（测试计量技术及仪器专业论文）奶粉蛋白质含量光学快速检测方法的研究.pdf

中文摘要 近年来不断出现的奶粉质量问题正日茄引起人们对奶粉质量监控的重视。如 何快速检测奶粉的质量成了一个亟待解决的问题。目前奶粉的主要质量问题是蛋 白质含量不达标。传统的蛋白质检测方法耗时较长、对操作人员的要求较高，因 而无法满足现代质量控制的要求，因此需要研究一种简单快速的检测奶粉中蛋白 质含量的方法。本文研究了两种快速检测奶粉蛋白质的方法：近红外漫反射光谱 法和染料结合法，这两种方法都属于光学方法。对近红外漫反射光谱方法进行了 可行性研究，对染料结合法进行了实验研究及仪器开发，并对这两种光学方法进 行了比较。 近红外检测技术具有检测速度快、不破坏样品，能够实现多参数同时检测， 便于在线分析等特点，在食品分析领域具有广阔的应用前景。本文采用漫反射分 析技术，在美国n i c o l e t 公司的近红外傅立叶交换光谱仪上进行了奶粉蛋白质含 量检测的探索性研究。首先确定了奶粉样品光谱的扫描次数，装样条件，评价了 进样操作带来的误差。研究了s n v 和m s c 预处理算法，采用偏最小：二乘回归 ( p l s ) 算法建立了奶粉蛋白质的模型，经过s n v 预处理后模型的相关系数为 o ，9 8 ，r m s e p 为0 4 3 。实验结果表明s n v 和m s c 算法都可以有效地减小粒 子大小不同，进样密度不同等引起的散射干扰，提高了建模精度。为了减少建模 计算工作量，利用蛋白质在近红外光谱区的1 1 个特征吸收峰进行了波长优选， 建模的相关系数为o 9 5 ，r m s e p 为0 。6 8 。 染料结合法具有分析速度快，检测成本低的优点。本文首先研究了酸性橙 1 2 染料的光谱特性，确定了奶粉先加水溶解再与染料反应比奶粉直接与染料反 应实验误差更小，模型线性更好。验证了通过测量4 8 3 n m 处的酸性橙1 2 的吸光 度值来获得奶粉蛋白质含量的可行性。在仪器设计部分，介绍了系统总体设计， 电路及单片机控制系统设计。仪器采用发光二极管作为光源，取代传统的光源和 分光器件，简化了仪器结构、降低了仪器成本。仪器的稳定性为0 ，1 2 。利用己 知蛋白质浓度的奶粉样品对仪器进行了标定，蛋白质含量与吸光度的相关系数为 o 9 9 4 ，测量的标准偏差为o 2 2 ，基本可以满足蛋白质测量的要求。 关键词：近红外漫反射光谱法，染料结合法，奶粉，蛋白质含量，分析仪 a b s t r a c t n o w a d a y s ，f a c i n ge v e r - i n c r e a s i n gq u a l i t yp r o b l e mo fm i l kp o w d e r ，m o r ea n d m o r ep e o p l eh a v er e a l i z e dt h a ti ti si m p o r t a n tt os u p e r v i s et i m e l yt h eq u a l i t yo fm i l k p o w d e r s t h em a i nq u a l i t yp r o b l e mo fd r ym i l ki st h a tt h ep r o t e i nc o n t e n ti st o ol o w t or e a c ht h es t a n d a r do fo f f i c i a lr e q u i r e m e n t ，r o u t i n ec h e m i c a lm e t h o d sf o rp r o t e i n d e t e r m i n a t i o na r cs l o wa n de x p e n s i v e ，w h i c hc a n ts a r i s f yt h er e q u i r e m e n to fm o d e r n q u a l i t yc o n t r 0 1 i ti su r g e n tt od e v e l o pas i m p l ea n df a s td e t e r m i n i n gm e t h o d i nt h e p a p e rt w oo p t i c a lm e t h o d s ，n e a ri n f r a r e dd i f f u s er e f l e c t a n c es p e c t r o s c o p ya n dd y e b i n d i n gm e t h o d ，a r ec o m p a r e d n e a ri n f r a r e dd i f f u s er e f l e c t a n c es p e c t r o s c o p yh a sb e e nu s e dw i d e l yo nf o o d a n a l y z i n gf o ri t so b v i o u sa d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs p e e d ，s i m u l t a n e o u sn o n - d e s t r