（生物物理学专业论文）节旋藻分类学地位及生产性状的分子标记研究.pdf

摘要 一、基于1 6 sr r n a 的节旋藻与螺旋藻分类学地位研究 测定了本实验室保存的1 0 株节旋藻品系s p - 4 、s p - 6 、s p - 7 、s p - 8 、s p - 1 2 、 s p - 1 4 、s p 1 5 、s p - 1 6 、s p 一1 7 和s p - 1 8 的1 6 sr r n a 基因序列，进而与g e n b a n k 上有关品种( 系) 的1 6 sr r n a 基因序列作同源性分析，并构建了颤藻目下属间 的系统发生树。结果表明：( 1 ) 节旋藻和螺旋藻之间的亲缘关系相距较远，支持 了伯杰氏系统细菌学手册重新分立节旋藻属和螺旋藻属的观点。( 2 ) 节旋藻 稳定族群与由颤藻和浮游蓝丝藻构成的族群亲缘关系相近，节旋藻品种( 系) 间 1 6 sr r n a 基因序列的相似性高于9 9 ，表明该属的界限、定义明确。( 3 ) 7 株 螺旋藻在系统树上的分布较离散并分成两个分支。第一个分支由a b 2 0 0 2 0 6 与 f a c h b 3 5 1 组成，它们1 6 sr r n a 基因序列的相似性为9 8 1 ，并与盐螺旋藻 c c c b a j a - 9 5 c 1 3 和m p is 3 构成一个族群；其余5 株螺旋藻组成另一分支，品种 ( 系) 间1 6 sr r n a 基因序列相似性大于9 6 。这两个分支品系闻1 6 sr r n a 基 因序列的相似性仅为9 2 ，与颤藻目下大多数属间的相似性程度在同一水平。 ( 4 ) s p - 1 2 虽处于节旋藻稳定族群内，但单独处于该族群的最外围，明显有别 于其它节旋藻品系。这主要是由于该品系1 6 sr r n a 基因序列中，只有后1 1 9 2b p 与其它节旋藻的高度同源，但前3 2 0t , p 与其它节旋藻品系的相似性只有约6 6 ， 而与弯杼菌属f l e c t o b a c i l l u sr u b b e r 和b e l l i ab a l t i c ab a l 的相似性却高达9 0 和 8 9 。推测s p - 1 2 的1 6 sr r n a 基因序列可能来源于弯杆菌属品系与节旋藻属品 系间的基因水平转移。 二、钝顶节旋藻品系问的亲缘关系研究 测定了1 6 株钝项节旋藻品系1 6 sr r n a 、1 6 s 2 3 si t s 、2 3 sr r n a 和e p e h i d 操纵子序列，并基于这些序列分别用超级树和超级矩阵法构建了系统树，探讨钝 顶节旋藻品系间的亲缘关系。( 1 ) 在用超级树法构建系统树时，先以1 6 sr r n a 基因将1 6 株节旋藻品系分成了3 簇，自展值( b o o t s t r a p ) 高达1 0 0 ；再用1 6 s - 2 3 s r r n a i t s 区分第1 i 簇中的s p - 1 4 ；尔后用e p c h i d 操纵子序列分别构建出第h 、 i n 簇的亲缘关系树：最后将上述3 步构建的子树合成超级树。( 2 ) 在用超级矩 阵法构建系统树时，先将1 6 sr r n a 、1 6 s - 2 3 si t s 、2 3 sr r n a 和c p c h i d 操纵子 4 个基因串成一个4 0 8 4b p 的串联序列，再分析品系间该序列的相似性与遗传距 离，进而构建出亲缘关系树。( 3 ) 用两种方法构建的系统树基本一致，整个系统 树分成界定明确的3 大簇：第1 簇由s p - 1 l 单独形成，第簇由s p - 1 、s p - 2 、s p - 6 、 s p - 9 、s p q o 、8 1 0 - 1 4 和s p q 8 组成，第1 i i 簇由s p - 3 、s p - 4 、s p - 5 、s p - 7 、s p 一8 、 s p - 1 5 、s p - 1 6 和s p - 1 7 组成。两棵系统树的主要差异在于第1 i 簇，超级矩阵法将 该簇分成由s p - 6 、s p - 1 4 和s p - 1 8 组成的一个分支和s p q 、s p - 2 、s p - 9 和s p - 1 0 组成的另一分支；而利用超级树法，第n 簇的所有品系组成同一支系。 三、节旋藻生产性状优劣评价的若干分子标记 在多年研究与生产实践的基础上，建立了4 种能简单、快速、有效初步评价 节旋藻生产性状的分子标记技术。分别如下：( 1 ) 以节旋藻生产性状差的第1 类品系与生产性状好的第n 类品系，在1 6 s - 2 3 sr r n ai t s 中碱基位点有显著共 性差异、分别位于1 5 0b p 和2 8 1 4 0 0b p 的序列( 称为i t s m a r k e r l 和 i t s m a r k e r 2 ) ，作为生产性状优劣评价的分子标记。( 2 ) 以节旋藻生产性状差 的第1 类品系与生产性状好的第1 i 类品系，c p c i 第1 8 0 位氨基酸序列中第7 、 2 0 、3 0 、5 6 和7 2 位的共性差异，作为生产性状优劣评价的分子标记。