（果树学专业论文）CaCllt2gt与热激在低温逆境中对杂柑‘不知火’果实的影响.pdf

摘要 杂柑不知火品质优良，深受消费者喜爱，但由于不知火成熟季节集中在 冬季寒冷的2 3 月，且果实需留树越冬，易受1 2 月至翌年2 月的冬季霜冻影响。本试 验用四川省蒲江县鹤山镇成年柑橘园的不知火为材料，探讨在一5 低温逆境下， 用不同浓度c a c l 。和不同时间的3 8 热激对其进行处理后，对酶活性与热激蛋白的变 化，以及抗冻的效果和机理。在一5 低温逆境胁迫下，实验结果表明： ( 1 ) 1 0m m o l l c a c l ：处理是减小细胞膜透性和丙二醛( m d a ) 含量效果最佳 处理。经9 h3 8 。c 热空气热激处理，是减少细胞膜透性和m d a 含量的最佳处理。c a c l ： 和热激同时使用，减小细胞膜透性效果比单独使用好，其中又以1 0m m o l l c a c l 。+ 热激9 h ，是减少细胞膜透性和m d a 含量最佳处理。 ( 2 ) 可溶性蛋白不随c a c l ：浓度增加而增加，1 0 m m o l l q 时含量最大，5 0 m m o l l 1 含量下降，1 0 0 m m o l l 1 时含量最低。在3 8 c 热激处理后，蛋白质含量也显著高于没有 进行热激的处理。1 0m m o l l c a c l 。+ 热激9 h 对可溶性蛋白含量增加的效果显著高于 其他的处理。 ( 3 ) 1 0 0m m o l l - 1 c a c l ：处理下，可溶性糖含量和超氧化物歧化酶( s o d ) 比活 力显著高于其他的各处理。热激9 h 后可溶性糖含量和s o d 比活力为最大，高于其他的 各处理。1 0 0m m o l l c a c l ：+ 9 h 热激同时使用时可溶性糖含量和s o d 比活力高于其它 处理。 ( 4 ) 过氧化物酶( p o d ) 活性随着c a c l ：浓度增加呈现先升高后降低，再升高趋 势，1 0 0m m o l u 1c a c l ：处理下p o d 活性高于其他的各处理。9 h 热激后p o d 活性都高于 其他的各处理。两种处理同时使用时，1 0 0r m o l l c a c l ：+ 9 h 热激对p o d 活力提高效 果最佳。 ( 5 ) 过氧化氢酶( c a t ) 活性随着c a c l ：浓度增加而先升高再降低，在1 0m m o l l q c a t l 。的处理下是提高c a t 活性的最佳方案。9 h 热激后c a t 活性呈现最大值。1 0m m o l l 。1 c a c l ：+ 9 h 热激处理时c a t 活力最高。 ( 6 ) 不同浓度c a c l 。对诱导热激蛋白( h s p ) 的增加不明显，未能诱导新h s p 产生 和原有h s p 增加；9 h 的热激，虽未能诱导新的h s p 产生，但诱导条带上蛋白质的增加效 果明显，且是四种热激时间内条带颜色最深，诱导蛋白质增加最多的处理；喷旋1 0 0 m m o l l - 1c a c l 。+ 热激9 h 同时处理下，增加原有h s p 的量是最多的，且效果比单独使用 好。 关键词：不知火；冻害；机理；热激 e f f e c t so fc a c l 2a n dh e a ts h o c ko nt h ef r u i to fh y b r i dc i t r u s c u l t i v a r - s h i r a n u it a n g o ri nt h el o w t e m p e r a t u r es t r e s s h u a n gl e i ( p o m o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f l i a om i n g a n a b s tr a c t c u l t i v a r s h i r a n u it a n g o r h a dg o o dq u a li t y ，b u ti tw a sv u l n e r a b l eo f t h ef r o s to nt h ed e c e m b e rt of e b r u a r yb e c a u s ei tm a t u r i t yi nt h ew i n t e r o f t h ec o l ds e a s o no nt h ef e b r u a r yt om a r c ha n dt h ef r u ith a dt oo nt h et r e e s i nw i n t e r i nt h i ss t u d y ，u s e dt h em a t e r i a l si nt h ea d u l tc i t r u so r c h a r d so f t h eh e s h a nt o w np u j i a n gs i c h u a n d i s c u s s i o nt h ev a r i e t yo ft h ee n z y m ea l i v e a n dh