（生物物理学专业论文）脐血干细胞的分离玻璃化冻存和活率检测研究.pdf

致谢 本论文的顺利完成与严庆丰副教授、钱凯先教授与王勇副教授的悉心指导是 分不开的。严老师在学术上严谨踏实，认真执着，在生活中乐观开朗，正直宽容， 不仅在治学上给我留下了深刻的印象，更在为人处世_ l = 给我指引了方向。即使他 在国外期间，也不忘我的论文进展。钱教授执着的事业心、求实的治学态度、平 和大度的待人处事，对我现在和将来的人生道路都不无裨益。而王老师在我的论 文完成阶段给予了许多细节上的指导与帮助。这一切，都让我铭【己在，i i , ，在此， 谨向三位老师致以最诚挚的谢意! 感谢浙江省血液中心输血研究所的傅启华、何占、许先圈、刘晋辉、姜侃、 洪小珍、金蕾等各位老师在我实验过程中给予的大力支持和帮助。他们的无私、 热情，是我得以顺利完成论文的坚实基础。 感谢浙江大学生科院中一i i , 实验室的金文涛老师、曾冬云老师、丁鸣老师、朱 京平老师给我的实验提供的仪器条件和帮助。 感谢浙江大学生科院微生物实验室的周伟为我提供的海藻糖试剂。 感谢方林、叶德仕、苏清锋、沈行燕、吴薇、谢志鹏、许宁一、陈秋、苏忠 亮、邱丽燕、迟万好等同学在论文完成过程中给予我的支持和帮助。 感谢吴一峰在整个论文完成阶段对我的全力支持和帮助，他的关心和鼓励 直是我前进的动力。我的论文的完成，与他点点滴滴的倾注密不可分。 感谢我含辛茹苦的父母和亲爱的妹妹，浓浓的亲情在我求学在外的f 1 子里永 远温暖着我的心。深深地感谢他们j 感谢所有一直关心和帮助我的老师和同学，愿大家顺利 竺竺竺竺竺! 三竺竺竺 摘要 詹血中造血细胞的数量和质量都与骨髓相近，而且，具有来源丰富、无病原体污染、 抗原性弱、淋巴细胞不成熟等优点。随着对脐血研究的深入，脐血的进一步开发利用展 现出诱人的前景。广y 一 本文研究了脐血的两种不同分离方法：f i c o l l 法和h e s 法。比较了这两种方法的回 收率。同时得出：于2 4 小时内分离的脐血干细胞可以保持较高的活率，在9 3 以上。 在此基础上，本文以h e s 法分离所得的脐血干细胞作为材料，进行玻璃化法超低温 保存，目的是探索最合适的保护剂浓度和最合适的预处理时间，以期细胞冻融后获得较 高的活率。 f 脐血的广泛应用有赖于脐血库的建立。而有效的冻存方法，是脐血库建库中相当重 要的一个环节。目前，脐血的冻存主要采用程控降温法，但由于其操作繁琐，且需要价 格昂贵的程控降温仪，难以在生物工程领域得到普遍的推广和应用。近些年来兴起的玻 璃化法超低温保存，以其简单、快速等优点，有望在脐血干细胞的保存方面展现良好的 应用前景。 玻璃化法是指受高浓度复合保护剂处理后的细胞连同保护剂本身都进入一个均一 的无冰晶的玻璃化状态，冰冻保存的细胞受到损伤较小，存活率较高。它是一种简便、 有效、成本低廉的超低温保存方法。 9 本文采用系列浓度( 1 0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ) 的p v s 2 保护剂预处 理不同的时间( 5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，3 0 ，4 0 分钟) ，然后在完全浓度的玻璃化保护剂中直接 投入液氮。( 冻融后的细胞经过m t t 检测和f d a p i 双荧光染色法检测，获得预处理过 渡的优化条件，即6 0 浓度的保护剂，预处理1 5 分钟，此时的f d p i 值为4 6 4 3 。， ， 本文还将海藻糖取代原保护剂中的蔗糖。( 采用以上的优化条件：6 0 保护剂浓度， 进行不同时间的预处理。冻融后的细胞以f d a p i 双荧光染色、流式细胞仪c d 3 4 + 计数 等检测手段，与同样条件的6 0 蔗糖保护剂处理的细胞相比较。两者在预处理时间为 1 5 分钟时的f d a p i 值分别为5 5 8 3 和4 6 4 3 ，很明显，海藻糖要比蔗糖高出2 0 2 5 。 而两者在预处理时间为1 5 分钟时的c d 3 4 + 回收率则分别为5 7 2 6 和3 1 6 2 ，亦是前 者高出后者2 5 6 4 。由此可见，海藻糖的低温保护作用明显优于蔗糖。寸一) ， 本文得出结论如下： 1 ) h e s 法分离脐血干细胞的回收率明显高于f i c o l l 法。 2 ) 2 4 小时内分离脐血干细胞可以保持9 3 以上的活率。 3 ) 6 0 浓度的保护剂( p v s 2 ) ，1 5 分钟预处理时间，是玻璃化冻存脐血干细胞的 最适条件，f d a p i 值为4 6 4 3 。 4 ) 以海藻糖取代原保护剂中的蔗糖，同样的处理条件下，f d a p i 值高于后者 2 02 5 ，c d 3 4 + 回收率高于后者2 5 6 4 。 