（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥g蛋白信号转导调节蛋白atrgs1n末端、c末端结构域在葡萄糖和aba介导的信号转导途径中的作用.pdf

拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t _ r g s l ) n 末端、c 末端结构域在葡萄糖和a b a 介导的信号转导途径中的作用l 拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t r g s l ) n 一末端、c 末 端结构域在葡萄糖和a b a 介导的信号转导途径中的作用 研究生：董婷 导师：梁建生教授 摘要 本研究以拟南芥野生型c o l o 、突变体r g s l - 2 、过表达3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s j ，c 为材 料，通过突变体分析、转基因植株构建等技术，用分子生物学、生物化学等方法研究了 a t r g s l 蛋白n 一末端、c 一末端结构域在拟南芥葡萄糖和a b a 信号转导途径中的作用。取得 了以下主要研究结果： 1 、采用t o p o 克隆的方法构建了3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s l 一c 过表达转基因植株。 克隆了a t r g s l 基因n 一末端、c 一末端e d n a ，通过t o p o 克隆构建了c a m v3 5 s 为启 动子，g f p 为报告基因，含有融合基因3 5 s ：r g s l - n - g f p 、3 5 s ：r g s l c - g f p 的植物表达载 体。利用根癌农杆菌浸染转化法将3 5 s ：r g s l - n - g f p 、3 5 s ：r g s l 一c - g f p 融合基因导入突变 体r g s l - 2 植株，经过抗生素筛选、根部荧光观察和觎p 基因p c r 鉴定，获得了转化成功 的阳性植株。 2 、运用突变体分析技术研究a t r g s l 蛋白n 末端、c 一末端结构域在拟南芥葡萄糖和 a b a 信号转导途径中的作用及其调节机理。结果表明： ( 1 ) r g s l - 2 种子萌发对葡萄糖的抑制作用不敏感，而3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s l c 种子 表现为超敏感，其中3 5 s ：r g s l - n 种子最敏感。四基因型种子萌发对甘露糖的抑制作用未表 现出差异。表明这种抑制作用与糖的渗透胁迫无关，而是由葡萄糖介导的信号转导途径引 起的。己糖激酶抑制剂n a g 处理削弱了甘露糖对种子萌发的抑制效应，而对葡萄糖抑制萌 发没有影响，表明葡萄糖抑制种子萌发不依赖于已糖激酶途径。 ( 2 ) r g s l - 2 种子萌发对a b a 低敏，而3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s l ，c 种子表现为超敏感， 其中3 5 s ：r g s l - n 种子最敏感。表明过表达a t r g s i - n , a t r g s l c 能互补r g s l 2 的a b a 不 敏感性表型，增加了种子对a b a 的敏感性。 ( 3 ) 葡萄糖与a b a 共处理结果显示葡萄糖与a b a 对种子萌发的抑制作用存在叠加 效应。f l u r i d o n e 与葡萄糖共处理结果显示f l u r i d o n e 能降低葡萄糖抑制种子萌发的效应。表 明葡萄糖是通过增加内源a b a 含量来抑制萌发的。 ( 4 ) r g s l ，2 幼苗主根显著长于c o i ，而3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s l 一c 主根显著短于c o l 、 扬州大学硕士论文 r g s l - 2 。r g s l - 2 、3 5 s ：r g s l - n 和3 5 s ：r g s l 一c 主根生长对葡萄糖和a b a 的应答表现出相同 趋势，即r g s l 2 敏感性最低，其次是3 5 s ：r g s l ，c ，3 5 s ：r g s l - n 敏感性最高。表明a t r g s i 基因突变和过表达改变了代谢糖和a b a 调节作用的敏感性。 ( 5 ) 植株水平，r g s i 2 离体叶片失水速率显著快于c o l ，而3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s i c 显著低于c o i 。表明过表达a t r g s l - n 、a t r g s l c 能降低植株叶片失水速率，增强耐旱性。 ( 6 ) 干旱胁迫条件下，r g s l ，2 水势显著低于c o l ，而3 5 s ：r g s l - _ i v , 3 5 s ：r g s l c 水势 显著高于c o l 、r g s l - 2 。表明r g s l - 2 保水能力较弱，而3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s l 。