（应用化学专业论文）BODIPY和罗丹明类阳离子荧光探针的研究.pdf

大连毽工大学 毒士学笾论文 摘要 荧光分子探针具有诸如最高可达单分予检测的高灵敏度、畿够实现开关操作、对亚 微粒具有可视的亚纳米空阀分辨能力和亚毫秒时闻分辨能力、原位检测( 荧光成像技术) 以及利用光纤进行远距离检测等众多优点。氟硼荧( b o d i p y ) 和罗丹明类荧光染料具 有优异的光化学光物理性质，例如高的摩尔消光系数、良好的光稳定性、高的荧光量子 产率等优点。嚣此，基于氟硼荧类和罗丹甓类染料荧光分予探针的研究已零l 起人们越来 越多的关注。 设计合成了b o d i p y 类p h 荧光分子探针m 1 m 6 。m 5 对p h 的响应范围是p h 5 3 6 3 6 6 ，其它都是近中性的p h 荧光分子探针，m 1 m 6 是专一识别质子的p h 荧光分 子探针。同时，发现可以通过增加b o d i p y 染料8 位亚甲基氮原子上取代基的数量、增 加脂肪链取代基的链长、引入芳香烃基团等途径来降低此类染料的p r , 值，这主要是由 于该氮原子附近存在的空间张力增加，使得氮原子的质子化变得更难。这种通过改变 b o d i p y 染料8 位亚孕基氮原子上的取代基来调变探针憾对此类p h 荧光分子探针设 计很有意义。 基于p e t 原理设计合成了b o d i p y 类p h 荧光分子探针b d t a 。b d t a 具有非常狭 窄的p h 识别范围( p h2 0 0 0 。6 5 ) ，具有很高的p h 灵敏度。此辩，b d t a 不畿够识别 金属离子和阴离子，因此，b d t a 是一个专一识别质子的p h 荧光分子探针。 基于p e t 原理设计合成了b o d i p y 类荧光化合物b p b l ，在乙腈中其最大吸收波长 ( 4 9 6r i m ) 和最大发射波长( 5 0 5r i m ) 在可见区，荧光量予产率为0 0 1 3 ，加入过量p b 2 + 后，p b 2 + - b p b l 络合物的荧光量子产率增大到0 6 9 3 。其它常见金属离子和阴离子在乙腈 中对b p b i 检测p b 2 + 没有明显的干扰。荧光增强是由于p b 2 + 和受体的络合阻断了探针分 子中由受体到荧光母体的光诱导电子转移( p h ) 。 设计合成了两个罗丹明类c u 2 + 荧光增强型分子探针r b 2 和r g 2 。在强s - h c l 中性 缓冲液中，r b 2 和r g 2 在常见金属离子中( n 矿，k _ ，m 矿，c a 2 + ，b a 2 + ，m 1 1 2 + ，c d 2 + ， c r 3 + ，c 0 2 + ，胪，a 矿，p b ”，z 1 1 2 + ，f e 3 + ，f e 2 + ，h 8 2 + ) 和常见阴离子( a c - ，c i 。，n 0 3 。， h 2 p 0 4 一，p 0 43 - s 0 4 2 ) 中麓够专一性地识别c u 2 + ，具有很高的灵敏度，r b 2 至少可以检 测到ln mc u 2 + ；r g 2 至少可以检测到o 1n mc u 2 + 。加入c u 2 + 蘑，r b 2 和r g 2 的荧光 强度分别增大约1 9 5 倍和3 0 9 倍。r b 2 、r g 2 对p h 不敏感，可以在较宽的p h 范围( 包 括重要的生理p h 范围) 内对c u 2 + 高灵敏地识别。r b 2 、r g 2 分别和c u 2 + 作用后，溶液 的颜色和荧光发生明显地变化。 合成了罗丹明类荧光化合物r b l 和r g l 。r g l 对p h 的响应范围是p h4 。5 1 0 9 6 。 随着酸度的增加( p h4 5 1 0 9 6 ) ，r g l 的吸光度和荧光强度将逐渐增大，p h 降到o 9 6 b o d i p y 和罗丹明类阳离子荧光分子探针的研究 时，其荧光强度增大了约6 9 倍，而且r g l 对常见金属离子和阴离子都没有响应，所以 r g l 是一个高灵敏、可以专一识别质子的p h 荧光分子探针。 关键词：荧光分子探针；氟硼荧染料；罗丹明染料；p h ：c u 2 + 一n 一 大连理工大学博士学位论文 s t u d yo fb o d i p y a n dr h o d a m i n ef l u o r e s c e n tp r o b e sf o rc a t i o n s a b s t r a c t t h ea d v a n t a g e so fm o l e c u l a rf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rs e n s i n gc a r lb es u m m a r i z e d ：h i g h s e n s i t i v i t yo fd e t e c t i o nd o w nt ot h es i n g l em o l e c u l e “o n 。