关键词：脐血干细胞：分离；玻璃化冻存；活率检测；海藻糖 竺竺竺竺兰竺竺兰竺三一 a b s t r a c t t h eo u a n t i t ya n dq u a l i t yo fh e m a t o b l a s ti nu m b i l i c a lc o r db l o o d ( u c b ) c a n b ec o m p a r e dw i t hb o n e m a r r o 、uf u r t h e r m o r e ，i th a so t b e ra d v a n t a g e s ：w i d e l ys o u r c e d ，n oc o n t a m i n a t i o n o fp a t h o g e n y , w e a k l y a n t i g e n i c i t y , a n dn o m a t u r el y m p h o c y t e ，e ta l - i nt h i sp a p e r , w ec o m p a r e dt h er e g a i n r a t eo f t w ok i n d so fp r o c e d u r ef o rs e p a r a t i n gu c b s t e m 。l l s ： w i t hf i c 0 1 1a n dw i t hh e s o b v i o u s l y , t h ep r o c e d u r e w i t hh e si sb e u e rt h a nt h ef o r m e r a l s o ，w ef o u n d t h a t t h eu c bs t e mc e l l sw o u l dr e m a i nah i g hs u r v i v a l - r a t ei fi ti ss e p a r a t e dw i t h i n2 4 h ，a b o v e9 3 w i t ht h ed e v e l o p m e n to fu m b i l i c a lc o r db l o o d ( u c b ) b a n k ，h o wt op r e s e r v e t h eu c bs t e mc e l l e f f e c t i v e l yh a sb e e no n eo f t h ek e y f a c t o r sd u r i n gu c b b a n k 。u p b u i t d i n g c r y o p r e s e r v a t i o nb yv i t r i f i c a t i o n i sak i n do fb i o t e c h n o l o g ys p r u n gu pi n1 9 8 0 s i t i s s u p e r i o ri n s i m p l e e q u i p m e n t a n d f a c i l i t a t e d - o p e r a t i o n v i t r i f i c a t i o n r e f e r st ot h e p h y s i c a lp r o c e s sb y w h i c h c o n c e n t r a t e dc r y o p r o t e c t a n ta n dc e l l st r e a t e da r et o t a l l yv i t r i f i c a t e di n t oai c e 。f l e ea n dh o m o g e n o u ss t a t e v i t r i f i c a t i o ni sas i m p l ea n de f f i c i e n tt e c h n i q u e f o rc r y o p r e s e r v a t i o n o nt h eb a s eo fu c bs t e mc e l l ss e p a r a t e dw i t hh e s ，w ec r y o p r e s e r v e dt h ec e l l sb yv i t r i f i c a t i o n c e l l s w e r ed i s p o s e dt oas e r i e sc o n c e n t r a t i o no f p v s 2 f o rd i f f e r e n tt i m ea n de q u i l i b r a t e di nc o m p l e t es t r e n g t ho f t h ev i t r i f i c a t i o ns o l u t i o nb e f o r ep l u n g i n gt h ec r y o t u b e sc o n t a i n i n gt r e a t e dc e l l sa n dc r y o p r e t e c t a n ti n t o l i q u i dn i t r o g e nd i r e c t l y t h es u r v i v a l r a t eo f t h e r e c o v e r e dc e l l sw a st e s t e db ym t t a n df d a _ p 1 t h e r e f o r e ， w e g o tt h ep r e f e r a b l ec o n d i t i o no f v i t r i f i c a t i o n ，i e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f