（生理学专业论文）孕妇外周血中胎儿细胞的克隆化培养.pdf

中国协和医科大学硕士学位论文 英文缩略语 b f u eb u r s tf r o m i n gu n i t e r y t h r o i d c f u e 红系爆式集落形成单位( 前成 红细胞的前驱细胞) c o l o n yf o r m i n gu n i t e r y t h r o i d 红系集落形成单位( 后成红细胞 的前驱细胞) c f u - g e m m c o l o n yf o r m i n gu n i t g r a n u l o c y t e ，粒系、红系、巨噬细胞系、巨 e r y t h r o c y t e ，m a c r o p h a g e ， 核细胞系克隆形成单位 m e g a k a t y o c y t e c v sc h o r i o n i cv i l l u ss a m p l i n g绒毛取样 d n t p s d e o x y r m o n n u c l e d t i d e脱氧核糖核苷三磷酸 t r i p h o s p h a t e e be t h i d i u mb r o m i d e f a c s 溴化乙锭 f l u o r e s c e n c e a c t i v a t e d荧光激活的细胞分离术 c e l ls o r t i n g m a c s m a g n e t i c a c t i v a t e d 磁性激活的细胞分离术 c e l ls o r t i n g p b s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 磷酸盐缓冲液 p e pp r i m e re x t e n s i o n p r e a m p l i f i c a t i o n 引物延伸预扩增 中国协和医科大学硕士学位论文 f i s hf l u o r e s c e n c ei ns i t u荧光原位杂交 h y b r i d i z a t i o n t et r i se d t ab u f f e rs o l u t i o nt r i s e d t a 缓冲液 s t rs h o r tt r a n d o m r e p e a t短串联重复序列 中国协和医科大学硕士学位论文 中文摘要 孕妇外周血中胎儿细胞的克隆化培养 f i 医学遗传学长期以来追求的目标之一就是找到一种简单可靠的非损伤性 产前遗传诊断的方法。非损伤性产前遗传诊断对胎儿没有任何风险，对孕妇几 乎没有痛苦与忧虑，而且不受孕妇年龄和病史( 如习惯性流产、先兆流产、岔 腔或宫腔感染等) 的限制，易于接受与推广。，1 、 t 一个多世纪以前人们就已经发现孕妇外周血中存在胎儿细胞，随着时间的 推移和研究的深入这一点被越来越多的人所验证，很多研究者致力于利用孕妇 外周血进行非损伤性产前遗传诊断的研究，这是一种非常理想的产前遗传诊断 方法，几乎可以用于诊断所有目前可以进行产前遗传诊断的疾病，包括染色体 异常所导致的遗传病。f 但这一理想的产前诊断技术仍存在两大问题：( 1 ) 孕妇 外周血中胎儿细胞数量极少；( 2 ) 富集得到的细胞纯度不高。人们尝试用各种 各样的方法来克服这两大难点，其中孕妇外周血中的胎儿细胞的克隆化培养无 ，、 疑是解决这两个问题的最佳方法。j 但是人们对能否成功培养孕妇外周血中的胎 儿细胞存在不同的观点，拳实验室在这方面已经做了一些探索性的工作，我们 准备进一步验证这一方法的可行性。 f 相习f 砻名，砭+ ；0r 争。t l 。”一 i 我们先用脐带血摸索胎儿有核红细胞体外培养的条件，然后耿孕妇( 1 3 17 孕周) 外周静脉血( 5 7 m 1 ) ，用双密度梯度离心法分离单个核细胞，洗涤，接 种于含有多种生长因子和人脐血血清的半固体培养基，3 7 。c ，5 c 0 2 培养1 2 1 4 天后收获细胞。同时取未经培养的孕妇外周血，用双密度梯度离心分离得到单 个核细胞，分别用p e 荧光标记的抗h b f 单抗标记，经流式细胞分选仪分离 ( f a c s ) ，收集h b f 阳性细胞，记数。在倒置显微镜下，用显微操作仪控制的 中国协和医科大学硕士学位论文 玻璃针挑取培养后分离得到的h b f 阳性细胞。每一个挑取的细胞单独置于一个 0 5 m l 薄壁p c r 管中。每一管中的单个细胞经蛋白酶k 消化，以1 5 - m e r 的随 机引物进行p r i m e re x t e n s i o np r e a m p l i f i c a t i o n ( p e p ) o ( p e 吵2 物作为随后进行的 特异引物p c r 反应的模板。在基因分析中，首先分析胎儿的性别，以巢式p c r 扩增丕x 位点，扩增产物经h a e i i i 消q 6 ，p a g e 电泳，分析胎儿性别，若为 男性，则可作为确定所挑取细胞来源于胎儿的重要指标。之后，选择父母双杂 合率高的多态性遗传标记分析母体和所挑取细胞的基因型，根据s t r 的孟德尔 遗传规律进行连锁分析，确定所挑取细胞是否有可能是胎儿来源以及是否受到 母体细胞或其它来源的污染。因为无法得到父亲的资料，所以只能推测而不能 完全确定胎儿细胞的父源等位基因。 在我们培养的5 份孕妇外周血中，均可看到许多克隆生长，与未经培养的 孕妇外周血比较，培养后孕妇外周血中h b f 阳性细胞明显增多，相差两个数量 级( p ( 0 0 5 ) 。分别收集每份孕妇外周血血样培养后经f a c s 分选得到的h b f 阳性细胞( 3 1 6 - 2 0 8 6 个细胞例) 进行分析，有3 例经性别鉴定发现男性胎儿 细胞( 阳性率分别为4 4 、5 4 、4 0 ) ，经连锁分析的结果显示男性胎儿细胞有 一等位基因条带与母源等位基因条带相同而另一条带与母源不同。结合性别和 8 t r ( d 8 8 1 1 7 9 ) 分析结果，我们完全确定这3 例挑取的细胞中有的属胎儿来源， 并没有受到母体细胞或其它来源的污染。