（应用化学专业论文）生物可降解PEG化喜树碱前药及其衍生物的合成.pdf

生物可降解p e g 化喜树碱前药及衍生物的合成 摘要 通过酯键在喜树碱及其衍生物上羟基位点接入改性基团，制得6 个衍生物， 带羧酸根的衍生物与生物可降解型聚乙二醇反应制各喜树碱及其衍生物的大分 子前药。2 0 位羟基成酯有效的增加了内酯环的稳定性，与大分子偶联使其具有 药物的缓释、控释特点。 ( 一) 、生物可降解型聚乙二醇的制备，设计以短链聚乙二醇为缩聚单体， 与丁二酸酐在4 二甲基氨基吡啶( d m a p ) 催化下于6 0 缩聚，合成出高分子 量、经可降解的酯键连接而成的聚( 丁二酸聚乙二醇酯) 。工艺研究表明：4 二甲氨基吡啶可作为该反应的催化剂，三乙胺和毗啶不适宜作该反应的催化剂； 反应时间控制在3 6 h 为宜；不同分子量的聚乙二醇制备的聚( 丁二酸聚乙二醇 酯) 分子量差别不大，以聚乙二醇( 1 0 k d a ) 为原料时制备的丁二酸聚乙二醇 酯分子量相对较高，达4 2 1x 1 0 4 。体外降解性能研究结果表明：产物在所考察 的o 1 m o l l p h 7 4 的n a 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 缓冲溶液、猪胰脂肪酶和木瓜蛋白酶降 解体系中均有一定程度的降解，且降解速率随产物结构中酯键含量的增加而加 快。 ( 二) 、喜树碱在4 一二甲氨基毗啶和n 一羟基琥珀酰亚胺的催化下，与丁二 酸酐反应，制得喜树碱一丁二酸，产率2 7 4 。反应的溶剂体系和微波条件对喜 树碱丁二酸反应产率的研究表明，由于喜树碱2 0 位羟基会与临近的酯羰基形 成分子内氢键，因此，在低极性溶剂体系中有利于喜树碱2 0 位羟基的酯化反应， 但溶剂极性对产率影响并不是非常弱显；微波条件下研究表明，延长微波反应 时间能提高产率，但4 5 h 后再延长反应时间，产率提高不明显。最终的反应产 率较常规反应也没有明显提高，但是能有效的缩短反应时间，由常规搅拌回流 反应的6 天缩短到微波条件下的5 h 。 喜树碱丁二酸与聚( 丁二酸聚乙二醇酯) 在二环己基碳化二亚胺存在下反 应，制得成生物可降解p e g 化喜树碱前药。 ( 三) 、羟基喜树碱在4 一二甲氨基吡啶和n 一羟基琥珀酰亚胺的催化下，与 丁二酸酐反应，制得双羧酸化羟基喜树碱，产率8 2 4 。此产物与分子量较小 ( 6 k d a ) 的聚乙二醇在二环己基碳化二亚胺存在下反应，从而制得羟基喜树碱 丁二酸聚乙二醇的共聚物。g p c 检测结果显示，此共聚物分子量较原料聚乙 二醇的分子量明显增加。 关键词：喜树碱羟基喜树碱聚乙二醇生物可降解 s y n t h e s eo fb i o d e g r a d a b i ep o l y e t h y l e n e g l y c o l ( p e g ) l i n k - - c a m p t o t h e c i na n dd e r i v a t e s a b s t r a c t t h ep o l y m e rp r o d r u g so fe a m p t o t h e e i na n di t sd e r i v a t ew e r ep r e p a r e du s i n g s u c c i n i ca n h y d r i d ea sal i n k - s p a c ei nt h i sp a p e r t h ee s t e ro f 2 0 一o he n h a n c e st h e s t a b i l i t yo fl a c t o n e ，a n dt h ep r o d u c t i o nh a st h ec h a r a c t e r i s t i co fs l o w r e l e a s ea n d c o n t r o l l e dr e l e a s e a 、p o l y ( p o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ) l i n k e dw i t he s t e rb o n dw a sp r e p a r e df r o m p e ga n ds u c c i n i ca n h y d r i d ew i t h4 d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n ea st h ec a t a l y s ta t6 0 ( 2 t h ee f f e c t so fc a t a l y s t ，r e a c t i o nt i m ea n dm o l e c u l a rw e i g h to fp e go nr e a c t i o n w e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec a t a l y t i ce f f e c to ft r i e t h y l a m i n ea n d p y