c r y o p r o t e c t a n t i s6 0 a n dt h et i m e o f d i s p o s a li s1 5 m i n u n d e r t h i sc o n d i t i o n ，t h ev a l u eo f f d a p ii s4 6 4 3 i no u rr e p o r t ，w es e l e c t e dt r e h a l o s et os u b s t i t u t e s u c r o s ei nt h e c r y o p r o t e c t a n t t h ep r o c e s s o f v i t r i f i c a t i o ni su n d e rt h es a m ep r e f e r a b l ec o n d i t i o n t h es u r v i v a l - r a t eo f t h er e c o v e r e dc e l l sw a st e s t e db y f d a p ia n dc d 3 4 + c e l l c o u n t a sf d a p i ，t r e h a l o s ei s 2 0 2 5 h i g h e rt h a ns u c r o s e ，a n d a sc d 3 4 + c e l l c o u n t ，t r e h a l o s ei s2 5 6 4 h i g h e rt h a nt h ef o r m e r i ti se v i d e n t l yt r e h a l o s ei ss u p e r i o rt os u c r o s ed u r i n g c r y o p r e s e r v a t i o n t h i sp a p e ri st h ef i r s tr e p o r to fc r y o p r e s e r v a t i o no fu c bs t e mc e l l sb yv i t r i f i c a t i o n i ti sa l s ot h ef i r s t r e p o r to fi n t r o d u c i n gt r e h a l o s ei n t oc r y o p r e s e r v a t i o n a n d g o tt h ee x p e c t e dr e s u l t s k e y w o r d s ：u m b i l i c a lc o r db l o o ds t e mc e i l ；c r y o p r e s e r v a t i o n ；v i t r i f i c a t i o n ；v i a b i l i t yt e s t ；t r e h a l o s e 2 竺竺竺兰竺竺兰竺 第一部分文献综述 一前言 脐血，是指婴儿娩出断脐后，残留在脐带和胎盘绒毛血管内的血液，也称为胎盘血， 脐带血。对脐血造血活性的研究始于6 0 年代初，有学者发现胎鼠和新生鼠的脐血中含 有可重建同系小鼠造血功能、延长小鼠存活期的脾脏集落形成单位。1 9 7 4 年k n u d t z o n 等发现脐血中富含造血祖细胞，他们在广泛而深入的研究基础上，发现脐血中含有 丰富的造血细胞、一定量的造血支持细胞，脐血浆中含有较高活性的造血刺激活性，提 出脐血可作为骨髓外另一个极有潜力的造血干细胞的来源。这些研究成果在8 0 年代末 期引起了人们极大的兴趣2 1 。1 9 8 9 年，脐血造血细胞移植首先在同系小鼠上取得成功”1 。 同年g 1 u c k m a n 等1 用h l a 相合的同胞脐血对一例f a n c o n i s 贫血儿童进行脐血造血细 胞移植也获得成功，该患儿已存活至今。随后在世界各地兴起了脐血热。1 9 8 9 年至今已 有4 0 余例儿童接受了同胞的脐血移植，并且移植的对象从儿童逐渐过渡到了成人。许 多国家相继开展了脐血库的建立工作。脐血具有以下优点”“”：1 来源丰富，采集 方便，容易获得。2 对产妇和新生儿均不造成伤害。3 脐血富含幼稚的造血干祖细胞。 4 脐血可实物冻存，易找到h l a 相合的供者。5 有可能扩充少数民族的造血干细胞供 者库。6 脐血中各种病毒的感染率均远远低于骨髓。所以，脐血成为造血干细胞移植的 又一来源愈来愈显示出其重要性“1 。 二脐血的生物学特性 在个体发育过程中，造血组织由卵黄囊迁移至肝脏，进而再迁移到骨髓。足月胎儿 正处在造血细胞由胚肝通过循环血迁移到骨髓的过程，人们因而推测循环血中含有丰富 的造血干祖细胞1 1 2 1 。由于迄今为止还没有直接测定人造血干细胞的方法，只能通过脐 血造血细胞表面标志、体外各阶段造血祖细胞的活性的测定并与骨髓进行比较来推断脐 血中造血干祖细胞的数量和质量。 脐血造血干细胞具有骨髓造血细胞的一些特点：是一组异质性细胞群，由不同等级 的造血细胞组成，包括造血干细胞、多向祖细胞、定向祖细胞。