（生物物理学专业论文）大豆皮过氧化物酶的分离纯化研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 过氧化物酶 p e r o x i d a s e ，p o d ，e c l 1 1 1 7 ( x ) 是一类以血红素为辅基的 酶，在生物中广泛存在，具有多种不同的生物功能，主要催化h 。o 。和有机过氧化 物对多种有机物和无机物的氧化作用。它在蛋白质、多肽、激素、病毒、寄生虫、 生物降解及神经系统等方面都有应用，具有特异性强，灵敏度高等优点。 迄今被研究最深入的应首推辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ， h r p ) ，此酶已经作为一种商品化试剂广泛用于生物学研究并成为重要的诊断试 剂。与h r p 同属于植物过氧化物酶超家族的i 类酶大豆皮过氧化物酶( s o y b e a n h u l lp e r o x i d a s e ，s h p ，e c i 1 1 1 _ 7 ) ，是从大豆加工副产品豆皮或豆荚中提取的 一类具有很高活性的过氧化物酶。s h p 是一种由单一肽链与卟啉 ( p r o t o p o r p h y r i ni x ) 构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子须与血红素结合才 构成全酶。其分子量约为3 7 k d ，由3 0 0 多个氨基酸残基组成，其等电点为3 9 ， 属于酸性蛋白质。 本文对大豆皮过氧化物酶进行了提纯，采用低浓度中性磷酸盐缓冲液抽提。 纯化过程采用了硫酸铵分级沉淀、丙酮分级沉淀、d e a es e p h a r o s ef l a s tf l o w 离子交换层析、s e p h a d e xg - 7 5 凝胶层析等技术，比较并摸索出提取和纯化的合 适方法和条件。最后得到的过氧化物酶样品纯化了3 3 7 倍，回收率为4 6 1 。 同时分析了酶的热稳定性和酸碱稳定性，结果表明，大豆皮过氧化物酶的热稳定 性和酸碱稳定性都很高，这些特性正好弥补了h r p 的不足，使s h p 能够代替h r p 应用于更广阔的领域内，且大豆皮来源广又便宜，所以大豆皮过氧化物酶的产业 化和应用前景非常乐观。 关键词：大豆皮过氧化物酶纯化热稳定性酸碱稳定性 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e r o x i d a s e p o d ，e c l 1 1 1 7 ( x ) 】i s a k i n d o f r e d o xe n z y m e 矗t h h e m o g l o b i n a sp r o s t h e r i c g r o u p ，w h i c hw i d e l ye x i s t s i no r g a n i s ma n dh a sm a n yd i f f e r e n t b i o l o g i c a lf i m c t i o n s i tm a i n l yc a t a l y z e st h eo x i d a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ea n d o r g a n i cp e r o x i d ew i t hm a n yi n o r g a n i ca n do r g a n i cs u b s t a n c e s f o rt h eh i g hs p e c i f i c i t y a n ds e n s i t i v i t y , i ti sw i d e l ya p p l i e di np r o t e i n ，p o l y p e p f i d e ，h o r m o n e ，v i r u s ，p a r a s i t e ， l i g n i f i c a t i o n ，b i o l o g yd e g r a d a t i o na n dn e u r o - s y s t e me t c o n eo ft h em o s tw i d e l ys t u d i e dp e r o x i d a s ei sh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) s o y b e a nh u l lp e r o x i d a s e ( s h p ) o b t a i n e df r o mt h es o y b e a nh u l lc o a t sb e l o n g st oc l a s s i i io ft h ep l a n tp e r o x i d a s es u p e r f a m i l y , s i m i l a rt oh r p i tc o n t a i na b o u t3 0 0a m i n o a c i d sw i t ham e a nm o l e c u l a rm a s so f3 7 k d t h i se n z