（机械电子工程专业论文）小型底栖生物样品自动分离技术研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文以小型底栖生物标本为研究对象，基于国内外小型底栖生物分离的现状，综合 利用机械、电子、两相流、生物、光学等技术理论，提出分离小型底栖生物样品中生物 标本的自动分离技术，研制了一套基于此技术的新型小型底栖生物自动分离装置。着重 分析了流道优化设计和位移控制，提出了旋转射流法解决分离装置中毛细孔堵塞问题， 应用比例控制技术解决分离装置中接收定位问题，并进行了仿真和实验论证。结果表明： 本文的分离技术可以达到自动分离小型底栖生物标本的目的，并具良好的使用效果。 全文分为七章： 第一章阐述了研究背景、意义以及国内外小型底栖生物分离的现状及相似领域的研 究情况，并做了相应的分析。 第二章介绍了咀小型底栖生物自动分离技术为依托的分离装置的设计方案，将其划 分为四个子技术：生物标本稀释的流道优化技术、底栖生物标本的识别检测技术、机电 分离采集技术及整机集成技术。并对生物识别检测技术做了简单介绍。 第三章分析了生物标本稀释的流道优化技术，着重解决了流道设计中的参数优化、 解堵、倒灌等问题。提出了旋转射流法解决毛细孔堵塞问题，取得了良好的解堵效果， 解决了这个流道技术中最关键的一个技术难点。 第四、五章介绍了生物标本接收的机电分离装置。从装置的设计分析到试验研究， 从开环到闭环控制。提出了以比例控制解决样品的接收，达到了使用要求。通过仿真研 究找到了闭环数字p i d 控制三个参数之间的关系，为以后试验参数调整提供了指导。 第六章介绍了整机集成技术，并对整机做了试验研究。 第七章对全文进行了总结，对本文分离技术的未来发展做了展望。 本论文特点是注重实用性，将自动分离技术与具体实现结合起来，着重解决技术难 点、分析设计思路。 关键词：小型底栖生物；分离；检测；两相流；毛细孔：旋转射流；解堵；比例控制 a 浙江大学硕上学位论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , m e c h a n i c s 、e l e c t r o n i c s 、t w o p h a s ef l o w 、b i o l o g y 、a n do p t i c s t h e o r i e sw e r es y n t h e t i c a l l ya p p l i e d ，a u t o m a t i cs e p a r a t i o nt e c h n i q u e sf o rm e i o b e n t h o s b a s e do nt h ec u r r e n td e v e l o p m e n t si nt h i sf i e l df r o mc o u n t r yt oa b o a r dw e r ep u t f o r w a r d ，a n das e to fn e wt y p em e i o b e n t h o ss e p a r a t ed e v i c ew a sd e v e l o p e d b et a k e n a se m p h a s e s ，o p t i m i z e df l o wp i p ed e s i g na n dm o t i o nc o n t r o lt e c h n i q u ew e r ea n a l y z e d t h er o t a t i n gl i q u i dj e tm e t h o db a s e do nt h ec r a m m i n ga n ds t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i c so f c a p i l l a r yp o r o c i t yw a sp r o p o s e dt os o l v ec a p i l l a r yp o r o c i t yp l u g - r e m o v i n ga n dr a t a b l e c o n t r o lw a sp r o p o s e dt os o l v es a m p l e sc o l l e c t i n g ，s i m u l a t i o na n dt e s td e m o n s t r a t i o n w e r ea l s os u p p l i e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h es e p a r a t et e c h n i q u e sc a nr e a c ht h eg o a l o f m e i o b e n t h o sa u t o m a t i cs e p a r a t i o na n dh a sg o o de f f e c t s t h et h e s i si n c l u d e ss e v e nc h a p t e r s c h a p t e r 1i sas u r v e y t h ec u r r e n td e v e l o p m e n t si nt h ef i