（应用化学专业论文）粘质沙雷氏菌及其酶对芳香化合物的氧化作用研究.pdf

粘质沙雷氏菌及其酶对芳香化合物的氧化作用研究 摘要 本文研究了粘质沙雷氏菌及其酶对芳香化合物的氧化作用。该研究 主要包括两个部分：首先采用粘质沙雷氏菌菌株a b 9 0 0 2 7 离体酶催化 异丁香酚合成香兰素，对异丁香酚的转化途径进行了分析；然后进行了 该菌株及其离体酶对羟基苯和氨基苯的降解作用研究，对酶催化降解机 制，降解动力学条件以及酶的一些性质进行了探讨和分析。所研究的内 容及其结论主要包括以下四个部分： ( 1 ) 利用粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) 菌株a b 9 0 0 2 7 产生 的离体酶催化异丁香酚进行生物转化，结合t l c 、u v - v i s 、i r 等测试 手段对异丁香酚的转化途径进行了探讨，借助薄层扫描法对不同反应体 系下产物香兰素的产率作了比较，并研究了可催化异丁香酚合成香兰素 的酶在细胞的存在位置。结果表明：在酶的作用下，异丁香酚分别经过 阿魏酸和香兰素两条途径开环降解成小分子，采用酶催化所得的香兰素 产率最高，其产率达l o 9 0 ，可催化合成香兰素的酶主要是胞外酶。 ( 2 ) 采用a b 9 0 0 2 7 离体酶催化过氧化氢氧化处理1 5 种羟基和氨基 苯类化合物。以对苯二酚和对氨基苯酚为代表物，对其降解动力学条件 进行了研究；测定了催化降勰前后溶液的c o d 值，借助u v v i s 、i r 吸收光谱和h p l c 考察了分子结构的变化；探讨了化合物降解性与结构 之间的关系；并就该方法处理工业废水进行了效果评价。得到对苯二酚 降解的适宜条件为每降解5 0m l 质量浓度为2 0 0 0m gl 。的对苯二酚溶 液，h 2 0 2 ( 3 0 ，w v ) 用量5m l 、温度4 0 、p h 9 5 ，降解2 4h 后对 苯二酚c o d 去除率可达9 63 。对氨基苯酚降解的适宜条件为每降解 5 0 0m gl 1 对氨基苯酚溶液5 0m l ，h 2 0 2 ( 3 0 ，w v ) 用量3m l 、温 度4 0 。c 6 0 、p h9 0 1 00 ，降解后对氨基苯酚c o d 去除率可达 9 6 8 0 。经过h 2 0 2 酶作用后，对苯二酚等易降解化合物u v - v i s 及j r 谱图上苯环特征吸收峰均已消失，h p l c 则检测到有机酸等小分子化合 物，从而阐明了酶促降解机理为苯环开环生成小分子化合物。取代基的 性质、位置、数目均影响化合物的降解性。多元酚胺较一元酚胺容易 降解，其中间位取代使降解变难，推电子基一o h 、一n h 2 、一o c h 3 有 利于降解，吸电子基一n 0 2 、一c i 、一c o o h 不利于降解。 ( 3 ) 就共代谢一h 2 0 2 氧化法处理苯酚等难降解化合物进行了初步研 究，实现了苯酚、问苯二酚和水杨酸的氧化降解，经u v - v i s 和h p l c 分析表明其降解过程仍为苯环开环过程。 ( 4 ) 对可催化h 2 0 2 降解羟基苯和氨基苯的酶的产酶发酵条件和酶 的性质进行了研究。产酶的适宜条件为培养时间3 0h ，温度2 8 ，初始 p h l o 0 ，摇床转速15 0rm i n 。研究发现，该酶主要存在于细胞外，属 于胞外酶。其催化机制可能与增强h ：o ：的氧化能力有关。 关键词：粘质沙雷氏菌：离体酶；过氧化氢；催化；香兰素；异丁香酚； 降解；苯酚；苯胺；开环；共代谢。 t h eo x i d a t i o ne f f e c to fs e r r a t i am a r c e s c e n sa b 9 0 0 2 7a n d i t se n z y m eo na r o m a t i cc o m p o un d s a b s t r a c t t h i st h e s i sr e s e a r c h e so nt h eo x i d a t i o ne f f e c to fa r o m a t i cc o m p o u n d sb yt h e b a c t e r i u ms e r r a t i am a r c e s c e n sa b 9 0 0 2 7a n di t se n z y m e t h er e s e a r c hc o n s i s t so f t w om a i np a r t s ：f i r s t l y ，ac r u d ee n z y m ee x t r a c tw a su s e dt ot r a n s f o r mi s o e u g e n o lt o v a n i l l i n ，a n dt h et r a n s f o r m a t i o np a t h w a yw a si n v e s t i g a t e d t h e n ，t h eo x i d a t i o n e f f e