u c t i v e m e a s u r e m e n to fan u m b e ro fc o n s t i t u e n t s t h ef u n d a m e n t a lr e s e a r c ho nq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fp r o t e i nc o n t e n ti nd r ym i l ki sp e r f o r m e do nn i c o l e tf o u n e rn e a ri n f r a r e d s p e c t r o m e t e rw i t hd i f f u s er e f l e c t a n c es p e c t r o s c o p y e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o na n d s a m p l i n gm e t h o da r ec a r e f u l l ys e l e c t e d t - v v ok i n d so fp r e t r e a t i n gm e t h o d s ，s n va n d m s c ，a r ed i s c u s s e dw h i c hc a ne f f e c t i v e l yr e m o v et h em u l t i p l i c a t i v ei n t e r f e r e n c e so f s c a t t e r , s a m p l i n gd e n s ea n dp a r t i c l es i z e p l sc a l i b r a t i o n s a r ep e r f o r m e do nm i l k p o w d e rw i 也t h ew h o l eb a n d t h ec o r r e l a t i o na n dr m s e po ft h em o d e lw i t hs n v p r e t r e a t m e n ti so 9 8a n d0 4 3 r e s p e c t i v e l y t h ec o r r e l a t i o na n dr m s e po ft h e m o d e lu s i n gs e l e c t e dl lw a v e l e n g t h st or e d u c et h ec a l c d a t i o no fm o d e l i n gi so 9 5 a n do 6 8 ，r e s p e c t i v e l y d y eb i n d i n gm e t h o dm e a s u r ep r o t e i nc o n t e n t o fd r ym i l kb yc o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o no fu n b o u n da c i do r a n g e1 2d y e 、城t ht h ea d v a n t a g eo ff a s t a c c u r a t e a n dl o wc o s t t h ev i s i b l es p e c m m ao fa c i do r a n g e1 2i sa n a l y z e d a c c o r d i n gt ot h e r e s u l to fe x p e r i m e n t ，t h ep r o c e d u r et h a tf w s f l yd i s s o l v e sp o w d e r e dm i l ki nd i s t i l l e d w a t e rc a np r o v i d em o r ea c c u r a t em o d e l i n gr e s u l tt h a nt h a tw i 也o u tt h ed i s s o l v i n g p r o c e d u r e i ti sf e a s i b l eb ym e a s u r i n gt h ea b s o r b a n c eo fa c i do r a n g e1 2a t4 8 3 n m t o d e t e r m i n et h ep r o t e i nc o m e n to f 1 i l kp o w d e r as i n g l eb e a mp r o t e i na n a l y z e ri s d e s i g n e du s i n gm o n o c h r o m a t i cl e d a sl i g h ts o u r c ea n d p h o t o c e l la sd e t e c t o r i nt h i s p a p e r ，t h ew h o l es y s t e mi si n t r o d u c e