e l do fm e i o b e n t h o s s e p a r a t eo rr e l a t e df r o mc o u n t r yt oa b o a r dw e r ei n t r o d u c e da n da n a l y z e d t h eb a s e s a n ds i g n i f i c a n c e so f t h er e s e a r c hw e r ed i s c u s s e d i nc h a p t e r2 ，t h ed e s i g no fs e p a r a t ed e v i c eb a s e do na u t o m a t i cs e p a r a t i o n t e c h n i q u e sf o rm e i o b e n t h o ss p e c i m e n sw a si n t r o d u c e d t h ea u t o m a t i cs e p a r a t i o n t e c h n i q u e sw e r ed i v i d e di n t of o u rs u b - t e c h n i q u e s ：o p t i m i z e df l o wp i p et e c h n i q u e ， d e t e c t i o nf o rm e i o b e n t h o st e c h n i q u e ，e l e c t r o - m e c h a n i c a ls e p a r a t et e c h n i q u e ，o v e r a l l i n t e g r a t i o nt e c h n i q u e f l u o r e s c e n ti n s p e c tt e c h n i q u ew a ss i m p l yi n t r o d u c e d i nc h a p t e r3 ，o p t i m i z e df l o wp i p et e c h n i q u ew a sa n a l y z e d o p t i m i z e dp a r a m e t e r s ， p l u g - r e m o v e l ，b a c k i n gu pe t c w e r ee m p h a s i z e di nf l o wp i p e d e s i g ns o l v i n g r o t a t i n g l i q u i dj e tm e t h o dw a sp r o p o s e d ，w h i c hi so n e o fg o o dm e t h o d sf o rc a p i l l a r yp o r o c i t y p l u g r e m o v i n g ，t h u st h em o s tk e yt e c h n i q u ew a ss o l v e di nf l o wp i p ed e s i g n f r o m c h a p t e r 4t o c h a p t e r5 ，e l e c t r o m e c h a n i c a ls e p a r a t et e c h n i q u e w a s i n t r o d u c e df r o md e s i g na n a l y z e dt oe x p e r i m e n t a li n v e s t i g a t i o na n df r o mo p e n l o o p c o n t r o lt oc l o s e d l o o pc o n t r 0 1 r a t a b l ec o n t r o lw a sp r o p o s e dt os o l v es a m p l e s c o l l e c t i n g t h r e ep a r a m e t e r s r e l a t i o n s h i p o fd i g i t a lp i da r ed i s c o v e r e dt h r o u g h r 浙江大学硕士学位论文 s i m u l a t i o n ，w h i c hc a no f f e rg u i d ef o rp a r a m e t e ra d j u s t m e n ti nt e s t i nc h a p t e r6 ，o v e r a l li n t e g r a t i o nt e c h n i q u ew a sd i s c u s s e d ，a n do f f e r e do v e r a l l t e s ts t u d y i nc h a p t e r7 ，t h er e s e a r c hw o r ka n dm a i nc o n t r i b u t i o nw e r es u m m a r i z e d ，a n d p o i n t e dt h a tt h ep r o s p e c ta b o u t a u t o m