( 3 ) 以 随机引物$ 3 5 和$ 9 9 分别对生产性状差的第1 类和生产性状好的第类节旋藻品 系作r a p d 扩增显示出的特征性差异条带为标记，评价节旋藻品系生产性状的 优劣。即$ 3 5 和$ 9 9 的扩增条带分别为9 0 0b p 和6 5 0b p 者，属第1 类品系；扩 增条带分别为6 8 0 b p 和9 0 0 b p 者，属第1 i 类品系。( 4 ) 生产性状差的第1 类节 旋藻品系的总d n a 中只含1 条e x d n a ，而生产性状好的第1 i 类品系有2 条 e x d n a ，可以此作为分子标记评价节旋藻生产性状的优劣。 关键词：节旋藻，分类学，生产性状，分子标记，超级树，超级矩阵，染色体外 d n a ( e x d n a ) a b s t r a c t 1 s t u d i e so np h y i o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft h eg e n u s a r t h r o s p i r aa n ds p i r u l i n a t h e1 6 sr r n as e q u e n c e so ft e na r t h r o s p i r as t r a i n sw e r es e q u e n c e da n d c o m p a r e dw i t l lt h es e q u e n c e so f r e l a t e de y a n o b a c t e r i as t r a i n sw h i c h w e r ed o w n l o a d e d f r o mt h en u c l e o t i d es e q u e n c e sd a t a b a s e ( g e n b a n k ) b a s e do n1 6 sr r n as e q u e n c e s ， t h em o l e c u l a rp h y l o g e n e t i en o fo r d e ro s c i l l a t o r i a l e sw a sc o n s t r u c t e d a n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) t h es p i r u t i n as t r d m sf o r m e das e p a r a t ec l u s t e rd i s t i n c tf r o m t h ea r t h r o s p i r ac l u s t e r , a n di tw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ep o i n to fv i e wt h a ts e p a r a t i n g t h e s et w og e n u si nb e r g e y sm a n u a lo fs y s t e m a t i cb a r t e r i o l o g y ( 2 ) t h et i g h tc l u s t e r o fa r t h r o s p i r ah a dac l o s er e l a t i o n s h i p 、桶缶t h ec l u s t e ro fo s c i l l a t o r i aa n d p l a n k t o t h r i x a n dt h es e q u e n c es i m i l a r i t yv a l u e so f1 6 sr r n ag e n eb e t w e e nd i f f e r e n t s t r a i n so fa r t h r o s p i r aw e r em o r et h a n9 9 0 , 6 ，i n d i c a t i n gt h a tt h e s ea r t h r o s p i r as t r a i n s b e l o n g e d t ot h es a m eg e n u s ( 3 ) t h es e v e ns p i r u l i n as t l a i mw e r ed i s t r i b u t e d d i s p e r s e d l yi nt h ep h y l o g e n e t i ct r e e ，a n dd i v i d e di n t ot w og e n e t i c a l l yc l u s t e r e d l i n e a g e s o n es u b - c l u s t e rw a sf o r m e db yt h es t r a i n sf a c h b 3 5 1a n da b 2 0 0 2 0 6 w h i c ht h es e q u e n c es i m i l a r i t yv a l u eo f16 sr r n a g e n ew a s 9 8 1 a n dc l o s