c 具有较强 的保水能力，在干旱胁迫下能够保持较高的叶片水势。相应地，c o l 、r g s l - 2 叶片a b a 含 量较低，而转基因株系3 5 s ：r g s l - n , 3 5 s ：r g s j c 叶片a b a 含量显著高于c o l 、r g s l 。2 。表 明过表达a t p , g s ln 一末端、c 末端结构域增强了拟南芥应对干旱胁迫的能力。 关键词：拟南芥，a t r g s l 蛋白，结构域，突变体，脱落酸，糖，转基因植株 拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t r g s l ) n 末端、c 末端结构域在葡萄糖和a b a 介导的信号转导途径中的作用3 f u n c t i o n a la n a l y s e so fn - - t e r m i n a ld o m a i na n dc - t e r m i n a l d o m a i no fr e g u l a t o ro fg p r o t e i ns i g n a l i n g ( r g s ) p r o t e i n i ng l u c o s ea n da b a s i g n a l i n gi na r a b i d o p s i st h a h a n a p o s t g r a d u a t e ：t i n gd o n g s u p e r v i s o r ：p r o f j i a n s h e n gl i a n g a b s t r a c t t h er e g u l a t o ro fg p r o t e i ns i g n a l i n g ( r g s ) p r o t e i n s ，r e c e n t l yi d e n t i f i e di na r a b i d o p s i st h a l i a n a ( n a m e da sa t r g s1 ) ，h a sap r e d i c t e ds e v e n - t r a n s m e m b r a n es t r u c t u r ea sw e l la sa l lr g sb o xw i t h g t p a s e a c c e l e r a t i n ga c t i v i t y s p e c i f i cs t r u c t u r ed e t e r m i n e si t sc o m p l e xf u n c t i o n s t h er o l e so f t w o d o m a i n so fa t r g s1p r o t e i n si nd g l u c o s ea n da b a s i g n a l i n gi na r a b i d o p s i sw e r ei n v e s t i g a t e d i nt h ep r e s e n ts t u d y , u s i n gs e e d st h a tc a r r i e san u l lm u t a t i o ni nt h ea t r g s lg e n ea n d o v e r e x p r e s s t h eg e n e se n c o d i n gt w od o m a i n so fa t r g s l ，n a m e dr g s i 一2 ，3 5 s ：r g s i - na n d3 5 s ：r g s l 一c ， r e s p e c t i v e l y , w i t hd i f f e r e n ta p p r o a c h e ss u c ha sb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h e35 s ：r g s lo v e r e x p r e s s i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e db yt o p oc l o n i n g n - t e r m i n a la n d c t e r m i n a lc d n ao fa t r g s lw a sf i r s tc l o n e di n t ot o p ov e c t o rr e s p e c t i v e l y , t h e ns u b c l o n e d i n t ob i n a r yv e c t o rt h a t c a r r y i n gc a m v3 5 sp r o m o t e ra n dg f pr e p o r t e r f u s i o ng e n e s 3 5 s ：r g s l - n - g f pa n d3 5 s ：r g s i c - g f pw e r ei n t r o d u c e di n t o r g s l - 2 p l a n tb y a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n t r a n s 一3 5 s ：r