a t i cs e p a r a t i o nt e c h n i q u e sf o rm e i o b e n t h o s s t u d i e sw a sg i y e n t h i sp a p e r si sp a y i n ga t t e n t i o nt op r a c t i c a b i l i t y , u n i t i n gt h et h e o r ya n dp r a c t i c e i n t oi m e g r i t y i ti se m p h a s i z eo ds o l v i n gt e c h n i q u ed i f f i c u l t i e sa n da n a l y z i n gd e s i g n i d e a s k 呵w o r d s ：m e i o b e n t h o s ；s e p a r a t e ；d e t e c t i o n ；t w op h a s ef l o w ；c a p i l l a r yp o r o e i t y ； r o t a t i n gl i q u i dj e t ；p l u gr e m o v e l ；r a t a b l ec o n t r o l c 第一章综述 1 1 课题背景 第一章综述 随着陆地资源的日趋紧张，人口剧增，耕地锐减，环境状况日趋恶化。人们 把目光投向了地球陆地以外的地方，海洋和外星球，尤其是海洋目前更具有可行 性。海洋素有“生命之泉”、“液体宝库”、“蓝色保健箱”、“海底聚宝盆”、“海上 家园”、“第六大陆”等等一系列的美称，这足以说明海洋的价值。从上个世纪 开始各国就加紧了对海洋的研究，尤其是发达国家，如德国、英国、欧盟、美国 等都在海洋研究上投入了巨额资金0 3 。目前世晃各国也都加紧了对海洋的研究， 尤其是深海的研究，这还是一块未开发的处女地。 海洋是生命的摇篮。浩瀚的海洋水体在全部深度上都有生物分布，海洋生物 的栖居环境分水层和底层两部分。海洋生物生活环境奇特，不同于陆地： 海水深度对生物最明显的影响是流体静压力的作用和光照深度。 流体静压力，在海洋中每深1 0 m 压力约增加1 0 1 3 2 5 h p a 。海洋最深处压力 可超过1 0 1 3 2 5 1 0 6 h p a 。许多生物能耐受变化范围很大的压力，但一般来说生 活在深海海底生物的生命活动比较缓慢。 光照深度，光照强度随着水深的增加而指数下降。在清澈的海水中，水深 2 5 m 处，大部分红光被吸收，依次是橙光、黄光和绿光。在清澈的大洋区，光线 投射的深度才2 0 0 m 。 温度，海水温度随着纬度、深度、季节的变化而变化。水温对海洋生物是个 极为重要的生态因子，通过自然选择保留至今的每一种海洋生物对水温的适应都 有特定的范围。 盐度，海水比陆地水含有更多的盐，盐度对海洋生物的作用主要在于影响渗 透压。 海水运动的综合效应，海流、潮汐对海洋环境有很大的影响，对环境因素造 成的变化是综合性的，既能影响海洋生物的生态环境，也能影响某一海域海洋生 物的种群丰度和群落结构。 大洋沉积物是由生物组分( 钙质和硅质) 及非生物组分( 陆源、自生、火山、 及宇宙尘埃) 组成。在潮间带、浅海及深海海底的大洋沉积物及其附近生活着一 个生态群体，海洋底栖生物。它是海洋生物中种类最多的一个生态类群，包括了 大多数海洋动物门类、大型海藻和海洋种子植物。其中海洋小型的底栖生物种类 繁多，数量巨大，是海洋底层食物网的重要环节，成为海洋环境影响评价的一个 最重要的指示类群。 第一章综述 图1 - 1 海洋底层食物网 深海沉积物中发现生物圈是一个重大的发现，对其研究已成为全球科学家关 注的一个新热点“1 。1 9 7 7 年，美国深潜器“阿尔文”号在加拉帕戈斯群岛附近 2 5 0 0 米深处中央海底热液口环境中发现大量的能氧化硫的细菌，其生物量每m l 可达1 6 6 个，并在海底形成厚厚的丝状细菌垫( 可达3 c m 厚) ，俗称“黑烟囱“1 。 这些细菌与一些蠕虫和双壳类动物一起共生，构成了海底特殊的生物群落。海底 除了热液生态群外，也存在生活在低温冷泉口特殊海洋环境中的细菌群。如在墨 西哥湾3 2 7 0 m 处海底，发现大量密集成层的白色细菌覆盖在底面上。研究发现， 这些生物并不依赖光合作用，它们生存完全依靠化学自养菌的初级生产力。在黑 烟囱喷出的热液硫化物中含有大量硫化氢，这些细菌就是以硫化氢为能量，从二 氧化碳中合成有机化合物。 除生活在热液口和冷泉口附近的特异微生物群落外，在广袤的深海海底还生 活着其它不同类型的生物群落。由于这些深海生物面临三个极端环境：低温( 或 高温) 、高压和无光照、低营养水平，还具有嗜冷( 或嗜热) 、耐压( 或嗜压) 、抗 毒等一系列特点，更加增强了国际学术界对深海生物分子生物学和基因工程学 研究的兴趣。 小型底栖生物，是指能通过2 5 0 9 m 孔径的网筛而被3 2 9 m 孔径的网筛所阻 留的底栖生物，在海洋环境中表现出种类繁多，数量大，生命周期短，生产量高 等特点。在深海底栖生物中，小型底栖生物的生物量约占全部底栖生物总量的 8 0 ，是深海底层食物网的重要环节，成为深海环境影响评价的一个最重要的指 示类群，因此，对其进行研究对深海生态学研究和深海采矿环境影响评价有十分 第一章综述 重要的意义。