d l a t c 至i j l 半胱氨酸有一分子的n h 3 放出，而n i - 1 3 是大多数微生物可利 用的氮源形式，本研究通过控制培养基中微生物氮源来筛选可利用d l - a t c 的微 生物菌株。从富含d l a t c 的环境中采取土样，以d l a t c 为其生长的唯一氮源， 同时检测目的产物l 半胱氨酸的生成情况，就可以从土样中筛选得到本研究所需 要的微生物菌株。 传统的菌种分类鉴定手段【4 8 】有形态学和生理生化、血清学实验与噬茵体分 型、氨基酸顺序和蛋白分析以及分子杂交和1 6 s r d n a 序列分析等，本研究通过形 态学观察，对筛选到的菌株进行初步的鉴定。 2 1 2 实验材料 2 1 2 1 菌种 11 号菌为本研究室筛选获得。 2 1 2 2 土壤和水样采集 白天津试剂二厂d l a t c 生产车间及周围环境。 2 1 2 3 实验设备和仪器 o l y m p u s 光学显微镜，u v - 2 8 0 0 型紫外分光光度计，d l c j 1 f 实用医用型 无菌操作台，h z q q x 全温振荡器，h h s 型电热恒温水浴锅，1 0 1 3 a b 型电热鼓 风干燥箱，电子分析天平，磁力搅拌器。 第二章菌株的筛选及初步分类鉴定 2 1 2 4 培养基 1 富集培养基( g l ) 酵母膏5 9 ，蛋f l 胨, s g ，甘油2 5 9 ，d l - a t c2 9 ，n a c l2 5 9 ，k 2 h p 0 4l g ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 9 ，f e s 0 4 。7 h 2 00 0 1 9 ，m n s 0 4 。5 1 - 1 2 00 0 0 7 9 ，p h 7 0 ，0 0 5 m p a 灭菌3 0 r a i n 。 2 筛选培养基( g l ) 葡萄糖2 0 9 ，d l - a t c3 9 ，m n s 0 4 5 h 2 00 0 0 7 9 ，k 2 h p 0 4l g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，固体力1 2 0 9 琼脂粉，p h 7 0 ，0 0 5 m p a 灭菌2 0 m i n 。 3 斜面保藏培养基 葡萄糖1 0 9 ，牛肉膏5 9 ，n a c l3 9 ，d l - a t c2 9 ，酵母膏5 9 ，琼脂2 0g ，p h 7 0 ，0 1 m p a 灭菌3 0 m i n 。 4 产酶培养基 葡萄糖3 0 9 ，a t c5 9 ，玉米浆3 9 ，尿素3 9 ，n a c l3 9 ，k 2 h p 0 43 9 ，m n s 0 40 0 0 7 9 ， m g s 0 4 。7 h 2 00 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 9 ，p h 7 5 ，0 0 5 m p a 灭菌2 0 m i n 。 5 生理生化特征测定所用培养基 参见文献【4 1 】 2 1 3 实验方法 2 1 3 1 菌种的筛选 1 9 土样或水样接种于2 5 m l 富集培养基中，3 0 c 振荡培养2 4 h ，从中吸取0 1 m l 转接于2 5 m l 筛选培养基中，继续振荡培养2 4 h ，然后挑取一环菌在固体筛选培养 基上划线，于3 0 c 培养。待长出菌落后挑取单菌落接种在2 5 m l 产酶培养基中， 3 0 c 培养振荡培养1 6 h 后，于4 c ，4 0 0 0 r m i n 离心收集菌体，菌体用2 0 m m o l l 磷酸 缓冲液洗涤后悬浮于相同体积的缓冲液中用于酶活测定。 2 1 3 2 酶促反应 底物溶液的配制：2 d l a t c 3 h 2 0 、l k 2 h p 0 4 、0 1 4 盐酸羟氨、p h 调节n 8 0 ，酶促反应时取3 m l 底物溶液，加入1 5 m l 细胞悬液，混匀后于4 0 水 浴中反应2 h ，反应液离心后即可用于酶活力测定。 2 13 3d t n b 对产物的定性检测 l 一半胱氨酸可以与d t n b t u ( 或称e l l m a n 氏试剂) 发生硫醇二硫化物交换反应 ( 反应如图l _ 4 所示) ，反应中1 分子的l 半胱氨酸引起1 分子的硫硝基苯甲酸的释 放，它在p h 值8 0 时，显黄色，在4 1 2 r i m 波长处有强烈的光吸收，该试剂可以对 含巯基的l 半胱氨酸进行定性检测。 1 2 第二章菌株的筛选及初步分类鉴定 e l l m a n 氏试剂的配制：1 0 m m o l ld t n b ，2 m m o l le d t a ，溶解于1 0 m m o l l 磷酸缓冲液，p h 8 0 ，4 。c 存放。 取4 0 反应2 d , 时的酶促反应液0 5 0 0 m l ，加入0 0 5 0 m le l l m a n 氏试剂，观察 其显色反应，结合酸式茚三酮法对l 半胱氨酸进行初步定性检测。 2 1 3 4 酶活力测定 比酶活力定义：单位时间( h ) 单位质量( g ) 干茵体转化生成l c y s h 的i jt o o l 数， 计为1 u g 。 反应液中l 半胱氨酸含量测定参考g a i t o n d e l 2 5 1 的酸式茚三酮法【2 6 1 ，l 半胱氨 酸在煮沸的条件下与酸式茚三酮试剂生成红色物质，在5 6 0 n m 下有最大吸收，其 颜色深浅与l 半胱氨酸的量成正比。并根据实际情况稍作改动。酸式茚三酮试剂 制备是将茚三酮溶解于乙酸一浓盐酸( 3 ：2 ) 混合溶液中( 该溶液现配现用) 。 l 半胱氨酸酸式茚三酮法显色标准曲线的建立：配锘l j s 0 0 m g ll 半胱氨酸标 准溶液，分别用蒸馏水稀释至以下浓度：0 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ， 9 0 ，1 0 0 m g l 。分别取0 2 m l 不同稀释度的溶液加入0 2 m l 冰醋酸，再加入0 2 m l 酸式茚三酮试剂，于沸水浴中反应1 0 m i n 然后立即在冷水中冷却，最后加入2 4 m l 工业酒精，总体积3 m l ，放置1 0 m i n 后于5 6 0 n m 下比色，以l 半胱氨酸的浓度为 横坐标、以o d 5 舳为纵坐标绘制标准曲线。 反应液中l 半胱氨酸测定方法：取0 2 m l 反应液，加入0 2 m l 冰醋酸，再加 入0 2 m l 酸式茚三酮试剂，于沸水浴中反应1 0 m i n ，然后立即在冷水中冷却，最 后加入2 4 m l 工业酒精，总体积3 m l ，放置1 0 r a i n 后于5 6 0 r a n 下比色，以不加底物 的反应液空白作对照。 2 1 4 菌株筛选结果 2 1 4 1 纸层析定性 对初筛得到的1 8 株菌进行种子培养，取培养液适量在产酶培养基中培养。 离心分离得菌体，冷冻干燥后取适量进行底物拆分。离心弃菌体，取拆分液进行 测定。拆分液进行纸层析，以纯品l 胱氨酸、半胱氨酸作为对照。发现均有胱 氨酸显色点。 2 1 4 2 定量测定 ( 1 ) 酸式茚三酮法：1 l 号菌的摩尔转化率最高，为8 6 。比酶活力：2 8 7 0 u g 干菌体。 ( 2 ) 结晶法：底物拆分液加浓盐酸，1 0 0 0 0 r