屏障系统实验动物饲养与管理PPT课件.ppt

第四章屏障系统实验动物饲养与管理,.,第一节基础知识,屏障环境设施适用于饲育无特定病源体(SpecificPathogenFree)级实验动物。动物来源于无菌、悉生动物或SPF动物种群。进入屏障的人、动物和物品必须经过严格的微生物控制。空气经低效、中效、高效过滤器进入屏障系统，结净度达到10000级，利用空调送风系统形成清洁走廊、动物房、污染走廊、室外的静压差梯度，以防止空气逆向形成的污染。空气、人、动物、物品的走向采用单向流通路线。空气经初效、中效和高效过滤器静茹动物饲养室或实验室，检测尘埃粒子数在350/升，该系统利用空调送风系统形成清洁走廊、饲育室或实验室、污染走廊灯不同压力的净化区，净化区内形成梯度压差，一般压差为20Pa。工作人员工作时要在淋浴后穿着无菌工作服、口罩、帽子以尽量减少和动物的直接接触。,实验动物环境控制的重要性实验动物几乎终身被限制在一个极其有限的环境范围内生活，这种环境就成了实验动物赖以生存的条件。动物实验在实验前和实验中控制各种环境因素十分重要。甚至可以说没有环境控制就没有动物实验。,动物对实验处理的反应可用以下公式表示：R=（A+B+C）D+ER：实验动物的总反应A：动物种的共同反应B：品种品系特有的反应C：个体反应（个体差异）D：环境影响E：实验误差环境因素与动物的总反应呈正相关，要尽量减少D的变化，排除实验处理以外的影响。,实验动物环境因素的分类1、气候因素：温度、湿度、气流、风速等；2、理化因素：氧、二氧化碳、粉尘、臭味、噪音、照度、杀虫剂、消毒剂、有害化学物质等；3、居住因素：房屋、笼具、垫料等；4、营养因素：饲料、水等；5、生物因素：同种生物因素：社会地位、势力范围、咬斗和饲养密度等异种生物因素：微生物、人和其它动物的关系环境对实验动物质量和动物试验结果的影响是多因素联合作用的结果。多种因素是共存的。所以在论述实验动物的环境时，应该按复合环境（environmentalcomplex)状态加以考虑。,各种环境因素对实验动物质量和动物试验结果的影响1、温度：最适宜温度20-25，温差：3或4温度对动物的影响：新陈代谢：低温时新陈代谢增加，摄食增加散热：除灵长类，其他动物汗腺不发达或无汗腺，高温时散热困难，难以维持体温恒定脏器重量：负相关生殖：高温时雄性睾丸萎缩，精子活力下降；雌性动物性周期紊乱，泌乳下降对动物实验的反应性,实验动物的温度标准范围：,2、湿度：相对湿度，实际水蒸气分压力相对湿度（%）=-100%饱和水蒸气分压力适宜的相对湿度是40%-70%。高温高湿导致机体蒸发散热受阻。高湿利于微生物繁殖和传播。湿度过低可导致粉尘飞扬，而微生物主要附着在粉尘上，动物室内变态反应原的含量随湿度的下降而上升。低湿，散热增加，产热增加，摄食增加低湿，大鼠环尾症,3、气流与风速换气次数，气流速度，压强梯度气流速度和散热正相关，实验动物体表面积与体重的比值较大，对气流速度更敏感。气流速度过大或气流直吹，动物体表散热过大。气流速度小，散热慢。0.1-0.2m/s换气次数，洁净程度越高，要求换气次数越多。屏障环境：10-20次/h隔离环境：20-50次/h.压强梯度：洁净区高于污染区合理组织气流和风速可调节室内温度和湿度，又可降低室内粉尘和有害气体污染，控制传染病的流行。,4、光照工作照度150300lx动物照度1520lx明暗交替时间12/12或10/14h照度对动物的生殖生理和行为活动有较大影响强光长时间照射引起角膜退行性变化,5、噪声60dB以下音域，人10002000Hz,小鼠10005000Hz。引起小鼠听力性痉挛。对生殖影响较大，如豚鼠流产。