s pa sw e l la st h ee f f e c ta n dm e c h a n i s mo ft h er e s i s tf r e e z ea f t e rd e a l w i t ht h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc a c l 2a n dd i f f e r e n tt i m e so ft h e3 8 h e a tt r e a t m e n to nt h ef r u i ti nl o w t e m p e r a t u r e 一5 c i nl o w t e m p e r a t u r e 一5 u n d e rs t r e s s ，t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a t ： ( 1 ) i 0 衄o l l c a c l 2d e a lw i t ht h em e m b r a n ep e r m e a b iii t yo fp e e la n dt h e m d af o rt h el o w e s t ：a f t e r9 ho f3 8 h o ta i r h e a t s h o c kt r e a t m e n t 。t h em e m b r a n e p e r m e a b i1i t yo fs k i na n dt h em d aw e r er e d u c e do fb e s tt r e a t m e n t ；u s e do ft h e c a c l 2a n dh e a ts h o c ka tt h es a m et i m e ，t h ee f f e c tw a sb e t t e rt h a nt r e a t m e n t a l o n e ，w it hi0m m o l l c a c l 2a n dh e a ts h o c k9 h ，r e d u c et h em e m b r a n e p e r m e a b i l i t ya n dt h em d ao ft h eb e s t ( 2 ) d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sc a c l 2o ft h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n th a d i n c r e a s e de f f e c t t h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n th i g h e rt h a nt h eh a n d li n go f w i t h o u tc a c l 2 i n3 8 h e a ts h o c kt r e a t m e n t ，t h ep r o t e i nc o n t e n tw a sa l s o m a r k e dh i g h e rt h a nt h o s ew i t h o u th e a ts h o c ko ft h et r e a t m e n t ：i 0m m o l l c a c l 2 a n dh e a ts h o c k9 ha tt h es a m et i m ei n c r e a s et h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n to f t h ee f f e c to fm a r k e dh i g h e rt h a nt h a to fo t h e rt r e a t m e n t ( 3 ) u n d e rt h et r e a t m e n to ft h e 1 0 0m m o l l1 c a c l 2 ，s o l u b l es u g a rc o n t e n t a n ds o da c t i v i t yw e r em a r k e dh i g h e rt h a no t h e rt r e a t m e n t ：h e a ts h o c ka f t e r9 h s o l u b l es u g a rc o n t e n ta n ds o da c t i v i t yw e r et h el a r g e s t ；1 0 0m m o l 。