c to fa b 9 0 0 2 7a n di t s e n z y m eo np h e n o l sa n da n i l i n e sw a ss t u d i e dt h e d e g r a d i n gm e c h a n i s m ，k i n e t i c c o n d i t i o na n dc h a r a c t e r i s t i co f e n z y m ew e r e e s t i m a t e d t h ew o r kw a sc o m p o s e do ff o u rp a r t s ： ( 1 ) ac r u d ee n z y m ef r o ma b 9 0 0 2 7w a su s e dt oc a t a l y z et op r o d u c ev a n i l l i nf r o m i s o e u g e n o l t h et r a n s f o r m a t i o n p a t h w a yo fi s o e u g e n o lw a ss t u d i e db yt l c ， u v - v i s i b l es p e c t r u ma n di rs p e c t r u mt h ey i e l d so fv a n i l l i ni nd i f f e r e n tr e a c t i o n s y s t e mw e r em e a s u r e db yt l c st h es i t u a t i o no ft h ee n z y m ew h i c hc o u l dc a t a l y z e t o s y n t h e s i z e v a n i l l i nw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t d u r i n g t h e t r a n s f o r m a t i o np r o c e s s ，i s o e u g e n o lb r o k ei t s p h e n y lr i n ga n db e c a m et os m a l l m o l e c u l e sw i t hf e r u l i ca c i da n dv a n i l l i na si n t e r m e d i a t e sr e s p e c t i v e l y t h eh i g h e s t y i e l do fp r o d u c tv a n i l l i nc o u l db e1 0 9 0 w h e nc a t a l y z e dj u s tb ye n z y m e t h e e n z y m ew h i c hh a da b i l i t yt oc a t a l y z ei s o e u g e n o lc o n v e r t i n gt ov a n i l l i nw a sm a i n l y e x t r a c e l l u l a re n z y m e ( 2 ) l5k i n d so fp h e n o l sa n da n i l i n e sw e r ed e g r a d e du s i n gh y d r o g e np e r o x i d ea s o x i d i z e ra n de n z y m ef r o ms e r r a t i am a r c e s c e n sa b 9 0 0 2 7a sc a t a l y s t h y d r o q u i n o n e a n d p a m i n o p h e n o lw e r ec h o s e nf o rs t u d y i n gt h ek i n e t i cc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w e di n t h ed e g r a d a t i o no fh y d r o q u i n o n e ( 2 0 0 0m gl 一，5 0m l ) ，t h eo p t i m a lv o l u m eo f h 2 0 2 ( 3 0 ，w v ) ，t e m p e r a t u r ea n dp hw e r e5m l ，4 0 。c a n d95 ，r e s p e c t i v e l y a n d t h ec o dr e m o v a le f f i c i e n c yc o u l dg e tt o9 63 a f t e rt r e a t e df o r2 4hf o r p a m i n o p h e n o l ( 5 0 0m gl 。