g s i - na n dt r a n s - 3 5 s ：r g s l 一cp l a n t sw e r e s c r e e n e db yr e s i s t a n c es e l e c t i o n , o b s e r v a t i o no fr o o tf l u o r e s c e n c ea n di d e n t i f i c a t i o no fg f p t h e a c q u i r e dt r a n s g e n i cp l a n t sw e r eu s e da sm a t e r i a l sf o rp h y s i o l o g i c a la n a l y s i s t h er o l e so ft w od o m a i n so fa t r g s1i nd g l u c o s ea n da b a s i g n a l i n gw e r ea n a l y z e db y c o m p a r i n gt h ed i f f e r e n tr e s p o n s e so ff o u rg e n e t y p e st od g l u c o s ea n da b a i ns e e dg e r m i n a t i o n a n dp r i m a r yr o o tg r o w t h c o m p a r i n gt h e i rr e s p o n s e st og l u c o s e ，m a n n o s ea n das p e c i f i ch x k i n h i b i t o r ，n - a c e t y l g l u c o s a m i n e ( n a g ) ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，i nc o n t r a s tt ow i l dt y p ec o l 一0 ， r g s l 一2s e e dg e r m i n a 廿o nw a si n s e n s i t i v e t o g l u c o s e ，w h i l et h o s e o f3 5 s ：r g s l - na n d 3 5 s ：r g s l 一cw e r eh y p e r s e n s i t i v et og l u c o s e b u t 也e ys h o w e dt h es a m er e s p o n s e st om a n n o s e n a gd i c h a t o b v i o u s l ya f f e c tt h ei n h i b i t o r ye f f e c to fg l u c o s eo ns e e dg e r m i n a t i o n ，b u t 4 扬州大学硕士论文 s i g n i f i c a n t l ya l l e v i a t e dt h ee f f e c to fm a n n o s e t h e s ed a t as u g g e s tt h a tt w od o m a i n so fa t r g s 1 p r o t e i nm o s tl i k e l yf u n c t i o n si na nh x k i n d e p e n d e n tg l u c o s es i g n a l i n gi na r a b i d o p s i ss e e d g e r m i n a t i o n f o u rg e n e t y p e ss h o wt h es a m em n d e n c yo fs e e dg e r m i n a t i o nt oa b a a sg l u c o s e a b aa n dd - g l u c o s eh a da d d i t i v ee f f e c to i ls e e dg e r m i n a t i o no ff o u rg e n e t y p e s w h e n e n d o g e n o u sa b ab i o s y n t h e s i sw a si n h i b i t e db yf l u r i d o n e ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fg l u c o s eo n s e e dg e r m i n a t i o nw e r em a r k e d l ya l l e v i a t e d , i m p l y i n gt h a tg l u c o s ei n h i b i t e ss e e dg e r m i n a t i o n t h r o u g hi n c r e a s i n gc o n t e n to fe n d o g e n o n sa b a r o o tg r o w t ho ff o u rg e n e t y p e ss