y m ea c c o u n t sf o ru pt o5 o f t h e t o t a ls o l u b l ep r o t e i no ft h eh u l l ，a n di sb e l i e v e dt ob eo i lo ft h er i c h e s ts o u r c e so f p e r o x i d a s e s h pw a se x t r a c t e db yp h o s p h a t eb u f f e ra n dp u r i f i e db ya m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a i o na n da c e t o n ep r e c i p i t a t i o n ，i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yu s i n gd e a e s e p h a r o s ef l a s tf l o wc o l u m n ，a n dg e lf i l t r a t i o nu s i n gs e p h a d e xg 一7 5c o l u m n t h e s p e c i f i ca c t i v i t yo f t h ep u r i f i e de n z y m ei n c r e a s e d3 3 7f o l do v e rt h ec r u d ee x t r a c tw i t h 4 6 1 r e c o v e r y a tt h es a m et i m e as y s t e m a t i ce v a l u a t i o no ft h eb i o c a t a l y t i c p r o p e r t i e so fs h pw a sc a r r i e do u tt h ee f f e c t so fp ha n dt e m p e r a t u r eo nt h e e n z y m a t i ca c t i v i t yo ft h ep e r o x i d a s ew e r ea s s a y e d t h er e s u l t ss h o wt h a ts h pi sa b l e t or e t a i ni t sc a t a l y t i ca c t i v i t yu n d e rw i d eo fp ha n da te l e v a t e dt e m p e r a t u r e s k e y w o r d s ：s o y b e a nh u l lp e r o x i d a s e ，p u r i f i c a t i o n ，t h e r m a ls t a b i l i t y ，p hs t a b i l i t y 4 第一篇：论文综述部分 大豆皮过氧化物酶的结构、分离纯化及 应用研究 浙江大学硕士学位论文 1 、过氧化物酶简介 过氧化物酶 p e r o x i d a s e ，p o d ，e c l ，1 1 1 7 ( x ) 是一类广泛存在于各种植 物、动物和微生物体内的氧化还原酶，催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机 物和无机物的氧化作用。其分子量范围为3 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 ，其中含铁过氧化物酶 是一类结构相似、功能相同的酶。 p o d 为一大类有共同活性的酶，但并不都具有相同或相似的结构和作用机 理。多数p o d 含f e ( i i t ) 一原卟啉辅基，属氧化血红素蛋白质。p o d 广泛存 在于动物、植物、真菌和细菌中，基于序列相似性比较分析，可将含血红素p o d 划分成两个p o d 超家族( s u p e r f a m i l y ) ，一个由真菌、细菌和植物来源的p o d 组成；另一个则由动物来源的p o d 组成。目前，对于真菌、细菌和植物来源的 p o d 的研究已经拓展到几十种，依来源不同，可将植物p o d 超家族的成员进一 步归为三类：i 类p o d 是胞内型p o d ，包括酵母细胞色素c 过氧化物酶( c c p ， 位于线粒体电子传递链中的一种可溶性酶蛋白，主要保护细胞免受有毒的过氧化 物损害) ，抗坏血酸过氧化物酶( a p ，主要存在于高等植物的叶绿体和胞液中， 负责h 2 0 2 的清除) 和细菌来源的触酶一过氧化物酶( 同时兼具过氧化氢酶和p o d 两种活力，为细胞应激高氧化环境压力提供保护) ；i i 类p o d 来源于真菌的胞外 型，包括各种真菌产生的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶，在木质素的生物降解 中起重要作用；i i i 类p o d 是来源于高等植物的分泌型p o d ，参与多种不同的生理 功能，如机体内毒性过氧化物酶的清除，细胞壁的合成，组织愈伤，生长素合成 与代谢等。 