，5 0m l ) ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e ：t h ev o l u m eo f h 2 0 2 ( 3 0 ，w v ) w a s3m l ，t h et e m p e r a t u r ew a s4 0 6 c 6 0 ca n dt h ep hw a s9 - 1 0 a f t e rt r e a t m e n tt h ec o dr e m o v a le f f i c i e n c yw a su pt o9 68 0 t h ec o do ft h e s e 15k i n d so fc o m p o u n d sb e f o r ea n da f t e rt r e a t m e n tw e r em e a s u r e d ，a n dc h a n g e so f m o l e c u l a rs t r u c t u r e s d u r i n g t h ep r o c e s sw e r ei n v e s t i g a t e d b yu v v i s i ra n d h p l ci tw a sf o u n dt h a ta f t e rh 2 0 2 e n z y m et r e a t m e n t ，t os o m ec o m p o u n d ss u c ha s h y d r o q u i n o n e ，p e a k so nu v - v i sa n di rs p e c t r aw h i c hb e l o n gt op h e n y lr i n ga l l d i s a p p e a r e d ，a n dh p l cd i s c o v e r e ds m a l lm o l e c u l e ss u c ha so r g a n i ca c i d s s ot h e m e c h a n i s mw a sc l a r i f i e dt h a td u r i n gt h ed e g r a d a t i o nt h ep h e n y lr i n gw a sc l e a v e d a n ds m a l lm o l e c u l e sw e r ei n t r o d u c e d ，w h i c hi u s tc a u s e dt h ec o dv a l u e s o f d e g r a d a t i o n a m i a b l ec o m p o u n d ss u c ha sh y d r o q u i n o n ed e c l i n e dg r e a t l y a l s o ，t h e r e l a t i o nb e t w e e nd e g r a d a b i l i t ya n ds t r u c t u r eo fp h e n o l sa n da n i l i n e sw a sa n a l y z e d ， a n dt h ec o n c l u s i o nw a sa sf o l l o w s ：d i 一t r i d h e n o l s a n i l i n e sw e r ee a s i e rt od e g r a d e t h a nm o n o p h e n o l s a n i l i n e s ；o r t h o 一p a r a s u b s t i t u t e dc o m p o u n d sw e r ee a s i e rt o d e g r a d et h a nm e t a - s u b s t i t u t e dc o m p o u n d s ；e l e c t r o n - - d o n a t i n gs u b s t i t u e n t ss u c ha s o h ，一n h 2a n d o c h 3m a d ed e g r a d a t i o ne a s i e r ，w h i l ee l e c t r o n w i t h d r a w i n g s u b s t i t u e n t ss u c ha s - n 0 2 ，c ia n d c o o hm a d ed e g r a d a t i o nm o r ed i f f i c u l t t h e h 2 0 2 e n z y m et r e a t m e n tw a sa l s oa p p l i e dt ot r e a ti n d u s t r i a lh y d r o q u i n o n ee f f l u e n t s a n dt h ee f f i c i e