r i d i n ew a si n s i g n i f i c a n t ，w h i l et h ec a t a l y t i ce f f e c to f4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e w a ss i g n i f i c a n t ；v i s c o s i t y a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t ( 瓦) i n c r e a s e da st i m eg o n ea n d t h ei n c r e a s ev a l u eo f 瓦w a s n ts i g n i f i c a n ta f t e r3 6h ；t h e - _ o ft h ep r o d u c t i o n p r e p a r e df r o mp e gw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw e r ea l l4 0 1 0 4a p p r o x i m a t e l y t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep o l y ( p o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ) w a sd e g r a d a b l ea t p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n p h 、p i gp a n c r e a t i cl i p a s e a n dp a p a i n ，a n dt h a t p o i y ( p o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ) w i t hah i g h e rp o r t i o no fe s t e rb o n ds h o w e d h i g h e rd e g r a d a t i o nr a t e b i o d e g r a d a b l ep o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) - l i n k c a m p t o t h e c i n w a sp r e p a r ef r o m p o l y ( p o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ) a n dc a m p p t o t h e c i n - s u c c i n i ca n h y d r i d ew i t h d i e y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d ea sad e h y d r a t i n ga g e n t 。 b 、c a m p p t o t h e c i n - s u c c i n i ca n h y d r i d ew a sp r e p a e df r o mc a m p t o t h e c i na n d s u c c i n i ca d h y d r i d ew i t h4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n ea st h ec a t a l y s ta t4 0 1 2 ，y i e l d 2 7 4 t h ee f f e c to fs o l v e n to ns y n t h e s i sw a ss t u d i e d 。t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e y i e l dw a sh i g h e ri nt h ep o o rp o l a rs o l v e n t t h es y n t h e s so fc a m p p t o t h e e i n s u c c i n i c a n h y d r i d ew a sp e r f o r m e di nt h em i c r o w a v ec o n d i t i o n t h ey i e l dw a st h eh i g h e s t ， u p t o2 9 1 ，i n5h c 、t h eb i e s t e ro fh y d r o x y c a m p t o t h e c i nw a sp r e p a e df r o mh y d r o x y c a m p t o t h e c i n a n ds u c c i n i ca d h y d r i d ew i t