e l yr e l a t e d t os t r a i n sc c c b a j a - 9 5 c i 3a n dm p is 3 o fh a l o s p i r u l i n a t h eo t h e rf i v es t r a i n s f o r m e da n o t h e rs u b - c l u s t e r , a n dt h e1 6 sr r n as e q u e n c es i m i l a r i t yv a l u e sw e r em o r e t h a n9 6 t h es i m i l a r i t yv a l u e sb e l - w e e nt h e s et w os u b - c l u s t e r ss t r a i n sw e r e9 2 w h i c hw e r ea tt h es a m el e v e la so n e so fm o s to fo t h e rd i f f e r e n tg e n u si n o s c i l l a t o r i a l e s ( 4 ) a l t h o u g hb e l o n g e dt ot h ea r t h r o s p i r ac l u s t e r , s p - 1 2l o c a t e dm o s t p e r i p h e r a l l ya l o n ei nt h ec l u s t e rw h i c hw a sv e r yd i s t i n c tf r o mo t h e r s t h em a i n r e a s o n sw e r et h a tn o n eb u ti t ss e q u e n c ef r o m3 2 1t o1 5 1 2b po f1 6 sr r n ag e n ew a s c o m p a r a t i v e l yh o m o l o g o u sw i t l lt h a to fo t h e ra r t h r o s p i r a w h e r e a st h es i m i l a r i t y v a l u e so f t h e i rs e q u e n c e sf r o m1t o3 2 0b pw e r eo n l y6 6 a n dr e a c h e d9 0 a n d8 9 w i t l lf l e c t o b a c i l l u sr u b b e ra n db e l l i ab a l t i c ab a i ( f l e x i b a c t e r a c e a e ) r e s p e c t i v e l y i t i sp r o b a b l et h a tt h es p e c i f i c1 6 sr r n as e q u e n c eo f s p - 1 2w a sar e s u l to f h o r i z o n t a l g e n et r a n s f e rb e t w e e ns t r a i n sa r t h r o s p i r aa n df l e x i b a c t e r a c e a e t h u st h e1 6 sr r n a g e n es e q u e n c ew a sn o ta s u f f i c i e n tc r i t e r i o nt og u a r a n t e es p e c i e si d e n t i t y 1 1 1 2 s t u d i e so i lp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f a r t h r o s p i r a p l a t e n s i s t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fs i x t e e na r t h r o s p i r ap l a t e n s i ss 旺a i l l si si n v e s t i g a t e db y s u p e r t r e ea n ds u p e r m a t r i xa p p r o a c h e sb a s e do nt h es e q u e n c e so f1 6 sr r n ag e n e , n u c l e a rr i b o s o m a ld n ai n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r , 2 3 sr r n ag e n ea n dt h ec p c h i d o p e m n ( 1 ) w i t ht h es u p e r t r e ea p p r o a c h , t h eo p t i m