n c yw a se s t i m a t e d ( 3 ) c o m e t a b o l i s m - h 2 0 2 o x i d a t i o n m e t h o d w a s a p p l i e d t o d e g r a d e d e g r a d a t i o n r e s i s t a n tc o m p o u n d ss u c ha sp h e n o l ，r e s o r c i n o la n ds a l i c y l i ca c i d ，a n d i tw a sp r o v e da sap r o c e s so fp h e n y lr i n g sc l e a v a g ea sw e l l ( 4 ) t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ss u c ha st i m e ，t e m p e r a t u r e ，p ha n ds h a k i n gs p e e d w e r ed i s c u s s e da n dt h ec h a r a c t e r i s t i co fe n z y m ew a si n v e s t i g a t e dt h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ee n z y m ew e r ea sf o l l o w s ：f e r m e n t a t i o np e r i o d3 0h ， t e m p e r a t u r e2 8 。c ，i n i t i a lp h i 0 0 ，s h a k i n gs p e e d 15 0 rm i n t h ee n z y m ew a s m a i n l y e x t r a c e l l u l a re n z y m e ，w h o s ec a t a l y z i n gm e c h a n i s mw a sp r e s u m e dt o s t r e n g t h e nt h eo x i d i z i n gb e h a v i o ro fh 2 0 2 k e y w o r d s ：s e r r a t i am a r c e s c e n s ；e n z y m e ；h y d r o g e np e r o x i d e ；c a t a l y z e ；v a n i l l i n ； i s o e u g e n o l ；d e g r a d e ；p h e n o l ；a n i l i n e ；c l e a v a g e ；c o m e t a b o l i s m 插图清单 图2 - 1 香兰紊的i r 谱图” 图2 2 阿魏酸的i r 谱图一 图2 - 3 香兰素、阿魏酸及降解产物的u v - v i s 谱图 图2 4 香兰素、阿魏酸及降解产物的i r 谱图 图2 - 5 异丁香酚降解途径“ 图3 - l 不同h 2 0 2 用量下对苯二酚降解率一时间关系曲线 图3 - 2 对苯二酚降解率一h 2 0 ：用量关系曲线一 图3 - 3 对苯二酚降解率温度关系曲线- 图3 4 对苯二酚降解率一p h 关系曲线 图3 5 不同体积缓冲溶液对苯二酚降解率一时间关系曲线 图3 - 6 对苯二酚催化降解不同时间的u v - v i s 吸收光谱 图3 7 对苯二酚及其降解产物的i r 谱图 图3 - 8 对苯二酚降解液的h p l c 谱图- 图3 - 9 对苯二酚的降解途径” 图3 1 0 对氨基苯酚降解率时间关系曲线” 图3 1 l 对氨基苯酚降解率一h ：o ：用量关系曲线 图3 1 2 对氨基苯酚降解率一温度关系曲线 图3 1 3 对氨基苯酚降解率一p h 值关系曲线 图3 1 4 对氨基苯酚催化降解不同时间的u v - v i s 吸收光谱 图3 1 5 对氨基苯酚催化降解产物的i r 谱图分析- 图3 1 6 对氨基苯酚降解过程中p h 值变化 图3 1 7 对氨基苯酚降解液的h p l c 谱图 图3 1 8 对氨基苯酚的降解途径 图3 1 9 易阵解化合物的降解前后的u v - s 谱图 图3 2 0 问苯二酚降解的i _ j s 谱图 图3 2 l 对硝基苯酚降解的u v - v i s 谱图 图3 2 2 不同体积反应溶液对苯二酚降解率一时间关系曲线 图3 2 3 不同体积反应溶液对氨基苯酚降解率一时间关系曲线 图3 2 4 工业废水处理的工艺流程图 图3 2 5 工业废水处理前后u v ：s 吸收光谱 图4 - l 三种难降解化合物的共代谢h 2 0 2 处理的u v - v i s 谱图- 图5 1 时间对产酶的影响 图5 2 温度对产酶的影响 图5 - 3p h 对产酶的影响 图5 - 4 摇床转速对产酶的影响- 1 6 1 6 1 