同时因为深海小型底栖生物也生活在三个极端环境，因此其对基因 研究、生命科学研究也有极其重要的研究意义。”。” 图1 - 2 小型底栖生物放大图图1 - 3 小型底牺生物分类图 而从沉积物样品中分离小型底栖生物是对小型底栖生物定量研究过程中一 个很关键的基本步骤，其分离精度直接影响到调查资料的可靠性和准确性，从而 影响到研究的结果。由于小型底栖生物的大小、比重等物理特性与沉积物颗粒接 近，如何高精度地分离样品成为一个难题，从上个世纪初人们就开始了小型底栖 生物的研究，同时也在不断探索分离小型底栖生物的方法。 在大洋环境研究工作中，利用多管采样器采取深海未受扰动的深海沉积物样 品取得了成功“，为进一步保证后续研究中资料的准确性和研究结果的可靠性， 研制一套自动化分离系统，高效率、高精度地从沉积物样品中分离出小型底栖生 物是十分必要的。 1 2 国内外研究现状 海洋小型底栖生物的研究工作在国内开展不多，大部分研究集中在潮间带和 浅海，在深海的研究尤其鲜见报导。从已发表的文章来看，分离沉积物样品大多 采用离心的方法或人工挑选的方法。在国外，目前对于细质和淤泥沉积物大多也 是采用这两种方法。在沉积物样品分离系统方面，国外从上世纪7 0 年代就开始 了探索研究，j u a r i o ( 1 9 7 4 ) 。”将浮游生物分选器进行了改进，当时能从沉积物中 自动分离一些比重较轻的生物体和片断：o l s s o n ( 1 9 7 5 ) 。”运用了一种“微量分选 器”能分离更重一些的小型生物；e l m g r e nn 9 7 3 ) “”专门为小型底栖生物的分离 设计了一种分选器，称为“a s k 6 分选器”。这种分选器的工作原理是将样品和水 混和后剧烈振荡，根据生物与沉积物沉降的速率不同来分选标本。j e n s e n ( 1 9 8 2 ) “ 通过改进，设计了工作效率和精度更高的“j e n s e n 分选器”，但受其工作原理的 局限性，没有被推广使用。据了解，目前有些国家己开始利用光学识别生物体的 方法来设计小型底栖生物的分离系统，但是还没有该类型仪器设备的正式报导。 目前，分离小型底栖生物的方法可以分为以下几类： 第一章综述 1 人工挑选，即将沉积物样品进行生物染 色、稀释后放在解剖镜下用细针将小型底栖生物 挑出来。这种方法分选准确性相对较高，适合于 各种类型的沉积物样品。但这是一项极为耗时的 工作，根据实践，分离一根直径9 0 r a m 的芯状样 品需要1 人花费两周左右的时间。为保证分离生 物样品的精度，世界上很多实验室还是采用这种 原始的方法。 图1 - 4 小型底栖人工挑选图2 离心的方法“。”1 ，即将样品加入某种介质中 ( 目前大多使用l u d o x 硅胶) ，经一定转速离心一段时间后，过滤上层清液。这 种方法普遍用于浅海和潮问带的沉积物样品，并取得比较好的效果。但是对于深 海的样品，由于沉积物颗粒的比重与小型底栖生物很接近，使用该方法造成的标 本的损失率就很大了。而且，对于不同沉积物类型的样品，介质的比重，离心的 转速和时间要经过调整才能达到最好的结果。 80i 。 - - - 一1 0 0 - - - 一 图1 - 5 s k 6 分选器图卜6d e n s e n 分选器 3 使用自动分离器进行样品的挑选。长期以来，人们设计和改进了多种分离 沉积物样品中小型底栖生物的自动分离系统，如对“f o l s o m 浮游生物分选器” 的改进，“a s k 6 分选器”、“j e n s e n 分选器”等。这些系统的基本原理都基于生物 和沉积物比重的差异，仅对粗糙类型的沉积物有较好的作用，而对质粒细、粘性 又大的深海沉积物样品，很难达到理想的效果。 总之，目前采用的方法不是效率太低，就是精度不能达到要求。随着海洋研 究的深入研究，研制一套实用的自动分离系统已是追在眉睫了。 m 0 + 第一章综述 1 3 分离技术 图卜7 密度及沉降系数 分离技术是一大类技术的总称，方法总类繁多。这里就分离生物类作一简单 介绍。 离心分离细胞组分和生物分子是最常用得分离方法因为不同的细胞器和分 子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。常用的两类离心分 离方法是速度离心( v e l o c i t yc e n t r i f u g a t i o n ) 和等密度离心( i s o d e n s i t y c e n t r i f u g a t i o n ) 。 速度离心法原理，差速离心是利用不 同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同 一离心条件下，沉降速度不同，通过不断 增加相对离心力，使一个非均匀混合液内 的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 移动区带离心( 图1 8 ) ，是在离心前 于离心管内先装入密度梯度介质( 如蔗糖、 甘油、k b r 、c s c i 等) ，待分离的样品铺在 梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中问， 同梯度液一起离心。这种方法是根据分离 的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有图卜8 移动区带离心法 不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的 目的。