引起动物呼吸、心跳、血压、肾上腺皮质激素等生理指标变化。,6、空气洁净状况气体污染，氨14mg/m3有害气体，氨、甲基硫醇、硫化氢等颗粒污染，100级，10000级，100000级美国宇航局标准，每立方英尺空气中直径0.5微米以上粒子的个数。粉尘颗粒，是变应原，还是微生物的主要载体。落下菌数，0（隔离环境），3（屏障环境），或30个/皿（普通环境）在不饲养动物的状态下每510m2放置1个直径9cm的血琼脂培养皿，暴露30min培养48h的菌落数。,7、生物因素动物社会因素和动物饲养密度微生物其它动物实验人员,8、居住因素包括实验动物室的建筑、饲养笼具、垫料、饮水器和给食器等。,动物试验设施环境指标：以屏障系统小鼠为例温度：2025换气次数：1020次/h日温差：3气流速度：0.10.2m/s相对湿度：4070%压强梯度：2050Pa噪声：60dB空气洁净度：10000级氨浓度：14mg/m3落下细菌数：3个/皿照度：（工作）150300lx（动物）1520lx昼夜明暗交替时间：12/12或10/14小时密度（20g):面积0.01m2,高度0.15m,实验动物设施laboratoryanimalfacility,LAF是进行实验动物饲养、保种维持、生产、实验研究、试验等设施的总称。包括实验动物繁育、生产设施和动物实验设施。实验动物设施根据对饲养动物的空气净化程度分为三类：开放系统(opensystem)屏障系统(barriersystem)隔离系统(isolationsystem),实验动物屏障环境特点：恒温（2026）恒湿（4070）足够的换气次数（1020次/小时）保证有害气体浓度降低到最小正向梯度压差（2050)使屏障外污染源不能进入万级空气洁净度保证空气洁净适合的动物照度(1520)和对时明暗交替（12h/12h)符合动物生活习性,第二节屏障系统的环境控制与管理,一、人流路线,二、物流路线,三、消毒与灭菌高压锅：121，0.11Mpa，30分钟132，0.21Mpa，15分钟传递窗：紫外线，表面消毒，30分钟渡槽：0.1%新洁尔灭浸泡4小时Co60照射2%过氧乙酸喷雾高锰酸钾、福尔马林熏蒸,四、废弃动物处理深埋或焚烧,屏障系统（IndividuallyVentilatedCages简称IVC）是独立通风笼盒的简称.它的特点是具有一定的密闭性,同时让经HEPA过滤器的洁净空气流入盒内,使盒内保持正压,减少了可能的感染来源,适合于饲养SPF级动物,以及一些免疫缺陷动物。,IVC的使用要点：对IVC中的动物进行的一切工作均在动物超净工作台中进行使用超净工作台前30分钟用70%酒精喷雾工作站内表面，同时放入经表面消毒的各种灭菌物料和实验用品，并打开紫外灯和风机用70%酒精喷雾工作车、双手手套和IVC的外表面，将笼盒移入工作台后进行换窝，喂饲，喂水，实验等工作,层流架,隔离系统,隔离器的基本构造示意图,引进动物进入清洁级屏障动物房：从外面引进的动物必须有与其适用范围相符的实验动物生产许可证,同时必须附带动物的品系、性别、年龄等信息经实验动物中心工作人员审查后方可准备进入动物房动物运输时必须有合格的包装箱,清洁级及以上动物包装箱必须以高效滤膜封闭窗口，包装箱以胶带封口，封口破损或滤膜破损者不得传入屏障系统。,将检查合格的动物包装箱在外准备间以70酒精棉球或5%碘伏仔细擦拭表面,将包装箱放入灭菌通道进行喷雾消毒或紫外线消毒,在内准备间打开灭菌通道的门在门口拆开包装箱轻轻提起鼠尾根部，放入准备好的盒子中，盖好盖子动物包装箱仍退回灭菌通道将刚装了动物的笼盒放在架子上并填写、悬挂卡片，加饲料，饮水从外准备间打开灭菌通道，取出动物包装箱。,注意：新引进动物应在单独房间，单独笼架饲养一段时间,待观察健康无病后再移入其它房间。