p o d 是一种由单一肽链与卟啉( p r o t o p o r p h y r i nl x ) 构成的血红素蛋白 ( h e m o p r o t e i n ) ，脱辅基蛋白分子( a p o p r o t e i n ) 须与血红素结合才构成全酶 ( h o l o e n z y m e ) 。参与植物p o d 血红素的合成部位可能像动物一样是在线粒体 上。多数植物p o d 能与碳水化合物结合成为糖基化蛋白，而植物抗坏血酸p o d 、 真菌细胞色素e p o d 及高等动物p o d 则无碳水化合物。p o d 蛋白的分子量约为 3 5 k d 左右，约由3 0 0 个左右氨基酸组成，其中存在酸碱催化域( a c i d b a s ec a t a l y s i s d o m a i n ) 和血红素结合区域( 1 i g a n do f h e m e ) ，常含8 个半胱氨酸、2 个葡萄糖胺、 6 浙江大学硕士学位论文 约8 个糖和2 - 6 个糖基化位点、一个原高铁血红素( p r o t o h e m a t i n ) 和2 个钙离 子、n 一端为吡咯烷酮碳酸、c 一端为精氨酸。但抗坏血酸p o d 和细胞色素c p o d 缺少相应的半胱氨酸残基。p o d 等电点范围在p i3 5 1 0 之间，此酶钝化温度为 9 5 一1 0 0 c ，时间1 0 m i n 以上，在酶粗提液中p o d 的热钝化温度往往与加热时间 呈为非线性关系，这与不同热稳定性的p o d 存在有关。某些同工酶在p i l l 0 ，甚 至个别同工酶在p i l l 4 时仍具有9 0 的活性。 目前，过氧化物酶在酶的构建、免疫测定技术和药物诊断技术上应用较为广 泛。另外应用在生物传感器，药物的改进，化学试剂的生产，芳香化合物的降饵 和环境监测，在材料科学领域也有应用，比如生产无需甲醛做溶剂的树脂涂料； 它还用于糖链成分的酶学测定，尤其适用于糖尿病的诊断。大批的植物过氧化物 酶同工酶，它们普遍的性质和许多灵敏的比色分析方法使得过氧化物酶作为种 便利的酶标记物，在基因学、生理学和病理学研究中发挥了重要作用。过氧化物 酶还被常常应用于有伸展蛋白参与的多糖链接、吲哚乙酸的氧化、抗病性及细胞 生长发育的调节。 迄今被研究最深入的应首推辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 。 早在1 9 4 0 年，t h o r e l l 即用电泳方法从部分春花的辣根组织中区分出2 种不同的 h r p ，之后此酶在植物正常和应激反应代谫 中发挥重要作用而受到广泛关注，并 对此酶进行了大量研究，涉及酶的种类、等电点、氨基酸组成和序列、生理功能， 以及基因表达和调控的分子机制等，迄今此酶作为一种商品化试剂也广泛用于免 疫组织化学、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，并成为重要的渗断 试剂。 2 、大豆皮应用、优势 大豆皮是大豆制油工艺的副产品，占整个大豆体积的1 0 ，占整个大豆重 量的8 。大豆皮主要是大豆外层包被的物质，颜色为米黄色或浅黄色，由油脂 加工热法脱皮或压碎筛理两种加工方法所得，主要成分是细胞壁和植物纤维，粗 纤维含量为3 8 ，粗蛋白1 2 2 ，氧化钙0 5 3 ，磷0 1 8 ，木质素含量低于 2 ( n r c1 9 9 6 ) 。大豆皮的组成见表1 所示： 浙江大学硕士学位论文 表i 大豆皮组成 中性洗酸性洗半纤维 组成千物质粗蛋白脂肪粗纤维果胶类木质素 涤纤维涤纤维素 含量 9 11 0 一1 224 06 24 51 53 52 ( ) 从大豆皮组成可知，大豆皮富含纤维素等非淀粉多糖，是一种天然膳食纤维 源。据资料介绍，作为膳食纤维豆皮有其独特的生理活性，且其中所含的铁不但 含量高，并以二价铁离子形式稳定存在不被氧化，因此大豆皮也是人类膳食铁的 一个重要来源。基于此，国内外对大豆皮开发重点也在于饲料和膳食纤维的加工 利用上。我国是大豆生产国，年产量1 5 0 0 万吨以上，随着我国大豆榨油工业的 发展和对豆粕需要量的增加，我国每年要进口大量的大豆，估计产生大豆皮2 4 0 万吨，随着全国大豆产量和加工能力不断提高，作为副产品的大豆皮产量是非常 可观的。因此如何进行大豆皮综合利用和开发，以提高大豆加工的效益，生产出 高附加值的产品正日益受到人们的重视。 近年来，随油厂规模不断扩大，对大豆加工能力不断增加，市场竞争也更加 激烈。如何降低生产成本、开发出具有高附加值的产品，提高企业效益就显得尤 为重要。大豆皮是大豆加工的副产物，是大豆综合开发的可利用资源。大豆皮在 作为饲料、加工膳食纤维方面都有其独特的功能性质，并可从中提取微量成分如 过氧化物酶和果胶类物质等。然而，对大豆皮的利用，与国外相比，在国内还没 有得到足够的重视，有关大豆皮开发和利用的相应研究还很少，只是简单加入到 大豆粕中加工成饲料，尚未充分利用起来。因此，合理的开发和利用大豆皮对于 有效。充分利用资源、提高企业的经济效益具有重要的意义。 大豆皮过氧化物酶( s o y b e a nh u l lp e r o x i d a s e ，s h p ，e c l 1 1 1 7 ) 是从大豆加 工副产品豆皮或豆荚中提取的一类具有很高活性的酸性同工酶。