di n c l u d i n ga m p l i f y i n gc i r c u i t ，ai dc o n v e r s i o n s i n g l e c h i pm i c r o c o m p u t e rc o n t r o ls y s t e m t h es t a b i l i t yo ft h ei n s t r u m e n ti sa b o u t 0 1 2 t h ea n a l y z e ri sc a l i b r a t e du s i n gm i l kp o w d e r 谢也p r o t e i nd e t e r m i n e db y k j e l d a h lm e t h o d t h ec o r r e l a t i o na n ds t a n d a r dd e v i a t i o no ft h em o d e li so ，9 9 4a n d o 2 2 ，r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r e ，t h eh o m e - m a d ed e v i c ec a nm e e tt h er e q u i r e m e n to f t h ep r o t e i nm e a s u r e m e n t k e yw o r d s ：n e a ri n f r a r e dd i f f u s er e f l e c t a n c es p e c t r o s c o p y , d y eb i n d i n gm e t h o d ， d r ym i l k ，p r o t e i nc o n t e n t ，a n a l y z e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：潴日鸥欢 签字日期：训 年g 月2 牛f ：j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫壅盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫凄盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：襦旯i 鹚鸯欠 导师签名黼l 签字日期： 却步年疗月呻曰签字日期：细j 啤量月t p n 第一章绪论 1 1 研究的目的及意义 第一章绪论 随着人类生活水平的提高，乳制品在人类生活中的地位越来越重要。奶粉是 一种营养价值高，储藏期长，方便运输的产品。虽然液态牛奶正在逐渐取代传统 的奶粉市场，但是奶粉在经济不发达地区仍然有广大的市场空间。并且近些年来， 功能性乳粉开发很快，主要有适合胎儿发育和哺乳期产妇的奶粉，婴幼儿食用的 母乳代用品奶粉：预防骨质疏松、降低胆固醇、提高人体抗氧化的中老年奶粉等， 这些都是液态牛奶无法取代的市场。2 0 0 4 年4 月，“阜阳劣质奶粉事件”成为全 国关注的焦点，引起了人们对奶粉质量的重视。国家质检总局2 0 0 4 年一季度公 布的奶粉产品质量抽蠢结果表明，目前市场上各类奶粉产品的质量状况难以令人 满意。在公布的抽检奶粉产品中，大型乳制品企业的产品合格率不到8 0 。中 小型企业的产品合格率仅在4 0 左右。数据显示，奶粉产品的主要质量问题有 两个：一是微量元素指标不符合标准规定：二是蛋白质含量过低。 蛋白质是奶粉中最重要的营养成分之一，其中含有人体所必需的全部氨基 酸；不同生长发育阶段的婴幼儿及特殊人群与正常成人对蛋白质的需求不尽相 同。蛋白质含量是衡量奶粉中营养成分含量的重要参数，直接反映奶粉的产品质 量状况。因此，国家标准对奶粉蛋白质含量有很严格的规定和要求。但是，在对 乳制品进行监督检测及执法过程中，由于缺乏快速便捷的检测手段，工商执法部 分无法快速将劣质奶粉从市场上剔除。目前急需研制出一种能够快速检测出奶粉 中蛋白质含量的仪器，把好奶粉流通环节的质量关。同时，在竞争激烈的奶粉市 场上，高质量和低成本的产品是企业的立身之本，如何快速准确地分析奶粉的品 质，控制奶粉质爨已是一个迫在眉睫的重要课题。 1 。2 现有方法及检测现状 目前，测量奶粉中蛋白质含量的方法主要有半微量凯氏定氮法，紫夕 线吸收 光谱法，染料结合法和近红外光谱法等。 1 2 1 半微量凯氏定氯法 半微量凯氏定氮法的原理是将被测样品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋 第一章绪论 自质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后通过碱化蒸馏使氨游离，用硼 酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含 量。该方法是国家标准中所规定的蛋白质测定方法，要求同样品的两次平行测 定结果之差不得超过平均值的1 5 u j 。半微量凯氏定氮法具有应用范围广，灵 敏度较高等优点。但是其中长达数小时之久的消化过程决定了该法只能在实验室 完成。