h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s c o m p a r i n gt oc o la n dr g s l 一2 ， p r i m a r yr o o tg r o w t ho f3 5 s ：r g s l - na n d3 5 s ：r g s l 一ch a dr e m a r k a b l es h o r tr o o t s l o w c o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ea n da b a p r o m o t e dp r i m a r yr o o tg r o w t h ，a n df o u rg e n e t y p e sa l w a y s k e e p 吐l es a m eg r o w t ht e n d e n c y t h e s ed a t as u g g e s tt h a tm u t a t i o no f a t r g s ia n do v e r e x p r e s s i o n o f a t r g s i - na n da t r g s l 一ca l t e rp r i m a r yr o o tg r o w t ho f a r a b i d o p s i ss e e d l i n g sa n d r e s p o n s e st o g l u c o s ea n da b a a s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nd r o u g h tt o l e r a n c ew a so b s e r v e da m o n gf o u rg e n o t y p e si n v e s t i g a t e d t r a n s g e n i cp l a n t s3 5 s ：r g s i - na n d3 5 s ：r g s l 一cs h o w e dt h ek g h e s tt o l e r a n tt os o i l & y i n g a m o n gf o u rg e n o t y p e s w a t e rl o s sa s s a yw i t ht h ed e t a c h e dl e a v e si n d i c a t e dt h a tc o la n dr g s l 一2 l o s tw a t e rm o r er a p i d l yt h a nt h o s eo f 3 5 s ：r g s i - n a n d3 5 s ：r g s l 一c u n d e rs o i ld r y i n gc o n d i t i o n , t h el e a fw a t e rp o t e n t i a lo fa l lf o u rg e n o t y p e sd e c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h e p r o g r e s so fs o i ld r y i n g h o w e v e r , t h el e a f w a t e rp o t e n t i a lo f3 5 s ：r g s i - na n d3 5 s ：r g s l 一cw e r ea l w a y sh i g h e rt h a nt h a t o fc o la n dr g s l 一2 a c c o r d i n g l y , t h el e a fa b ac o n t e n to f3 5 s ：r g s l - na n d3 5 s ：r g s l cw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o la n dr g s l 一2 a c c o r d i n gt ot h ea b o v er e s u l t sa n do t h e rr e p o r t s ，i ti ss u g g e s t e dt h a tb o t hn t e r m i n a la n d c t e r m i n a ld o m a i np l a ya ni m p o r t a n tr o l ei ng l u c o s ea n da b a s i g n a l i n ga n db o t hp r o t e i n sm a y i n v o l v ei nt h es i g n a lt r a n s d u c t i o no fd r o u g h ts t r e s s 拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t r g s i ) n 末端、c 末端结构域在葡萄糖和a b a 介导的信号转导途径中的作用5 缩略语 a b a e l i s a c a 田 p l c c 0 1 一o f l u 中英文对照词 英文全称 a b s c i s i ca c