自九十年代中期 开始，人们对豆皮过氧化物酶的研究逐渐重视起来。在国内，现阶段从事的主要 工作是酶的分离、纯化和结构鉴定。而国外对大豆皮过氧化物酶应用研究则较多， 且重点在于对废水处理应用上。 浙江大学硕士学位论文 3 、大豆皮过氧化物酶的化学结构 3 1 大豆皮过氧化物酶一级结构 s h p 是一种由单一肽链与卧啉( p r o t o p o r p h y r i ni x ) 构成的血红素蛋白， 脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。s h p 的分子量约为3 7 k d ，由3 0 0 多个氨基酸残基组成。其等电点为3 9 ，属于酸性蛋白质。 s h p 和h r p 同属于植物过氧化物酶超家族的i 类酶，两者的结构和作用机理 有许多相似之处。近期的研究结果表明，s h p 和h r p c ( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e is o e n z y m ec ) 具有相似的三维折叠模式，且氨基酸序列有5 7 的同源性。两者 都含有f e ( 1 i d 一原卟啉i x 辅基，1 个色氨酸，4 个二硫键，2 个c a ”和8 个多 糖。 s h p 前体酶的c d n a 序列包含一个 0 5 6 h p 的开放读码框( o r f ) ，编码一个3 5 2 氨基酸的蛋白质；该o r f 的5 一端和37 一端各有9 2 和1 6 5 b p 大小的非编码区， 在p o l y a 上游7 5 b p 处具有a a t a a a 序列片段，与典型的真核基因p o l y a 信号序列 a a t a a a 一致。与酵母菌、脉抱霉、平革霉及曲霉的多数高表达基因不同( 其密 码子简并位使用频率明显偏歧于c g ，可能与基因高效表达所要求的翻译效率有 关) ，s h p e d n a 编码区的密码子简并位使用频率对c o 无明显偏歧性。 对大量分泌蛋白前体的信号肽进行氨基酸组成分析，发现都有一个保守的三 联结构：一个带正电荷的n 端区域、一个中央疏水区域和一个极性的c 端区域， 三个区的长度分别为1 - 5 ，7 - 1 5 和3 - 6 个残基，其中c 一区的末端为信号肽酶 识别位点，模式为x x a ( g ) ( x 是任意一种氨基酸，i 为酶切位点) ，多数真 核生物的信号肽序列c 一末端为a l a 或g l y 残基。对成熟的s h p 前体酶序列分 析( 图1 ) 表明，其n 一端含有一个2 6 氨基酸大小的导向序列，符合信号肽的保守 三联结构。s h p o d n a 的翻译序列切除信号肽后，即得到一个成熟的s h p 酶蛋白。 其中含有8 个c y s 残基( c y s l ，4 ，4 9 ，9 1 ，9 7 ，1 7 6 ，2 0 8 ，2 9 9 ) ，最多可形成4 对二硫 桥。在a s n 5 6 ，1 3 0 ，1 4 ，1 8 5 ，1 9 7 ，2 11 ，2 1 6 处均有典型的a s n x a - - t h r s e r 结构 ( 其中x a 是除p r o 以外的任意氨基酸) ，是潜在的n 一糖基化位点。另外，还含 有5 2 个t h r s e r 残基( 占氨基酸总量的1 6 o ) 作为潜在的o 一糖基化位点。 浙江大学硕士学位论文 1 m g s m r | iv v a ic a f a m h a gf s v s y a qt pt f y r e t c p nif pv f g vf da s f t d p rg a 6 1s i m r ih f h d cf v q g c d g s v ii n n t d t i e s eq d a i p n ir l s ir g i d v v n d ikt a v e n s c p d t 1 2 1v s c a d ii a i aa a i a s v i g g gp 酬p v p i g rrd s i t a n r t ian q n l p a p f f ni t 口ik a s f a v 1 8 1q g i n t i d t v tis g g h t f g r ar c s t f i n r i yn f s n t g n p d pt i n t t y i e v ir a r c p q n a t g 2 4 1d n i t n i d is tp d q f d n r y y sn ii q f n g ias d q e i f s t p ga d t i p i v n s f s s n q n t f f s n 3 0 1f r v s m i k m g ni g v i t g d e g er i q c n f v n gd s f g i a s v a sk d a k q k i v a qs k 图1s h p 前体酶的氨基酸序列 3 2 大豆皮过氧化物酶高级结构 8 0 年代初，研究得到了第一个酵母细胞色素c 过氧化物酶( c c p ) 的x _ 射线 晶体结构，很长时间内有关过氧化物酶的结构及功能研究一直以c c p 的晶体结构 基础。