l c a c l 2 a n d9hh e a ts h o c ka tt h es a m et i m ed e a lw i t ht h ep e e la n dp u l ps o l u b l es u g a r c o n t e n ta n ds o da c t i v i t yh i g h e rt h a nt h a to fo t h e rt r e a t m e n t ( 4 ) p o da c t i v i t yt a k eo na tf i r s ti n c r e a s e dt or e d u c ea n dt h e nt e n d e d t oi n c r e a s ea l o n gw i t hi n c r e a s eo ft h ec o n c e n t r a t i o no fc a c l 2 p o da c t i v i t y t h a no t h e rt r e a t m e n tu n d e rt h e1 0 0m m o l l - c a c l ：a tt h es a m et i m eu s e ，1 0 0 m m o l l c a c l 2a n d9 hh e a ts h o c ko ft h ep o dv i t a li t ye n h a n c eo ft h eb e s tr e s u l t s ( 5 ) c a ta c t i v i t yt a k e do ni n c r e a s e dt or e d u c ea l o n gw i t hi n c r e a s eo ft h e c o n c e n t r a t i o no fc a c l 2 ：9 hh e a ts h o c ka f t e rt h ec a ta c t i v i t ys h o w e dm a x i m u m ： 1 0m m o l l c a c l 2a n d9 hh e a ts h o c ka tt h es a m et i m ed e a lw i t ht h ec a tv i t a l i t y o ft h eh i g h e s t ( 6 ) w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc a c l 2s p r a y i n gf r u i tp r o c e s s i n g i n d u c e db yh s pf o rt h ei n c r e a s ew a sn o tv e r yo b v i o u sc h a n g e s ，f a il e dt oi n d u c e t h en e wf o r m a t i o no fh s p ，a l s of a i l e dt oi n d u c eh s pi n c r e a s ei nt h eo r i g i n a l ： 9 ho fh e a ts h o c k ，a l t h o u g hn o tc a ni n d u c ean e wh s p ，b u te f f e c t i v ew i t ht h e i n d u c t i o no ft h ee f f e c to ft h ei n c r e a s ei np r o t e i na n dw a sa l lt h et i m ei n d u c e d b yh s pi n c r e a s et h em o s t ，t h ed e e p e s tc o l o rb a n d s ；1 0 0m m o l 。l 叫c a c l 2a n dh e a t s ti m u l a t e d9 ha tt h es a m eti m e ，i n c r e a s et h eo r ig i n a la m o u n to fh s pw a st h e l a r g e s t k e yw o r d ：c u l t i v a r s h i r a n u it a n g o r ；f r e e z e ：m e c h a n i s m ；h e a ts h o c k 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：黟蕾 及汐。9 年5 月及日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名：苗蔷 导师签名：缪川沾 0 o o 铲年多月a 够日 厕年月谚日 1 引言 1 1 提出问题 不知火属于芸香科( r u t a c e a e ) ，为柑桔亚科，宽皮桔类。品种原产于日 本，为“清见桔橙中野3 号桠柑的后代。用枳作砧树势较弱，以温州蜜柑作中间 砧高接树势中庸。幼树树姿直立，进入结果期后开张；树体较耐寒，抗病力中等；枝 梢密生，细而短，叶略小，枝梢间或有刺，叶片披针型，翼叶明显；花几乎全为单花， 但也有总状花，有少量花粉，无核果率高，单性结实强，春秋梢为主要结果母枝，以 有叶单花坐果为主；4 月开花，5 月坐果，1 2 月果实开始着色，2 - 3 月完全着色成熟， 单果重2 0 0 3 0 0 9 1 。在宽皮柑桔中属大果形，果实形态较多，初结果树，果蒂部有 凸起呈肩状倒卵形，果顶部有“脐( 实为花柱痕，但有“脐”的果顶不像脐橙那样 凹) 。