而且无论对实验室的条件，还是对检测人员的素质，均有较高的要求，且 检测过程中必须用浓硫酸加热，因此会产生大量有害气体，不但污染环境，甚至 危害操作人员健康。不能满足奶粉生产企业和质量监督部门对快速检测的需要。 1 2 2 紫外线吸收光谱法 奶粉中蛋白质含量可以利用紫外光谱法测定，测定原理是奶粉中蛋白质及其 降解产物的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用，并且在 定浓度范围内，光吸收程度与蛋白质浓度呈线性关系，因此通过测定蛋白质溶液 的吸光度，并参照事先用半微量凯氏定氨法测定蛋白质含量的标准样品所作的标 准曲线即可求出样品中蛋白质的含量。2 0 0 4 年，候冬岩，回瑞华等人利用该方 法在2 8 0 h m 最大吸收波长处测量蛋白质含量冈。本法常用于生化研究，具有操作 简便迅速的特点，但由于非蛋白质物质在紫外部分也可能引起光吸收，又由于光 散射的干扰，所以分析精度不高，因此在食品分析领域，并不能为分析工作者广 泛接受。 1 2 3 近红外光谱法 近红外光谱分析技术作为“绿色检测技术”的代表，具有显著提高分析效率， 降低人工和生产成本的潜能，近年来在分析测试领域，特别是在在线分析和二 业 控制领域发挥着越来越重要的作用。在农业、食品工业、石油工业、制药工业和 临床医学等领域，近红外光谱技术都有着成功的应用。近红外光谱的常规分析与 紫外可见光谱类似，分为透射光谱和漫反射光谱。在实际中，要根据不同的样品 性质，采用不同的分析技术。在奶粉质量检测中，大多采用漫反射光谱分析技术。 1 9 6 8 年b e ng e r a 和n o r r i s 研究了脂肪含量对近红外光谱的影响，并首次将多 变量回归用于各个成分的检测。1 9 7 8 年c a s a d o 等人分析了奶粉中脂肪、蛋白质、 湿度含量，获得的s e c 分别为0 1 2 5 ，0 1 9 3 和0 0 9 5 l 3 1 。1 9 8 3 年，b a e r 等人 采用近红外漫反射光谱法测量脱脂奶粉和乳清粉的湿度、脂肪、蛋白质和乳糖含 量，用多元线性回归( m l r ) 建立模型【4 】；对于蛋白质测量采用7 个波长点数， 相关系数为0 9 1 ，s e p 为0 4 3 8 。 在国内，魏少华等人采用f o s s 公司的n i r s y s t e m s5 0 0 0 光谱仪，波长范丽 第一章绪论 白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铰，然后通过碱化蒸馏使氯游离，用硼 酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，郎为蛋白质台 量。该方法是国家标准中所规定的蛋白质测定方法，要求同样品的两次平行测 定结果之差不得超过平均值的i5 i lj 。半微量凯氏定氮法具有应用范围广，是 敏度较高等优点。但是其中长达数小时之久的消化过程决定了该法只能在实验室 完成。而且无论对实验室的条件，还是对检测人员的素质，均有较高的要求，且 检测过程中必须用浓硫酸加热，因此会产生大量有害气体，不但污染环境，甚至 危害操作人员健康。不能满足奶粉生产企业和质量监督部门对快速检测的需裴。 1 2 2 紫外线暇收光谱法 奶粉中蛋白质含量可以利用紫外光谱法测定，测定原理是奶粉中蛋白质及其 降解产物的芳香环残基在紫外医内对一定波长的光具有选择吸收作用，并且在一 定浓度范围内，光吸收程度与蛋向质浓度呈线性关系，因此通过测定蛋白质溶液 的吸光度，并参照事先用半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样品所作的标 准曲线即可求出样品中蛋白质的含量，2 0 0 4 年，候冬岩，回瑞华等人利用该方 法在2 8 0 h m 最大吸收波长处测量蛋白质含量【2 j 。本法常用于生化研究，具有操作 简便迅速的特点，但由于非蛋白质物质在紫外部分也可能引起光吸收又由于光 散射的干扰，所以分析精度不高，因此在食品分析领域，并不能为分析工作者，“ 泛接受。 1 2 3 近红外光谱法 近红外光谱分析技术作为“绿色检测技术”的代表，具有显著提高分析效率， 降低人工和生产成本的潜能，近年来在分析测试领域，特别是在在线分析和i i 业 控制领域发挥着越来越重要的作用。在农业、食品工业、石油工业、制药工业和 临床医学等领域，近红外光谱技术都有着成功的应用。近红外光谱的常规分析与 紫外可见光谱类似，分为透射光谱和漫反射光谱。在实际中，要根据不同的样品 性质，采用不同的分折技术。在奶粉质量检测中，大多采用漫反射光谱分析技术。 1 9 6 8 年b e ng e r a 和n e r r is 研究了脂肪含量对近红外光谱的影响，并苣次将多 变量回归用于各个成分的检测。1 9 7 8 年c a s a d o 等人分析了奶粉中脂肪、蛋白质、 湿度含量，获得的s e c 分别为0 1 2 5 ，0 1 9 3 和0 0 9 5 ”j 。1 9 8 3 年，b a e r 等人 采用近红外漫反射光谱法测量脱脂奶粉和乳清粉的湿度、脂肪、蛋白质和乳糖含 量，用多元线性回归( m l r ) 建立模型 4 1 i 对于蛋白质测量来用7 个波长点数， 相关系数为0 9 l ，s e p 为0 4 3 8 。 