近年来，相继又获得了多个不同种类及来源的过氧化物酶晶体结构，包括 来自a r t h r o m y c e sr a m o s u s 和c o p r i n u sc i n e r e u s 的过氧化物酶，来自 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 的l i p 和m n p ，以及来自碗豆胞质的过氧化物酶。 多序列比较分析表明，尽管这些过氧化物酶之间的序列同源性较小( 草酸根 c 1 0 4 s c n - ( c h 3 ) 3 c c o o p 一甲苯磺酸根 浙汪大学硕士学住论文 】, b r - n 。3 c i h 2 p 0 4 c h 3 c o o f 在相同的条件下，排在前面的离子置换能力强。在上述阴离子置换剂中c 1 应用最广泛。阳离子在强阳离子交换剂上的置换能力为： b a 2 + c 2 + m 9 2 + k + n h 4 + n a b l r 这个次序在弱阳离子交换层析上基本保持不变，由于高价盐的溶解度低，常 常不被使用。上述次序只是近似的规律，在某些情况下可能会有偏差，因为流动 相中的盐可以影响到基质的疏水性、蛋白质水化层、蛋白质的结构和介质表面双 电层的厚度，所有这些都会在离子交换层析过程中表现出来，对蛋白质的保留起 到一定的作用。另外，所选缓冲液的p k 值要在所用的p h 值附近( 0 7 之间) ， 这样才能有较高的缓冲能力。否则，缓冲容量低，p h 可能改变，出现p h 交错界 面，产生假峰。 4 ) 疏水作用的影响 除了电荷之间的作用外氢键或疏水作用也会改变蛋白质与离子交换剂之间 的作用，但在设计很好的离子交换介质应用中，这没有什么实际意义。必要的时 候，例如在疏水膜蛋白的层析中，可以加入非离子表面活性剂或有机溶剂减少疏 水作用。实际操作中，蛋白质分子间的疏水作用比蛋白质与离子交换剂之问的交 换作用更重要 5 ) 蛋白质大小的影响： 蛋白质的大小在离子交换中是比较重要的影响因素。分子量的增加会增加与 离子交换剂的作用，特别是当蛋白质形成聚集体时。对非常大的蛋白质，由于基 质本身的空间排阻，结合作用力会降低。离子交换剂的离子交换能力依据其带电 基团的取代能力一般为2 0 4 0 um o l l 。然而大多数带电基团在凝胶内部。凝胶 基质必须是多孔性的，允许蛋白质扩散到内部结合。 除了表面电荷及交换剂的孔度，离子交换剂结合蛋白质的能力还随不同情况 的许多因素而易。这包括洗脱液的p h 值和盐浓度，洗脱流速，蛋白质的大小及 表面电荷。典型的结合量为t 0 0 m g m l ，但对一个特殊样品实际结合能力只能在 适当的条件下测得。 浙江大学硕士学位论文 4 4 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析。其分离原理是，胶体颗粒具有网状小孔，小分子 物质可以进入颗粒内部，通过时间较长；大分子物质从颗粒间通过，所需时间短。 任何一种被分离的物质在凝胶层析柱中受到的阻滞都在0 1 0 0 之间，这种阻 滞程度可以用分配系数k a y 表示，k a y 的大小取决于凝胶床总体积( v t ) 、外水体 积( v o ) 以及分离物本身的洗脱体积( v e ) ，即k a v( v e v o ) ( v t v o ) 。 可见，样品中各成份的k a y 差异性越大，越容易分离。充当层析界质的物质主要 有葡聚糖凝胶( s e p h a d e xg 一) 、聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp 一) 、交联葡聚糖与双 丙烯酰胺共聚凝胶( s e p h a c r y ls - ) 、琼脂糖凝胶( s e p h a r o s eb i o g e la 一) 、交联 琼脂糖凝胶( s e p h a r o s ec l 一) 、烷基化葡聚糖凝胶( s e p h a d e xl h 一) ，聚苯乙烯凝胶 ( b i0 一b e a d ss 一) 。 4 5 其他层析技术 i ) 亲和层析 六十年代末，固定化酶的出现，使得一种高效便捷的大分子分离纯化技术得 到迅猛地发展。这种依据大分子的生物学特异性质进行分离的技术就是亲和层 析。亲和层析的基本原理是，欲分离的大分子物质s 和相对应的专一性配体l 以次级键结合，形成可解离的络合物l - s 。其中l 又能与活化的基质m 以共价键 结合而形成l _ m s 复合物。由于l 与s 的结合是特异性的，样品中杂质不能与连 在固定基质上的配体结合而被首先洗脱下来。之后用改变条件的流动相将目的产 物单独洗下来，达到分离纯化的目的。 2 ) 聚焦层析 这是依据蛋白质等电点的差异和离子交换行为进行分离纯化的一种方法，既 具有聚焦作用的性能，又有浓缩样品和分辨力高的优点。它与其它层析的显著不 同点是流动相为p h 梯度缓冲液。蛋自质在柱中所带电荷取决于它们的等电点和 介质的p h ，当介质的p h 低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，不与阴离子交换 剂结合，随洗脱液向下移动。在蛋白质从顶向下移动的过程中，其周围的p h 逐 1 7 浙江大学硕士学位论文 步增高，当移动到某一点的环境p h 高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电而与离 子交换剂结合。