另2 例性别分析表明，所挑取的细胞 均显示为女性细胞，然后用连锁分析的方法来确定所挑取细胞的来源，结果发 现在挑取的细胞中有些细胞也有一条带与母源的相同而另一条带与母源不同 ( 阳性率为2 5 、4 4 ) ，初步确定这些细胞为胎儿来源。我们的实验说明孕妇 外周血中的胎儿细胞经培养是可以得到增殖的，我们有十之八九的把握获得纯 一的胎儿细胞，但是要真正用来进行产前遗传诊断尚需要进一步的探索、改进。 j 装唾鼋；j ：o 方+ 庀1 乡岛2 ，( 腑一己薹 坦1 z t 卺蔫 中国协和医科大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec u l t u r eo ff e t a lc e l l s f r o mm a t e r n a lb l o o d a l o n g - s o u g h tg o a l o fm e d i c a lg e n e t i c sh a sb e e nt h e d e v e l o p m e n to f p r e n a t a ld i a g n o s i sp r o c e d u r e st h a td on o te n d a n g e rt h ef e t u s t h es a f e t yo f n o n i n v a s i v em e t h o d so fp r e n a t a l d i a g n o s i s i s e s p e c i a l l y a t t r a c t i v eb e c a u s e t h e y c a nb ee x t e n d e dt oa l l p r e g n a n tw o m e n ，r e g a r d l e s so ft h e i ra g e o r p r e v i o u sm e d i c a lh i s t o r y ( s u c h a sh a b i t u a la b o r t i o n ，t h r e a t e n e da b o r t i o ne t c ) i ta v o i d sa n yr i s kt ot h ef e t u sa n dt h em o t h e r , a n dm i n i m i z e st h em o t h e r s s u f f e r i n g s f e t a lc e l l sw e r ef i r s ti d e n t i f i e di nm a t e m a lb l o o dac e n t u r ya g oa n ds i n c e t h e nt h e i re x i s t e n c eh a sb e e nc o n f i r m e dt i m ea n da g a i n n u m e r o u ss t u d i e st o o p t i m a l l y i s o l a t ea n dr e l i a b l y i d e n t i f yf e t a lc e l l sf r o mb l o o do fp r e g n a n t w o m e nh a v em a d en o n i n v a s i v e p r e n a t a ld i a g n o s i sm o r ea n d m o r e p r o m i s i n g a n dp r a c t i c a l a l t h o u g hi s o l a t i o no ff e t a lc e l l sf r o mm a t e m a lb l o o di su n d e r i n t e n s i v ei n v e s t i g a t i o na n di m p o r t a n ta d v a n c e sh a v eb e e nm a d e n o n i n v a s i v e p r e n a t a ld i a g n o s i su s i n gf e t a lc e l l si nm a t e r n a lb l o o dh a sb e e nh a m p e r e db y t h ef a c tt h a tv e r yf e wf e t a lc e l l sa r ep r e s e n ti nm a t e r n a lb l o o d a n di ti s a l m o s ti m p o s s i b l et oo b t a i na p u r es a m p l e o ff e t a lc e l l sf r o mm a t e r n a lb l o o d m e r e l yb yt h eu s u a lm e t h o d so f e n r i c h m e n tf o rf e t a lc e l l s c e l lc u l t u r ei so n e p o s s i b l ew a yt oo v e r c o m et h e s eo b s t a c l e s b u tc u l t i v a t i n gf e t a lc e l l si nv i t r o h a s n tb e e nu n i f o r m l ys u c c e s s f u l t h ea i mo fo u rw o r ki st o i m p r o v et h e o u t c o m eo f t h i sm e t h o d f i r s t w eu s e dc e l l si s o l a t e df r o mc o r db l o o dt ot e s ti fo u rc u l t u r e m e d i u mc o u l ds u s t a i nt h ep r o l i f e r a t i