不得向屏障动物房内传入不符合相应的实验动物生产许可证的动物！,实验用品和器具进出清洁级屏障动物房：用70%酒精或5%碘伏仔细擦拭消毒物品表面紫外灯照射15min或直接喷雾消毒手术器械可经高压消毒或经消毒液中浸泡后在紫外灯下照射15min传入小型仪器经灭菌通道喷雾消毒后传入,物品进出SPF动物实验室：所有物品在经过进入屏障系统时的一次消毒后,在进入超净工作台时必须经过酒精喷雾或紫外线照射15min再次消毒。实验用品和器具在实验结束后可经内准备间从传递窗或灭菌通道传出，也可经缓冲间出屏障系统,第三节屏障与隔离系统的实验动物饲养管理技术,一、无菌动物（Germfreeanimal，简称GF）定义：指用现有的实验手段检测，动物的体表体内不携带其它生命体（包括一切微生物和寄生虫）的实验动物。饲养条件：无菌隔离器内来源：第一代通过无菌剖腹产术，人工哺乳获得；以后通过无菌动物雌雄交配繁殖或无菌剖腹产术，保姆鼠代奶扩群。,无菌动物的培育无菌动物的理论基础和实践依据：胎盘屏障和屏障观念。1、无菌手术小哺乳动物动物：子宫切除术（剖腹产）大哺乳动物动物：子宫切开术（剖腹产）鸟类：消毒卵2、哺乳人工哺乳代乳3.放入隔离器进行饲养,注意：供胎动物：不携带垂直传播的微生物手术时间的选择手术速度无菌操作环境温度防止羊水呛入呼吸道手术后微生物的检查代乳动物的准备,无菌动物特点：1.微生物特点：在动物体内外任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫。“无菌”是个相对的概念，只是根据现有的科学知识和检验方法在一定时期内不能检出病原体而已。随着科学技术的发展，现在认为是无菌的动物或许将来可以检出病原体而不是无菌动物。,2.形态学特点：消化系统(1)盲肠肥大，(2)肠道肌层薄，肠绒毛变细变短(3)肝脏变小循环系统(1)心脏变小(2)白细胞数变少，且数量波动范围小免疫系统(1)胸腺，淋巴组织，网状内皮系统发育不良(2)脾脏小，无二级滤泡,2.生理学特点：免疫功能(1)血清中IgG、IgM水平低，几乎不存在丙种球蛋白和特异性抗体(2)免疫应答速度慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱生长率(1)不同种属不同(2)无菌鸟类生长率高于同种普通鸟(3)无菌大、小鼠与普通鼠差不多(4)无菌豚鼠和无菌兔比普通的慢,生殖(1)无菌大、小鼠略高于普通大小鼠(2)豚鼠和兔繁殖能力比普通级低代谢和营养无菌动物血中含氮量少，肠管对水的吸收率低，代谢周期比普通动物长体内不能合成维生素B和K，易产生这两种维生素的缺乏症抗辐射能力无菌动物抗辐射能力强，抗实验性烫伤和抗休克死亡能力也强于普通动物寿命无菌动物的寿命普遍长于普通动物,二、悉生动物（Gnotobioticanimal，简称GN）定义：又称已知菌动物，指动物体内带有明确的微生物种类的动物。饲养条件：无菌隔离器内来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其体内带有已知菌单菌动物双菌动物多菌动物,悉生动物的培育（1）获取无菌动物（2）准备好特定的微生物材料（3）把上述材料转入无菌饲育隔离器（4）在隔离器内给无菌动物授入微生物,悉生动物特点：微生物特点体内携带有已知微生物来源无菌动物植入微生物饲养管理必须饲养在温湿度恒定的百级空气净化的隔离系统中，实行严格的微生物控制。其他与无菌动物比较。悉生动物肠道内存在细菌可以合成维生素，不会像无菌动物一样发生维生素缺乏症。抵抗力、生活力较强，易于饲养管理。