i d e n z y m e l i n k e dk n m u n o s o r b a n ta s s a y a d e n o s i n ec y c l i c3 ，5 - p h o s p h a t e p h o s p h o l i p a s ec c o l u m b i a f l u r i d o n e g a p sg t p a s e a c c e l e r a t i o np r o t e i n s g d p g f p g p a l g p c r g p r o t e i n g t p g p a l - 4 g o g b g 所 n a g r g s r g s l - 2 r g s 7 t m p l a 2 g a 口 g a b r b i f c g u a n o s i n ed i p h o s p h a t en u c l e o t i d e g r e e nf l u r e s c e n c ep r o t e i n 0 ls u b u n i to fg p r o t e i n g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r h e t e r o t r i m e r i cg t pb i n d i n gp r o t e i n s g u a n i n et r i p h o s p h a t en u c l e o t i d e 0 ls u b u n i to fg p r o t e i n ps u b u n i to fgp r o t e i n 所c o m p l e xo fgp r o t e i n n - - a c e t y l - d g l u c o s a m i n e r e g u l a t o ro fgp r o t e i ns i g n a l i n g r e g u l a t o ro fgp r o t e i ns i g n a l i n g 7t r a x t s m e m b r a n e p h o s p h o l i p a s ea 2 g a l p h ai n t e r a c t i n gp r o t e i n g i b b e r e l l i n b r a s s i n o l i d e b i m o l e c u l a rf l u o r e s c e n c ec o m p l e m e n t a t i o n 中文名称 脱落酸 酶联免疫吸附法 腺苷一3 ，5 环化一磷酸 磷脂酶c 拟南芥哥伦比亚野生型 1 甲基3 一苯基一5 ( 3 - 三氟甲 基 - 苯基) 一4 ( 1 氢) 一吡啶 促进g t p 水解酶活性的蛋 白 鸟嘌呤二磷酸核苷 绿色荧光蛋白 g 蛋白仅亚基 g 蛋白偶联受体 g 蛋白 鸟嘌呤三磷酸核苷 g p a l 突变体 g 蛋白a 亚基 g 蛋白d 亚基 g 蛋白p 丫亚基二聚体 n 一乙酰一葡糖胺 g 蛋白信号转导调节蛋白 r g s l 缺失突变体 g 蛋白信号转导调节蛋白 7 次跨膜 磷脂酶a 2 g a 作用蛋白 赤霉素 油菜素内酯 双分子荧光互补 6扬州大学硕士论文 d g l c h x k s n f f r e t m a n x l g s d g l u c o s h e x o k i n a s s u c r o s en o n f e r m e n t i n g f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r m a n _ n o s e e x t r al a r g eg p r o t e i n d 一葡萄糖 己糖激酶 非发酵型蔗糖载体 荧光共振能量转移 甘露糖 超大g 蛋白 扬州大学硕士论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经 标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：苇童霉 工。、j 签字日期：) i p 7 年6 月j 口日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社 会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：董蠢 签字日期：山灼7 年6 月i o e t 导师签名 签字日期：上一7 年占月i o e t 拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t r g s l ) n 一末端、c 末端结构域在葡萄糖和a b a 介导的信号转导途径中的作用7 第一章文献综述弟一早义l 颚综尬 摘要：异三聚体g 蛋白( h e t e r o t r i m e r i cgp r o t e i n s ) ( 以下简称g 蛋白) 介导的信号转导 途径是真核生物中最为保守的信号途径之一。g 蛋白信号转导调节蛋白( r e g u l a t o ro fg p r o t e i ns i g n a l i n gp r o t e i n , r g s ) 是g 蛋白信号转导途径的主要脱敏因子，在g 蛋白信号转 导过程中发挥十分重要的作用。