o no ff e t a lc e l l s w h e nt h i sw a s p r o v e d t o b es u c c e s s f u l t h e np e r i p h e r a lv e n o u sb l o o df 5 7 m 1 ) w a so b t a i n e df r o m10 p r e g n a n tw o m e n a t13 17w e e k so fg e s t a t i o n n u c l e a l e de r y t h r o c y t e sw e r e i s o l a t e db yd o u b l ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o na n dw a s h e dt w i c ew i t l l r p m i16 4 0 c e l l sf r o m5s a m p l e sw e r es e e d e di ns e m i s o l i dc u l t u r em e d i u m 中国协和医科大学硕士学位论文 4 c o n t a i n i n gs e v e r a lg r o w t hf a c t o r sa n dh u m a nc o r db l o o ds e r u ma t3 7 i na h u m i d i f i e d5p e r c e n tc 0 2a t m o s p h e r e a f t e r1 2 1 4d a y so fc u l t i v a t i o n ，w e h a r v e s t e dt h ec e l l s f e t a ln u c l e a t e de r y t h r o c ”e sw e r el a b e l l e db vp e h b f a n t i b o d ya n d i d e n t i f i e dp r e l i m i n a r i l yb yf l u r o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g ( f a c s ) i n d i v i d u a l h b f + c e l l sf r o mc u l t u r e d s a m p l e s w e r ec o l l e c t e d s e p a r a t e l y w i t hm i c r o m a n p u l a t o r p r e a m p l i f i c a t i o no ft h ec e l l g e n o m ew a s p e r f o r m e db yt h em e t h o d o f p r i m e re x t e n s i o np r e a m p l i f i c a t i o n ( p e p ) u s i n g p e pp r o d u c t sf r o mi n d i v i d u a lc e l l sa s t e m p l a t e ，s e xw a sd e t e r m i n e db y a n a l y z i n g t h ez f x l o c u s b y n e s t e d - p c r a m p l i f i c a t i o n a n dh a e d i g e s t i o no f t h ep r o d u c t s i ft h er e s u l tw a sc o n s i s t e n tw i t ham a l es e x t h ec e l l m u s tb eo ff e t a lo r i g i n t h ec e l lo r i g i nc o u l db ec o n f i r m e d b ya n a l y z i n gt h e m e n d e l i a ni n h e r i t a n c eo fs t rm a r k e r sw h i c hw e r ed o u b l y h e t e r o g e n e o u si n t h ef a t h e ra n dm o t h e r a tt h e s a m e t i m e ，t h e m a t e r n a la n d o ro t h e r c o n t a m i n a t i o nc o u l db ei d e n t i f i e d b u ti no u rw o r k ，w ec o u l do n l ys p e c u l a t e o nt h ep a t e r n a la l l e l e si nt h ef e t a lc e l l sb e c a u s ep a t e m a lb l o o dc o u l d n tb e o b t a i n e d w ec o n c l u d e dt h a tf e t a ln u c l e a t e de r y t h r o c y t e sc o u l db eg r o w n i nv i t r o t h e r ew a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ea m o u n to fh b f + c e l l sb e t w e e n c u l t u r e da n du n c u l t u r e dg r o u p s ( p o 0 5 ) w 色c o u l dd e t e c tz f yi nt h r e eo ft h e f i v ec u l t u r e d s a m p l e s t h i sw a sc o n f i r m e db