随着洗脱过程的进行，p h 梯度不断下降，当再降至蛋白质的等 电点时，蛋白质重新脱离交换剂而下移，至p h 大于其等电点处又重新结合。如 此不断重复，直至从柱下流出。不同的蛋白质有不同的等电点，在与交换剂结合 以前将移动不同的距离，最后按等电点顺序流出。 3 ) 疏水作用层析 疏水作用实质上是疏水基团或侧链出自避开水的需要而被迫靠近，是墒驱动 过程。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸，如s e r ，i l e ，p h e ，t y r ，l e u ，v a l ， a l a 等，在分子中形成一定的疏水区，不同蛋白质疏水区的强弱有较大的差异。 疏水作用层析就是利用固定介质上偶联的疏水基团与不同蛋白质分子疏水区之 间相互作用强弱的不同来达到分级分离的目的。它的特点有：保留过程有一个与 其它层析相反的温度系数，即温度增加，保留时间增长；溶质在相对较高的盐浓 度下吸附于固定相上，而在低浓度下被洗脱下来；固定相疏水基团的极性大于反 相层析。 4 6 大豆皮过氧化物酶的鉴定 根据s h p 具有4 0 3 n m 和2 8 0 n m2 个吸收峰的特性，可用r z 值 ( o d 4 0 3 n m o d 2 8 0 n m ) 来判断s h p 的纯度，高纯度的酶r z 值应在2 0 以上。s h p 底物范围较宽，能与多种底物反应，常被用于测酶活性的底物有愈创木酚、联苯 胺、联大茴香胺、抗坏血酸等。 大豆皮过氧化物酶的应用 5 1 生物传感器 过氧化物酶也可以被用作生物探针。近年来由于在探针上固定后的酶可重复 使用，稳定性好，对抑制剂和激活剂的敏感性降低，比较经济；再加上酶本身的 特效反应性和灵敏度，辣根过氧化物酶修饰电极得到了较为广泛的研究和发展。 它在h 2 0 ：、芳香胺、酚类、葡萄糖等物质的测定中有着很重要的作用，这为酶电 浙江大学硕士学位论文 极提供了广阔的应用前景。w o l e n b e r g e r 、t a t s u m a 等人制各了h r p 聚吡咯膜电 极，提出了聚毗咯的作用。王雅琴将介体对甲酰苯基二茂铁( f p f ) 与辣根过氧化 物酶( h r p ) 共价结合，然后同单体吡咯一起电聚合到铂电极上，再通过戊二醛将 葡萄糖氧化酶( g o d ) 交联固定在电极上，制成共价修饰的h r p g o d 介体酶传感 器。结果显示共价修饰的酶传感器响应电流增大，底物测试范围o - 4 0 n m m o l l ， 电极稳定性增强。 厦门大学固体表面物理化学实验室在中性溶液中利用邻苯二胺电聚合实现 了酶的固定化，解决了聚吡咯可能降解的问题，为h r p 找到了新载体。陈滨晖等 人还在他们的文章中结合前人的工作介绍了用酶的电化学固定化方法制备辣根 过氧化物酶聚邻苯二胺膜( h r p p p d ) 电极的方法，并对其过程的动力学因素进 行了探讨。王朝瑾等人研究了以n 一甲基吩嗪作为介体，通过牛血清白蛋白和戊 二醛使其作为结合到玻碳电极上去的辣根过氧化物酶生物传感器。该酶电极对过 氧化氢有较好的响应，n 一甲基吩嗪还原电流的增值与过氧化氢浓度在1 1 0 6 5 i 0 1 m o l l 范围内有良好的线性关系，该传感器灵敏度高，检出限为1 0m o l l ， 对过氧化氢的响应时间小于i o s 。 有文献报道用该电极检测芳香胺及酚类化合物的研究方法及进展，阐述了芳 香胺能够促进直接和间接的酶电极还原反应，酶电极还原电流的增加与芳香胺的 浓度相关。酚类化合物在被酶中间体氧化后，能够在电极上电化学还原，还原电 流与其浓度成比例。 另外在工业生产、环境保护中，要对水溶液中h 2 0 。的含量进行检测；而h r p 有很高的催化效率，每个h r p 分子在一种内可以将2 5 0 0 0 个h 2 0 ：分子催化还原为 h 。o 分子，因此h r p 修饰电极对心魄的检测很灵敏。用直接电子转移方式检测h 。o 。 时，通常选择控制电位为o v ( s c e ) ，在此电位下，噪音和其它物质的干扰都很 小，但此时高反应性的酶中间体( 化合物i 化合物i i ) 可能通过酶反应引起干 扰；用间接电子转移方式时，电极电通常选择接近电予供体的标准电位。直接和 间接测量h 。o 。的检测下可达到1 1 0 - 8 m o l l 。对h ：0 ：来说，电极上无论是固定单 纯的h r p 还是加以修饰的h r p ，酶催化反应的表观米氏常数是相近的，这说明修 饰与否不太影响酶的催化活性。但用不同底物进行酶修饰则可提高反应活性和选 择性。 浙江大学硕士学位论文 r u z g a s 等以h r p 修饰的碳糊电极和固体石墨电极检测了苯酚及相关的一些 芳香族化合物；l i n d g r e n 等用包括h r p 在内的几种酶分别修饰的石墨电极检测 了以系列酚类化合物，对甲酚的检测限达到了1 0 - t m o l l ；d o m i n u g e z - - s a n c h e z 等人用h r p 修饰的碳糊电极检测苯胺。h r p 修饰电极对i i 2 0 。的检测有很高的特效 性，但对芳香胺及酚类化合物的检测则缺乏选择性。酶电极目前还很少用于酚和 芳香胺类混合物的测定，将酶电极与液相色谱相结合使用或许能够解决这个问 题。