本文主要介绍了目前拟南芥中g 蛋白信号转导途径以及 r g s l 蛋白研究进展，并概述了糖和a b a 信号转导途径以及g 蛋白和r g s l 蛋白在这两种 信号转导途径中的作用。 关键词：g 蛋白，g 蛋白信号转导调节蛋白，葡萄糖，a b a ，分段克隆 在生命过程中，生物细胞几乎每时每刻都靠传递激素或神经递质等化学信使相互通讯 来感受环境信号、适应环境变化。环境信号主要被位于细胞表面的受体所接受，然后通过 跨膜信号转导将胞外信号转变为胞内信使，再进一步传递引起胞内生理生化反应和遗传性 状的表达。负责识别、感知、转导环境信号的转导途径( s i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n p a t h w a y ) 已 成为人们感兴趣的研究对象。真核生物细胞内最重要、最保守的g 蛋白信号转导途径的研 究取得了显著进展，其中对该途径主要脱敏因子r g s l 蛋白的研究最为活跃。 1 动物中g 蛋白介导的信号转导途径 1 1 经典的g 蛋白信号转导模式 g 蛋白是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有g t p 水解酶活性，广泛存在于真核生物中的 一类蛋白。g 蛋白主要有三类：一类是与膜受体偶联的异三聚体g 蛋白( h e t e r o t r i m e r i cg t p b i n d i n gp r o t e i n s ) ；一类是非膜蛋白，称为小g 蛋白( s m a l lg t pb i n d i n gp r o t e i n ) ；还有一类 是通常多细胞g 蛋白的两倍大，称为超大g 蛋白( e x t r al a r g egp r o t e i n ，x l g s ) 。 异三聚体g 蛋白由0 【亚基( m ) 、p 亚基( g 1 3 ) 、丫亚基( 研) 三个亚基组成，在动 物和酵母的信号级联转导中充当着十分重要的角色( s i m o ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。经典的g 蛋白介导 的细胞信号转导模式如图1 1 所示。当位于细胞质膜上的g 蛋白偶联受体( g p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r ，g p c r ) 与其特异性配体( 1 i g a n d ) 结合后构象发生变化，其上0 【亚基结合位点暴 露，受体与g a 在膜上扩散导致两者结合，形成受体g a 复合体。q 亚基构象改变，释放 g d p ，结合g t p 而活化，0 【亚基与所亚基的亲和力降低，异三聚体解离为g a ( o t p ) 和 g p 丫。活化态的g 0 c g t p 和g 所分别与下游各自的效应分子相互作用，并通过一系列信号 传导过程最终引发胞内相关基因的表达和生理生化响应( t e m p l ea n dj o n e s ，2 0 0 7 ) 。当g 0 【 亚基利用自身的g t p 水解酶活性催化g t p 水解为g d p 时，使g a g d p 与效应物解离，并 重新结合g 脚形成异三聚体，g 蛋白又回到基态，从而使信号终止。因此，g 蛋白介导的 扬州大学碗士论文 信号途径的组成成分包括g p c r 、g 蛋白、效应分子( 蛋白) 及其它调节蛋白等 图1 - 1g 蛋白舟导的信号转导经典模式图 f i g1 - 1 s i c a l m o d e l f o r g - p r o t e m - c o u p l e d f i g n a l i n g ( t e m p ka n dj o e s ，2 0 0 7 ，a n u u a l r e v i e w m p i a n t b i o l o g y ) 1 2 动物g 蛋白信号转导途径各组分简介 目前，人们已从哺乳动物和酵母细胞中至少鉴定到约9 5 0 种o p c 轧1 7 个编码g 的 基因，包括2 3 个o a 亚基；5 个o b 基因以及至少1 2 个。丫基因。理论上讲哺乳动物细胞 内有一千多种g 蛋白。 g p c r 是一类非常重要的信号分子受体，属7 次跨膜受体御r e c e p t o r s ) ，能够与0 蛋 白结合从而调节g 蛋白活性。g p c r 主要位于细胞质膜上，肽链n 末端在胞外而c 末端在 胞内，其结构处于非活性构象和活性构象不断变化的高度动态平衡之中。没有配体结合时， 分子内相互作用力使g p c r 处于非活性的静止构象，当受体与配体结合或受体发生突变时。 分子间相互作用力破坏，受体被激活。 根据功能和序列的差异，人们将g d 亚基分为4 个亚家族，即0 、g 啦、g 和g d l 2 几3 每个亚家族作用于特定的效应分子。g 吨亚家族由g 嗨和0 k 组成，偶联激活腺苷酸环化 酶，产生c a m 第二信使，继而激活蝴依赖的蛋白激酶。g 啦亚家族以能抑制腺苷酸 环化酶活性而得名，产生与g 相反的生物学效应。g 啦亚家族的成员同磷脂酶c ( p h o s p h 0 1 i p a s ec ，p l c ) 偶联，在磷脂酰肌醇代谢途径信号传递过程中发挥重要作用。 