o f f s w i t c h a b i l i t y , s u b n a n o m e t e r s p a t i a lr e s o l u t i o na n ds u b m i l l i s e c o n dt e m p o r a lr e s o l u t i o n , o b s e r v a t i o ni ns i t u , r e m o t es e n s i n g b yu s i n go p t i c a lf i b r e s ，e ta 1 1 1 1 eb o r o nd i p y r r o m e t h e n e ( b o d i p y ) d y e sa n dr h o d a m i n ed y e s h a v ee x c e l l e n tp h o t o p h y s i c sa n dp h o t o c h e m i s t r yp r o p e r t i e ss u c h 嬲h i 曲m o l a re x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t , h i g hs t a b i l i t ya g a i n s tl i g h ta n dc h e m i c a lr e a c t i o n s ，a n dh i 曲f l u o r e s c e n c eq u a n t u m y i c l d s ，e t c t h e r e f o r e , t h es t u d i e so nf l u o r e s c e n c em o l e c u l a rp r o b e sb a s e do nb o d i p yd y e s a n dr h o d a m i n ed y e sa r ea t t r a c t i n gm a n yp e o p l e sa t t e n t i o n s p hf l u o r e s c e n tp r o b e s ( m 1 - m 6 ) b a s e do nb o d i p yd y e sh a v eb e e nd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d m 5h a st h er e s p o n s es i g n a lf r o mp h5 3 6 - 3 6 6 1 1 l eo t h e rc o m p o u n d sa m o n g t h e ma l et h en e a r - n e u t r a lp hf l u o r e s c e n tp r o b e s m 1 一m 6a l en o n - m e t a li o na n dn o n - a n i o n s e n s i t i v e a tt h es a m et i m e ，i tw a sf o u n dt h a tt h ei n c r e a s eo fn u m b e ro fs u b s t i t u t e s ，t h e i n c r e a s eo fa l i p h a t i cc h a i nl e n g t ha n dt h ei n t r o d u c t i o no fa r o m a t i cg r o u po nt h en i t r o g e na t o m l i n k e dm e t h e n ea ts i t e8o fb o d i p yd y e sc a nr e d u c et h e 诋o ft h e m t h em a i nr e a s o ni st h e p r o t o n a t i o no ft h i sn i t r o g e na t o mw i l ll e a dt og r e a t e rs t e r i cs t r a i n 1 1 1 ea f f i n i t yo fap r o m nt o t h i sn i t r o g e na t o m b e c o m e sm o r ed i 伍c u l t i ti sv e r ys i g n i f i c a n tf o rt h ed e s i g no ft h i sk i n do f p hf l u o r e s c e n tp r o b e st h a tt h ev a r i o u ss u b s t i t u t e so nt h en i t r o g e na t o ml i n k e dm e t h e n ea ts i t e 8o f b o d y d y e s t h eb o d i p yf l u o r e s c e n tp hp r o b eb d t ab a s e do np e th a sb e e nd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d n ep r o b eh a sm u c hn a r r o wp h - s e n s i t i v ew i n d o w sq h2 0 0 0 6 5 ) i na d d i t i o n , b d t ai sn o n - m e t a li o na n dn o n a n i o ns e n s i t i v e t h e