a lp h y l o g e n f i ct r e ew a sc o n s t r u c t e d s t e pb ys t e p f i r s t l y t h es i x t e e ns t r a i n so fa r t h r o s p i r ap l a t e n s i sw 讹d i v i d e di n t o t h r e es u b - c l u s t e r sb yt h es e q u e n c e so f1 6 sr r n ag e n es u p p o r t e db yab o o t s t r a pv a l u e o f1 0 0 s e c o n d l y , b a s e do nt h es e q u e n c e so fn u c l e a rr i b o s o m a ld n ai n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r , s t r a i ns p - 1 4w a ss e p a r a t e df r o mt h eo t h e rs t r a i n so f t h ec l u s t e r t h i r d l y , t h ep h y l o g e n e t i et r e e so f t h ec l u s t e ri ia n dh 1w e r ec o n s t r u c t e db a s e do nt h e s e q u e n c e so ft h ec p c h i de p e r o n , r e s p e c t i v e l y ( 2 ) w i t ht h es u p e r m a a i xa p p r o a c h ，a c o n c a t e n a t e d4 0 8 4b ps e q u e n c ew a sc o m p o s e db yt h es e q u e n c e so f16 sr r n ag e n e ， n u c l e a rr i b o s o m a ld n ai n t e m a lt r a n s c r i b e ds p a c e r , 2 3 sr r n ag e n ea n dt h ee p e h i d o p e r o ni nt u r n t h e s es e q u e n c e sw e r ea l s ou s e dt oc a l c u l a t et h es e q u e n c es i m i l a r i t y v a l u e sa n dc o n s t r u c ta p h y l o g e n e t i ct r e eo f s i 】【t c e ns w a i n so f a r t h r o s p i r a p l a t e n s i s ( 3 ) t h et w op h y l o g e n e f i ct r e e sc o n s t r u c t e dw i t ht h o s et w oa p p r o a c h e sd i s c u s s e da b o v e w e r eb a s i c a l l ys i m i l a r t h es i x t e e ns t r a i n so f a r t h r o s p i r ap l a t e n s i sw e r ed i v i d e di n t o t h r e eg e n e t i c a l l yc l u s t e r e dl i n e a g e sd e f i n i t e l y ：s p - l lf o r m e dt h ec l u s t e ri ，s p - 1 ，s p - 2 ， s p - 6 ，s p - 9 ，s p - 1 0 ，s p - 1 4a n ds p - 1 8f o r m e dt h ec l u s t e ri i ，a n ds p - 3 ，s p - 4 ，s p - 5 ，s p - 7 ， s p - g ，s p - 1 5 ，s p - 1 6a n ds p - 1 7f o r m e dt h ec l u s t e rh i t h em a i nd i f f e r e n c eb e t w e e n t h s e st w op h y l o g e n f i ct r e e sw a st h ed u s t e ri i t h i sc l u s t e rw a ss u b d i v i d e di n t ot w o l i n e a g e st h a to n es u b d u s t e rc o n t a i n e ds t r a i n ss p - i ，s p - 2 ，s p - 9a n