h4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n ea st h ec a t a l y s ta t4 0 y i e l d 8 2 4 t h e h y d r o x y c a m p t o t h e c i n s u c c i n i c a d h y d r i d e p o l y e t h y l e n eg l y c o l t h r e e - b l o c k p o l y m e r w a ss y n t h e s i z e d c a t a l y s t a t4 0 e x a m i n e db yt h e t h r e e - b l o c k p o l y m e rw a sm u c hh i g h e r u s i n g4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e a st h e g p c ，t h e m o l e c u l a r w e i g h t o ft h e k e y w o r d s ：c a m p t o t h e c i n ；h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ；p o l y e t h y l e n e g l y c o l ； b i o d e g r a d a b l e 插图清单 图卜1 喜树碱作用机理2 图卜2 喜树碱构效关系图4 图2 1 碳化二亚胺法反应历程图1 6 图2 2 酰氯法反应历程图1 6 图2 3 产物的高效液相( 反相c ，。柱) 检测图谱2 l 图2 - 4 微波条件下反应时间与产率关系2 1 图2 5 微波条件下产物的高效液相检测图谱( 反应5 h ) 2 2 图2 6 产物的高效液相( 反相c 。柱) 检测图谱2 2 图2 7 产物的1 h - n m r 图谱2 3 图2 - 8 氯甲酸乙酯气谱检测图2 3 图2 9h c p t 酯化产物h p l c 检测图2 5 图2 1 0 已上市3 0 0 0 种药物c l o g p 分布图2 7 图2 - 1 1 已上市3 0 0 0 种药物l o g s 分布图2 7 图2 1 2 已上市3 0 0 0 种药物分子量分布图2 8 图3 1 产物和原料的f t i r 图谱3 3 图3 2 原料( 曲线1 ) 和产物( 曲线2 ) 的g p c 检测图谱3 3 图3 3 反应时间对共聚物分子量的影响3 5 图3 4 产物的粘均分子量( 曲线2 ) 和羟值( 曲线1 ) 随反应时间的变化3 6 图3 5 聚乙二醇与丁二酸酐反应过程3 6 图3 - 6 产物在p h = 7 4 的磷酸盐缓冲液中的降解3 7 图3 7 产物在猪胰脂肪酶溶液中的降解3 7 图3 8 产物在木瓜蛋白酶溶液中的降解3 8 图4 1 产物的高效液相( 反相c 。柱) 检测图谱4 2 图4 2 喜树碱一丁二酸与聚( 丁二酸聚乙二醇酯) 混合物进行的高效液相检测 图 著4 2 图3 3 产物的高效液相( 反相c 。柱) 检测图谱4 7 图3 - 4 产物的高效液相( 凝胶色谱柱) 检测图谱4 8 表格清单 表卜l 部分上市或进入临床的喜树碱衍生物药物5 表2 - 1 实验试剂1 8 表2 - 2 实验仪器1 8 表2 3 溶剂对产率的影响( 反应4 天) 2 1 表2 - 4 氯甲酸乙酯气谱检测结果2 4 表2 - 4o s i r i sp r o p e r t ye x p l o r e r 对1 0 种小分子性质预测结果( r = e t c o ) 2 6 表3 - 1 实验试剂3 0 表3 - 2 实验仪器3 1 表3 3 原料和产物的分子量3 4 表3 - 4 起始聚7 , - - 醇分子量对聚( 丁二酸聚乙二醇酯) 粘均分子量的影响3 5 表4 - 1 实验试剂4 0 表4 - 2 实验仪器4 0 表5 - 1 实验试剂4 4 表5 - 2 实验仪器4 5 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得盒世王些盍堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字： 筝签字日期：p 曰年莎月，歹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金目b 王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权金a b 王、业盔 当! 一可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：唇查 签字日期：御年月r 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翩签名：女州 签字日期5 。岸5 月眵日 电话： 邮编： 致谢 本论文的研究工作是在姚日生教授的悉心指导和帮助下完成的。