r e f o r e ，b d t ai sah i 星蛐ys e n s i t i v ea n d s e l e c t i v ep hf l u o r e s c e n tp r o b e t h eb o d i p yf l u o r e s c e n tc o m p o u n db p b lb a s e do np e th a sb e e nd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d 1 1 1 ca b s o r p t i o n ( 4 9 6n m ) a n de m i s s i o n ( 5 0 5n m ) w a v e l e n g t h sa r ei nv i s i b l er a n g e i na c e t o n i t r i l e n l ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d so ft h el e a d f r e ea n dl e a d - b o u n ds t a t e so f b p b li na c e t o n i t r i l ea r e0 0 13a n d0 6 9 3 ，r e s p e c t i v e l y o t h e rm e t a li o n sa n da n i o n sh a v en o o b 访o u si n t e r f e r e n c ef o rb p b lt od e t e c tp b 什i na c e t o n i t r i l e t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ti s b a s e do nt h eb l o c k i n go fp h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e ri nb p b lb yt h es e l e c t i v e c o o r d i n a t i o no fp b z w i t ht h er e c e p t o ri nt h ep r o b em o l e c u l e c u z + f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n tp r o b e sr b 2a n dr g 2b a s e do nr h o d a m i n ed y e sh a v e b e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d r b 2a n dr g 2e x h i b i tc u f + - o n l ys e n s i t i v ea m o n gm e t a li o n s s u c h 弱n d ，k ，m 矿，c e + ，b a 2 + ，m 铲+ ，c d 2 + ，c r 3 + ，c 0 2 + ，n i 2 + ，a g * ，p b 2 + ，z n 2 + ，f e 3 + ，f e 2 + ， h 矿a n da n i o n ss u c ha sa c - ，c 1 。，n 0 3 。，h 2 p 0 4 。，p 0 4 ，s 0 4 2 。t h e yh a v ee x t r e m e l yh i g h i n b o d i p y 和罗丹明类阳离子荧光分子探针的研究 s e n s i t i v i t yf o rc 一r b 2a n dr g 2w o l l l dd e t e c t a tl e a s t1n ma n d0 1n mo fc u + r e s p e c t i v e l y u p o nt h ea d d i t i o no fc u z 十t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n tf a c t o r so fl u 吃a n d r g 2a r ec a 19 5 一f o l da n d3 0 9 f o l d ，r e s p e c t i v e l y r b 2a n dr g 2a l ep h i n s e n s i t i v ec u 2 + f l u o r e s c e n tp r o b e s w h i c hw o u l dd e t e c tc 一十e f f e c t i v d yi nar e l a t i v e l yw i d er a n g eo fp h i n c l u d i n gt h es i g n i f i c a n tp h y s i o l o g i e a lr e g i o n a f t e rt h er e a c t i o nb e t w e e nr b 2a n dc u 2 + o r b e t w e e nr g 2a n d 国f ：t h ec o l o u ra n df l u o r e s c e n c eo fs o l u t i o nh a v ev e r yo b v i o u sc h a n g e s 。 