ds p - l o ，a n dt h e o t h e rc o n t a i n e ds t r a i n ss p - 6 ，s p - 1 4a n ds p - 1 8w i t ht h es u p e r m a t r i xa p p r o a c hw h i l e t h e r ew a sn ol i n e a g ei nt h ec l u s t e r1 1w i t ht h es u p e r t r e ea p p r o a c h 3 m o l e c u l a rm a r k e r st oe v a l u a t et h ep r o d u c t i o nt r a i t si na r t h r o s p i r a p l a t e n s i $ f o u rm o l e c u l a rm a r k e rt e c h n i q u e sw e r ce s t a b l i s h e dw h i c hc o u l de v a l u a t e p r o d u c t i o nt r a i t so fa r t h r o s p i r ap l a t e n s i sc o n v e n i e n t l y , f l e e t l ya n de f f i c i e n t l yf o rt h e f i r s tt i m e ，d e s c r i b e da sb e l o w ：( 1 ) i nt h e16 s - 2 3 sr r n ai t s ，t h es e q u e n c e sf r o m1t o 5 0b p ( i t s m a r k e r l ) a n d2 8 1t o4 0 0b p ( i t s - m a r k e r 2 ) w e r ed i s t i n c tm a r k e d l y , l v c o n s e q u e n t l yt h e yc o u l db eu s e dt oe v a lu a _ t et h ep r o d u c t i o nt r a i t s ( 2 ) t h ep o i n t so f 尹， 2 0 山，3 0 。，5 6 血a n d7 2 埘i na m i n oa c i ds e q u e n c e so fc p c li n it o8 0b pw e r ed i v e r s e t h u st h e ye o t f l db e o o m cam o l e c i l l a rm a r k e r ( 3 ) a n o t h e rm o e c u a rm a r k e rw a s s p e c i a lb a n d so fr a p de l e c t r o p h o r e t i cm a pa m p l i f i e db y $ 3 5a n d $ 9 9p r i m e r s n a m e l y , i tw a sc o n s i d e r e da sas u p e r i o rp r o d u c t i o nt r a i tg r o u pw h e nt h eb a n d sw e r ea t 6 8 0b pa n d9 0 0b p ，a m p l i f i e db ys 3 5a n d $ 9 9r e s p e c t i v e l y , a n da ni n f e r i o ro n ea t9 0 0 b pa n d6 5 0b p ( 4 ) t h ep r o d u c t i o nt r a i t sc o u l da l s ob ee v a l u a t e db yt h ee x d n ai n t o t a ld n a , t w ob a n d sw a sr e p r e s e n t e ds u p e r i o rp r o d u c t i o nw a i t s , a n do n eb a n d i n f e r i o r k e yw o r d s ：a r t h r o s p i r a , t a x o n o m y , p r o d u c t i o nt r a i t s , m o l e c u l a rn 翰d s u p e r t r e e , s u p e n m a f i 】【，e x t r a c h r o m o s o m a ld n a ( e x d n a ) v 致谢 研究生生涯即将结束，回望所走过的路，一时感慨良多。两年时光，在人生 旅途的坐标中，也许只是一个“点”，但这个“点”的影响，将在以后的r 子罩，时 刻伴随着我。 在论文即将付梓之际，首先要感谢的是我的导师汪志平博士。汪老师以渊博 的学识，开阔的视野，严谨的治学态度，督促、指导着我在研究方向上努力i i i 行， 去勇敢地的面对困难。