砸i 枷蛋白能激活小g 蛋白p , h o 和其下游靶分子。 通常，g 蛋白b 和t 亚基通过非共价键的疏水作用组成特定的叶二聚体结构，p 、t 两亚基单独表达时会导致b 亚基不稳定或t 亚基不折叠。随着研究的深入，g 所参与调节 的下游效应器数日与种类正在逐渐增多m h i k a w ad 蛆，1 9 9 6 ；m u l l e r 时缸，1 9 9 6 ；f o r dd 虹，1 9 9 8 ) ，包括p l c ，磷脂酶a 2 ( p h o s 曲o b p b s e a 2 ，p i a 2 ) ，c 矿和贮通道以及c a m p 酶 。鼢蓐专缓 蕊。一 拟南荠g 蛋自信号转导调节蛋白( a t r g s i ) n - 末端、o 末端结构域在葡萄塘和a b a 舟导的信号转导造径中的作用9 的异构体等。 根据在细胞中功能不同，动物小g 蛋自可分为5 个亚家族：r a s 、k h o 、r a d 、a r f 和r a n 。 r a s 家族在酵母和哺乳动物中调节细胞分化过程；r h o 家族调控肌动蛋白重组过程、参与 m a p 激酶的细胞信号转导；p a d 和a f t 家族在膜转运过程中起着重要作用；而r a n 家族在 核孔位置调节着蛋白和r n a 分子的运输过程。 1 3 动物中的g 蛋白信号转导调节蛋白 r g s 蛋白最初是源于酿酒酵母的s s t 2 基因，主要参与了酵母对信息素响应的脱敏作用 ( c h a ua n d o t t e , 1 9 8 2 ) 。1 9 9 6 年，三个研究小组同时在哺乳动物中鉴定到一类新的蛋白质 家族，该蛋白直接与g g y p 结台，并显著促进舶亚基g y p 水解酶活性( g t p a s e a c c e l e r a t i n g p r o t e i n ，g a p ) ，从而加速活化态g a 亚基回到非活化态，终止g 蛋白介导的信号转导，该 蛋白被称为r g s 蛋白( d r u e ye t 出，1 9 9 6 ；k o e l i ea n d h o r v i t z , 1 9 9 6 ；s i d e m v s k ie t a l ，1 9 9 6 ) 。 迄今为止，在哺乳动物中已经鉴定到2 0 多种r g s 蛋白，包括5 个亚家族：r z ，r 4 ，r 7 ， r 1 2 和r a ( e u i o t t e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。每个r g s 蛋自包括r g s 结构域和其它的功能域，如图1 - 2 所示。 e 窖嚣嚣一 oi l - _ o = = _ 图1 2 r g s 蛋白家属 f i g1 - 2 r g s p r o t e i n f a m i l y ( e l l i o t t e t a l ，2 0 0 0 a n n u a l r e v i e w o f b i o c h e m i s t r y ) r g s 蛋白发挥作用的机制主要有以下3 个方面： 首先，r g s 蛋白能发挥g a p 活性促进g 亚基水解g t p 。g r g s 的晶体结构显示 r g s 蛋白能稳定g q 亚基过渡状态的结构，揭示其g a p 活性，同时也解释了r g s 抑制g 蛋白信号的作用，阻及有些信号、肉眼可见的反应爱心脏钾通道比纯化的g 亚基在g 四 1 0 扬州大学硕士论文 酶作用下的预期水解速度快的原因。体外酶转化( s i n g l et u r n o v e r ) 实验、脂质体包埋法、融合 表达( c a v a l l ie ta 1 2 0 0 0 ) 以及最近采用的在特定细胞中超表达受体、g 蛋白以及r g s 蛋 白等信号分子的方法( x i ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 均证明，几乎所有的r g s 蛋白都具有g a p 活性而 促进g a 亚基水解g t p 。 其次，r g s 蛋白具有拮抗g 蛋白效应器的功能。目前已经观察到r g s 4 可与p l c d 竞 争结合g t p t s g a q ( h e p l e re ta 1 ，1 9 9 7 ) ；另外，r g s 4 和g c 【作用蛋白( ga l p h ai n t e r a c t i n g p r o t e i n ，g a i p ) 都可以阻断g t p y s 诱导的百日咳毒素非敏感性p l c p 激活。r g s 4 在c o s 7 细胞中短暂表达，但它可以阻断a l f 4 一诱导的磷酸肌醇合成，这也与效应器拮抗机制一致 ( y a he ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 再次，r g s 蛋白能增强g o 【亚基与g p 丫二聚体的结合力。在无受体激活状态下，r g s 3 和r g s 4 诱导g p 丫调节的k + 通道内流增加( x u e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。用百日咳毒素或胆碱能受体阻 断剂消除激动剂诱导的k + 内流，但不改变r g s 的作用。细胞内共转染g 所结合蛋白显著 降低r g s 4 诱导的基础k + 内流。