在国内，魏少华等人采用f o s s 公司的n i r s y s t e m s5 0 0 0 光谱仪，波长范吲 在国内，魏少华等人采用f o s s 公司的n i r s y s t e m s5 0 0 0 光谱仪，波长范刚 第一章绪论 自质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后通过碱化蒸馏使氨游离，用硼 酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含 量。该方法是国家标准中所规定的蛋白质测定方法，要求同样品的两次平行测 定结果之差不得超过平均值的1 5 u j 。半微量凯氏定氮法具有应用范围广，灵 敏度较高等优点。但是其中长达数小时之久的消化过程决定了该法只能在实验室 完成。而且无论对实验室的条件，还是对检测人员的素质，均有较高的要求，且 检测过程中必须用浓硫酸加热，因此会产生大量有害气体，不但污染环境，甚至 危害操作人员健康。不能满足奶粉生产企业和质量监督部门对快速检测的需要。 1 2 2 紫外线吸收光谱法 奶粉中蛋白质含量可以利用紫外光谱法测定，测定原理是奶粉中蛋白质及其 降解产物的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用，并且在 定浓度范围内，光吸收程度与蛋白质浓度呈线性关系，因此通过测定蛋白质溶液 的吸光度，并参照事先用半微量凯氏定氨法测定蛋白质含量的标准样品所作的标 准曲线即可求出样品中蛋白质的含量。2 0 0 4 年，候冬岩，回瑞华等人利用该方 法在2 8 0 h m 最大吸收波长处测量蛋白质含量冈。本法常用于生化研究，具有操作 简便迅速的特点，但由于非蛋白质物质在紫外部分也可能引起光吸收，又由于光 散射的干扰，所以分析精度不高，因此在食品分析领域，并不能为分析工作者广 泛接受。 1 2 3 近红外光谱法 近红外光谱分析技术作为“绿色检测技术”的代表，具有显著提高分析效率， 降低人工和生产成本的潜能，近年来在分析测试领域，特别是在在线分析和二 业 控制领域发挥着越来越重要的作用。在农业、食品工业、石油工业、制药工业和 临床医学等领域，近红外光谱技术都有着成功的应用。近红外光谱的常规分析与 紫外可见光谱类似，分为透射光谱和漫反射光谱。在实际中，要根据不同的样品 性质，采用不同的分析技术。在奶粉质量检测中，大多采用漫反射光谱分析技术。 1 9 6 8 年b e ng e r a 和n o r r i s 研究了脂肪含量对近红外光谱的影响，并首次将多 变量回归用于各个成分的检测。1 9 7 8 年c a s a d o 等人分析了奶粉中脂肪、蛋白质、 湿度含量，获得的s e c 分别为0 1 2 5 ，0 1 9 3 和0 0 9 5 l 3 1 。1 9 8 3 年，b a e r 等人 采用近红外漫反射光谱法测量脱脂奶粉和乳清粉的湿度、脂肪、蛋白质和乳糖含 量，用多元线性回归( m l r ) 建立模型【4 】；对于蛋白质测量采用7 个波长点数， 相关系数为0 9 1 ，s e p 为0 4 3 8 。 在国内，魏少华等人采用f o s s 公司的n i r s y s t e m s5 0 0 0 光谱仪，波长范丽 第一章绪论 为1 1 0 0 2 4 9 8 n m 。采集了3 0 0 个奶粉样品的漫反射光谱，光谱经过s n v 卜d 校d ：， 用改进的偏最d , - - 乘回归分析( m p l s ) 建立了定标分析模型，构建了相关系数为 0 ，9 7 3 ，s e c 为0 1 8 4 的分析模型【5 j 。有些研究机构在波通公司的型号为8 6 2 0 的奶粉分析仪上，测量了奶粉的漫反射光谱 6 , 7 , 8 1 ，用5 5 个高钙奶粉样品利用多 元线性回归算法建立了模型，蛋白建模的相关系数为0 9 6 ，s e c 为0 1 9 6 。 目前，波通和福斯公司都已经开发出基于近红外光谱法的奶粉分析仪，但是 由于缺乏有代表性的模型，这些产品的测量精度都不太让人满意，这也是近红外 光谱法需要解决的一个关键问题。同时其技术资料对我们都是保密的，在国内还 没有开发出专用型的近红外光谱仪。因此很有必要研究近红外漫反射光谱法在奶 粉成分测量中的可行性，开发出具有自主知识产权的专用型仪器。 1 2 4 染料结合法 在酸性条件下，样品蛋白质中的组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基与过量的偶氮 磺酸染料如酸性橙( a c i do r a n g e 1 2 ，一种单磺酸盐) 发生静电结合，形成不溶性的 复合物而沉淀析出。蛋白质含量与染料结合量之间存在正相关关系，剩余的没有 反应的染料浓度与蛋白质含量成反比。先对蛋白质含量不等的样品用半微量凯氏 定氮法测得蛋白质百分含量，然后用分光光度计测定未反应的染料溶液吸光度， 对二者进行数理统计，建立线性回归方程。利用建立的回归方程就可以根据末反 应的染料溶液吸光度来确定奶粉样品的蛋白质含量。可见，染料结合法实际上仍 然属于分光光度法。该方法与半微量凯氏定氮法相比，具有分析速度快，检测成 本低，灵敏度离的特点。除了可以用于奶粉蛋白质检测外，该方法还可以检测谷 物，豆制品，肉制品等食品的蛋白质含量。