有人以对苯二酚等有机物为例研究有机物存在对h r p p p d 酶膜电极上h 。o 。 还原速度的影响，并讨论如何根据动力学试验结构确定有机物进行测定并初步探 讨了其动力学。试验表明当溶液中存在被称为激活剂的芳香物时，h r p 酶电极上 h ：0 ：还原电流明显增大。 检测有机过氧化物也是今年来研究的一个热点。关于h r p 修饰电极检测过氧 化物的原理及h r p 与r o o h 集团如何发生催化氧化反应，文献中已有多次报道。 还有研究表明，h r p 修饰电极对h 。o 。响应的降低或升高与溶液中抑制剂或激活剂 的量有对应关系。据此可检测h r p 抑制剂和激活剂。国内外在这方面都做了很多 工作：b o g d a n o v s k a y a 等以h r p 修饰的碳黑电极检测h r p 抑制剂氟化物，检测限 为2 0 1 0 m o l l ；s m i t 等以二茂铁为媒介物，检测h r p 抑制剂氰化物，检测限 可达n g m l 。1 级。s m i t 等还利用锰对h r p 的激活作用检测微量锰，可检测到5 1 0 m 0 1 m l 。的锰。对于金属例予抑制剂的检测，韩树波等用以亚甲基蓝为介质 的h r p 修饰电极检测h 9 2 + ，检测限可达到p g m l _ j 级。w a n gj 等在有机相中，以 h r p 修饰电极检测了好几种不易溶于水的h r p 抑制剂。此外，h r p 激活剂的检测 也有研究。在用于有机溶剂水混合物中物质的测定以及膜电极，酶电极也显示 了很好的稳定性和选择性。 以上所说的生物传感器都是以h r p 为基础构建的，但h r p 的最适p h 值为中 性偏碱，难以在酸性条件下应用；另外，h r p 的热稳定性也不太好。这些原因促 使必须寻找具有更低的p h 和更高的热稳定性的过氧化物酶。王炳全通过双水相 萃取、m o n o q 柱层析和b u t y l s u p e r o s e 疏水层析这一方法，从大豆种皮中分 离了一种酸性过氧化物酶一一大豆皮过氧化物酶( s h p ) ，活力高于e n z y m o l i n t e r n a t i o n a li n c 的高纯级s h p 商品酶( 1 3 0p y r o g a l l o lu m g ) 。然后，用溶 胶一凝胶薄膜固定了大豆皮过氧化物酶而构建了一种能在酸性溶液中检测h 。0 。 浙江大学硕士学位论文 的生物传感器。在p h5 0 时，这种h 。0 。传感器具有灵敏度高、响应时间短( 5s ) 、 热稳定性好和储存稳定性高等优点。而且，该酶电极比i i r p 酶电极具有更高的选 择性，流动注射分析证明这种h 2 0 。传感器能用于酸性条件下h 。o 。的在线检测。大 豆皮过氧化物酶具有很高的热稳定性，并且在p h4 到1 0 时稳定储存。当该酶被 固定在聚乙烯醇接技聚乙烯吡啶的接枝共聚物中时，酶电极在p h3 0 时显示了 灵敏的响应和好的稳定性。另外，基于s h p 的传感器要较h r p 传感器具有更高的 检测上限。h r p 在p h3 0 时发生卟啉脱落或脱出活性中心，降低甚至丧失了活 性；而s h p 却可以紧密地抓牢辅基。 5 2 环保方面的应用 随着现代工业的发展，人们生活水平的提高，环境污染问题将是2 1 世纪人 们最关心的问题之一。目前我国有些地方严重的环境污染，引起高度重视，加强 环境保护和治理力度已成为社会各界的共识。在各种污染物中，有机污染物已经 成为重点污染源之一。现常用物理和化学方法对污染物进行处理，但这些方法设 备投资很大，运转费用也昂贵，并且不能从根本上解决问题。 后来人们在研究中发现来自白腐菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 中的木质 索过氧化物酶( l i g n j np e r o x i d a s e ，l i p ) ，能使许多有机物的键断裂，使许多污 染物最终降解成c o 。和h 2 0 ，这比某些微生物只能降解少数几种化合物有更大的 优越性。例如，多环芳香族化合物、芳香族氯化物、农药、染料、有机氯化物、 叠氮化合物中的几十种物质都可以被降解。对于l i p ，人们还研究了在生物漂白 过程中和工业废水中l i p 对各种聚合型染料的降解。其中由于偶氮染料是颜色品 种最为丰富的一类，所以对它的研究也是最多的。p a s z c z y n s k ia 等人发现白腐 菌中的酶不但可以脱去偶氮染料中的颜色还可以将它们转化为c o 。h e l e n a p o d g o r n i k 等人进一步研究，他们对2 4 种染料作了测定，发现来自自腐菌中的 木质素过氧化物酶可以对来自不同化学结构和种类的染料脱色，且并不具备特异 性，可适用的底物范围非常之广。s a m is a y a d i 等人在对橄榄加工厂的废水的生 物处理时首先发现，l i p 对其中的大部分有害的多酚组分有着较高的脱色和解聚 作用。m o n i k aw a g n e r 等人还发现在h 。0 。的作用下h r p 不但可以催化降解牛皮纸 再生过程中排放的含酚类物质的含量( 样品i i i 样品i v 样品i i 。 样品i 和样品i i 比较，发现未磨碎的样品i i 的酶活远远小于磨碎的样品i 。 