,无菌动物和悉生动物的应用1、病因学的研究如：猫瘟、龋齿的形成2、微生物学中的研究(1)微生物间的拮抗作用(2)微生物和宿主之间关系(3)病毒学研究3、免疫学研究中的应用无菌动物体内既无抗原也无特异性抗体，处于一种“原始状态”，很适合用于各种免疫功能的研究。如，无菌动物暴露于微生物，先产生球蛋白，再产生球蛋白，最后产生球蛋白。制备高效价，无交叉反应的特异性抗体,4、肿瘤学研究如，制备人体肿瘤模型需要免疫抑制动物，而普通动物给予免疫抑制剂后常继发感染死亡，所以可以应用无菌动物。研究垂直传染的致癌病原，如白血病病毒。某些微生物的代谢产物可以降解无害的苏铁素，使其致癌。5、老年病学研究无菌动物普遍寿命比普通动物长，说明微生物和机体老化有关。普通大鼠寿命2年，而无菌大鼠寿命34年。,6、营养学的研究无菌动物是研究营养的良好模型，很多营养成分是靠细菌产生的。如VB和VK是靠肠道细菌合成的，无菌动物体内不能合成VB和VK，所以可以用来研究哪些细菌合成了哪些维生素。7、放射医学研究无菌动物可以耐受大剂量的放射线照射。可用区别放射引起的症状和继发感染的症状。8、毒理学研究如：研究发现青霉素过敏是因为肠道菌代谢引起，而非青霉素本身。豆类中毒也是由肠道细菌的代谢活动引起的。,9、心血管病研究实验证实肠道微生物可以分解胆汁酸，降低血液中胆固醇水平。10、宇航中应用可以用来携带地外微生物。,三、无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimal，简称SPF动物)定义：指不携带特定病原体（细菌、病毒、寄生虫），但带有未知的微生物群的动物。饲养条件：屏障系统内大规模生产/隔离器内保种最初来源：将无菌动物/悉生动物转移到屏障系统中饲养繁殖,SPF动物特点：1、微生物特点SPF动物除一、二级动物应排除的病原体外，不携带主要潜在感染或条件致病和对研究实验干扰大的病原。2、来源SPF动物来源于无菌动物或剖腹产动物。3.饲养管理SPF动物必须饲养在温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中，实行严格的微生物控制。,SPF动物的应用：目前国际上公认SPF动物适用于所有科研实验，是国际标准级别的实验动物。它的应用价值在于它无人畜共患病，无主要传染病，无对实验研究可能产生干扰的微生物。各种疫苗生产所采用的动物应为SPF动物。,四、清洁动物（Cleananimal，简称CL动物）定义：微生物控制级别介于SPF动物和普通动物之间的动物饲养条件：屏障系统大规模生产来源：SPF动物扩群应用：各种科研、教学用大小鼠,清洁级动物特点：1、微生物特点清洁级动物比普通级动物要求排除的微生物和寄生虫多，但比SPF动物少。清洁级动物除肉眼观察无病外，尸体解剖时，主要脏器、组织无论是肉眼观看还是病理组织切片均应无病变。2、来源清洁动物来源于SPF动物、无菌动物、悉生动物或剖腹产动物。,3、饲养管理清洁级动物饲养于温湿度恒定的万级空气净化的屏障系统中。其所用的饲料、垫料、饮用水、笼器具等都经过消毒灭菌处理。工作人员需换灭菌工作服、鞋、帽、口罩等进入动物室进行操作。,清洁级动物的应用：清洁级动物是根据我国国情而设立的等级动物。它较普通级动物健康，又较SPF级动物易达到质量标准，在动物实验中可免受动物疾病的干扰，其敏感性与重复性亦较好。目前在我国已成为适用于科研的标准级别的实验物。,SPF动物和清洁动物的培育：将无菌动物或悉生动物饲养于屏障系统使其自然感染特定微生物以外的微生物，但应严格防范特定病原体的污染，并需要定期检查。,五、普通动物（Conventionalanimal，简称CV动物）定义：不带有严重危害