1 9 7 0 年，美国的u d y 公司研制出基 于该方法的蛋白质测定仪，该仪器的核心是传统的光电比色计，其测定的蛋白质 结果与凯氏定氮法的相关性达到了9 9 【9 】。另外，染料结合法已经成为美国的谷 物化学协会( a a c c ) i lo j 和国际公职分析化学家联合会( a o a c ) 【l l 】推荐的食品 蛋白质分析方法。但是在国内还没有相应的专用型仪器面世，也没有相关的标准 出台。因此对于该方法的研究具有较高的社会价值，存在很大的市场开发空间。 1 3 本文主要内容 以国内外已有的相关理论及研究成果为基础，结合本课题组现有的实验条件 和研究经验，本文研究了两种快速检测奶粉蛋白质的方法：近红外漫反射光谱法 和染料结合法，这两种方法都属于光学方法。对近红外漫反射光谱方法进行了可 行性研究，对染料结合法进行了实验研究及仪器开发，并对这两种光学方法进行 第一章绪论 了比较。本文主要工作集中在以下几个方面： 1 第二章阐述了分子吸收光谱的基础理论：介绍了分光光度计的结构组成 并重点介绍了紫外可见分光光度计和近红外光谱仪器的分类；光谱分析 技术的数据处理方法：介绍了奶粉的物理化学性质。 2 为了评价近红外漫反射光谱法在奶粉蛋白质测量中的可行性，第三章进 行了基础实验研究。在研究中首先确定了实验条件，比如选用的光谱仪 的参数设置，进样方式的确定，这些都需要通过实验来进行评价。采用 偏最小二乘( p l s ) 算法建立奶粉模型以评价近红外方法在奶粉检测中 的精度，研究了能够提高检测精度的预处理算法( s n v ，m s c 等) 、波 长优选等方法。为后续的仪器开发做了充分的基础研究工作。 3 染料结合法与近红外方法相比具有检测成本低的优点。其核心部件是光 电比色计。传统的比色计是采用滤光片等分光元件来实现分光的，随着 发光二极管技术的发展，我们希望能够通过采用尽量少的发光二极管甚 至希望只采用一个发光二极管来达到蛋白质测量的目的。在第四章中， 进行了染料结合法的可行性实验验证。通过调研确定了染料结合法所用 试剂的配置方法及样品处理方法，在美国海洋光学公司的u s b 2 0 0 0 光 谱仪上测量了酸性橙1 2 溶液的光谱，确定了其吸收峰。评价了奶粉蛋 白质含量与所测得的吸光度峰值的线性关系，确定了用单波长的吸光度 值预测奶粉蛋白质含量的可行性。 4 第五章介绍了简易的低成本的奶粉蛋白质测定仪的设计。文中详细介绍 了仪器的系统设计，光源和检测器选择，电路设计和软件设计：并对仪 器进行了稳定性评价和奶粉标定实验。 第二章奶粉蛋白质含量光学测量方法的基本理论 第二章奶粉蛋白质含置光学测量方法的基本理论 由于染料结合法的本质是获得染料的吸收光谱后进行定量分析，而近红外漫 反射光谱也属于分子吸收光谱，所以本章对采用分子吸收光谱法检测物质成分所 涉及到的基本原理和方法进行总体的介绍，主要内容包括：分子吸收光谱基本知 识、分光光度计的组成及分类、数据处理分析方法及评价指标，最后介绍了奶粉 的物理化学性质。 2 1 分子吸收光谱 光作用于物质时，有一部分光会被物质 吸收。改变入射光波长，并依次记下物质随 着波长变化对光的吸收程度，就得到该物质 的吸收光谱。每一种物质都有其特定的吸收 光谱，因此，可根据物质的吸收光谱来分析 物质的结构和含量。物质是由分子和原子组 成的，所以物质的吸收光谱实质上就是物质 内部的分子和原子的吸收光谱，称之为分子 光谱或原子光谱。分子光谱是由分子的3 种 不同运动状态即电子运动、各原子或原予团 之间的振动以及分子的转动所对应的能级问 的跃迁而产生的。图2 1 是最简单的双原予分 子能级示意图。从图中可以看出每种运动状 态都具有一定的能级，分子具有转动能级、 振动能级和电子能级。由于3 种能级跃迁所 需的能量不同，因此可以产生3 种不嗣的吸收光谱， 子光谱，它们处于电磁波的1 9 0 - - 4 1 0 6 n m 波段【i ”。 特征l i3 1 。 图2 1 分子能级示意图 即转动光谱、振动光谱和电 表2 1 显示了电磁波谱区的 施趣 考一 第二章奶粉蛋白质含量光学测量方法的基本理论 表2 1 电磁波谱区及其特征 光谱区波长t n m 特征 紫外光( u v )1 9 0 3 6 0离域n 电子的跃迁 可见光( v i s )3 6 0 7 8 0电子跃迁：如颜色的测量 近红外光( n i r ) 7 8 0 2 5 0 0 分子基频振动的倍频和合频 中红外光( i r )2 5 0 0 4 0 0 0 0 分子的基频振动( 伸缩、弯曲、扭曲) 远红外光( f i r )4 i 0 4 1 旷 分子的转动 紫外可见吸收光谱是电子能级的跃迁而产生的光谱，又称电子光谱。由量子 力学的相关理论【1 4 1 ，分子振动的频率包括基频、各级倍频与各种合频。分子可 以通过共振吸收，对环境中频率与分子的基频、倍频与合频相同的电磁波产生吸 收，这就是分子的基频吸收、各级倍频吸收与各种合频吸收。在中红外谱区的吸 收是分子的基频振动吸收，在近红外光谱区，吸收带主要是由含氢化学基团分子 振动的倍频或合频所致，这些化学基豳包括：c - h ( 甲基、亚甲基、芳基、羟基) ， 羟基o h ，巯基s h ，氨基n h 等。 2 2 朗伯一比尔定律 光与介质发生作用时，除发生光的反射现象和折射现象，还将发生光的吸收 现象。对于均匀分布的连续体系，光的吸收满足朗伯比尔定律，其数学表达式 为： a = l n ( i 。