7 1 7 1 7 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 - 2 5 2 5 2 5 2 6 2 7 2 7 2 7 - 2 7 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 3 2 - 3 3 - 3 3 3 4 - 3 4 - 3 6 3 6 3 9 - 4 2 4 2 4 2 4 2 图5 5 微量离子对产酶的影响 图5 - 6 不同位置酶的活力 图5 7 酶的p a g e 示意图 4 3 4 3 4 4 表格清单 表l 不同反应体系下香兰素的产率l8 表2 氨基苯和羟基苯的c o d 及其降解率2 4 表3 不同振摇速率下对氨基苯酚的降解率28 表4 不同化合物降解前后的c o d 比较3 0 衷5 不同加料方式的对苯二酚降解辜3 4 表6 不同加料方式的对氨基苯酚降解率”3 4 表7 酶的提取方式对降解率的影响35 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得盒蟹王、业太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字 虻郏期2 0 0 6 年5 肌5 曰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒墅王、业盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权盒胆王些左 ：! l 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：孙敏桶- 自得师签名： 姚日生 签字日期：2 0 0 6 年5 月1 5 日签字日期：2 0 0 6 年5 月1 5 日 碱j 。| 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：中国科学技术大学化学系 通讯地址；中国科学技术大学化学系 电话：1 3 0 8 3 4 0 1 2 1 3 邮编：2 3 0 0 0 9 致谢 本论文的研究工作是在导师姚日生教授的悉心指导下完成的。在近三年的 研究过程中，姚教授不但在科研上给了我很大的指导，也教会了我许多的道理。 科学研究的道路上不是一帆风顺的，不但需要丰富的想象，扎实的理论和实践 基础，还需要严谨的治学态度和不气馁的决心。姚老师不断创新的学术思想， 渊博的学识，实验遇到暂时的挫折时鼓励的话语，以及对学生的关心和爱护， 将使我终身难忘。 尤亚华老师在分析测试方面提供了有益的指导，另外朱慧霞老师和邓胜松 老师也给予了许多帮助，在此表示深深的感谢。 师姐高文霞同学在研究期间给了我许多建议和意见，她对于师妹毫无保留 的关心和爱护给我留下了深刻的印象。王春玲，程丹，王磊，母哲轩等同学协 助我完成了部分实验。另外，何红波，徐玉福，齐本坤，董明辉，张玲，秦燕 军，邹国勇，李发，贾冬梅，张云，周琪同学也在必要时给了我关心和帮助。 应该说，我的研究论文是在本课题组全体人员的帮助下完成的，感谢他们给予 我的家人般的温暖。 感谢校学生创新基金项目对本课题的资助i 最后，请允许我向所用关心我，爱护我，帮助我的人致敬! 1 1 粘质沙雷氏菌及其酶 1l1 粘质沙雷氏菌简介 第一章研究背景 粘质沙雷氏菌s e r r a t i am a r c e s c e n s 又名灵杆菌，最早由意大利的b i z i o 于 1 9 2 8 年在腐败食物中发现。该菌属于革兰氏阴性球杆菌，大小为05 0 8 i t m x 09 2o u m ，端圆，周身鞭毛，能运动，细菌大小均匀，单个或排成断 链。 该菌属兼性厌氧，能在普通培养基上生长。在营养培养基上于2 5 3 0 培养l 2 天后，可形成圆形、光滑、中心呈颗粒状、直径约2 m m 的菌落。大 多数菌落不透明，有的菌株可产生白色、粉红色或红色色素，室温下常呈红色， 但于3 7 色素产生不良。色素溶于氯仿、乙醚和乙醇，加酸后呈鲜红色，加碱 后呈黄色，最后变为无色。有的菌株不产生色素或产生色素不明显。培养物可 产生鱼腥味、尿呋及霉味。在营养肉汤内呈均匀混浊生长，液面有菌膜，与管 壁接触部分有红色环，管底可见灰色颗粒状沉淀。 该属细菌触酶阳性，氧化酶阴性。多数菌株发酵葡萄糖并产生少量气体， 发酵蔗糖、甘露醇、水杨素、肌醇、戊五醇、纤维二糖、木糖和甘油，但在肌 醇、丙三醇、纤维二糖中不产气。对乳糖迟缓发酵或微弱发酵或不发酵。对卫 矛醇、阿拉伯糖、鼠李糖不发酵。大多数菌株不产生吲哚，甲基红阴性，v - p 、 枸橼酸盐阳性，丙二酸盐及硫化氢阴性，不发酵棉子糖，不分解尿素。鸟氨酸 脱羧酶、o n p g ( 邻硝基苯一1 3 - o 吡喃半乳糖苷) 酶，d n a 酶均阳性，苯丙氨 酸脱氨酶阳性。几乎所有菌株可水解d n a 及可溶性酪蛋白，液化明胶迅速。 1 12 粘质沙雷氏菌研究概况 粘质沙雷氏菌是一种广泛分布于水、土壤和食物等环境中的腐生菌，为医 院内感染的主要条件致病菌。