结果稳定后，多为高扁圆形，果形指数1 1 5 乜1 。果倒卵或扁球形，果实大小整齐， 果梗部似三宝柑，多有突起短颈为其主要特征；果皮黄橙色，稍粗糙，油胞微凸，易 剥皮，具香气，囊壁化渣性好，果汁糖度1 3 1 4 ( 高的可达1 7 - 1 8 ) ，味极甜， 酸l 左右，风味极好，品质优曙卅。 小苗定植或高接换种后，树体生长较快，成花容易，早结丰产，脐橙大树高换第 二年株产可达4 0 一- 8 0 9 ，结果成堆成串，第三年株产1 2 0 3 0 0 9 。生理落果期幼果生长 迅速，着果率高。2 月下旬至3 月上旬萌芽，4 月中旬盛花。果实发育期长，1 0 月上旬 开始着色，1 1 月上旬全部着色，次年元月上旬成熟。正逢水果的淡季上市，果实耐贮 运，采收供应期和货架期长，对丰富市场果品花色、调节市场供应具有积极的作用口1 。 不知火多为有叶单顶花枝结果，结实力强，甚丰产，1 0 1 5 y 生甜橙或温州蜜柑 高换树，第一年恢复树冠，一般第二年株产2 0 2 5 k g ，第3 年3 0 一- 3 5 k g ，高的则达6 0 8 0 k g 。枳砧小苗定植第3 年投产，株产3 5 k g ，5 年生l o 1 5 k g 阻1 果品在市场很受欢迎， 精品果售价一般在8 - 1 0 元k g ，普通包装的优等果售价6 8 元k g ，普通一级果为 4 - 6 元k g ，销售价格为普通脐橙的3 6 倍。每6 6 7 m 2 产果1 2 5 0 1 5 0 0 k g ，毛收入达 0 7 5 万1 0 万元左右，高的产量达2 0 0 0 k g 以上，毛收入则达2 万元左右，效益十分 喜人。 尽管不知火具有多方面的优点，但也存在不少问题，这些问题的存在，制约 着不知火的进步发展。虽然不知火桔橙树体的耐寒性较强，但果实对低温 敏感。据松本亮司报道，它适宜种植在年均温1 6 5 c 以上，在无雪害、霜期短、最低 温度一2 以上的地区是该品种的适宜区，最低气温在一3 c 以上的区域。在栽培不知 火的四川盆地西部地区，年均温和最低温度都要高于这一范围，也很少会遭遇一3 以下的低温，加上近年常出现暖冬，通常意义上的冻害很少发生。但在1 2 月至翌年 2 月的冬季时有霜冻出现，尽管出现的天数不多，在川西一般为l o - - 一2 0 d ，因不知火 的果实要留树越冬，果面容易受霜冻危害，受冻果实通常首先在基部或中部表面组织 显现局部坏死，果皮变软，然后受疫菌褐腐病菌侵染，呈水浸状褐色斑点或斑块，最 后斑点逐渐蔓延扩大至果实脱落。在一些产区，也会遭受到冻害和病害的双重危害， 引起大量落果，造成严重的经济损失。究其根源还是冻害，受害程度视霜冻的程度和 树势强弱而异，轻的损失3 0 - - 4 0 ，重的达7 0 - - - - 8 0 0 o ，甚至绝收删。 现在四川大部分地区采用在低温冻害来临前的1 2 月果实上色后采收，然后经过 贮藏，待酸度降低、糖分增高、风味转好后出售。此法成本虽然较低，但果实品质不 及果实挂树至充分成熟者，因而品质往往难于达到其本身应有的水平。也有采用覆薄 膜和套袋，虽然可保护果实免受霜冻，达到防寒目的，又可防止病虫危害，使果面美 观光洁，改善商品外观，提高果品等级和价格，一举数得，效果良好1 。但劳力投人 大，较费时费事，且果实风味稍逊，且薄膜覆盖后在晴天高温时没有及时通风降温易 使不知火出现浮皮现象口副。不知火在生产上还存在的问题主要有褐腐病n 朝、 裂果、日灼、畸形果多等口“。 1 2 研究内容 研究不同时间的热激处理与不同浓度的c a c l ：相结合的处理对不知火抗低温 逆境效果的影响。抗性效果包括含糖量、v c 含量、伤害率、丙二醛( 如a ) 含量、可 溶性糖、可溶性蛋白含量和可溶性固形物含量等化学指标。 研究不同时间的热激处理与不同浓度的c a c l 。相结合的处理对不知火h s p s 产 生和消长规律的影响。 研究不同时间的热激处理与不同浓度的c a c l ：相结合的处理对不知火在低温 逆境下常见酶的影响。 1 3 研究目的和意义 通过探究不同浓度的c a c l ：处理对不知火果实在低温逆境下的影响，研究不 同浓度的c a c l ：在低温逆境下对不知火果实是否起作用。 通过探究不同时间的热激处理对不知火果实在低温逆境下的影响，研究不同 6 浓度的c a c l 。在低温逆境下对不知火果实是否起作用。 通过探究不同浓度的c a c l 。处理、不同时间的热激处理和不同浓度的c a c l ：+ 不同时 间的热激处理对不知火果实在低温逆境下的影响，研究三种处理方式中，什么处 理方式对不知火果实在低温逆境下所起的作用最佳。 2 文献综述 2 1 c a 2 + 对霜冻害的调节作用 钙不仅是果树生长发育所必需的一种大量元素，更重要的是作为胞外信号和胞内 生理生化反应的第二信使参与果树生长和发育的调控，钙对果实品质的影响远比氮、 磷、钾、镁重要n 射。c a 2 + 作为胞内信使触发许多重要的细胞活动，从而影响植物的生 长发育以及对外界环境的反应与适应n 引。近年来，不少研究表明，c a 2 + 处理可提高果 树的抗逆性。 果树体内钙素形态大致可分为：水溶性钙( 包括游离c a 2 + ，易溶于水的钙盐类) ， 非水溶性钙( 包括草酸钙、果胶酸钙等) n 利。