t h er h o d a l n i n ef l u o r e s c e n tc o m p o u n d sr b la n dr g lh a v eb e e ns y n t h e s i z e d r g lh a s t h er e s p o n s es i g n a lf r o mp h4 51 - 0 9 6 t h ea b s o r b a l i c ea n dt h ef l u o r e s c e n te m i s s i o ni n t e n s i t y o fr g li n c r e a s ec o n t i n u o u s l yw h e nt h es o l u t i o nb e c a m em o r ea c i d i cf r o mp h4 51t o0 9 6 w h e np nw a sd e c r e a s e dt o0 9 6 ，t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n tf a c t o ro fr g li s6 9 f 0 1 d i i l a d d i t i o n , r g li sn o n - m e t a li o na n dn o n - a n i o ns e n s i t i v e t h u s r g li sap hf l u o r e s c e n tp r o b e w h i c hh a sh i g h l ys e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rp r o t o n s k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c em o l e c u l a rp r o b e ；b o r o nd i p y r r o m e t h e n eo b o d i p y ) d y e s ； r h o d a m i n ed y e s ；p h ；c u 2 + 一 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：里遨丝 日期坦雪、多印 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解茹大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阗和借阕。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行橙索，也 可采用影印、缩印或括描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名：竺受娅 导师签名： 大连理工大学博学位论文 1 前言 1 1 绪论 1 9 8 7 年，当莱恩( l e h nj 酝) 1 1 、克挝姆( c r a md j ) 2 1 和彼褥森( p e r t c r s o nc j ) 【3 】三位化学家因其对分子识别方面的巨大贡献而获得诺贝尔化学奖时，这一刻也同 时预示着一门将会给化学领域带来革命性变化的新学科超分子化学( s u p e r m o l e c u l a rc h e m i s t r y ) 的诞生。至此，以“超分子化学为名称的新的学科蓬蓬勃勃地 发展起来，并以其新奇的特性吸引了全世界化学家的关注。超分子化学也迅速发展成 为覆盖化学、物理、生物以及材料等基础学科的极富挑战的新领域之一。 超分子是通过分子之间的非共价键弱相互作用，如氢键、范德华力、偶极偶极相互 作焉、亲水硫水相互作角以及它钠之润昀协同作用丽生成的分子聚集体，可以说是共价 键分子化学的一次井华、一次质的超越，被称为“超越分子概念的化学”。 超分子的结合都是建立在分子识别基础之上的，所谓分子识别就是主体( 或受体) 对客体( 或底物) 选择性结合并产生某种特定功能的过程。互补性( c o m p l e m e n t a r i t y ) 及预组织( p r e o r g a n i z a t i o n ) 是决定分子识别的两个关键原则。前者决定识别过程的选择 性，后者决定识别过程的键合能力。底物与受体的互补性包括空间结构及空间电学特性 的互补性。空间结构互补佳即“锁钥关系和“诱导契合 ( i n d u c e d f i t ) 。电学特性互 补包括氢键形成、静电作用、堆叠作耀、阳离子作用、疏水相互作用等，这要求主体及 客体的键合点和电荷分布能很好匹配【4 1 。自然界中，分子识别是广泛存在的一种现象， 特别是在生命过程中，分子识别起着极其重要的作用。对分子识别事件的认知需借助一 定的技术手段把分子识别事件转化为人们可以感知的物理信号。在众多的方法中，荧光 分析法有很多优点：荧光检测灵敏度蔫( 可实现单分子检测) 、选择性好、成本低、易 操作、适用面广、对皿微粒可以实现可视的亚纳米空间分辨和亚毫秒时间分辨，故通过 荧光信号输出分子识别事件已成为人类揭示生命现象和过程、认知世界的重要方法之一 【5 ，6 1 ；蔫样以分子识别为基础，设计、合成和组装具有新的光、电、磁等物理性能的纳 米级超分子器件，为材料科学提供新的理论依据，在改善人类生活质量方面具有重要意 义。 