它们可引起呼吸道感染、尿道感染、伤口感染， 特别对患有原发性疾病者，可进而引起菌血症、心内膜炎、脑膜炎、骨髓炎、 肺炎、脓胸、肺脓肿、腹膜炎等i ”。而且对氨苄青霉素、第一代头孢霉索、呋 喃妥因和多黏菌素等多种抗生素具有耐药性1 2 。3 】，因此引起许多免疫学者兴趣。 有关粘质沙雷氏菌遗传学上的研究多集中于灵菌红素和胞外核酸酶f 4 】。作 为次级代谢产物的灵菌红素是一种天然红色素，其形成机制上的变化可以用来 反映菌落中不稳定的表现型及其自然突变p 】；由于具有甲氧基吡咯的骨架结构， 灵菌红素具有多种生物学活性，如可用来抑制迟发型超敏反应和器官移植后的 宿主排斥反应的自身免疫抑制，并具有抗细菌( a n t i b a c t e r i a l ) ，抗疟疾 ( a n t i m a l a r i a l ) ，抗真菌( a n t i f u n g a l ) 和抗原生动物( a n t i p r o t o z o a l ) 等活性1 6 - 7 1 。 近年来人们还发现灵菌红素在癌症治疗上有巨大药用潜力。美国国立癌症研究 所( n s i ) m e l v i n 等人发现灵菌红素在平均i c 5 0 ( 半数抑制浓度) 为2 1g m o ll 。 时对5 7 种不同的人癌细胞有抗性作用，同时还发现能诱导细胞的凋亡。陶金莉 等人以沙雷氏菌w 0 2 0 6 为出发菌株，通过对氯化锂前处理过的细胞进行紫外诱 变，以含高浓度葡萄糖的培养基筛选得到一株灵菌红素的高产突变株b 一2 0 1 。 1 9 6 3 年e a v e s 和j e f f r i e s 第一次由粘质沙雷氏菌中提取出核酸酶【9 1 ，该酶引 起了很多学者的兴趣，由于它是一种非选择性核糖水解酶，即对于单链和双链 的d n a 或r n a 均有裂解作用，粘质沙雷氏菌特有的分泌系统能够将核酸酶蛋 白质外排至胞外，这种独特的分泌机制目前尚未完全阐明，但是已经证实可以 通过培养基，培养环境以及宿主细胞突变调节 ”】。在蛋白质提纯过程中，粘质 沙雷氏菌的胞外核酸酶可用于清除核酸类物质的干扰，此外还具有高选择性的 抗菌、抗病毒、抗肿瘤细胞的活性”】。 粘质沙雷氏菌在香料合成工业上也有应用，r a b e n h o r s t 等1 报道了用 s e r r a t i am a r c e s c e n sd s m3 0 1 2 6 一步发酵获得香兰素的方法，即在细菌的发酵 过程中加入底物异丁香酚直接进行代谢，优化发酵条件后转化率可达2 0 。 环境学上对粘质沙雷氏菌研究得较少，r a j k u m ae ta 1 【1 2 l 从土壤中分离出一 支能够降解二氯二苯基三氯乙烷( d d t ) 的菌株s e r r a t i am a r c e s c e n sd t - 1 p ，经 过驯化后，最大降解量可达15p p m ，而当d d t 含量达到5 0p p m 时，该菌的降 解活性则完全丧失；ujj l j a h i ”】从热带土壤中分离出能够降解原油中c 2 0 c 2 8 多种烃类的菌株s e r r a t i am a r c e s c e n so c s 2 1 ，其降解周期约为1 6 天。 1 l2 源于粘质沙雷氏菌的酶及其应用 有关粘质沙雷氏菌酶学方面先后有人研究过核酸酶，金属蛋白酶【l “，几 丁质酶1 1 5 。“，b 一内酰胺酶1 1 7 q ”，碱性磷酸酯酶【1 9 1 等。粘质沙雷氏菌突出特性 之一是其可以产生胞外核酸酶，这种酶是由n u c a 基因控制的，其作用是裂解 各种形式的d n a 和r n a 。在缺乏可直接利用碳源的情况下，粘质沙雷氏菌通 过分泌胞外核酸酶降解环境中的核酸而获得能量，核酸降解后的核糖和脱氧核 糖将直接作为碳源被利用；另外，还可以通过此方式获得核苷直接为体内r n a 和d n a 合成提供前体【”。粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的这种特性极大地增强了细 菌生存能力。同时，这种酶还可以用来清除蛋白质中的核酸类杂质，杀死有害 细菌和病毒等。金属蛋白酶是活性中心依赖于金属离子的一类蛋白酶，p a d m a n 在研究致病性粘质沙雷氏菌株时，发现其蛋白酶基因组成上具有共同的特点， 从而为粘质沙雷氏菌引起的传染病研究提供重要依据【1 ”。粘质沙雷氏菌是几丁 质酶的主要产生菌之一，几丁质是由n 一乙酰氨基葡萄糖通过1 ，4 糖键构成的多 聚体，是自然界仅次于纤维素居第二位的可再生的资源，其产物几丁寡糖是重 要的保健品医用原料。但几丁质不溶于水，也不溶于酸和碱，由此决定了几丁 质的工业化利用会遇到很大困难。而几丁质酶由于可以作用于几丁质非还原性 末端而将其水解成n 一乙酰氨基葡萄糖或几丁质寡糖而具有重要的工业价值。 粘质沙雷氏菌q m b l 4 6 6 是几丁质酶的主要产生菌，以几丁质为唯一碳源发酵， 几丁质酶可以从细胞中分泌出来，并且粘附在不溶于水的几丁质微粒的表面， 而在几丁质的水解过程中则会产生水溶性的n a g ( n 一乙酰一p 一氨基葡萄糖苷 酶) ，这种酶可以为微生物直接利用生长。