细胞壁上c a 2 + 结合位点多，是细胞最大的 钙库，其浓度可达l 一5 m 0 1 l - i n 8 删，这样的浓度对保护质膜或维持细胞壁结构的完整 性很重要。线粒体、叶绿体、微粒体、液泡和内质网等细胞器均有钙的分布，其钙浓 度也是细胞质的几百倍到上千倍h 钔。草酸钙和大部分磷酸钙主要沉淀于液泡内3 。 2 1 1 c a 2 + 是生物膜的稳定剂，可防止膜脂过氧化，减少膜损伤 植物对温度胁迫的适应主要在于细胞膜，特别是质膜和类囊体膜的特性乜。植物 在遭遇低温胁迫时，细胞内会发生一系列生理、生化和物理特性的变化，使膜的流动 性下降，膜脂发生相变，由原来的无序状态变为有序状态，由液晶态变为凝胶态，膜 脂双分子层中的有些区域变为固相，从膜脂中分离出来，使膜脂的结构发生改变，从 而破坏了结构与功能的统一性锄吨引。冷胁迫不仅使细胞膜脂过氧化，也促进了膜磷脂 的脱酷化反应，使无机磷从膜磷脂中大量游离出来强制。m i n o r s k y 提出，c a 2 + 是生物膜 的稳定剂，在维持细胞膜结构稳定性和功能两方面具有重要作用。钙与细胞壁中的果 胶酸形成果胶酸钙，保护中胶层结构；同时它具有抑制多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 活性的 作用，减少细胞壁的分解。另一方面，c a 2 + 可作为磷脂的磷酸根和蛋白质的梭基间联 结的桥梁，使膜结构更为牢固口5 1 。钙有防止膜损伤和渗漏，稳定膜结构和维持膜的完 整性的作用z 2 e l 。 电解质渗漏率是反应细胞受伤害程度的重要指标。糖的积累与细胞渗透浓度的升 7 高有直接关系，液泡中积累大量糖可增加细胞的保水能力，以增加组织中的非结冰水， 因此，可溶性糖的抗寒作用机理是调节组织渗透势。周玉萍等报道，香蕉幼苗受到 低温影响时，细胞的质膜透性会不同程度的增大，电解质会有不同程度的外渗，以至 于电导率会有不同程度的加大啪1 。欧洲白桦苗期遭受低温胁迫时，细胞膜透性增大， 随着低温胁迫加强，电导率显著增加1 。 l e v i t t 证明，越冬植物无论是草本植物或木本植物，从秋季到冬季的低温锻炼过 程中，细胞内可溶性糖含量增加，到翌年春天解除锻炼时降低驯。康国章等证实c a c l ： 能增加香蕉幼苗叶片可溶性糖积累，减缓叶绿体降解，提高幼苗的抗冷力。但也有研 究发现，可溶性糖的积累并不与植物的抗冷力密切相关m ，推测可溶性糖的积累可能 是植物细胞在冷胁迫下的一种应激反应，c a 2 + 加强了这种应激程度。 在低温胁迫下，2 0 m m o l l - l 的c a c l 2 可减少洋葱鳞茎细胞5 0 的k + 外渗，提高其抗 冻性。加钙处理可减缓低温对细胞质膜的伤害，叶绿体、线粒体仍基本维持原有的形 态和结构阻引。张燕等也证明c a c l ：浸种处理提高了幼苗中结合态钙含量，增强了细胞 膜结构的稳固作用，使冷害烟草幼苗的电解质渗漏率降低，减缓了低温对烟草幼苗细 胞膜的伤害钔。柑橘低温锻炼过程中有c a m 积累，c a 2 + 、c a m 浓度的增加可提高原生质 体的抗冻性射。采后钙处理可以明显减轻油梨、桃等果实低温贮藏的冷害m 1 。 钙是植物生长发育必需营养元素之一，在植物生理活动中，起着结构成分的作用， 也具有酶的辅助因素功能口7 1 。有研究表明冷敏感植物在冷胁迫条件下，细胞中活性氧 的产生加速，而清除活性氧的能力降低，导致活性氧水平的提高啪瑚1 。高水平的活性 氧可能加速了膜脂过氧化和膜蛋白间的聚合，从而破坏膜结构功能一。因此，冷害条 件下活性氧所引起的伤害也是冷害的重要原因之一。另一方面，有研究证明冷驯化提 高了细胞内抗氧化酶活性和内源抗氧剂含量，相应地削弱冷害引起的膜蛋自间的聚合 和膜脂过氧化，提高了植物的抗冷力q 朋。还有便是，植物不同的抗冷力也是与其细 胞内具有不同水平的抗氧化酶活性和内源抗氧剂含量相关的= 4 4 嗡1 ，抗冷植物比冷敏感 植物有更高水平的抗氧化能力。在低温胁迫下，植物体中保护酶活性的强弱直接关系 到抵御低温伤害的能力m 1 。s o d 和p o d 是植物对膜脂过氧化的酶促防御系统中重要的保 护酶。s o d 在细胞保护酶系统中的作用是清除超氧自由基0 ：一，同时产生歧化产物h ：o 。， 避免超氧自由基对膜的伤害。p o d 在保护酶系统中主要是起到酶促降解h 。0 ：的作用，避 免细胞膜的过氧化伤害。因为h ：0 ：的过量积累会导致毒性更大的伽含量增加，进而对 细胞膜产生伤害。m d a 是膜脂过氧化的最终产物。 大量实验h 7 刮证明，c a c l ：浸种处理可以提高低温胁迫下幼苗的s o d 、c a t 和p o d 的活 性，减少m d a 的积累。在苹果上研究发现，钙处理能提高苹果超氧化物歧化酶( s o d ) 的 活性，降低丙二醛( 佃a ) 的含量，从而保护膜结构的完整性呻1 。张建霞等研究表明柑 橘叶片中的s o d 、p o d 、c a t 和m i ) a 的变化与c a c l 。处理的有密切关系。