荧光分子探针( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a r p r o b e ) 、荧光分子牙关( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a r s w i t c h ) 和荧光分子传感器( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o r ) 是在荧光分子识别中经常使用 的概念。荧光分子探针是其中内涵最广的一个概念，一般凡是在一定体系内，当某种物 质或体系的某一物理性质发生变纯时该分子的荧光信号麓发生相应改变的分子就可称 为某一物质或物理性质的荧光分子探针；荧光分予开关是指在识别过程中分子荧光信号 有明显强弱变化的荧光分子探针；荧光分子传感器是指在识别过程中分子荧光信号能够 b o d i p y 和罗丹明类阳离子荧光分子探针的研究 快速、可逆响应的荧光分子探针。荧光分子探针是建立在分子识别和荧光技术两者有机 结合的基础上，通过特定的受体结合目标实现分子识别，并随之通过相应的荧光信号传 导机制将这些分子识别到的信息转换为易于检测的荧光信号，从而实现单分子水平上的 原位、实时检测。目前，设计、合成专业化、特殊化的荧光分子探针已经引起了广泛的 关注，成为了一个世界性的热门研究课题 7 d 们。 1 2 分子荧光产生原理 当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就发射出波长和强度各不相同的 光，停止光照射时，光线马上或逐渐消失，这就是荧光。对荧光的产生原理和条件直到 1 9 世纪中期才弄清楚。g o r g egs t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后， 首先确定和报告了它们的荧光波长总比激发光波长要长。他还研究了荧光强度和荧光物 质浓度的关系，发现在高浓度时荧光会被淬灭，他也发现荧光可以被外部物质淬灭，从 而建议利用荧光达到检测的目的。由a l e x a n d e rj a b l o n s k i 在1 9 3 5 年提出的荧光产生的过 程图，常被称为j a b l o n s k i 刚1 1 】( 见图1 1 ) 。通常情况下，荧光试剂分子处于基态，吸 收光后，试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两种 i 上 一r 一一一 一1 - 一一一一 ，雩硐醣_ 籀贸绡细嘲o n 拥瞅斜确翻m ic 托强国i f 啦 i i l 7 鞭妁咖 瓠 。囊奄白鼬磁 l | ，簧a n t i术 糍x 蝴 1 u 厂文引 1v 黏糟瞳涮霸融翰巍鹚叠叠i ： l薹盖j： t ， 、 乏i 图1 1发光系统的j a b l o n s k i 图 f i g 1 1 j a b l o n s k id i a g r a mf o rap h o t o l u m i n e s c e n ts y s t e m 类型。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为o 或1 。s 为o 时，分子内轨道中的所 有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机物分子的基态是处 于单线态。分子吸收光能后，电子跃迁到高能级，电子自旋方向不变，此时分子处于激 发单重态。s o ，s l ，s 2 ，表示分子的基态和第一，第二，激发单重态，能量由 低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋方向的 变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时s = 1 ，表明分子处于激 一2 大连理工大学博士学位论文 发态的三重态，用t 表示，t l ，t 2 分别表示三重态的第一第二激发态。分子中的电子从 基态s o 跃迁到激发态s l ，s 2 比较容易发生，进行很快( 约1 0 以5s ) ，而从基态单重态到 激发态三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如s 2 ) 可以与其他同类分子或溶 剂分子碰撞通过内转换回到激发态的最低能级s l ，这一过程为1 0 d 2 s ，处于激发态最低 能级的分子寿命一般为l o 。4 一1 0 8 s ，它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是荧光。 从s l 到t 1 能量转化是系间跨越。从t l 回到s o 有两种过程，一个是无能量释放；另一 个是放出光子，即磷光，在l o 珥一1 0s 间完成。 1 3 荧光分子探针识别原理 1 3 1 光诱导电子转移 典型的光诱导电子( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，p e t ) 转移体系是由包含电子给 体的受体部分r ( r e c e p t o r ) ，通过间隔基s ( s p a c e r ，如c h 2 ) 和荧光团f ( f l u o r o p h o r e ) 相连而构成的【1 2 d 4 1 。