r g s 蛋白也改变另外一种g p y 效应器n 型c a 2 + 通道的性 质。这些结果表明r g s 3 和r g s 4 也具有调节g p 丫二聚体信号转导的作用。 r g s 结构域与r g s 蛋白的g a p 活性有关，其它结构域的作用则较为复杂多变。r g s 蛋白上的其他功能区域如g g l 、d e p 、d h p h 和p d z 区域可能与其他蛋白偶联并涉及另 外的信号通路，这样r g s 与g a 结合后会带有一些能产生各种蛋白间相互作用的功能单位。 r g s 蛋白是一个庞大的蛋白家族，其组织分布特异且可为特异的信号物质调节，其功 能除抑制g 蛋白信号外，还可以增加g 蛋白激活，并能作为支架( s c a f f o l d ) 蛋白促进受体、 g 蛋白效应器及其他调节分子的聚集。 g 蛋白信号转导是很多胞外信号引发细胞生理功能改变的共同途径，r g s 蛋白的深入 研究对于充分阐明该信号转导体系的构成及其调节机制具有深刻意义。 2 植物中g 蛋白介导的信号转导途径 2 1 植物g 蛋白信号转导途径各组分简介 已经在多种植物中到检测到g 蛋白的存在，在拟南芥和水稻中单拷贝基因a 盟j 或r g 么j 编码g a ( i s h i k a w ae ta 1 ，1 9 9 5 ；m ae ta 1 ，1 9 9 0 ) ；单拷贝基因么g 留或r g b j 编码g p ( i s h i k a w a e ta 1 ，19 9 6 ；w e i s se ta 1 ，19 9 4 ) ；2 个基因a g g j 或尺g g 和么g g 2 或r g g 2 编码研( k a t oe ta 1 ， 2 0 0 4 ；m a s o ne ta 1 ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 。理论上讲，在模式植物拟南芥和水稻细胞中最多存在2 种可 能的g 蛋白，l i l g a l 3 7 1 和g a 脚2 。植物中还没有发现和哺乳动物g p c r 高度同源的基因。但 是，拟南芥中有一个基因编码g c r l ，它具有7 次跨膜结构，与盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m ) 的腺苷酸环化酶受体( r e c e p t o ro fc a m p ，c a r l ) 有2 0 相似性( j o s e f s s o na n d r a s k , 1 9 9 7 ；f , a n y u k ae ta 1 ，2 0 0 1 ；p l a k i d o u d y m o c ke ta 1 ，1 9 9 8 ) ，与g a 亚基具有相互作用 拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t r g s l ) n 一末端、c 末端结构域在葡萄糖和a b a 介导的信号转导途径中的作用1 1 ( p a n d e ya n da s s m a n n , 2 0 0 4 ) ，但目前还没有鉴定到g c r l 的配体。最近，l i u 等鉴定到一种 新g p c r ( g c i 也) ，该蛋白与o a 共同作用调控已知的a b a 参与的众多响应过程，并且可与 a b a 特异性结合，被认为是a b a 的膜受体( l i ue ta 1 ，2 0 0 7 ) 。但o a o 等对g c r 2 序列进行分 析发现它不具有g p c i 洪有的7 t m 结构，g c r 2 功能缺失突变体g c r 2 与其同源蛋s g c l l 功能 缺失突变f 本g c l l 单、双突变体都未表现出对a b a 不敏感。另外，o p a l 功能缺失突变体g p a l 对a b a 抑制种子萌发和早期幼苗发育表现出的超敏感性也证明了g c r 2 不可能作为a b a 受 体与o p a l 共同发挥作用( g a oe ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 植物细胞中与动物细胞中同源的小g 蛋白家族包括r a d 、a f t , r a n $ 口r h o ，但迄今尚未 找到与动物r a s 有较高同源性的小g 蛋白( v e m o u de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。自从1 9 9 3 年第一次从豌豆中 发现鼬1 0 相关的g t p a s e 以来，人们先后在1 7 种植物中发现3 5 2 种与r h o 相关的o t p a s e 。与真 菌和动物有所不同，植物r h og t p a s e 属于一种特殊的r o p ( r h o r e l a t e do t p a s ef r o mp l a n t s ， r o pg t p a s e ) 。r o pg t p a s e 在植物中分布较为广泛，并且种类繁多。研究发现拟南芥中含 有1 1 种，玉米中含有9 种，水稻中含有7 种。人们推测植物信号转导途径可能与动物信号转导 途径有较大的不同，并j t r o pg t p a s e 有可能在其中扮演着独特的角色( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 0 )