生活上，汪老师以宽博的胸襟和对生活饱满的热情，通过 点滴小事教会我许多做人做事的道理，指导着我从不同的角度观察生活，认识、 分析事物。在此，谨向恩师表示崇高的敬意和衷心的感谢。 在学习和研究过程中，也得到了本所陈子元院士、华跃进所长、沈圣泉书记、 徐步进教授、叶庆富教授、崔海瑞教授、张明龙副教授、黄建中副教授、张永熙 副教授、柴立红副教授、孙志明副教授、傅俊杰副教授和赵小俊实验师、以及其 他老师对我的关心和支持，在此向他们致以深深的谢意。 感谢浙江大学研究生处领导及农业与生物技术学院研究生科袁熙贤老师、马 永芳老师、吴晓晶老师的热情指导与帮助。 感谢本所许镇孥博士、许光治博士、汪海燕博士、陆辉明博士、张泉硕士、 李小白硕士、孙洁硕士等对我论文和工作中的指导和生活中的帮助。 特别感谢本实验室杨灵勇硕士、陈晓燕硕士、李雪斌博士、张巧生硕士、以 及潘剑用、沈潞妮和安伟民等同学在学习与生活上给予的关心和帮助，在实验室 这个大家庭旱，我们共同进步与成长。 感谢我的室友方华博士、华大颂博士、安亚明硕士。他们使我的研究生生活 变得丰富多彩。 最后，特别要感谢我的家人，他们对刻给予我支持和鼓励，并在学习上给我 以督促，使我能安心学习，顺利完成学业。 谨以此文献给所有关心和帮助过我的老师、同学及亲朋好友，致以我真挚的 谢意! 黄晖 2 0 0 7 年5 月于华家池 本论文创新之处： l 测定了1 0 株节旋藻品系的1 6 sr r n a 基因全序列，并与g e n b a n k 中相关序列 进行联配和聚类分析，进而首次构建了较完整颤藻目的亲缘关系树，结果支 持将节旋藻单立成与螺旋藻并列的属的观点，为澄清节旋藻和螺旋藻分类学 上长期存在的争议提供了有力证据。 2 测定并首次综合了1 6 sr r n a 、1 6 s - 2 3 sr r n a 转录单元内间隔区( i t s ) 、2 3 s r r n a 和c p c h i d 操纵子等序列的遗传信息，进而利用超级树和超级矩阵法构 建了节旋藻品系问的亲缘关系树，为节旋藻品种( 系) 间的分类与鉴定提供 了理论依据，并为其它物种的低阶元亲缘关系的研究提供可借鉴的方法指导， 3 研究并发现节旋藻品系s p - 1 2 的1 6 sr r n a 序列很可能来源于弯杆菌属和节 旋藻属品系间的基因水平转移，为该物种的起源、进化与分类等提供了新的 重要信息。 4 在总结本课题组长期实验研究和生产实践基础上，发现在节旋藻生产性状优 与劣两类品系间1 6 s - 2 3 sr r n a i t s 、c p c i 、s 3 5 和$ 9 9p c r 扩增产物、e x d n a 方面存在显著的共性差异，进而提出了4 种简单、快速、有效评价节旋藻生 产性状优劣的分子标记，为生产上优良品系的筛选与构建提供了新的途径和 技术方法。 浙江人学硕十学伉论文 第一章文献综述 l 节旋藻及其分类学研究进展 1 1 节旋藻概述 节旋藻( a r t h r o s p i r a ) 和螺旋藻( s p i r u l i n a ) 均为由多个细胞串连而成、无 异形胞的原核丝状微藻。它们的藻丝不分枝，币常形态一般呈规则的螺旋或波浪 形。在分类学上，两者均属蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 、颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤 藻科( o s c i l l a t o r i a c e a e ) ，但在属的划分和归类上则由于历史原因而长期混淆并存 有分歧( c i f e r r i ，1 9 8 3 ；胡鸿钧，1 9 9 7 ) 。近年来，国内外综合形态学、生理生化、 分子系统学等研究成果形成了较一致的观点，即将节旋藻和螺旋藻设为颤藻科下 两个独立的属，澄清过去在科学研究，特别是在大规模商业化丌发中所称的“螺 旋藻”实际上几乎都为节旋藻，并建议今后学术用语还节旋藻以真名，而在产品 和商业性用语上仍可习惯称作“螺旋藻”( 胡鸿钧，2 0 0 3 ；杨灵勇等，2 0 0 6 ) 。 到目前为止，国内外已发现节旋藻属至少有钝顶节旋藻( a r t h r o s p i r a p l a t e m i s ) 、极大节旋藻( a r t h r o s p i r am a x i m a ) 、豁泽节旋藻( a r t h r o s p i r a s u b s a l s a ) 等3 8 个种。它们大多生长于淡水或献碱水中，仅有4 种生长于海洋( 胡鸿钧，1 9 9 7 ； 彭自露等，1 9 9 3 ；吴开国，1 9 9 8 ) 。其中钝顶节旋藻和极大节旋藻是当前国内外研 究与商业化丌发规模最大的两个种( 胡鸿钧，1 9 9 7 ；m o s u l i s h v i l ie la 1 ，2 0 0 2 ；l e h t o 甜a 2 0 0 6 ) 。 众多研究表明，节旋藻不仅蛋白质( 占细胞干重的5 0 7 0 ) 等营养成分丰 富，而且所含的伊胡萝卜素、不饱和脂肪酸( 如产亚麻酸) 、多糖、多胺和藻蓝 素等多种生物活性物质( c i f e r r ie ta 1 ，1 9 8 5 ；b e l a y , t 9 9 7 ；陈峰等，1 9 9 9 ：p u l ze la 1 ， 2 0 0 4 ；s u ne la 。