目前，通过细胞表面抗 原标志( 如c d 3 4 、c d 3 3 、c d 3 8 、c d 7 1 、c d 4 5 r a 、h l a d r 、t h y 一1 等) 、高增殖潜 能集落形成单位( h p p c f u ) 、长期培养启动细胞( l 1 ，l c ) 、粒红巨核巨噬系集落形 成单位( c f u g e m m ) 等检测方法，来间接推测造血干细胞。其中细胞膜c d 3 4 抗原阳 性是造血干祖细胞最具代表性的免疫表型特征，该抗原功能尚不清楚，可能与细胞间粘 附及造血相关基因的表达有关，它在原始造血中表达最强，随着细胞分化，其抗原的表 达逐渐减弱至消失，成熟血细胞c d 3 4 抗原阴性。实际应用中常以此作为造血干细胞阳 性筛选及体外扩增的依据。 脐血中c d 3 4 + 细胞约占有核细胞的1 ，略低于骨髓水平。但脐血中早期造血干细 胞含量却与骨髓和外周血相当或更高 1 3 i 。在c d 3 4 + 细胞群中，具c d 3 8 一、c d 3 3 一、 l i n 一、c d 4 5 r a - - 、h l a d r 一等膜标志的细胞代表较早期造血细胞，其与移植后骨髓 长期造血功能的重建有关。在脐血中这些细胞的所占比例相对较高“”，其中较原始的 细胞亚群c d 3 4 + c d 7 1 一c d 4 5 r a 细胞在脐血中占c d 3 4 + 细胞的2 5 ，而在骨髓中占 5 - - 2 0 1 5 1 o c a r d o s o 等研究表明脐血中c d 3 4 + c d 3 8 一细胞群占c d 3 4 + 细胞的4 ， 而骨髓则为1 6 1 。与骨髓相比，脐血中c d 3 4 + c d 3 8 - - 细胞形成c f u - g e m m 、粒巨 噬系集落形成单位( c f u g m ) 、红系爆式集落形成单位( b f u - e ) 的数量相当或更高， 形成的集落也较大，其形成的集落所含的细胞数比骨髓多7 倍左右 1 7 1 , 显示有较强的 生长潜力。可见，同等数量的c d 3 4 + 细胞中早期造血细胞的数量在脐血中相对多于骨髓， 满足同样体重造血重建所需的脐血量也可低于骨髓。c a r o w 等用半固体培养发现脐血 c f u g e m m 的再植入率、原代集落形成次级集落比例及集落大小均高于以往报道 1 8 1 大多数次级集落源于c f u g e m m ，且c f u g e m m 次级集落形成数远大于骨髓。这些 结果表明脐血中具有高质量的未成熟造血祖细胞，较骨髓更有利于造血功能的重建。 三脐血的免疫学特性 用单克隆抗体标记或流式细胞仪对脐皿淋巴细胞亚群分析显示，脐血淋巴细胞绝对 数比成人外周血高2 3 倍，但其表型及免疫功能均不成熟。脐血t 细胞中c d 2 、c d 3 、 c d 5 7 细胞的百分率显著低于成人：脐血和骨髓c d 2 的比例分别为5 7 年i7 9 ，c d 3 分别为4 5 和7 2 ，c d 5 7 分别为1 和1 0 。脐血c d 4 + c d 8 + 细胞的比例为l ：2 ， 较成人外周血1 ：3 高，c d 4 + t 细胞占淋巴细胞的3 1 ，其中主要为c d 4 + c d 4 5 r a + 群体，抑制活性占优势，相反，c d s + t 细胞的只有微弱的抑制活性。脐血t 细胞中c d 3 8 、 c d l6 c d 5 6 、c d 4 c d 4 5 r a 群体却显著高于骨髓：脐血和骨髓中c d 3 8 的比例分别为 7 9 和5 4 ，c d l 6 c d 5 6 分别为2 5 和1 4 ，c d 4 c d 4 5 r a 分别为2 2 和1 5 1 9 1 。 脐血i l 2 及干扰素y 的生成量较低，i l - 2 受体、h l a d r 及c d 3 + t 细胞的y6t 细胞 受体的表达都低于成年人t 细胞，未测出c d s c d 5 7 的表达。脐血的抗体应答不同于成 人，脐血中主要含i g m 抗体。虽然b 细胞和n k 细胞的比例和成人血相似，但6 8 的 c d l 9 + b 淋巴细胞共表达c d 5 这类细胞属于幼稚型的b 细胞。上述结果表明，脐血 淋巴细胞中抑制性和天然性细胞占有较大的比例1 2 0 , 2 1 1 。 脐血细胞的免疫功能也不同于成人外周血。脐血中已接触抗原的细胞或记忆细胞极 少( 5 ) ，其淋巴细胞对有丝分裂原、i l 2 或异种抗原反应差，b 细胞转化为能产生 抗体的浆细胞的能力差，只产生一定量的i g m 。n k 不够完全成熟，其活性低，i l 2 诱 导的l a k 活性正常。脐血中含有耐n k 和l a k 细胞作用的细胞。脐血中的t 淋巴细胞 受第一次异源性抗原刺激后，相应的细胞毒活性比成人t 细胞活性低，受第二次刺激后， 脐血t 细胞出现无反应状态，而成人t 细胞的细胞毒活性则随受抗原刺激的次数逐渐增 高。其它研究也表明，异基因抗原诱导脐血t 细胞发生增殖性应答后，只产生极少量的 异基因反应细胞毒t 细胞。以上资料提示这可能是移植异基因脐血后在宿主体内所导致 的g v h d ( 移植物抗宿主病) 反应低的原因之一。由于脐血中些t 辅助细胞还表达 c d 4 5 r a 和c d 3 8 ，这些t 辅助细胞对成人t 和b 细胞功能具有强烈的抑制作用，致使 g v h d 发生率低“2 2 3 , 2 4 , 2 5 1 0 体内及体外研究均表明，脐血中的n k 细胞及l a k 细胞 在不依赖t 细胞介导的g v h d 的情况下，仍具有介导正常生理强度的移植物抗白细胞 作用1 2 6 1 。 