1 , ) = l n ( 1 t ) = a 。( 五) = 口。( 且) 巴上 ( 2 1 ) 其中： a ：吸光度，是波长的函数 而：入射辐射强度 五：透过辐射强度 g ：成分月的浓度( m g d l ) ：光程长( m ) n 。：成分h 的吸收系数( m g d l m ) n 透过率= x z o 对于吸收系数a ，它是物质本身的固有性质。实验证明，不同浓度的同一物 质在相同波数处具有相同的吸收系数：不同物质，在不同波数处吸收系数不同。 由 公式( 2 1 ) 的适用条件为： 第二章奶粉蛋白质含量光学测量方法的基本理论 ( 1 ) 吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸收度具有可加合性： ( 2 ) 辐射与物质的作用仅限于吸收过程，无荧光、散射光等现象； ( 3 ) 吸收物是一种均匀分布的连续体系。 朗伯一比尔定律确定了在理想情况下物质吸光度光谱与浓度的线性关系，在 实际应用中会有很多因素干扰，使其无法达到理想情况，这就需要相应的化学计 量学算法进行辅助处理。在利用紫步 可见光谱定量分析物质成分的时候，为了 保证测量精度，试样溶液的浓度不能过高或过低。计算表明，当 t = 3 6 8 ( a = 0 4 3 4 ) 时，浓度测量的相对误差最小：当t = 7 0 一1 0 ( a = 0 】5 5 一1 0 0 ) 范围内时，浓度测量的相对误差较小且变化不大，一般为2 左右；当r 7 0 时，浓度测量的相对误差都急剧增大【1 5 】所测试样的浓度要保证对应的 吸光度在0 1 5 5 一1 0 0 范围内变化，这也是第四章中提到的样品处理过程要考 虑的一个环节。 2 3 分光光度计 分光光度计又称光谱仪，具有分析精密度高、测量范围广、分析速度快 和样品用量少等优点，它一经问世就受到人们的高度重视，并不断被改进提 高，已经成为理化分析的重要仪器之一。本文的基础实验部分要用到紫外可 见分光光度计和近红外光谱仪。另外在光谱仪器设计的过程中也要考虑到仪 器的组成和比较各种光谱仪的特点，确定设计方案。在此先总体介绍分光光 度计的组成和分类。 2 3 1 分光光度计的组成 分光光度计一般由光源、分光系统、测样器件、检测器、数据处理和显示等 6 部分构成l i ”。 ( 1 ) 光源 对光源的基本要求是在所测量光谱区域内发射足够强的光辐射，并具有良好 的稳定性。一般来说，光源的亮度不成问题，要获得稳定的光谱主要是解决光源 的稳定性，光源的稳定性主要通过高性能的光源能量监控和可靠电路系统来实 现。目前，在紫外区使用氘灯或氢灯；在可见光区则使用钨灯。在近红外光谱仪 器中最常用的光源为溴钨灯。目前，发光二极管( l a s e r e m i s s i o n d i o d e ) 作为- 种新型光源正快速进入光谱分析领域。对个确定的l e d 所发出光谱的带宽是 确定的，将多个相邻波长的l e d 组合即可得到在确定范围内的连续波长的光源。 由于每个l e d 的发光强度在一定波长范围内可以调节得基本致，从而降低其 第二章奶粉蛋白质禽量光学测量方法的基本理论 它光源辐射得非线性问题。另外发光二极管极好的单色性使其在单波长或几个波 长的专业型光谱仪器中有广阔的应用前景。 ( 2 ) 分光系统 分光系统的作用是将复合光转化为单色光，是分光光度计的核心部件。根据 分光原理得不同，现在分光器件主要有滤光片、光栅、干涉仪、声光调制滤光器 等4 种类型。 ( 3 ) 测样器件 测样器件是指承载样品或与样品作用的器件。在紫外可见光区一般只能分析 液体样品，所以用的是吸收样品池，又称比色皿。吸收池的材料视使用在不同光 谱区而异，在可见光区使用玻璃吸收池，在紫外区使用石英吸收池。由于近红外 光及样品近红外光谱的特点，近红外光谱仪器的测样器件随测样方式的不同有较 大差异。就实验室常规分析而言，液体样品根据选定使用得光谱区域可采用不同 尺寸的玻璃或石英样品池；固体样品可以采用积分球或特定的漫反射载样器件； 有时根据样品的具体情况也可以采用些特殊的测样器件。在定位或在线分析中 经常采用光纤测样器件。 ( 4 ) 检测器 检测器由光敏元件构成，其作用是检测光与样品作用后携带样品信息的光信 号，将光信号转变为电信号，并通过模数转换以数字信号形式输出。检测器有草 通道和多通道两种检测方式。前者是经过光谱扫描，逐一接受每个波长下的光信 号：后者则同时接受指定光谱范围内的光信号。常用的检测器有光电池、光电倍 增管和光电二极管等。 ( 5 ) 控制及数据处理分析系统 现代光谱仪器的控制及数据处理分析系统是仪器的重要组成部分。一般由仪 器控制、采集和光谱处理分析两个软件系统和相应的硬件设备构成。前者主要功 能是控制仪器各部分的工作状态，设定光谱采集的有关参数，如光谱测量方式、 扫描次数、设定光谱的扫描范围等，设定检测器的工作状态并接受检测器检测的 光谱信息。光谱处理分析软件主要对检测器所采集的光谱进行处理，实现定性和 定量分析。 2 3 2 紫外可见分光光度计 紫外可见分光光度计按照光路结构可以分为单光束、双光束、双波长分 光光度计。单光束紫外可见分光光度计是一类结构较为简单、使用较方便的 常用分光光度计。从设计原理和结构方厩来看，单光束紫外可见光分光光度 计具有如下特点：单光束光路，从光源经试样到接收器只有一个光通道。