b 一内酰胺酶是一种可以水解b 一内 酰胺环的酶，临床上发现粘质沙雷氏菌对培南等多种b 一内酰胺类抗生素产生 耐药性就是因为粘质沙雷氏菌可以产生b 一内酰胺酶| l ”。磷酸盐在细胞内不能 合成，当磷酸盐数量受限的时候，细胞必须通过磷酸酯酶的水解从核酸、磷酸 化糖和蛋白质中得到有机体所需的磷酸盐，因而磷酸酯酶在生命活动中扮演着 重要的角色。碱性磷酸酯酶是广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信 号肽转导的一种磷酸酶，其最适p h 在7 0 以上，能够以同样的速率催化许多种 磷酸单酯的水解。b h a t t i 从s e r r a t i a m a r c e s c e n s2 1 1 中分离出两种碱性磷酸酯酶 的异构体，其生长要求，电荷性质，层析行为，动力学性质和免疫性均不相同， 由此认为这两种酶应由不同的基因控制【l ”。另外，粘质沙雷氏菌的某些菌株还 产生氧化还原酶，p r e o b r a z h e n s k a v a 等 2 0 i 发现来自s e r r a t i am a r c e s c e n sw2 5 0 的卤素过氧化物酶不但可以催化碳一卤键形成，而且具有磷酸酯酶的活性，b u r d 等1 2 1 1 也报道从肠中的粘质沙雷氏菌中分离出一种卤索过氧化物酶，可以催化双 氧水将4 一氨基氯苯中的氨基氧化为硝基。 1 2 异丁香酚及香兰素 12l 异丁香酚简介 异丁香酚，又称异子丁香酚，其化学名称为对丙烯基邻甲氧基苯酚，分子 式c ，o h l 2 0 2 ，分子量1 6 4 2 ，为无色或淡黄色油状液体，本品是顺、反两种异 构体的混合物，市售品熔点约1 3 ，沸点2 6 6 。c ，相对密度1 0 8 0 ( 2 5 ) 。能 与醇、醚、乙酸乙酯混溶，难溶于水。 异丁香酚天然存在于依兰油，肉豆蔻油中，工业上通常将丁香酚用氢氧化 钾或氢氧化钠于1 6 0 1 7 0 下进行异构化而得22 1 。异丁香酚是重要的香原 料，以异丁香酚为原料制得的天然级香兰素由于具有很高的质量，因而得到人 们的青睐。 122 香兰素简介 香兰素( v a n i l l i n ) ，又名香草素，化学名4 一羟基一3 一甲氧基苯甲醛 ( 4 h y d r o x y 3 m e t h o x y b e n z a l d e h y d e ) ，分子式c s h 8 0 3 ，分子量1 5 2 ，通常是白色至 微黄色针状结晶，熔点8 1 8 2 ，沸点2 8 5 ，相对密度10 5 6 。溶于1 2 5 倍 的水，2 0 倍的乙二醇及2 倍的9 5 乙醇，溶于氯仿。 香兰素最早发现存在于香草豆英中( 俗称香兰豆) ，以香兰素葡萄糖苷的 形式存在，可由其在酶的存在下水解而得： c l d h l 8 0 8 + h 2 0 c 8 h 8 0 j+ c 6 h 1 2 0 6 醛素葡萄糖苷 香兰素 葡萄糖 除此以外，在一些针叶植物中也含有少量的此物质，它是一种化学结构近似于 香兰素的松柏醇，在天然产物中通常都是以松柏苷的形式存在。当松柏苷水解 时分解生成为葡萄糖及松柏醇，而松柏醇很容易被氧化生成为香兰素： h o c 1 6 h z 2 0 8 c l o h l 2 0 3 + c 6 h 1 2 0 6 松柏苷 松柏醇l葡萄糖 i 【0 2 】 t c 8 h , 0 3 香兰素 香兰素的主要应用领域是食品工业，用于配制荚兰豆、巧克力、太妃等香 精，常用于巧克力糖、糖果、饼干、蛋糕及冰淇淋中。在化妆品使用的香精中， 香兰素用以增加甜的豆香气味，如葵花香精、粉红康乃馨香精、水仙花香精中 都使用香兰素作为和香原料或定香剂。在用作粉底香中，香兰素常和洋茉莉醛、 香豆素、合成廉香等同用来增添粉香。香兰素除用作香精外，还可以用作矫臭 剂，以消除塑料、橡胶和其它工业品的异味。同时香兰素也是重要的医药原料 和工业添加剂，国外大量将其用于医药多巴、甲基多巴和磺胺药物增效剂中间 体3 ，4 ，5 一三甲氧基苯甲醛( t m b ) 生产f 2 ”。另外还可用作植物生长促进剂、 杀菌剂、润滑油消泡剂、电镀光亮剂、印制线路板生产导电剂等。 1 2 3 由异丁香酚合成香兰素的合成方法 香兰素的天然来源是香子兰属植物，成熟的香子兰豆荚中香兰素的含量约 占2 3 ，目前，世界上香兰素的年消费量约为l2 万吨，而直接从香子兰中 提取的仅占5 。这主要是因为香子兰的主要种植国家和地区如印度尼匹亚、 马达加斯加等地种植面积有限，而且香子兰的生长周期长，果荚不易存放，所 以依靠增加香子兰的产量远远满足不了需要【2 ”。 在香料工业中大部分香兰素是通过化学合成法生产的。国内厂家主要是采 用愈创木酚与乌洛托品反应的亚硝化工艺，收率低，对环境污染严重。国外目 前主要采用愈创木酚与乙醛酸缩合工艺。另外，香兰索还可以由丁香酚、松柏 苷、木质素、对羟基苯甲醛、黄樟素、2 一甲氧基一4 一溴苯酚、香兰醇合成1 2 “。 