脐血引起的免疫反应还受到另一个因素的影响，这就是脐血中母体血的污染。以往 一直认为母体血对脐血的污染率很低。随着分子生物学检测手段灵敏度的提高，母体血 对脐血的污染的检出率逐渐提高。脐血中混入的母体细胞对g v h d 的发生及移植的成 功有多大的影响，由于报道的资料太少，尚难以作出评价。从报道的脐血儿童移植来看 “”1 ，大多数接受脐血移植的患者未发生严重的g v h d ，表明母体血污染引起严重副 作用的可能并不是很大。 ! ! ! 竺竺兰竺! 竺三兰竺竺三 一 四脐血干细胞的低温保存 脐血移植对许多良性及恶性疾病的治疗均取得了令人满意的结果，许多国家相继开 展了脐血库的建立工作。脐血成为造血干细胞移植的又一来源，愈来愈显示出其重要性。 临床移植成功很重要的一个环节在于有效的脐血冻存。 脐血通常采用液氮( 一1 9 6 。c ) 低温冻存，- - 8 0 。c 以下的低温冰箱只能用于短期冻 存。但不能采用- - 6 0 。c 以上的低温冰箱冻存，因为在此温度区内，细胞内部可能存在的 极微小的冰晶会产生变化，从而对细胞内部的结构，特别是对细胞膜产生损伤，使细胞 死亡。 在脐血造血干细胞的冻存与复苏过程中，包括三个主要的物理化学过程，即液体溶 液的固化过程、固化溶液的融化过程和水分通过细胞膜的渗透过程。由此所引起的溶液 中冰晶形成和生长、冰晶的再结晶、高渗压力和溶液的高浓度毒性等因素均会损伤细胞， 若不进行特殊的控制，绝大多数细胞在经历低温时会因损伤而死亡。到目前为止，除了 最简单的细菌、微生物等以外，绝大多数细胞的低温保存都必须用抗冻剂( c r o p r o t e c t i v e a g e n t s c p a ) ，如甘油、二甲亚砜、甲醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、聚烯呲酮、羟乙基 淀粉、聚乙二醇、葡聚糖和清蛋白等，其中多采用甘油或二甲亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ， d m s o ) 作保护剂。d o n a l d s o n 等“”在4 的羟乙基淀粉条件下，加不同浓度的d m s o ( o ，1 ，2 5 ，5 ) ，观察对c d 3 4 + 细胞冻存的影响。结果显示，5 d m s o 对c d 3 4 + 细胞回收率影响最小，为6 2 1 ：当d m s o 的浓度从5 增加到1 0 时，对c d 3 4 + 细 胞回收率仍无明显影响。同时发现，加入不同浓度的羟乙基淀粉( 0 ，1 ，2 ，3 ， 4 ) 对c d 3 4 + 细胞回收率亦无明显影响。若在每毫升冻存剂中加入2 5 i t ld n a 酶，可 提高c d 3 4 + 细胞的回收率。 生物体的低温保存方法主要有两种。一种是快速冷却非晶态固化，即采用快速或超 快速的冷却方法，使样品能在无毒的低浓度下实现玻璃化。另一种是慢速冷却法，又称 “二步法”，即将置有细胞的含抗冻剂的水溶液，分两个步骤由室温降至液氮温度，再 将其置入液氮内，其相应的冷却速度较高些，不形成晶体状，目前造血干细胞的冻存主 要采用此种方法。所选择的降温速率有1 r a i n ，5 m i n ，一1 0 m i n ，c d 3 4 + 细胞的回收 率可随冷却速率的降低而下降。d o n a l d s o n 所推荐的最佳冻存条件为1 0 d m s o 、降温 速率1 。c m i n ，此时c d 3 4 + 细胞回收率可达9 3 4 。当大规模冷冻保存时，可先将 脐血置于8 0 2 小时，再直接放入液氮内即可。 五玻璃化法超低温保存的原理和发展 尽管脐血库的建立得到了长足的发展，但实际建设中仍然存在大量的问题。脐血库 的建立和维持都需要投入巨额资金，一个冻存5 0 万份标本的脐血库需5 亿美元的处理 费，其中的冻存就占了很大的比例。传统的程控降温法，设备昂贵，操作繁琐，难以在 生物工程领域得到普遍的推广，需要有更深入的研究。 近些年来发展的超低温保存方法一一玻璃化法有望在这些方面取得突破1 3 0 1 。玻璃 化( v i t r i f i c a t i o n ) 是指液体转变为非晶体( 玻璃态) 的固化过程。溶液在冷冻过程中粘 稠度增高，相变后转变成固态时，不形成或只形成极小且对细胞结构无损伤的冰晶，高 粘性使分子的弥散受到极度抑制，液体固化成玻璃状态，从而避免冰晶形成过程中对细 胞的损伤。它和常见的液体转变为晶体或部分结晶的固体的冻结( f r e e z i n g ) 过程不同， 玻璃态固体分子之间_ | 勺关系和液态相比无明显变化，而一般的晶体分子之间的关系和液 态相差甚远。 ! ! 竺兰! 竺竺! 竺竺竺竺兰一 玻璃化法并非是最近才提出来的。早在1 9 3 7 年，l u y e t 就指出玻璃化法可作为冰冻 保存生物体的一条途径 3 1 1 01 9 7 8 年，s k a e r 和f r a n k s 等在研究了用高分子聚合物( p v p ， h e s 等) 作为电镜生物样品制备的低温固定剂时，提出了在骤冷条件下可使细胞外实现 玻璃化。