ya n a l y z i n gt h es t rm a r k e r d 8 s117 9 a l lt h em a l ef e t a lc e l l ss h a r e do n ea l l e l ew i t hm a t e m a lc e l l sw h i l e t h eo t h e ra l l e l ew a sc l e a d vd i f f e r e n t t h ep r o p o r t i o no ff e t a lc e l l sw a s4 4 5 4 ，4 0 r e s p e c t i v e l y i nt h eo t h e rt w oc u l t u r e ds a m p l e s f e m a l ec e l l sc o u l d a l s ob ed e t e r m i n e dt ob eo ff e t a lo r i g i nb yt h em e t h o do fs t r 1 i n k a g ea n a l y s i s w ec o u l dd e t e c tf e m a l ef e t a lc e l l sw h i c hs h a r e do n ea l l e l ew i t hm a t e r n a lc e l l s w h i l et h eo t h e ra l l e l ew a sc l e a r l yd i f f e r e n t t h ep r o p o r t i o no ff e t a lc e l l sw a s 2 5 a n d 4 4 r e s p e c t i v e l y 中国协和医科大学硕士学位论文 前言 医学遗传学是运用遗传学的原理方法研究人类遗传病的病因、病理、诊断、 治疗的一门科学。通过对许多遗传性疾病病因，病理的长期研究，人们开始认 识到遗传病是由于遗传物质的载体d n a 发生变异所导致的。随着细胞遗传学和 分子遗传学技术的飞速发展，特别是荧光原位杂交技术( f i s t ) 和多聚酶链反 应技术( p c r ) 的出现，用细胞及分子遗传学的方法可以检测出越来越多的与 疾病相关的变异并做出诊断。但是因为到目前为止对绝大多数遗传性疾病而言 还没有有效的治疗方法，所以进行遗传病的产前诊断是预防患儿出生，减轻国 家与家庭的负担，实现优生优育，提高整个民族人口素质的重要手段之一。 进行产前遗传诊断的前提是能获得含有胎儿d n a 的材料并能从中获得胎 儿d n a 。尽管分子生物学和细胞生物学技术的发展已经使分析胎儿d n a 的方法 变得很简单，但到目前为止，产前遗传诊断获得胎儿细胞的方法仍是绒毛取样 ( c h o r i o n icv i l l u ss a m p l j n g ，c v s ) 或羊膜( 腔) 穿刺( a m n i o c e f i t e s is ) 。 虽然利用羊水或绒毛进行产前遗传诊断是相当精确的，但是绒毛取样( c v s ) 或羊膜腔穿刺对于妊娠存在着一定比例的风险，同样重要的是，这种方法需要 相当娴熟的技术，给孕妇带来一定的痛苦，并且受孕妇年龄和病史的限制( 如 习惯性流产、先兆流产、盆腔或宫腔感染等病史的孕妇就不能用这种方法取 材) 。羊膜腔穿刺是最早采用的产前诊断取样方法：在孕i6 - 2 0 周，从包围着 胎儿的羊膜腔中抽取约1 0 毫升羊水，从中得到胎儿细胞，经过培养后进行染 色体组成、基因序列或酶水平的分析。羊膜腔穿刺过程中可能出现子宫收缩， 腹部涨痛，阴道出血，感染或胎儿损伤。羊膜腔穿刺必须在孕中期进行，这对 经产前诊断需终止妊娠者因胎儿已较大，必增加孕妇的痛苦，若能更早的进行 产前诊断( 三个月以前) ，那终止妊娠只须在门诊进行吸宫术，这样可以减少 病人的痛苦，绒毛吸取术就是基于这一要求发展起来的。采取绒毛组织，一般 中国协和医科大学硕士学位论文 以妊娠7 1 2 周适宜。但这两种技术只有在超声波技术发展成熟，其安全性能 得到一定保证后才慢慢被大家接受。尽管这样，它们都存在流产、感染、出血、 r h 致敏、胎儿损伤的可能。绒毛吸取术的总妊娠丢失率 9 5 ，5 c 0 2 培养1 2 - 1 4 天。 收获细胞 将培养组中每个样本所有培养皿中的全部细胞收集到一起，置于一5 0 m l 离心管中，用1 6 4 0 洗涤3 4 次。然后将细胞悬浮于1 6 4 0 中。计数。 流式细胞分离技术一荧光激活的细胞分离术 ( f l u o r e s e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g ，f a c s ) 富集孕妇外周 血中荧光y 抗体标记的阳性细胞 培养组中每一样本设立阴性对照( 正常成人外周血5 m 1 ) ，阳性对照( 新 生儿脐血5 m 1 ) ，并与非培养组孕妇外周血( 5 - 7 m 1 ) 的单个核细胞分别经过f a c s 分选，收集h b f 阳性细胞并作一比较。 1 用前述密度梯度离心的方法分别分离阴性对照、阳性对照、非培养的 孕妇外周血中的单个核细胞，并用前述方法洗细胞。计数。 2 分别往培养后收获的细胞及经密度梯度离心得到的各组单个核细胞中 加入l m l o 0 5 戊二醛，室温固定1 0 分钟。 3 用2 m l p b s b s a 洗细胞3 次，室温，离心6 0 0 9 ，5 m in ，小心移去全部上 清。 4 将细胞悬浮于0 5 m l o 1 t r i t o n 一1 0 0 ，室温，孵育5 分钟。 5 用2 m p b s b s a 洗细胞，室温，离心6 0 0 9 ，5 m i n ，小心移去全部上清。 6 将细胞悬浮于i o o u l p b s b s a 中，并加入5 0 u l p e h b f 单克隆抗体、 7 0 0 u l p b s b s a ，室温，避光孵育1 5 分钟。 中国协和医科大学硕士学位论文 7 8 9 10 1l 12 用2 m l p b s b s a 洗细胞，室温，离心6 0 0 9 ，5 m i n ，小心移去全部