离心适当时间，不能离心太久，太久了两种颗粒都会沉淀到底部，然后收 集不同区带的样品进行分析。 等密度离心法( 图1 - 9 ) ，是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯 度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯 第一章综述 度液先混和，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的 密度梯度，与此同时原来分布均匀的 粒子也发生重新分布。此法一般应用 于物质的大小相近，而密度差异较大 时。常用的梯度液是c s c l 。 磁分离原理( 外场强化分离技 术) ，一切宏观的物体某种程度上都有 磁性，水中颗粒状物质在磁场里要受图卜9 等密度离心分离 磁力、重力、惯性力、粘滞力以及颗粒问相互作用力 的作用。磁分离技术就是有效地利用磁力，克服与 其抗衡的重力、惯性力、粘滞力( 磁过滤、磁盘) 或 利用磁力和重力，使颗粒凝聚后沉降分离( 磁凝聚) 。 这实际上是外场强化分离技术的一种。 旋流分离技术( 图1 - 1 0 ) ，是一种高效节能分离 技术，也是利用离心原理。包括旋流分离器、流程系 统、泵送系统和检测控制系统。它的关键部分是旋流 分离器，简称旋流器。混合物从切向进口以一定的压 力或速度注入旋流分离器，从而在旋流分离器内高速 旋转，产生离心力场。在离心力的作用下，密度大的 相被甩向四周，并顺着壁面向下运动，作为底流排出； 密度小的相迁移到中间并向上运动，最后作为溢流排图卜1 0 旋流分离 出，从而达到分离的目的。 膜分离技术是指以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力( 如 压差、浓度差、电位差等) 时，原料侧组分可选择透过膜，从而达到分离提纯的 过程。膜分离过程作为一种新型的分离方法，与传统的分离过程如精馏、萃取、 重结晶、吸附等相比，具有能耗低、单级分离效率高、设备简单、无污染等优点。 因此，自五十年代以来，膜分离技术己迅速发展成为新的单元操作，其应用也从 早期的脱盐发展到化工、食品、医药、生物、电子等工业，并将对2 1 世纪的工 业技术改造产生深远的影响。 此外常用的分离技术还有萃取分离，主要原理是根据被分离物在不同介质中 溶解度具有很大的差别来分离的；纳米分离技术和泡沫分离技术等是利用纳米材 料和泡沫材料的吸附特性来分离的；流式细胞仪，在医学上具有广泛应用，是对 细胞及细胞级别上生物进行分类分离或研究的一种先进仪器，本文将在下一章中 详细介绍。 第一章综述 1 4 研究任务 综合利用生物、光学、电子、机械、两相流等技术，开发一套小型底栖生物 标本自动分离技术，实现从沉积物样品中自动分离小型底栖生物标本，以大幅度 提高室内小型底栖生物分样的工作效率和精度。 研究任务是： 1 ) 沉积物和小型底栖生物标本的混和、均匀流动技术的研究 研制小型底栖生物样品分离的流道技术，设计一套流道系统保证底栖生物样 品的均匀混和、稀释，并保证生物样品分散的以不高于额定速度，又尽量快的流 经检测装置。流道设计以高效、流畅，不堵塞、不沉积、不破坏为原则。 2 ) 分离标本采集技术的研制 研制小型底栖生物样品标本的分离采集技术，设计高速定位的机电控制系 统，实现对小型底栖生物实时、有效的接收定位控制。分离沉积物样品中 3 2 岫 的小型底栖生物：分离响应频率达到5 h z 以上。 3 ) 光机电液系统的集成技术 光机电液集成技术，在保证各部分功能的前提下尽量美观实用，采用模块化 设计方法将系统按功能划分成模块，通观全局考虑各部分的相互配合和联接。建 立各部分之间的约束关系，使得最后整机统计指标的分离精度达9 5 以上。 1 5 研究意义 由于光学、电子等技术的蓬勃发展，为沉积物样品分离器设计方面提供了一 条新的途径。利用光学技术对生物体进行识别，并通过电子控制样品收集可以大 大提高分离样品的效率和精度。研制该分离技术就具有重要的意义： 1 大幅提高小型底栖生物样品的分离精度，减少人为因素造成的误差，保 证资料的准确性和可靠性； 2 大幅提高工作效率，将科研工作者从繁重的样品分选工作中解脱出来， 将更多的时间投入到进一步的研究工作中去； 3 大幅提高分离样品的数量，使深海生物学研究和深海采矿影响评价等工 作做得更细致，结果更准确； 4 该技术可以进行改进和升级，融入电子计算机等技术，可开发出能达到 对小型底栖生物进行分大类，并完成统计、测量等目的的系统； 5 其核心技术还可适用于浮游生物，质粒分析等其它领域研究的仪器设备； 6 该技术的研制成功，将对深海生物学的研究和深海环境评价有一定的推 动作用。 第二章小型底柄生物自动分离技术 2 1 引言 第二章小型底栖生物自动分离技术 由于机械、电子、光学、生物、流体等技术的蓬勃发展，为沉积物样品分离 器设计方面提供了新的途径。利用机械、两相流等技术设计优化流道，使生物体 单个流经检测装置；通过荧光染色技术对生物体进行识别；并设计电子控制接收 装置来收集样品，可以大大提高分离样品的效率。综合利用生物、光学、电子、 机械、流体等技术，提出了应用于小型底栖生物分离的自动分离技术，研制一套 面向小型底栖生物的自动分离装置。 2 2 流式细胞仪简介 流式细胞仪。