其中荧光团部分是能吸收光和荧光发射的场所，受体部分则用来结 合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性 识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。p e t 荧光分子探针中，荧光团与受体 单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移 到激发态荧光团( 还原型p e t ) 。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧 光很弱。一旦受体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧 光团就会发射荧光( 图1 2 ) 。 p e t ， 啊州炳医 帕o e 附 图1 2p e t 荧光分子探针识别客体原理图 f i g 1 2 t h ep r i n c i p l eo fg u e s tr e c o g n i t i o nb yp e tf l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e p e t 荧光分子探针的作用机制可由前线轨道能量来说明( 图1 3 ) ，荧光团受到激 发后，其最高占有分子轨道( h o m o ) 上的电子被激发跃迁到最低不占有分子轨道 ( l u m o ) 上，这使得供体( 属于受体部分) h o m o 轨道上的电子能被光诱导转移到荧 光团的h o m o 轨道上，引起荧光团的荧光淬灭。在受体与客体相结合后，供体的氧化 还原电位增加，其h o m o 轨道的能级变得比荧光团的h o m o 轨道的能级低，结果光诱 一3 一 b o d i p y 和罗丹明类阳离子荧光分子探针的研究 导电子转移不能再发生，荧光淬灭被抑制。由于与客体结合前后，荧光强度差别很大， 呈明显的“关、“开 状态，这类探针又被称作荧光分子开关。 il u m o l u m o u 。：! 二斗删。u 医。牟1 1i 。1 卜器 e x c i t e d f r e e e x c i t e db o u n d f l u o r o p h o r e r e c e p t o r f l u o r o p h o r er e c e p t o r 图1 3p e t 机理的前线轨道理论示意图 f i g 1 3 f r o n t i e ro r b i t a le n e r g yd i a g r a m si l l u s t r a t i n gt h em e c h a n i s mo fp e t 到目前为止，p e t 机理已被广泛用来设计功能有机分子，有大约6 0 0 0 多篇相关的 化学文献被报道。科学家们通过p e t 机理设计了很多功能有机分子器件，其中包括分子 整流器、电化学传感器 15 1 、开关【1 6 】、光电电池【1 7 1 、非线性光学材料【1 8 】、荧光分子探针【5 】 等。p e t 是人们在设计荧光分子探针时使用的最为广泛的原理之一，多数荧光分子探针 是以脂肪氨基、或氮杂冠醚作为受体单元。化合物l 是第一个最简单的p e t 荧光分子探 针【1 9 】，在甲醇中和c 络合后，其荧光量子产率从0 0 0 3 增加到o 1 4 。吴云扣等【2 0 】合成 的以二( 2 吡啶甲基) 胺为识别基团、b o d i p y 为荧光团的p e t 荧光分子探针2 ，探针 2 对p h 不敏感，其p k a 被降为2 1 ，它的细胞渗透性很好，在细胞内z n 2 + 的荧光显微成 像研究获得了满意的结果。g u n n l a u g s s o n 研究小组【2 1 】设计合成了含氨羧酸基团的化合物 3 ，化合物3 在p h 较高的介质中稳定，并且水溶性好。当p h 3 时，其荧光被淬灭， 因此，化合物3 可用在竞争性p h 介质中，如在生理p h 条件下。 r o 、 00 、 弋 一 2 3 k 图1 4 四种p e t 荧光分子探针 f i g 1 4 f o u rp e tf l u o r e s c e n tp r o b e s 4 多数p e t 荧光分子探针是基于受体和客体的结合，抑制了从受体到荧光团的光诱导 电子转移，从而使荧光团发射出强荧光的原理设计的。但是，当与过渡金属作用时，结 果有时会发生变化。由于过渡金属的3 d 电子的氧化还原行为，可以发生从荧光团到络 大连理工大学博士学位论文 合的过渡金属的电子转移，或者从过渡金属向荧光团的电子转移，因此，可以通过无辐 射能量转移使荧光淬灭。化合物4 的分子设计也是基于p e t 过程【2 2 1 ，但不同的是，当 络合客体后，产生了从荧光团到金属离子的氧化p e t 过程，导致荧光淬灭。 1 3 2 分子内电荷转移 当直接连有供电子基( 通常是氨基) 的荧光团和一个吸电子基共轭连接时，在光的 激发下，分子内就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。