在 第二章奶粉蛋白质含量光学测量方法的基本理论 使用过程中依次对参考样品和待测样品进行测定，然后将二次测定数据进行 比较或计算，才能获得最终的测定结果。 双光束紫外可见光分光光度计，双光束即从光源到检测器有2 条通路， 试样光路和参考光路。因此双光束分光光度计可以在2 条光路上几乎同时对 测试样品和参考样品进行测定，可直接获得试样的测定数据，还可以自动补 偿测定时因测试条件的随枫变化( 如温度变化、电源电压变化) 或试样中的 非测定组分的干扰所引起的影响，比单光束仪器使用更方便、准确。 双波长分光光度计的工作原理是从同一光源发出的光分为两束，分别经2 个单色器后得到两柬不同波长单色光，经斩光器使两束光以一定频率交替照 射同一样品，然后经过检测器显示出2 个波长下的吸光度差值。双波长分光 光度计既可作痕量分柝，又可作高含量测定：既能测定浑浊样品，又可同时 测定互相干扰的2 个组分甚至3 个组分；还可以利用双波长分光光度计获得 微分光谱和进行系数倍率法测定。 2 3 3 近红外光谱仪器 近红j l - 光谱仪器【l 。7 】的分类有很多釉，有简单的在个或几个波长下测定的专 用型滤光片型仪器，也有在近红外波长范围内测定全谱信息的研究型仪器。从仪 器的分光器件看，可以主要分为4 种类型：滤光片、光栅分光、傅立叶变换和声 光调制滤光器。 ( 1 ) 滤光片型近红外光谱仪器 滤光片型近红外光谱仪器早在5 0 年代就己得到使用，该仪器采用滤光片作 为单色光器件，在农副产品的质量评定及分析、铡试中得到了广泛的应用。滤光片 型近红外光谱仪器可分为固定滤光片和可调滤光片两神形式。光源发出的光经过 滤光片得到一定带宽的单色光，通过测样器件与样品作用后由检测器检测，记录 光能量的变化。 ( 2 ) 色散型近红外光谱仪器 色散型近红外光谱仪器中单色器一般采用扩展的光栅或棱镜系统，并且由步 进电机与光谱同步切换检测器。另一种仪器是以现代二极管阵列技术为基础。在 这种技术中，来自光源的自光，首先进入样品室，与样品发生相互作用，再进入 单色器产生单色光，经色散的光进入二极管阵歹i j 检测器，得到样品的吸收光谱。 在以现代二极管阵列检测器为检测元件的光谱仪器中，单色器的谱带宽度与二极 管阵列中二极管间距有关，每个谱带内只能得到一个数据，因此光谱的分辨率取 决于二极管阵列中二极管数目。这种设计的最大优点是扫描速度快，整个光谱的 扫描时间不到2 s 。 第二章奶粉蛋白质含量光学测量方法的基本理论 ( 3 ) 傅立叶变换近红外光谱仪器 傅立叶变换光谱技术是利用干涉图和光谱图之间的对应关系，通过测量“r 涉 图和对干涉图进行傅立叶积分变换的方法来测定和研究光谱的技术。与传统的色 散型光谱仪相比，傅立叶变换光谱仪能同时测量、记录所有波长的信号，并以更 高的效率采集来自光源的辐射能量，具有更高的信嗓比和分辨率。 ( 4 ) 声光可调滤光器近红外光谱仪器 用声光可调滤光器( a c o u s t o o p t i ct u n a b l ef i l t e r ，a o t f ) 作为分光系统， 被认为是9 0 年代近红外光谱仪器最突出的进展。a o t f 是利用超声波与特定的 晶体作用而产生分光的光电器件。a o t f 与通常的单色器相比，通过声光调制产 生单色光，即通过超声射频的变换实现光谱扫描。光学系统无移动部件，波长切 换快，重现性好，程序化的波长控制使这类仪器的应用具有更大的灵活性。 2 4 光谱分析技术 2 4 1 数据处理方法 染料结合法的数据处理方法很简单，利用最小二乘一元线性回归算法，即可 建立吸光度与浓度的模型。由于近红外光谱信息重叠严重，所以需要经过复杂的 数据处理才能提取所需要的信息。近几年由于化学计量学的出现和应用，使得光 谱分析进入了一个新时代，光谱和化学计量学的结合已成为一种快速和高效的分 析技术，即在很短时间内能够提供出被测样品的几种甚至几十种性质数据。化学 计量学是对化学测量数据进行计算分析的。就近红外光谱分析雨言，实际测褥的 光谱数据不仅包括了被测样品的组成和结构信息，而且还包括了噪音。噪音包括 测量误差，不同组分之闻的干扰等。由于噪音的影响，尤其在复杂分析体系中， 常常不能满足光谱分析的基础一一比尔定律成立的条件。而化学计虽学方法可有 效地剔除这些噪音。 图2 - 2 近红外光谱分析方法示意图 第二章奶粉蛋白质含量光学测量方法的基本理论 近红外光谱分析技术常使用“黑匣子”分析技术，即间接测量技术，其方法 流程图如图2 2 所示，即通过对样品光谱和其质量参数进行关联，建立校正模型， 然后通过校正模型预测样品的组成和性质的方法。样品的光谱包含了组成与结构 信息。而质量参数也与其组成、结构相关。因此，在样品的近红外光谱和其质：璧 参数间存在着内在联系。使用数学方法对两者进行关联，可确立这两者间的定量 或定性关系，即校正模型。建立模型后，只要测量未知样品的近红外光谱，根据 校正模型和样品的近红外光谱就可以预测样品的质量参数。近红外光谱分析常用 的化学计量学方法为多元校正方法，主要包括：多元线性回归( m l r ) 、主成分 分析( p c a ) 、主成分回归( p c r ) 、偏最小二乘法( p l s ) l 1 8 o 其中p l s 是近红 外光谱分析中使用最多、效果最好的一种方法。它是一种将因子分析和回归分析 结合的方法。p l s 通过因子分析将光谱压缩