同时，b o u t r o n 和k a u f m a n n 日2 1 开始了一系列有关冻结的细胞内外非晶态剩余 溶液的性质的研究。1 9 8 1 年，f a h y 首先明确的提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可 在较慢的冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化。1 9 8 5 年，r a l l 和f a h y 用玻璃化 溶液保存鼠胚胎获得成功 3 3 1 是这种技术走向实用化的首次真正突破。次年，t a k a h a s i 等玻璃化法冻存了人单核白细胞 3 4 1 01 9 8 9 年，l a n g i s 等玻璃化法冻存了蔓青悬浮培养 物 3 5 1o 同年，u r a g a m i 等冻存了石刁柏体细胞胚 3 6 1o 此后，玻璃化法冻存植物材料取 得了一些进展，冻存的材料涉及茎尖”、愈伤组织 3 8 1 原生质体1 3 9 1 顶端分生组织和 多生芽簇 4 0 1 02 0 0 1 年，项黎新等“”以衣藻为材料，经玻璃化冻存后，恢复培养的存 活率可达3 1 4 5 ，且其生长规律与未冻存的衣藻相一致。由于玻璃化法具有简单、快 速等优点，生物材料的玻璃化冻存已成为低温生物学领域发展最快的生长点之一。 溶液是通过晶核形成和晶核生长而使自己结冰的。溶液在降温时，如果没有非均一 晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先成为过冷的溶液，它是低于冰点而不结冰的液 态，继续降温，均一晶核开始形成，这时候的温度叫均一晶核形成温度，也叫过冷点( t h ) 。 如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶；降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有 形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定形的玻璃状态，这是一种透明 的“固态”，此时的温度叫玻璃化形成温度( t 。) 。此时，既没有溶液效应对细胞的损伤， 也没有冰晶对细胞的机械损伤。在人工的超低温保存中，玻璃化分为部分玻璃化和完全 玻璃化。部分玻璃化一般是指胞内玻璃化。细胞在适度脱水后，快速投入液氮，由于迅 速通过了冰晶生长的温度区，从而胞内进入玻璃化“2 4 3 1 。从广义上讲，传统的低温保 存方法中包含有部分玻璃化。完全玻璃化是受高浓度保护剂作用后的细胞连同保护剂本 身在快速降温中都进入玻璃化，从理论上讲，任何液体都可以进入玻璃化，只要降温速 度足够快，例如，使纯水玻璃化需要的降温速度是1 0 ”秒 4 4 1 这实际上是不可能的， 有两种方法克服这个困难，一是使用高浓度的保护剂，二是增加静水压力。因为随着保 护剂浓度或静水压力的提高，均一晶核形成温度下降，玻璃化形成温度上升，这就可能 使两者相交，产生稳定的玻璃化。 对于一种理想的保护剂，根据其引起的玻璃化状态差异，f a h y 按溶液浓度划分为4 个范围“5 1 ( 如图) 。 竺! 兰竺兰竺竺竺竺 0 - 4 0 温 度 毛 。8 0 、 1 2 0 ii ii v 旦 争 。 、 - p + ， ，孓一。 一一一一， 2 0加6 0 猿度( * w ，w ) 理想保护剂的相界图 在浓度较低的范围i ，由于均一晶核和非均一晶核不可避免，真正的玻璃化状态不 会出现。在浓度稍高的范围i i ，t h 的拐点a 是可能发生玻璃化的最低浓度，然而它是 一种非常不稳定的玻璃态，随着温度的升高，不可避免的发生结冰或去玻璃化。因此， 这一浓度范围的保护剂用于组织和细胞的玻璃化冻存是不合适的。在t h t 。的范围i i i ， 稍慢降温，尽管会有非均一晶核出现，但不会有冰晶形成，溶液可直接进入t 。，成为玻 璃态。因此，t 。和t h 的交点b ，可能是玻璃化所需的最低保护剂浓度。最后，在范围 ，即使缓慢升温，也不会出现去玻璃化过程，不会产生任何晶核，整个系统是十分稳 定的。 虽然从理论上讲，范围的保护剂浓度对组织和细胞超低温保存是很理想的，但是， 对于许多生物系统来说，这样的高浓度是无法承受的，会产生毒性损伤。把各种保护剂 混合使用，对降低毒性是有益的，各种渗透性保护剂的玻璃化形成能力、毒性以及对细 胞的渗透能力都是不同的。把1 ，2 一丙二醇加入到甘油、乙二醇中，可使后者在玻璃形 成能力提高的同时又减轻前者的毒性。使用非渗透性的高分子聚合物保护剂如p v p 、 p e g 、h e s 等作为加入混合物的一部分，也可明显地使渗透性保护剂的浓度降低“”( 见 表) 。 竺竺竺竺竺竺竺兰竺兰一 加6 ( w v ) p v p d m s o ( d ) 2 1 ( 2 1 ) 1 1 ( 1 2 )5 9 ( 6 3 ) 4 6 ( 4 9 ) d + 乙酰胺( a ) ( d a ) 2 3 ( 2 ，7 )1 3 ( 1 5 ) 6 6 ( 77 ) 4 6 ( 5 3 ) 6 h e s + d a 2 6 1 47 35 0 6 h e s + 蔗糖+ d a 2 5 1 47 24 8 6 p e g 8 0 0 0 + 甘油 2 71 56 66 1 注：o q 每l o m o l 水中含有的保护剂摩尔数； m - 重量摩尔浓度；m - 体积摩尔浓度 ( w v ) 体积百分浓度。 