2 0 0 6 ) ，对癌症、艾滋病、肝炎、糖尿病、高血脂等多种疾病具 有明显的预防和辅助治疗功效( l ie t a l ，1 9 9 7 ；张晓，1 9 9 9 ；l e h t oe ta 1 ，2 0 0 6 ) ，因 而被联合国粮农组织和世界卫生组织分别誉为“2 1 世纪最理想的食品”和。人 类2 l 世纪最佳保健品”。随着国内外对节旋藻研究的同益深入，其应用领域也在 不断扩展，已从最初的营养食品和医药保健品扩大到饵料与饲料( 唐理舟，1 9 9 9 ) 、 美容与化妆品( 李志勇，1 9 9 7 ) 、精细化工产品( 李乐农等，2 0 0 0 ) ，以及环境治理 和新能源丌发利用等方面( 汪志平等，1 9 9 7 b ；郑爱榕等，1 9 9 9 ；r a n g s a y a t o me t a l ， 浙江人学硕+ 学位论文 2 0 0 2 ) ，展现出广阔的应用前景。 同时，随着节旋藻商业丌发规模的不断扩大和产业化水平的同益提高，近年 来有关节旋藻的分子遗传学( b u t t a r e l l ie l a l ，1 9 8 9 ) 、高光合效率、形念建成( w a n g 甜a 1 ，2 0 0 5 ) ，以及耐盐碱( k e r f e l de t a l ，2 0 0 3 ) 、抗辐射机制( 汪志平等，1 9 9 8 ) 等基础研究也得到了前所未有的重视并不断深入。其成果不仅极大地推动了螺旋 藻产业的进步发展，而且对光合作用、生物起源与进化、逆境生存与适应机制 等重大生物学问题的研究也起到了巨大的推动作用( s a n a n g e l a n t o n ie la 1 ，1 9 9 3 ； 胡鸿钧，1 9 9 7 ；于平等，2 0 0 2 ) 。 1 2 节旋藻分类学研究进展 因节旋藻与其同科的螺旋藻形态学特征非常相近，如均不具异形胞、藻丝不 分枝且呈规则螺旋或波浪形等，造成了两者在属的划分与归类上长期混淆并存有 分歧( c i f e r r i ，1 9 8 3 ；胡鸿钧，1 9 9 7 ) 。一种意见认为，可以根据细胞横壁膈) 的 有无，将螺旋藻和节旋藻分成两个独立的属；莳者细胞横壁不明显，横壁处不收 缢；后者横壁清晰可见且收缢。另一种观点由蓝藻分类学家g e i t l e r ( 1 9 2 5 ) 提出： 他认为螺旋藻也存在横壁，只是由于藻丝直径比节旋藻的小得多而难以被观察 到，因而在其所著的蓝藻纲一书中，取消了节旋藻属，而将其作为亚属设予 螺旋藻属之下。g e i t l e r 的观点曾被学术界广泛接受，“钝顶螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) ”和“极大螺旋藻( s p i r u l i n am a x i m a ) ”等命名也被长期使用并影响至 今( 茅云翔等，2 0 0 1 ) 。 与其它物种一样，节旋藻等蓝藻的经典分类和系统发育学研究主要以形态学 特征为依据，它是现代生物分类与系统发育学研究的基础。而生物形念作为表型， 是基因与环境共同作用的结果，即“表型= 基因型十环境型”。节旋藻藻丝体的长 度、螺旋数、螺距、细胞尺寸等用作经典分类的主要形态参数指标，不仅因品种 ( 系) 不同而可能存有差异，而且即使同一品种( 系) ，也会因环境条件不同而 呈现出差别( 胡鸿钧，2 0 0 2 ) 。如a v i g a d ( 1 9 8 7 ) 曾报道，当培养温度升高、光照 强度增强时，节旋藻的螺距会变小；而在光照强度很弱的情况下螺距会变得很 长。b a i 等( 1 9 8 0 ) 曾描述3 种典型的节旋藻形态，并指出这3 种形态会因环境 或培养液成分的变化而相互转变。特别是实验研究与生产实践中均有发现并报道 浙江人学硕十学位论文 的，节旋藻在某些情况下会变成完全长直形( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) ，使其不符于经 典分类学上称节旋藻为“有规则的螺旋形或波浪形”之基本界定。因此，节旋藻 与螺旋藻的分类学地位，以及它们品种( 系) 问的分类，需在以形态学特征为主 要依据的经典分类学工作的基础上，结合生理生态，特别是现代分子尘物学等方 面的研究成果与技术方法。 近年来，国内外已根据脂肪酸( c o h e ne t a l ，1 9 9 5 ；r o m a n oe l a l ，2 0 0 0 ) 、蛋 白质( 汪志平。2 0 0 0b ) 等生化组成对节旋藻的分类与鉴定作了一些有意义的探 索。李晋楠等( 2 0 0 2a ) 先对7 株钝顶节旋藻的基因组d n a 进行r a p d 分析， 再根据它们的多念性，通过相似系数和遗传距离计算及聚类分析等进行分类研 究，得到了满意的结果。n e l i s s e n 等( 1 9 9 4 ) 、茅云翔等( 2 0 0 1 ) 、b a l l o t 等( 2 0 0 4 ) 利用有“生物进化分子钟”之称的1 6 sr r n a 基因序列对螺旋藻和节旋藻进行分 类与鉴定所取得的研究结果，为澄清它们在分类上长期存在的争议与分歧，在分 子遗传水平提供了证据。 