从中可以看出大豆皮是否磨碎在提取酶原液时是一个重要因素，磨碎的大豆皮更 能够抽提出酶。 样品i 和样品i i i 比较，发现摇晃的样品i 酶活高于静止的样品i i t ，说明 摇晃有利于提取酶原液。 样品i 和样品i v 比较，发现3 6 。c 的样品i 酶活高于4 。c 的样品i v ，说明温 度在提取酶原液时也是一个重要因素。 经过以上比较，得出酶原液提取的最适条件是：大豆皮碾磨后溶于磷酸缓冲 液中，在3 6 。c 下摇晃2 4 小时。 在实验初期，曾将大豆皮浸泡于水中抽提，但抽提出来的酶活不稳定。后来 发现在水中浸泡2 4 小时后的s h p 粗提液的p h 仅有f t 0 左右，如果再用硫酸铵 分级沉淀，势必会使溶液的p h 值进一步降低，从而导致s h p 的不稳定，直接影 响酶的活力和得率。后来就用磷酸缓冲液代替水来浸泡大豆皮。 3 2 硫酸铵及丙酮沉淀 将抽提得到的酶原液先经过传统的硫酸铵沉淀法。不同浓度的硫酸铵可以沉 浙江大学硕士学位论文 淀出不同的蛋白。我们将硫酸铵分成四个等级来测定不同浓度的硫酸铵饱和度沉 淀组分的过氧化物酶活性。表2 显示了不同硫酸铵饱和度沉淀组分的过氧化物酶 活性，可以看出4 0 8 0 饱和度的硫酸铵组分含有大部分的过氧化物酶活性差不 多一半的蛋白量。硫酸铵沉淀将很多与过氧化物酶的电荷和分子性质相差较大的 杂蛋白去掉，同时通过沉淀还可以将许多非蛋白性质的杂质从酶溶液中去除。 表2 硫酸铵分级沉淀的分离结果 硫酸铵饱和度总过氧化物酶活总蛋白含量过氧化物酶比活 ( )性( u n i t ) ( m g )力( u n i t s m g ) o 一2 01 6 7 3 。7 78 9 。2 21 8 7 6 2 0 4 0 1 4 2 7 3 64 9 62 8 7 7 4 0 8 0 7 4 1 4 6 2 61 0 0 。7 67 3 5 8 7 8 0 l o o5 0 8 2 42 2 3 4 2 2 7 5 本实验采用硫酸铵的分级沉淀，第一步将硫酸铵加到0 4 饱和度，第二步加 到0 8 饱和度，以除去一些杂蛋白。盐析后所得的酶液需经过透析除盐，为后面 的实验做好准备。 再用丙酮分级沉淀以进一步除去杂蛋白，但是在加丙酮前应先冷冻到一2 0 4 c ， 边搅拌边缓缓加入。低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取 效率。经过丙酮沉淀后得到的为呈黄褐色的s h p 粗酶，干燥后存于4 。c 的冰箱内 备用。 3 3d e a es e p h a r o s ef l a s tf l o w 离子交换柱层析 离子交换柱层析中，上样时的样品浓度要尽量低一些，总上样量不能超过层 析介质的总吸附容量。浓度过高许多样品未经吸附就直接流出，从而影响实验数 据的准确性。上样流速对于层析介质有效地吸附样品蛋白也十分重要，上样流速 过大会造成吸附不完全，使样品蛋白在层析介质中的分布过于分散，造成分离效 果的下降，同时通过柱子后的溶液中含有部分过氧化物酶，影响酶的回收率。本 实验以上样流速为0 2 - 1 4 m l m i n ( 间隔为0 2m h m i n ) ，来测验上样流速对d e a e s e p h a r o s e f l a s tf l o w 离子交换柱对s h p 吸附效果的影响。结果如图2 所示，当 浙江大学硕士学位论文 流速超过0 8 m l m i n 时会有大量的过氧化物酶未被有效的吸附到层析介质上而 直接流出，而小于0 4 m l m i n 的流速不会造成对过氧化物酶的流失。本实验选择 0 4 m l m i n 为上样流速。 o 20 4o 6o 8l1 21 4 流速( m l m i n ) 图2 上样流速对d e a es e p h a r o s f l a s tf l o w 离子交换柱对s l i p 吸附效果的影响 用d e a es e p h a r o s ef l a s tf l o w 分离粗酶。对吸附蛋白的洗脱采用n a c l 浓 度梯度洗脱，本实验前期曾用0 卜0 6 m ( 间隔以0 1 m ) 的n a c i 浓度梯度洗脱， 层析结果如图3 所示。 1 4 i 2 1 0 8 o 霜0 6 0 4 0 2 0 一o 2 管数 图3d e a e - s e p h r o s ef l a s tf l o w 层析结果a 2 8 0 ( n a c l 浓度间隔0 i m ) 4 5 j l l 0 o o o 0 o 0 鲫 浙江大学硕士学位论文 从图3 中可以看出，主蛋白峰的两侧各有一个杂蛋白峰与其靠近，为了使过 氧化物酶与杂蛋白能够更好的分离开，我们又采用了较为平缓的n a c i 浓度梯度 洗脱。用n a c l 浓度问隔为0 0 5 m 洗脱，结果如图4 。可以看出过氧化物酶被更 好的分离出来。 再将洗脱出来的溶液进行酶活测定 波长吸收值可以看到蛋白质的洗脱情况 结果如图5 所示。从洗出液的2 8 0 n m 有1 个主蛋白峰和5 个小蛋白峰。从酶 的比活力曲线看，主要的酶活是在主蛋白峰，虽然主蛋白峰左右两侧的小峰也具 有酶活，可是大部分的酶活都在主蛋白峰内。收集主蛋白峰的溶液，在p b s 中透 析l 天除盐。 将经过透析后的样品与m a r k 蛋白进行s d s p a g e 电