陈立松等研究表 明，钙处理能降低果实中脂过氧化产物丙二醛的含量，提高了超氧化物歧化酶( s o d ) 、 过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽还原酶( g r ) 和抗坏血酸一过氧化物酶 ( a s j ! 卜_ p o d ) 等保护酶的活性，从而抑制膜脂过氧化啼。潘秋红等研究发现，c a 2 + 处理 可减缓水分胁迫引起的芒果s o d 活性和维生素c 含量的下降，增大p o d 活性上升的幅度， 使高峰期提前且下降延缓，从而减轻膜脂过氧化，维持膜的相对稳定性，提高抗性羽。 这些作用能被专一性鳌合剂e g t a 所消弱。而且，幼苗的损伤较轻，细胞膜的修复较快， 说明c a 2 + 可能通过调节低温下幼苗膜保护酶类的活性，而防止膜脂过氧化，维持膜的完 整性。 低温胁迫会引起植物细胞中可溶性蛋白质含量发生变化，并有特异蛋白的产生， 且与植物的抗寒性密切相关璐引。刘慧民等研究说明可溶性蛋白含量的增加与温度变化 有关，模拟环境逐渐寒冷后，可溶性蛋白含量的增加能起到某种抗寒保护作用，以提 高试材抵抗寒冷的能力泓1 。 2 1 2 钙信使可对逆境信号进行接受和传递 钙信使能将环境刺激，如光诱导过程、光合作用、环境胁迫反应、酶活性调节、 细胞分裂与分化以及对植物激素的调节等，转变为化学反应的重要的第二信使畸7 1 。 而c a m 作为c a 2 + 重要的受体，形成c a 2 + - c a m 复合体，激活一系列的靶酶和非酶蛋白质， 从而调控生理代谢和基因表达，它在c z + 信号系统传导中起着关键的作用嘲1 。 钙信使与植物的抗寒性的提高有着密切的关系。正常情况下，液泡和细胞间隙是 植物细胞的钙库。但在低温处理之后，细胞质膜上钙离子沉淀明显增多，细胞质和细 胞核中的钙离子水平增加暗引。若用化学处理阻断钙通道或拮抗c a m 可以明显地抑制首 宿悬浮细胞系的抗冻力的获得。p l i e t h 等也得到了类似的结果，并且证明c a 2 + 对低温 信号的感受与温度降低的速率有关，而与低温的强度无关呦1 。 钙信使系统能调节植物上许多酶的活性哺。胁迫不仅可诱发植物细胞产生钙信 号，还可诱导钙结合蛋白的表达，钙调蛋白( c a m ) 可激活s o d 的活性，从而在活性氧的 清除中起重要作用2 l 。钙调蛋白c a m 也是一种热稳定蛋白，这些蛋白作为渗透保护蛋 白、脱水伤害修补蛋白和抗冻剂，可与变性蛋白结合，维持其可溶状态，从而阻止膜 9 与蛋白的脱水伤害硎。植物细胞中的磷脂酶a ：是一种钙信使系统依赖性的酶，它能催 化细胞膜不饱和脂肪酸的降解，产生大量的自由基，加剧膜脂过氧化，破坏细胞膜。 在柑橘上证明膜脂的磷脂种类和各种磷脂的含量、膜脂脂肪酸不饱和度等与抗寒性有 关，也发现冻害与膜脂的降解有关4 1 。 2 1 3c a 2 + 在抗冻基因表达中的调节作用 c a 2 + 诱导和调节基因表达的例证在日益增加。业已证实，低温引起细胞内c a 2 + 浓度 短暂性增加是诱导抗寒性植物苜蓿、拟南芥和冬小麦冷适应基因表达和抗冻性提高所 必需的溯1 。拟南芥某些受低温调节的基因：如c r t d r e 控制的c o t 6 6 和七i n j 的完全 表达也依赖于这种c a 2 + 水平的增加1 训。简令成等报道，低温等环境因子不仅引起细 胞质c a 2 + 水平的提高，而且可能首先引起细胞c a 2 + 水平的提高，而且可能首先引起细 胞核内c a 2 + 浓度的迅速增加，这也说明- r c a 2 + 与冷反应基因表达的密切关系_ 卜7 2 1 。至于 c a 2 + 进入细胞质后。信号如何传递，目前还知之不多，但综合许多资料，拟可以做出 这样的推论：低温引起c a 2 + 输入，导致细胞内c a 2 + 短暂性升高，从而抑制了蛋白质磷酸 酶2 a 的活性，并同时激活了一些有关的蛋白激酶，使某些蛋白质磷酸化，进而诱导抗 冻基因的表达，植物进入抗寒锻炼，发展各种抗寒特性，提高抗寒力m 1 。 2 2h s p 可提高果树的抗低温逆境能力 热激蛋白( h s p ：h e a ts h o c kp r o t e i n s ) 是1 9 6 2 年r i t o s s a 在研究果蝇唾液腺时 发现的。1 9 7 4 年t i s s e r e s 从热激果蝇幼虫的唾液腺等部位分离到了6 种新的蛋白质， n i h s p 盯钔。1 9 9 2 年h o r w i t z 提出低分子量热激蛋白( s h s p ：s m a l lh s p s ) 是一种分子 伴侣的理论，引。植物h s p s 在8 0 年代初才陆续开始研究，但进展很快，许多植物当给与 予高出正常生长温度5 。c i o c 热激处理时，都能产生h s p s 口 。 就h s p s 的功能而言，大分子量h s p s ( 1 a r g eh s p s ) 主要起结构作用，增强细胞对逆 境的耐受能力：小分子量h s p s 主要起调节作用。热激蛋白有稳定细胞膜结构，保护线 粒体、叶绿体等的功能。热激使植物体内产生具有分子伴侣功能的热激蛋白。