括号中的数字是未添加p v p 时所需的浓度。 由于细胞内包含了高浓度的蛋白质，这也同时可降低细胞内玻璃化所需的渗透性保 护剂的浓度。而细胞外通过加入非渗透性聚合物保护剂，将渗透性保护剂减少到最低值， 使胞内外既能达到玻璃化，又可以减少对细胞的毒性。实验表明，非渗透性保护剂的浓 度以6 ( w v ) 左右较适宜。更高的浓度对提高细胞存活率并无好处。另外，为减少 保护剂毒性，使用时尽可能在低温下进行处理操作，在高浓度下暴露的时间尽可能短。 还应选择适当的载体溶液，并使用一些特殊的低温保护剂的毒性中和剂。 由于玻璃化法没有繁琐的降温过程，是把生物材料直接投入液氮中保存，因此保护 剂的正确筛选和处理，已成为玻璃化冻存的关键。总之，- - e e 理想化的保护剂应满足： 一是尽量缩短t 。( 溶液冰点) 与t 。间的温度差，二是不存在均一晶核界线。 六玻璃化法在动物胚胎冻存中的应用 自1 9 8 5 年r a i l 和f a h y 采用玻璃化保护剂v s l ( 含2 0 5 w vd m s 0 ，1 5 5 w v 乙酰 胺，1 0 w v 丙二醇年1 3 6 w v p e g 8 0 0 0 ，均溶于p h 8 0 的改良的d u l b e c c o s 缓冲液中) ， 玻璃化冻存小鼠胚胎获得成功订 之后，用玻璃化方法冻存动物胚胎得到应用并开始迅 速地发展。19 9 0 年，l a n d a - 与t e p l a 亦成功冻存了鼠胚胎1 4 7 1 019 9 1 年，r i h a 等”冻存 了牛的胚胎。1 9 9 0 年，s t e p o n k u s 1 4 9 1 1 9 9 2 年，m a z u r1 5 0 1 t 冻存了果蝇的胚胎。 近年来的发展亦是很快，主要致力于改进玻璃化方案以提高胚胎存活率。 1 9 9 7 年，s o h b o s h i 等”设计了一系列五个实验，用玻璃化保护剂( 4 0 v v 乙 二醇，6 w v 聚乙二醇，0 5 m 蔗糖，溶于p b s 中) ，对在体外发育7 8 天的牛胚胎采用 不同的方法进行冻存。并对冻融后的活率用孵化率进行评估。实验表明，含聚乙二醇的 玻璃化保护剂可用于牛胚胎的冻存，而且，二步法有助于提高体外存活率。 1 9 9 8 年，a m a r t i n e z 等”扣采用四种玻璃化保护剂，分别为：丙二醇和甘油( p g + g l y ) ； 乙二醇，f i c o l l 和蔗糖( e f s ) ；改良的e f s ( e f s m ) ；乙二醇和甘油( e g + g l y ) ，以此来 冻存牛胚胎，以体外培养和移植后的体内发育情况来评估不同成分冻存液的保护效果。 1 9 9 9 年，s c s e h 等”采用的玻璃化保护剂为：d u l b e c c o sp b s 含2 5 v s 3 ，1 0 甘油，2 0 丙二醇。比较4 c 或室温平衡这两种处理方法对小鼠胚胎冻融后发育的影响， 结果表明，4 的平衡预处理比室温的平衡能提高1 0 倍的存活率。 竺兰竺兰竺兰竺 】9 9 9 年，m l a n e 等嗽1 采用新型的c r ) r 0 1 0 0 p 无容器法冻存鼠与人的胚细胞，结果 发现冻融后的胚细胞的孵化率、体外发育的活率、植入率与胎儿发育率与未冻存的相似。 2 0 0 0 年，m s u g i m o t o 等1 采用改良的v s l 玻璃化保护剂冻存幼鼠卵巢，以自体 移植的方式来检测玻璃化冻存后的活率，结果显示与未冻存的卵巢活性相差不大。 2 0 0 0 年，a s a e e d 等巧6 1 用两种传统的非平衡法，分别用玻璃化保护剂：v ( 3 5 8 m e g ，2 8 2 md m s o 置于加入2 0 f c s 的p b s 中) 和r f ( o 2 5 m 蔗糖，2 2 5 m e g ，2 2 5 m d m s o ，置于加入2 0 f c s 的p b s 中) 冻存了来自兔与猪的不同类型的丘细胞( c u m u l u s c e l i s ) 。结果显示，在冻存之前，如果将丘细胞分解为小细胞群，这能够提高其解冻后 的存活率。 2 0 0 0 年，朱士恩等巧7 1 用e f 4 0 溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷 冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟，体外受精和体外培养获得的早期囊胚，分别作两 步法和一步法处理，解冻胚胎的继续发育率分别为8 0 ，7 8 和5 0 ，与对照组的发 育率( 8 8 ) 无显著性差异。 2 0 0 1 年，e s u n g 等巧钔提出t t a x o l 作为一种细胞骨架稳定剂，对鼠卵母细胞玻璃化 冻存有一定的保护作用。 2 0 0 1 年，y y o s h i m a s e 等瞄9 1 冻存人类胚细胞，经快速玻璃化冻存后，解冻立即移植， 使用的玻璃化保护剂含e g 和d m s o 。以6 4 , 时或过夜后胚胎发育的形态学观察来确定存 活率：3 6 4 5 ( 8 0 ) ，植入率：7 3 2 ( 2 1 9 ) ，怀孕率6 1 8 ( 3 3 3 ) ，其中一例成功产 下健康婴儿。 