8 ，8 删是一种非常先进的检测仪器，是一种集电子技术、计算机 技术、激光技术、流体理论于一体，被誉为实验室的“c t ”。它主要用途是在医 学领域，是在细胞级别上单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手 段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。可以说 是当代最先进的细胞定量分析技术。 图2 - 1 流式细胞仪 流式细胞仪工作原理：首先将待测细胞荧光染色后制成单细胞悬液；然后用 第二章小型底栖生物自动分离技术 一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷 出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高 速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检 测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射 在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这 两种信号同时被前向光电二极管和9 0 。方向的光电倍增管接收。光散射信号在前 向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方 向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同 波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核 内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过a d 转换器，将 连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号 进行计算处理，将分析结果显示或存储起来。细胞的分选是通过分离含有单细胞 的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷 出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充 以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下 偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现 细胞的分离。 由以上介绍可知，流式细胞仪具有强大的功能，其中功能之一可以将细胞分 类分离。这一功能是在细胞级别上，比小型底栖生物还小，所以流式细胞仪完全 可以胜任分离小型底栖生物。由于流式细胞仪造价太高，发备使用维护成本昂贵， 不是很适合用来分离小型底栖生物，但其某些成熟技术还是可以为底栖生物自动 分离技术提供参考的。 2 3 总体设计 图2 - 2 底栖生物分离装置结构示意图 第二章小型底栖生物自动分离技术 总体设计是对整体框架进行设计，对系统按功能进行分块并统筹考虑，选定 系统的主要材料及元器件，并对系统的性能、可靠性、成本等综合指标进行评估， 反过来为各功能模块的设计提供综合要求和依据。 整个底栖生物分离装置按功能进行模块化设计，将整个分离装置按功能模块 分成三个主要模块：液路子系统，主要解决样品的混和，及均匀分散地流过检测 装置；生物光电识别控制子系统，完成生物体的识别，将光学信号转换成电子信 号；机电控制子系统，设计一套机电定位的闭环控制系统，对分离筛网进行定位 控制，来分离出小型底栖生物标本。 2 4 部件设计方案 ( 1 ) 液路子系统及结构设计： 液路子系统所要解决的技术关键是含沉积物颗粒及底栖生物标本的混合流 体要能以额定的速度均匀的流过检测和分离装置，同时要防止生物标本粘着和外 溢。液路系统的结构也决定了装置本身的结构。 1 固定夹2 弹性垫3 电机4 加气加液管 5 偏心轮6 盖板7 盛样器8 漏斗9 毛细管1 0 换接头1 1 支架 图2 - 3 液路子系统结构简图 液路子系统初方案包括颤振和稀释装置。含_ 沉积物颗粒及底栖生物标本的混 合流体要以额定的速度均匀的流过检测和分离装置，速度不能太大也不能太小， 太大了光电检测和机电分离系统反应速度跟不上，就影响分离精度；速度太小了， 流速就低，从而分离效率就低，此即所谓的速度匹配问题。为了防止生物标本粘 着和外溢：一方面设计高频响的颤振器，采用2 4 v 高转速直流电动机加偏心轮 第二章小型底栖生物自动分离技术 实现；另一方面，流道设计采用高光洁度的材料制作并以流线型设计，既要能保 证混合流体的额定速度又要尽可能减少粘着和外溢。液路部分设计将直接影响系 统的总体性能。 ( 2 ) 生物光电检测子系统设计方案： 生物光电检测予系统功能是通过光学原理对荧光染色后的生物体进行识别， 并将识别到的光学信号转化为电信号，放大输出给机电控制采集子系统。生物光 电识别模块设计好坏将直接影响到分离装置的分离精度。其关键是要寻找一种特 定的蛋白质荧光染色剂，该染色剂不仅能区分生物体和沉积物，使生物标本染色 而沉积物保持原样，同时又能受一定波长的紫外光激发产生荧光”“。 荧光光源、光电二极管以及被测混合流体的光路原理如图2 4 。用与蛋白质 荧光染色剂匹配波长的紫外光连续照射检测管，紫外光源经透镜1 和透镜2 ，聚成 一束平行光。