需要指出的是，众多研究表明，1 6 sr r n a 基因序列一般更适合于属问分类， 而对种以下水平往往会因个体日j 差异位点少、分辨率不够等原因，而得不到合理、 满意的分类结果( g e o r g ee ta 1 ，1 9 9 2 ；n e l i s s e ne ta 1 ，1 9 9 4 ；b i t t e n c o u r t o l i v e i r ae t a 1 ，2 0 0 1 ) 。同时，1 6 s - 2 3 sr r n a 转录单位内间隔区序列( i t s ) 在生物进化过程 中的变异程度一般比1 6 sr r n a 基因序列的高，可用作分子标记对螺旋藻或节旋 藻的品种( 系) 内等较低阶元进行分类与亲缘关系研究( s c h e l d e m a ne t a l ，1 9 9 9 ； 茅云翔等，2 0 0 1 ；b a u r a i ne t a l ，2 0 0 2 ；杨灵勇等，2 0 0 6 ) 。 一些学者以蓝藻等少数藻类所特有的捕光色素蛋白藻胆蛋白亚基的基 因( 如e p c b ，e p e a ，c p c b e p c a 间隔区) 序列为分子标记，对节旋藻等藻类作 分类学研究发现，不仅所取得的结果合理、科学，而且分类信息量比1 6 sr r n a 基因序列、1 6 s 一2 3 sr r n ai t s 等的更为丰富( m a n e ne la 1 ，2 0 0 2 ；t e n e v ae la 1 ， 2 0 0 5 ) 。在藻胆蛋白中，与其亚基同步进化的还有3 种连接亚基的棒状连接多肽 c p c h 、c p c i 和c p c d ，它们均由一个被称为“t e a ”的祖先基因演化而来( g r o s s m a n “a 1 ，1 9 8 6 ；k i r ke t a l ，1 9 9 5 ) 。基于这一原理，杨灵勇等( 2 0 0 6 ) 首次尝试并建 立了以由c p c h 、c p c l 和c p c d 基因组成的操纵子序列c p e h i d ( b h a l e r a oe la 1 ， 1 9 9 3 ；m a e c o l l ，1 9 9 8 ) 为分子标记，对钝顶节旋藻品系进行亲缘关系和分类学研 浙江人学硕十学 寺= 论文 究的新方法。 在分子系统学研究中，除了需要寻找更精确的分子标记或改进原有的分子标 记以适应低阶元的亲缘关系研究外。还需要根掘不同信息的数掘类型，采用合适 的数据分析方法和系统树构建方法，建立起准确合理的系统亲缘关系树，从而真 j 下了解生物的系统发生关系。 2 系统发育基因组学及其主要分析方法 2 1 系统发育基因组学 1 8 5 9 年，英国生物学家和生物进化论的奠基者d a r w i n 在其巨著物种起源 中首次提出生物进化的观点；1 8 6 6 年，德国动物学家h a e c k e l 在著名的生命之 树一书中首次提出了为当前生物学家所关注的系统发育学 4 0 的数值) 如图3 - l 示。 m l 法 m p 法 n j 法 l 图3 1 基于1 6 sr r n a 基因序列的系统发生树 f i g u r e3 - lp h y l o g e n e t i ct f e e sb a s e d o nt h ea l i g n m e n to f1 6 sr r n ag o n es e q u e n c e si n a r t h r o s p i r a p l a t e n s i s m l 法：m a x i m u ml i k e l i h o o dm e t h o d ；m p 法：m a x i m u mp a r s i m o n ym e t h o d ：n j 法：n e i g h b o u r j o i n i n gm e t h o d 。 m 1-1 r 一j 5 s 嚣 i m ， m 丁1j 1jr-j 1，j 4 8 鬻涮 浙江人学硕十学何论文 从m l 系统树( 图3 1 ，a ) 可以看出，1 6 株钝顶节旋藻品系可以分成3 个大 的聚类簇：s p 一1 l 单独为一簇，记为聚类簇i ；s p 一1 、s p 一2 、s p 6 、s p 一9 、s p 一1 0 、 s p 1 4 和s p 1 8 组成聚类簇i i ：其余品系为聚类簇i i i 。虽然聚类簇i j 和i i i 之| 日j 的分类得到b o o t s t r a p 极强的支持( 1 0 0 ) ，但大簇内部品系阃自展值普遍偏小， 这与1 6 sr r n a 基因过于保守，致使簇内品系间差异位点数及遗传距离较小有关 ( g e o r g ee ta 1 ，1 9 9 2 ；n e l i s s e ne l a l ，1 9 9 4 ；b i t t e n e o u r t - o l i v e i r ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 利用m p 法( 图3 1 ，b ) 和n j 法( 图3 1 c ) 所得的分类