七海藻糖在低温保存中的保护作用 海藻糖( t r e h a l o s e ) 是一种非还原性二糖，有( a ，a ) 、( b ，p ) 、( ，b ) 3 种 光学异构体。天然存在的海藻糖一般为( c l ，a ) 构型，是有2 个分子葡萄糖以a ，c l 一1 1 键连接而成，分子式为c 1 2 h 2 2 0 2 h 2 0 ，相对分子量为3 7 8 3 3 ，白色结晶，化学性 质极稳定，无毒无害，不会焦糖化。海藻糖具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、 干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。由于 海藻糖具有广泛而独特的生物学功能，受到人们的密切关注，以至于引发了世界性的海 藻糖的研究和开发热潮。海藻糖成为极受瞩目的天然物质，不仅是因为它具有独特的理 化性质，更重要的是它对生物体组织和生物大分子具有非特异性保护作用。它在各种严 酷的环境下，对生物体膜、膜蛋白、d n a 等发挥着保护功效。使海藻糖身价倍增的重 要原因是外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有良好的非特异性保护作用。过去 十几年来，对糖类在膜、蛋白质和细胞脱水中的稳定作用进行了广泛的研究。近几年来 的结构化学研究表明，由于几乎所有物质都能够转变成无定形态的普遍性，以及无定形 固体的种种应用，使人们对非晶态( 或无定形态) 固体的兴趣有了极大的增加。物质由 于外界的作用，如干燥、冷冻等，减少了体系中的自由水，就有可能使物质成分由胶质 态( 晶态) 转变成玻璃态( 非晶态或无定形态) ，即玻璃态转变，这一转变点的温度被 称为玻璃态转变温度( g l a s st r a n s i t i o nt e m p e r a t u r e ，简称t g ) 。1 9 8 9 年，g r e e n 等”提 出了海藻糖的高效力生物保护作用与它的玻璃态形成有关，糖类在生化保护作用中效力 的顺序由强到弱依次为海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖，这恰好与它们玻璃态转变温度 ( t g ) 由高到低的顺序一致。海藻糖具有高t g 值常常被认为是它在生物保护作用中比 其它糖类具有优越性的原因。w e n d e l l 等”研究发现样品贮存期间，海藻糖能在高于 t g 温度提供较好的蛋白质保护作用。 关于海藻糖对生物分子的保护作用，人们进行了大量的探索，提出了种种假说。目 前主要有两种假说解释海藻糖稳定生物分子的机制。一种称为“水替代”假说 6 2 1 ， 、 竺竺竺竺兰竺三竺竺竺兰 该假说认为生物体中的蛋白质、糖、脂类和其它大分子物质周围均包围着一层水膜，这 层水膜对维持生物大分子的结构和功能是必不可少的。当生物大分子失去维持其结构和 功能特性的水膜时，海藻糖能在生物大分子的失水部位以氢键形成连接，形成一层保护 膜以代替失去的结构水膜。另一种称为“玻璃态”假说1 6 3 1 该假说认为通过海藻糖玻 璃化转变的趋势，导致无定形连续相的形成，在结构上与玻璃态的冰相似，在这种结构 中分子运动和分子变性反应非常微弱。目前，这两种假说还不能完全解释现有的实验现 象，如海藻糖与葡萄糖对限制性内切酶稳定性的影响的显著差别是与“水替代”假说不 符的；同样，“玻璃态”假说也有一些不能解释的问题，如高温下海藻糖对生物制品的 稳定性问题。因此，海藻糖保护生物活性物质的机理，仍需深入研究。 总之，海藻糖是一种非特异性天然保护剂，具有保护生物组织、细胞和生物大分子 的作用，为其在食品、生命科学和医药卫生等领域的应用中展开了广阔的前景。随着 对海藻糖作用机理研究的进一步深入，人们将会发现海藻糖具有更多更大的用途。 本论文将海藻糖引入玻璃化冻存液的配方，对保存液进行改进，与原配方相比，取 得了预期的效果。这是对海藻糖在低温保护脐血干细胞方面的一次崭新的尝试，并再一 次证明了海藻糖对生物制品的低温保护作用。 八玻璃化法冻存脐血干细胞的问题及前景 玻璃化冷冻方法的优点显而易见，但是其中也有几个问题需要进一步研究和完善。 首先，玻璃化法中高浓度保护剂的使用增加了对细胞的化学毒性，这是一个突出矛 盾。理想的冷冻方法应是含低浓度防冻剂的玻璃化冷冻方法。一些学者研究开发了新型 防冻剂，如植物抗冻因子，抗冻蛋白( a f p ) 等天然抗冻因子。这些防冻剂在低浓度使 用时有较好的抗冻效果，且对细胞无毒害作用。 其次，去玻璃化是玻璃化冷冻中的主要危险。去玻璃化是指已玻璃化的溶液几乎都 含有冰核，随着缓慢升温，在自然热转化的同时，晶核融化，重新结冰而形成大晶体。 而a f p 被认为可以抑制去玻璃化，从而提高细胞的存活率。差示扫描量热法检测发现， 2 ，3 一丁二醇溶液中加入l m m la f p ，可以提高溶液去玻璃化点，使临界降温速率下降 7 0 0 0 倍1 。由于减小了对降温速率的制约，玻璃化保护剂的浓度可以相应地降低，对 细胞的毒性可以减小，被冻样品的体积可以增大，这将有利于克服玻璃化冻存中的一部 分难题。 第三，不同于传统的超低温保存，由于玻璃化冻存中保护剂的浓度很高，化冻后的 洗涤被认为很重要，它既除去