当流经透明检测管的混合流体中存在被染色后的小型底栖生物标本 时，底栖生物标本上荧光染色剂在紫外光的激发下将产生可见光波段的荧光。经 过光学透镜系统聚焦，并用滤光片滤去非荧光波长的杂散光和紫外激发光，荧光 将在p n 型光电二极管上感应出相应的电流信号。 击井离收羹装置 图2 - 4 光学通路结构示意图 通过试验和计算获得3 2 1 a m 生物体产生的荧光感应p n 型光电二极管上光通 量的最小值。测定p n 型光电二极管上的微弱光通量变化，从而判断当前流体中 是否存在有效的底栖生物标本。为了防止扁平形状的小型底栖生物标本产生的荧 光在一个方向上投射面小而被漏判的情况发生，设计采用两套垂直正交排列的荧 光感应装置。 第二章小型底栖生物自动分离技术 ( 3 ) 机电分离予系统设计方案： 机电分离子系统完成的主要功能是根据荧光测量系统所判别的底栖生物标 本存在情况，通过高频率响应机电定位装置，有选择地推动接盘运动，完成底栖 生物标本与悬浮颗粒的分离。 从光电检测通路 出来的混合液体 图2 5 机电分离采集设计示意图 机电分离子系统的设计难点是高频率响应机电定位装置。机电分离子系统的 响应速度是制约整个装置效率的瓶颈，经流道下来的生物的最大速度设定为 l m s ，如果机电分离采集部分占用太长时间的话，势必要加大检测部位到网筛距 离，一方面占用空间太大，影响分离效率，另一方面大距离又可能使水流发飘而 使分离采集系统的准确快速定位变得困难。机电分离部分设计好坏对整个装置的 研制成败起决定作用。 1 比例电磁铁2 弹簧3 网筛4 导轨5 底座 图2 - 6 机械部分结构图 位移控制装置采用例电磁铁，其输出量与位移成比例，再通过位移传感器构 成位置电反馈闭环。流道检测部位的毛细管内径为l m m ，要分离水中生物理论 上电磁铁至少也要l m m 的行程，但由于托盘隔板的物理厚度以及装置有高频、 微幅振动，所以行程要大于1 m m 。而要提高响应速度，工作行程要尽量短。由 于系统需要较高的频响，所以采用电磁铁与网筛直接接触式，比例电磁铁一直工 作在有效行程段。网筛采用两边加弹簧的白定位方式，比单边弹簧具有较好的稳 第二章小型底栖生物自动分离技术 定性，合理选择阻尼系数，系统应无明显振荡。 电控部分由单片机完成数据采集、数据缓冲、硬件控制等实时l 生要求较高的 工作，p c 工控机完成系统协调、数据分析和处理等工作。装置采用以通用型p c 工控机为主控计算机，单片机为从机的主从结构的上下位微机控制系统。通讯协 议总线采用r s 4 8 5 总线作为物理层协议。r s 4 8 5 通讯协议具有可靠性高、速度 快、距离远等优点，并且可以在通用型p c 机和笔记本计算机上以较低成本实现。 协调控制模式发挥了通用型计算机及单片机各自的优点，同时提高了系统可靠 性，加快了检测和采样的速度。 2 5 生物光电识别 图2 - 7 电控框图 对两相流中固体颗粒的识别有很多种方法。这些方法主要借鉴于流动显示技 术，流动显示技术。“主要目的是用来显示流场和测量流场参数，这样往往其很多 方法就通过识别其中的粒子或某些特性，再经过运算，间接得到流场参数；固体 颗粒识别技术，要得到的就是粒子的性质。 例如，粒子图像测速( p a r t i c l ei m a g ev e l o c i m e t r y ，简称p i v ) 技术，可以用 来识别固体粒子，用c c d 摄像头不断采集图片然后进行图像识别处理，可以获 得需要的信息。 激光诱导荧光技术，根据在激光照射下荧光的特性，通过探测荧光信号来分 析判断固体粒子的信息。 本设计方案采用的是用激光来诱导蛋白质荧光染色剂，其原理如上节所述。 而具体这一面向小型底栖生物样品的生物识别技术由浙江大学生命科学学院叶 树明等研究开发，基于这一生物识别技术，本自动分离技术提供相配套的硬件安 装，以符合模块化，光、机、电一体化的原则，研制开发了小型底栖生物自动分 离技术的生物光电检测子系统( 如图2 - 8 ) 。 第二章小型底栖生物自动分离技术 2 6 本章小结 图2 - 8 生物光电检测子系统 本章具体分析了小型底栖生物自动分离装置实旌方案。采用“总体设计 部件设计及试验总装联调”的研究开发方法。并将整个装置( 系统) 按功能 划分成三个模块，相应的小型底栖生物自动分离技术也就有四块主要技术组成： 生物标本稀释的流道优化技术、底栖生物标本的识别检测技术、机电分离采集技 术及整机集成技术。 第三章流道优化设计研究 3 1 引言 第三章流道优化设计研究 本分离技术综合利用生物、光学、电子、机械等技术，开发一套小型底栖生 物标本自动分离装置，实现从沉积物样品中自动分离小型底栖生物标本，以大幅 度提高室内小型底栖生物分样的工作效率和精度。其中液路部分的设计对整个系 统起着关键的作用，也是个技术难点，主要集中在解决速度匹配和流道堵塞两个 方面。 3 2 固液两相流 在流体力学中，固液两相流是指由动力学性质不同的固体和液体组成的物质 流动。从运动物质的连续性看，流相被看作连续介质；固相视其稀稠，稀疏的看 作离散介质，稠密的视为连续介质。本文中将沉积物样品稀释在水中，实际就是 稀疏固液两相流。 