典型分子内电荷转移 ( i n t r a m o l c c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，i c t ) 2 3 - 2 6 】荧光分子探针就是荧光团上连有强的吸电子 基和供电子基的推一拉电子体系。i c t 荧光分子探针的受体往往是推拉电子体系整体中 的一部分，当荧光团上的受体( 如氨基) 在供电子基团一端时，和客体结合后会减少这 个供电子基团的供电能力，从而导致体系共轭程度降低，吸收光谱蓝移，并伴随着摩尔 消光系数的减小。相反，当荧光团上的受体在吸电子基团一端，也就是说，在推拉电子 体系中拉电子的一端时，和客体结合后，会增大体系推拉电子的能力，增大电子的流动 性，吸收光谱红移，摩尔消光系数增大( 如图1 5 所示) 。原理上，荧光光谱的位移 和吸收光谱的位移方向一致。除了光谱的变化外，也能观察到荧光量子产率和荧光寿命 的变化。所有这些光物理性能的变化决定于客体的大小和电荷多少。 联1 | 一 。、啦糊 l 哆溢 畛蕊 图1 5 金属离子与供电子基或吸电子基结合引起的i c t 荧光分子探针荧光光谱的变 化趋势 f i g 1 5 s p e c t r a ld i s p l a c e m e n t so fl c tp r o b e sr e s u l t i n gf r o mi n t e r a c t i o no fab o u n dc a t i o nw i t ha l l e l e c t r o n - d o n a t i n go re l e c t r o n - w i t h d r a w i n gg r o u p 一5 一 b o d i p y 和罗丹明类阳离子荧光分子探针的研究 很多i c t 荧光分子探针是按照下面的原理设计的：阳离子识别体是一个氮杂冠醚， 氮杂冠醚上的一个氮原子和一个吸电子基共轭。冠醚上的这个氮原子对荧光团和阳离子 都起着电子供体的作用。5 是一个d a d ( 供受供) 型i c t 荧光分子探针【2 7 】，氮杂冠 醚有着双重身份：既是推拉电子体系中的电子给体，又是探针分子中的识别基团。当冠 醚与c a ”络合时，由于金属离子的拉电子效应，降低了氮杂冠醚中氮原子的供电子能力， 因此其吸收光谱发生较大的蓝移。荧光光谱也发生蓝移，但比吸收光谱蓝移得幅度要小。 这是由于光诱导电荷转移减少了冠醚上氮原子的电子云密度，这个氮原子由于极化变为 非配位原子。因此，光激发诱导冠醚上氮原子和金属离子之间的作用减弱或消失，从而 使荧光光谱发生较小的蓝移。 5 图1 6 两种i c t 荧光分子探针 f i g 1 6 t w oi c tf l u o r e s c e n tp r o b e s 6 r = ( h ，c h 3 ) 对于阳离子控制的i c t 荧光分子探针来说，其光物理变化现象经常是很复杂的。因 为激发态电荷转移经常伴随着扭曲的分子内电荷转移【2 8 】( t w i s t e di n t m m o l c c u l a rc h a r g e t r a n s f e r , t i c t ) 态的形成。简单的供受体取代的苯衍生物- n ，n 二甲基氨基苯腈 ( d m a b n ) 的双荧光发射最早由l p p e r t r 2 9 】等人于1 9 6 2 年发现。在荧光寿命期间，与发 色团单键相连的助色团( 通常是与发色团相连的氨基) 会发生分子内的扭转，使得构像 发生了变化；另有一种是以双键相连的，旋转后构型发生了变化。旋转的动力来源于电 子激发后受体( a c e e p t o r ) 的吸电性，扭转后的电子云分布将更加有利于系统的稳定， 这种扭转将有利于电荷的完全分离。所形成的激发态称为t i c t 态，是完全的电荷分离 ( 图1 7 ) 。t i c t 态能量要比l e 态低得多，因此t i c t 荧光变长，这样就实现了双波 长变化。t i c t 激发态由于是电荷的完全分离，具有非常高的偶极距，在极性溶剂中更 加的稳定，波长也更加红移。这同时也导致了激发态与三线态和基态的能量接近，增加 了非辐射跃迁的几率，所以，t i c t 态往往是无荧光或者发射非常弱的长波荧光，少数 情况下出现i c t 与t i c t 双重荧光现象。 由于t i c t 态的荧光常常很弱，因此利用t i c t 原理设计的荧光分子探针并不多。 t i c t 极易受到环境极性、粘度、温度等的影响。6 被光激发时t i c t 态是无荧光的【3 0 1 。 大连理工大学博士学位论文 当络合瞳和a 矿时，这些离子抑制了没有荧光的电荷转移t i c t 态的形成，荧光就被恢 复。 le态tict态 ( 共平面，部分c t ) ( 扭曲，完全c t ) 图l 。7 扭蓝的分子内电荷转移原理示意图 f i g 1 7p r i n c i p l eo ft w i s t e di n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，t i c t 1 3 3 激基缔合物 如果两个相同的荧光团( 主要是多环芳烃) 之间的距离和位置合适，当其中一个荧 光团被激发以后就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基缔合物( e x c i m e r ) ，其荧光 发射光谱的特征表现是原来单体的发射峰减弱或者消失，取而代之的是一个新的、强而 宽的、长波长的无振动精细结构发射峰 3 1 , 3 2 。