分子伴 侣功能即：协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累并协助蛋白质跨膜转移；与未 折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力；维持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折 叠的蛋白质降解；在蛋白质从头折叠及应激条件下能起到稳定多肽链、防止蛋白质失 活的作用。它参与靶蛋白活性和功能调节，却不是靶蛋白的组成部分一引。c o l l i n s 等 首先证实- j h s p 和抗寒性的直接关系。7 9 1 。如马铃薯、甘蓝型油菜、水稻、菠菜等植物 1 0 在冷胁迫时分别可检测到s h s p s 、h s p 9 0 、h s p i1 0 和h s p 7 0 等系列热激蛋白的表达，部 分热激蛋白还与细胞防脱水蛋白存在序列上的相似性，这能减轻冷胁迫对膜的损伤， 减少溶质渗漏，抑制细胞脱水，从而增强了组织的抗冷性。在热激和热激恢复时， 1 5 - 1 8 k d a 的h s p s 在细胞和细胞器之间穿梭，起着分子伴侣作用，具有保护细胞不受逆 境伤害，修复被损伤的蛋白质作用。 冷胁迫可以诱导植物h s p t 0m r n a 和特异蛋白质合成，但也有耐冷性和非耐冷性植 物都有h s p 7 0 的积累的报道呻们。高温热激和化学物质处理可增强冷敏感植物和组织的 耐冷性已有不少报道c o l l i n se ta l 首先证实t h s p s 和耐冷性的直接关系热激 ( 4 0 ，3 h ) 诱导绿豆下胚轴h s p 7 0 、h s p 7 9 从头合成，减轻随后的冷胁迫( 2 5 ) 对膜 的损伤，使溶质渗漏减少，增强了组织的抗冷性在2 5 c 下6 9 d ，热激诱导的耐冷 性消失，同时h s p 7 0 和h s p 7 9 也降至对照( 2 0 ) 水平魄1 。作为一种逆境胁迫蛋白，h s p s 具有交叉保护功能，h s p s 能被许多逆境( 如高温、寒冷、盐渍等) 所诱导，它能够减轻 逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复l u r i ee ta l 阳3 1 认为在不同胁迫蛋白之间必定 存在某种功能上的重叠，也臣p h s p s 具有交叉保护功能，他们认为一种胁迫的产生必定 能增强其对其它胁迫忍受能力m 1 。a d n a ne ta l 呻5 1 的实验证明热激下产生的s l n h s p 能 够减轻番茄冷伤害。 一种逆境可以诱导植物对另一种逆境的抗性，近年来用热处理诱导植物抗冷性的 现象日益受到人们重视，这在生产上，特别是在提高采后果蔬的抗冷性上，具有重要 的应用价值。如油梨在3 7 。c 0 3 8 。c 下处理1 7 h 1 8 h 后，抗冷性显著增强；在3 8 下处 理3 h 、6 h 、1 2 h 以及4 0 。c 处理o 5 h 后，可明显减轻油梨在2 贮藏期间的冷害，并且具 有延迟成熟，延长贮后货架寿命的效果。又如热水处理柑橘嘶1 ，热空气或热水处理葡 萄8 7 1 、草莓矧、李汹3 、桃啪1 、芒果阳1 1 等均可有效地减轻冷害的发生。这些都是由于采 用了热激的方法，使植物体内产生了h s p s ，从而增加了植物了抗冷性。由此可见，热 激蛋白在增强植物耐冷性的研究上，已取得了较好的实际应用效果。 2 3c a 2 + 与h s p 的相互关系 2 3 1c a 2 + - c a m 信号系统对热刺激的反应 c a 2 + 是目前植物细胞中被证实的主要胞内信使，许多环境胁迫如干旱、高盐、低 温、氧化及机械伤害均可引起细胞内游离c a 2 + 浓度的升高。c a m 是植物细胞中c a 2 + 最重 要的多功能受体蛋白，是c a 2 + 参与的信号转导途径中的重要成员。近年来已证实c d + - 2 c a m 信号转导系统在植物对环境刺激的感受、转导、响应过程中起重要作用。许多 环境刺激信号( 如光、风、触摸、冷激和机械刺激) 都能诱导c a m 或c a m 相关基因的表达。 研究表明热激诱导细胞内c a 2 + 浓度增加。植物方面的研究结果也证明了这一点。 k u z n e t s o v 等的研究结果显示：热激在促进甜菜细胞内自由c a 2 + 浓度增加的同时，也 诱导热激蛋白的合成和促进耐热性的获得啪1 。b i y a s e h e v a 等测定到热激能使豌豆叶原 生质体胞质自由c a 2 + 浓度增加4 倍9 副；g o n g 等用能表达水母发光蛋白的转基因烟草为材 料，发现热激时胞质中c a 2 + 水平迅速而短暂地升高。热激既动员质外体中的钙向胞质 中流动又可动员胞内钙库内质网中的钙向胞质中流动嘲。热激在使植物细胞质c a 2 + 浓 度升高的同时，也使细胞中c a m 浓度升高，如热激时玉米幼苗细胞中c a m 蛋白含量明 显增加，并且这种增加是依赖c a 2 + 的旧副。说明，热激时c a m 活性的增加可能不仅是因为 c a 2 + 激活c a m ，而且还由于促进c a m 基因的表达两1 。 2 3 2c a 2 + 及c a m 对热激基因表达的影响 r n a 杂交实验表明3 7 。