固液两相流大致有以下几个主要特点”： 1 ) 物性复杂，固液两相流的物性随固相的容积比、比重比、温度等因 素的变化而变化： 2 ) 流型复杂多变，层流和湍流交相变化，情况相当复杂； 3 ) 相间相互作用强，流相和固相之间存在相互作用，而固相的固体颗 粒之间也存在相互碰撞等作用： 4 ) 能耗变化因素多，依赖因素多： 5 ) 边界条件复杂，固相界面还会出现各种现象； 6 ) 描述和求解比较困难，描述各相的守恒方程、辅助公式和定解条件 数量多，形式复杂，方程组的非线性程度和耦合程度大，求解相当困难。 固液两相流根据不同情况不同问题特征，将固体相和流体相看作单一混合物 的连续介质、两种不同的连续介质、离散和连续两种不同的介质。也是基于这些 区别，提出了三种不同的方程：单流体模型、双流体模型、欧拉一拉格朗日模型。 单流体模型，也称为“无滑移模型”，是s p a l d i n g 在2 0 世纪7 0 年代提出的。 这个模型是在三个假设前提下的： 所有固体速度与周围流体速度相同； 固粒相的湍流扩散系数与流体相的湍流扩散系数相同并且都等于混合物 的湍流扩散系数； 第三章流道优化设计研究 固液两相i 司的相互作用看作类似于流体混合物中各组分的相互作用，不 考虑流体与固体颗粒之间的阻力。 单流体模型的基本方程为： 连续性方程： 詈+ v ( p o g ) _ 0 ( 3 - 1 ) 动量方程： 成融两卜+ v c 劢 z ， 其中：否是重力加速度： f 是流体的应力张量； 以是混合物密度； 万是流体的速度： 双流体模型，固粒和流体的速度均考虑为由当地的平均量和随机分量组成， 固液两相组成的速度场依赖于一系列的相互作用，双流体模型的连续方程和动量 方程为： 固粒相： 等丹( 矿一) = o 协，) 融碱卜丽叫厕 。， 流体相： 等+ v ( p 7 动= 。 s ) p 愕卿，巧卜- 一+ w ”啪霸 s ， 其中：= 岛固粒相的局部密度； p = 丹( 1 一d ，) 流体相的局部密度； 万是单位体积间的相互作用力： 1 6 第三章流道优化设计研究 巧是固粒相的应力张量； 艿是流体相应力张量； 欧拉一拉格朗日模型，采用“计算粒子”的概念，把固粒群分成k p 组，每 组称为一个计算粒子，它包含了m 个具有相同速度和位置的固粒。 固粒相的连续方程为： 鲁+ v ( n , , k u p k ) _ o ( 3 - 7 ) 计算粒子的动量方程为： 等= 妻瓦+ 吾 俘s ， 其中：胛。表示单位体积内k 类粒子的数量； 一u p k 为k 类计算粒子的速度矢量： 巧包括固粒所受的粘性阻力、压力梯度力、附加质量力、b a s s e t 力、 m a g n u s 力、s a f f m a n 力等各种力； 为了能更清楚的了解两相流中固体粒子的运动情况，有必要对固粒进行受力 分析，主要受以下几种力的作用： 1 粘性阻力 圪= 去c d 乃“二丌r 2 ( 3 - 9 ) 其中c d 是阻力系数，对于这个阻力系数具有很多种一定范围内实用的公式， 详细情况请参阅相关文献，这里仅对g a n s e r 的阻力系数作简单介绍。g a n s e r 阻 力系数是对圆球和非圆球固粒的一般表达式，对h a i d e r 和t h o m p s o n 等的结果进 行修正后得到的。 乏=丽241+01118(呲，92)06567rek + ? 坠3 3 0 5 ( 3 _ 1 0 ) 疋，eo 、1 j ， r e k k 2 其中，蜀、局是两个形状因子； r e 是固粒雷诺数： 第三章流道优化设计研究 2 压力梯度力 固粒在有压力梯度的流场中运动时，其表面除了存在流体绕流9 1 起的不均匀 分布压力外，还存在一个由流场压力梯度9 1 起的附加非均匀分布压力。其矢量形 式： 耳= 一 捌啊 ( 3 - 1 1 ) 3 附加质量力 当粒子作加速运动时，不仅固粒速度越来越大，而且周围的流体速度也越来 越大。为此，推动固粒运动的力不仅要用来抵消使其产生加速度的力，而且还要 抵消使周围流体的动量发生变化的那部分力。其表达式为： p 挣3 乃悟一誓 江蚴 其中，z 固粒的瞬时速度； ，流体的瞬时速度； 4 b a s s e t 加速度力 由于流谱偏离定常状态而引起的对固粒的作用，b a s s e t 力方程为： 删厩簪r 协脚 其中，是粘性系数； 5 m a g n u s 力 若流场中存在速度梯度，则该速度梯度将引起固粒旋转，速度梯度使得网格 两侧存在压力差，这个压力差会使固粒向压力向的一侧移动，产生这种移动的力 称为m a g n u s 力： 瓦= z r 3 p l c o ( 一u s u p ) 1 1 + o ( r e ，) ( 3 - 1 4 ) r e ，= 2 r i s 一咋j v ( 3 - 1 5 ) 其中，石是固粒的角速度： r e 。是固粒雷诺数； l ，是运动粘性系数，i ，= , u p ； 第三章流道优化设计研究 6 s a t t m a n 力 当固粒处于一个有速度梯度的流场中时，即使它没有旋转，也会受到一个横 向升力，将固粒推向低速区域，此即s a f f m a n 力： 1 1 只= 8 1 2 r 2f p s i ) jkj(3-16) 其中，k 是速度梯度的模； 固粒相方程由关于固粒分布函数痧( ，“p ，p p ，f ) 的l i o u v i l l e 方程控制 詈以( 厩) + v 石( 何) = 0 ( 3 - 1 7 ) 石= i d l g p = q ( 万 古v 巧+ 万1v p ( v 石+ v 7 ) ， + ，一考卜+ 瓦c ，邶， 其中，i 是固粒所在位置； 匕是固粒体积； 石是固粒加速度； v 巧是固粒所在位置的压力梯度； v 竹