由于形成这种激基缔合物需要激发态分子 与基态分子达到“碰撞”距离3 5 a ，因此荧光团间的距离是激基缔合物形成和破坏的 关键。利用各种分子间作用力改变两个荧光团之间的距离和取向，如用结合客体前后单 体激基缔合物的荧光光谱变化就能够表达客体被识别的信息。萘【3 3 】、蒽【蚓、芘【3 2 】等荧 光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基复合物，常常用于此类探针的设计中。 2 n a + 。一 _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - l 7 式1 1阳离子控制的激基缔合物的形成 s c h e m e1 1e x c i m e rf o r m a t i o nb yc a t i o nc o n t r o l 化合物7 是一个钠离子荧光分子探针3 5 1 。它的荧光光谱由单体和激基缔合物的特征带组 成。当逐渐把高氯酸盐加入7 的甲醇溶液中时，钠离子就诱导单体荧光发射强度降低， 一7 一 b o d i p y 和罗丹明类阳离子荧光分子探针的研究 激基缔合物荧光发射强度增大。钠离子的络合使两个荧光团靠得更近，有利于形成激基 缔合物。 1 3 4 荧光共振能量转移 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 是指在两个不同 的荧光团中，如果一个荧光团( 供体，d o n e r ) 的发射光谱和另一个荧光团( 受体，a c c e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光团间的距离合适时( 一般小于 o o a ) ，就可 以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受 体的荧光发射【3 6 , 3 7 】。进一步讲，就是在供体的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供 体向受体转移的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射性的。供体分子被激发后， 当受体分子与供体分子距离合适，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能 级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受 体被激发。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光淬灭；如果接受体也是一 种荧光发射体，则呈现出受体的荧光。由于受体的荧光波长要长于供体的荧光波长，因 此f r e t 可以观察到双发射波长，从而满足双信息通道的要求。f r e t 严格受到供体和 受体距离的影响，如果识别事件能够改变供体和受体之间的距离，那么两个波长的荧光 强度就会发生变化，从而可以用它们的比值来表达识别事件。 由含有异原子( 氧原子、氮原子和硫原子) 的柔性链连接的两个不同荧光团组成的 荧光分子探针，当结合阳离子时，两个荧光团之间的距离会减小，如果供体( d ) 的荧 光发射光谱和受体( a ) 的吸收光谱重叠，两部分之间的光诱导能量转移效率将增加。 按照f 6 r s t c r s 理论，能量转移效率决定于两个荧光团之间的距离： 咖f 1 ( 1 + ( 脚o ) 6 ) ( 1 1 ) 式( 1 1 ) 中r 表示两个荧光团之间的距离。r o 表示f 6 s t e r 临界半径。两个荧光团 之间的距离的变化就会导致能量转移效率较大的增加或减少。 d o n o r 哈钭 8 a c c e p t o r 图1 8 荧光共振能量转移p b 2 + 探针 f i g 1 8 l a b 2 + f l u o r e s c e n c ep r o b eb a s e do nf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r 大连理工大学博士学位论文 化合物8 是按照这个原理设计的p b 2 + 荧光分子探针 3 8 , 3 9 。两个荧光团( 香豆素) 由 含氧醚链间隔基连接。在乙腈中探针8 络合p b 2 + 引起了吸收光谱、激发光谱和发射光谱 的变化，但碱金属和碱土金属离子几乎没有干扰。p b 2 + 离子络合物的稳定常数是3 1x1 0 4 m 。能量转移效率在络合p b 2 + 离子后从0 7 7 增加到0 8 9 。 f r e t 近年来也被广泛地应用在生物酶的活性检测【矧，用在研究蛋白的结构 4 1 1 、核 酸的结构【4 2 1 、核酸调控 4 3 】、寡核苷酸从核糖体上释放【删等许多方面。 1 3 5 光诱导质子转移 芳香羟基( 酚类化合物) 在基态和激发态时通常具有不同的质子解离常数，受光激 发质子更加容易脱去，激发态时酸性增大，即这一类化合物激发态的p k a * 要小于基态的 p g a 。比如苯酚的p k a 和p 局幸分别是1 0 6 和3 6 ，2 萘酚的分别是9 3 和2 8 。同样的对 于芳香质子受体( 芳胺或芳