c 热激诱导小麦幼苗热激基因h s p2 6 和h s p7 0 的表达，1 0 m m o 1 l c a c l ：明显促进了热激诱导的h s p2 6 $ 口h s p7 0 的表达，而5 r e t o o l l _ e g t a 则抑 制它们的表达，异搏定和l a c i 。也抑sj j h s p2 6 的表达。c a m 拮抗剂w 7 和c p z 处理也都降 低了五s p2 6 和h s p7 0 的表达水平。对照实验表明，药物本身并不影响h s p2 6 和h s p7 0 的表达。这些药物在热激时影响热激基因的表达，说明的确是c a 2 + 和c a m 参与热激基因 表达的结果= 9 。此外在非热激( 2 2 。c ) 条件下，外源c a c l ：溶液处理小麦幼苗也能引起 热激基因h s p2 6 表达的明显增加，而m g c l ：处理没有作用，表明c a 2 + 能代替热激诱导 热激基因的表达。 热激引起胞1 勾c a = + 浓度迅速升高( i m i n 之内) ，因此可以认为c a 2 + 可能是启动热激 反应的胞内关键因子嘲1 2 3 3c a m 与h s p 间的相互作用 l u 等阳1 报告，从热激后悬浮培养的烟草细胞e d n a 表达文库中筛选到一个编码与 c a m 结合的h s p 的c d n a ，该c d n a 编码分子量为5 0 k d 的蛋白，用凝胶覆盖技术证明这个 蛋白可与3 5 s 标记的c a m 结合。以玉米为材料，通过体外结合和竞争性酶学实验，证明 了热激蛋白家族中最重要的成员之一，纯化的细胞质h s p 7 0 能与c a m 结合，并且玉米 h s p 7 0 中也有一个非常保守的2 1 个氨基酸组成的c a m 结合序列一州。这种高度的保守性 意味着这一c a m 结合序列可能在完整的h s p 7 0 中具有重要的功能，从而首次在植物中 1 2 证实h s p 7 0 是c a m 的靶蛋白，为进一步研究c a m 调节热激基因表达的方式和途径提供了 重要的线索。h s p 7 0 是h s f 的负调节剂，它能与c a m 结合是研究c a 2 + - c a m 参与热激信号转 导的依据。在以玉米幼苗为材料的h s p 7 0 免疫共沉淀实验中，在非热激、热激及热激 后恢复条件下都检测到了c a m h s p 7 0 复合物的存在，同时表明热激后c a m - h s p 7 0 复合 物含量增加：在c a m 免疫共沉淀实验中，非热激及热激后恢复条件下没检测到实验中， 非热激及热激后恢复条件下没检测到c a m h s p 7 0 复合物，而热激条件下检测到了c a m h s p 7 0 复合物。以上实验表明，在体内c a m 能与h s p 7 0 结合，c a m 影响热激基因表达可 能是通过与h s p 7 0 结合而调节h s f 的活性起作用。 3 材料与方法 3 1 材料 试验在四川省蒲江县鹤山镇成年柑橘园进行，属四川盆地中亚热带湿润气候区， 年平均气温1 6 4 ，年平均日照1 1 2 2 h ，年平均降雨量1 2 8 0 m m ，相对湿度8 4 。近年来 的最低温为2 0 0 8 年一5 。试材选用杂柑品种不知火，生长基本一致，正常结果， 常规管理。选取树冠外围无病虫害，生长健康，长势基本一致的果树1 2 株，进行4 种 处理，重复3 次。 3 2 试验方法 3 2 1 果实处理 于2 0 0 6 年1 2 月连续4 d 的1 5 ：0 0 在晴朗无风时用以下方法处理： a 分别用1 0m m o l l 、5 0 衄0 1 l 一、1 0 0n o l l - i 的c a c l ：( 国产分析纯) 溶液 均匀喷施树体，直至叶片有明显水珠滴落，同时每种处理加l t w e e n - 2 0 。第5 d 剪下 果实，一部份放在一5 低温下，2 4 h 后蒸馏水洗净，待测。另一部份分别在3 8 c 热空 气下0 h ，3 h ，6 h ，9 h 后放入一5 低温下，2 4 h 后蒸馏水洗净，待测。 b 在蒲江采取长势基本一致的果实，分别放在3 8 热空气下0 h ，3 h ，6 h ，9 h 后放 入一5 低温下，2 4 h 后用蒸馏水洗净，待测。 3 2 2 实验室测定 可溶性总糖含量的测定 可溶性总糖含量的测定参照植物生理生化实验技术与原理口叫，取果皮l g 研磨， 匀浆转入l o l 试管，煮l h ，蒸馏水定容在1 0 0m l 容量瓶，过滤后取2m l 过滤液 定容在5 0m l 容量瓶，放置备用测定可溶性糖含量。取果肉2 9 研磨，匀浆转入 1 0 l 试管，煮1 h ，蒸馏水定容在2 0 0m l 容量瓶，过滤后取2m l 过滤液定容在 5 0m l 容量瓶，放置备用测定可溶性糖含量。 电导率和m d a 含量的测定 电导率和m d a 含量的测定参照植物生理实验n 蚴。 可溶性蛋白质含量的测定 可溶性蛋白质含量的测定参照植物生理实验n0 2 1 ，用考马斯亮蓝法测定。取果皮 和果肉各2 9 ，加2m l 蒸馏水研磨，匀浆转入离心管中，用6m l 蒸馏水分次洗研钵， 完全转移至离心管后，放置o 5 1 h 后，在4 0 0 0 r m i n q 离心2 0 m i n ，上清液用蒸馏 1 4 水定容到1 0m l 容量瓶。 吸取果皮提取液0