在合成和半合成香兰素中，以丁香酚为原料生产的香兰素香气最佳，通常 在氢氧化钾存在下，先将丁香酚异构化，生成异丁香酚，即苯环上的烯丙基转 化成丙烯基，然后氧化断键获得粗香兰素。之所以采用丁香酚为原料，是因为 较之异丁香酚，丁香酚更易获得。 4 异丁香酚的氧化方法主要有三种： ( 1 ) 早期曾使用较强的氧化剂重铬酸钾，则需要先让异丁香酚用醋酐酰化 生成异丁香酚乙酸酯，以保护酚羟基，然后氧化，再把氧化得到的香兰素在乙 酸酯酸性介质中水解即为香兰素。 h ch 3 坚竖竺1 2 h c h 3 k 2 c 5 0 7 o m eh 2 s 0 4 h o o m eh o c o c h ， 再酸化即可游离出香兰素。 可供选用的氧化剂较多，如高锰酸钾、过氧化氢、臭氧、对氨基苯磺酸、芳香 族氨基酸、硝基苯等。其中臭氧是比较理想的氧化剂，在异丁香酚的氧化过程 中操作方便，环境污染少。李丽华等采用臭氧氧化异丁香酚钠制香兰素，异丁 香酚钠和水加入氧化反应塔，臭氧化空气从塔顶通入塔内，以气流翻动做搅拌， 进行气液相氧化反应。氧化反应结束后，分出有机层，加亚硫酸钠盐分解臭氧 化物，分解产物经中和、水洗后得到香兰素粗品 2 6 1 。l a m p m a n 等用异丁香酚与 乙酐作用生成异丁香酚乙酸盐，经氧化后在酸性介质中水解生成香兰素。他们 采用四辛基氯化铵作相转移催化剂，用高锰酸钾作氧化剂，所得香兰素产率为 4 0 2 7 1 。日本t s u d a 等发现高铁酸钾( k 2 f e 0 4 ) 是一种新的选择性氧化剂，他们 用k 2 f e 0 4 在室温下氧化异丁香酚钠，香兰素收率9 0 2 8 1 。美国d r a g o 等探索 了用 双( 邻羟苯叉一r 一亚氨基丙基) 甲胺 钴( i i ) 催化剂，用纯氧氧化异 丁香酚，在室温下反应2 4 h ，香兰素收率5 0 1 2 。 ( 3 ) 用电解氧化法也可生成香兰素。以m n ”一m n ”+ e 一为氧化还原中介 物间接电化学氧化异丁香酚合成香兰素，阳极为p b 0 2 ，阴极用n i 片电极，在 温度5 5 ，介质流速o4lm i n _ 1 条件下，反应2h ，香兰素收率达到7 45 3 0 l 。 + 4 m n 2 + + h + o m e 采用化学法合成的香兰素产品质不高，具有香型单一，易掺杂质，易被污 一 oh + m + 心 恬 岍 洲， 染的缺点，因此市场售价较低。化学合成的香兰素每千克市场价不到15 美元， 而天然香兰素的价格为每千克1 2 0 0 - - 4 0 0 0 美元1 3 。”】。为了使产品符合“天然化” 的要求，香兰素的生物合成法应运而生。采用生物法合成香兰素的过程中，往 往伴随有香草酸，香草醇，4 羟基苯甲醛等少量副产物生成，这与从香子兰中 提取的香兰素类制品的组成相似，产品香味浓郁，市场价格较高1 3 3j ，生产过程 中污染小，顺应当今社会“绿色化学”的发展趋势，因而具有广泛的市场前景。 黑曲霉能将异丁香酚转化为香兰素，转化率达l o ，香兰素还可进一步转 化为香草醇和香草酸 34 1 。枯草杆菌b 2 菌株能用异丁香酚作唯一碳源，并将其 转化成香兰素，产量为o6 1gl 。，摩尔收率( 以异丁香酚计) 为1 24 【”1 ：紫 红红球菌m t c c2 8 9 菌株以异丁香酚为底物时，在实验室最佳培养条件下，香 兰素的摩尔收率( 以异丁香酚计) 可高达5 8 i “i 。利用粘质沙雷氏菌d s m 3 0 1 2 6 发酵异丁香酚，初始得率为5 ，优化发酵条件后可增至2 05 ，异丁香酚产 量达到38gl 。1 。 g a t f i e l d 等报道名为c h i r a z y m el 2 ，c f ，c 2l y o 的脂肪酶能够催化h 2 0 2 氧化 异丁香酚并生成香兰素，得到的香兰素百分含量为3 04 。反应在乙酸乙酯体 系中进行，首先溶剂乙酸乙酯与h 2 0 2 形成过氧乙酸，然后这种氧化性的酸再 与具有苯乙烯结构的异丁香酚反应，生成相应的羰基化合物香兰素，同时还原 出溶剂乙酸乙酯1 3 “。 由于所有的生物代谢反应都是酶促反应，如能分离得到这些酶，利用酶促 反应，则可更直接地生产香兰素。而酶促反应具有高效，专一，反应条件温和， 产物易纯化，能耗低，污染小，操作简单易控等优点，因而有着不可比拟的优 越性。 1 3 酚及芳胺类污染物 131 酚类污染物及其处理方法 l3ll 酚类污染物简介 酚是苯环上带有羟基( 一0 h ) 的芳香烃化合物。我们所说的酚类污染物是 指单环和稠环芳烃的一元、二元或多元的羟基衍生物，主要来源于钢铁厂、炼 油厂、石油化工厂、合成塑料厂、苯酚及苯类化合物生产车间的排气和排水。 酚类化合物是污染空气、水体的主要毒物之一。它是一种原浆毒，能使蛋 白质生成不溶性蛋白而丧失活力。酚蒸气经呼吸道对神经系统、肝、肾和心肌 引起损害；含酚水溶液易被皮肤吸收引起中毒，长期饮用含酚水，会引起头晕、 出疹、搔痒、贫血及各种神经系统的疾病。 含酚污水排入水体，不仅使生化需氧量增大，还会危害水生生物的繁殖与生存。 当水中含酚0 1 0 2m gl ，鱼肉即有酚味；含酚1m gl _ 】，影响鱼的产卵与