在近三年的学习 中导师不仅在研究工作上给予谆谆教导和大力支持，还给予了学习和生活上的热心关 怀和帮助，使得我不仅能顺利的完成学业，更受益匪浅，恩师的言传身教让我明白了 科研工作的真谛，也让我明白了做人的道理，想起刚进实验室的惶然无知，两年前的 少不经事，让我感触良多。在此谨向恩师致以最衷心的感谢和最崇高的敬意。 此外，在本课题的完成过程中，邓胜松老师、朱慧霞老师以及徐玉福师兄、贾冬 梅、陶丽等同学给予我的帮助，在此一并表示最衷心的感谢。同时也对我的亲人所给 予的精神、生活和学习上的鼓励、关怀、帮助和支持表示最诚挚的谢意。 感谢答辩委员会委员，感谢他们在百忙之中抽出时间阅读我的论文，并提出宝贵 意见。 也感谢所有关心和帮助过我的同学。 谢谢! 第一章概述 1 1 引言 癌症是一组可影响身体任何部位的1 0 0 多种疾病的通称，是当今世界上危及 人类健康的重大疾病之一。自上世纪4 0 年代将氮芥末( n i r o g e nm u s t a r d s ) 【1 1 作 为第一个用于临床上治疗癌症的药物以来，许多具有不同作用机制的药物相继 问世【2 1 ，喜树碱( c a m p o t h e c i n e ，c p t ) 衍生物、紫杉醇以及维生素甲类化合物 抗癌治疗作用的证实被誉为9 0 年代抗癌药物的三大发现，其中c p t 因其独特的 抗癌机制、广谱的抗癌作用倍受关注，但由于水溶性差等缺点，使其临床上应 用受到限制。 本研究即是针对喜树碱及其衍生物在临床应用上的缺点，进行了小分子及 大分子改性研究，以期得到抗癌活性更高，毒副作用更小的抗肿瘤前药。 1 2 喜树碱简介 1 9 6 6 年w a l l 和w a n i 等人1 3 】首次从喜树中分离得到喜树碱( c p t ， c a m p t o t h e c i n ，( 1 ) ) ，并确定了其结构。喜树碱化学名称为：( s ) 4 - 乙基4 羟 基1 h 吡喃【3 ，4 ，6 ，7 】氮茚【l ，2 卜喹啉3 ，1 4 一( 4 h ，1 2 h ) - 二酮，英文名 为：( s ) - 4 - e t h y l - 4 - h y d r o x y - 1 h - p y r a n o 3 ，4 ，6 ，7 i n d o l i z a n o 1 ，2 b q u i n o l i n e 一3 ，1 4 一 ( 4 h ，1 2 h ) 一d i o n e 。 l o l l lz c p t 是一个依次稠合了喹啉( a b ) 、毗咯烷( c ) 、吡啶酮( d ) 、六元环内酯环( e ) 的 五元稠环生物碱。由于在动物实验中显示出极高的抗肿瘤活性，在1 9 6 9 年美国首次将 喜树碱应用至临床，用于治疗消化道肿瘤、白血病、绒毛膜上皮癌、膀胱癌等肿瘤。 由于c p t 水溶性差，曾一度以钠盐形式( 2 ) 进入临床实验【4 j 1 5 j ，但由于其在治疗过程 中产生了骨髓抑制、呕吐、腹泻和血尿等严重的副作用【6 】，临床实验被迫中断。 1 9 8 5 年，霍普金斯大学的h s i a n g 教授首次发现c p t 是通过抑制拓扑异构酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ， 1 0 1 9 0i ) 发挥抗肿瘤活性的，该酶在d n a 的复制、转录和修复中 发挥了关键作用，而后又发现c p t 的内酯形式是其必备的活性形式1 7 1 ，但在i 期临床 实验中。该药物大多以无活性的羧酸盐形式存在，因此未能观测到预期的抗肿瘤疗效。 对c p t 的独特作用机制以及临床药理学的深入研究，激起了以拓扑异构酶i 为靶点、 c p t 为先导化合物，开发高活性、低毒副作用及水溶性好的m e - t o o 类药物的热潮。 1 2 1 喜树碱抗肿瘤作用机制 h s i a n g 教授的研究揭示t c p t 是通过嵌合抑制d n a 局部拓扑异构酶i 而发挥独特 抗癌作用的。拓扑异构酶具备调控d n a 分子的解旋、松弛、断裂，然后重新闭合，使 d n a 进行翻译、修补、复制等功能，是在细胞周期中维持d n a 的拓扑学结构的关键性 核酶，有t o p oi 和t o p o i i 两种。其中t o p oi 是由6 5 个氨基酸组成的单体蛋白质，分四 个结构区域，分别为n 端域、核心域、连结子区和羧酸端结构域，其中羧酸端结构域 的酪氨酸残基t y r 7 2 3 是关键活性位点。在细胞d n a 的复制初期( s 期) ，t o p oi 首先以 共价键的形式与d n a 形成一个暂时可裂解的复合物( 图1 1 所示s t a g ea ) 嗍，此时d n a 的5 磷酸基与酶的酪氨酸残基t y r 7 2 3 形成酯键从而d n a 产生了一个单链缺口，并且通 过自身成桥状连接这个缺口( s t a g e b ) ，未受损的单链穿过这个缺口，结合于蛋白质内 部的“圆环状”孔中的d n a 结合位点( s t a g ec ) ，通过攻击磷酸- 酪氨酸键的羟基，使d n a 的断端重新连接起来( s t a g ed ) ，重新连接以后，通过一次构象变化，释放d n a ( s t a g e e ) ；2 0 ( s ) - c p t 通过与t o p oi - d n a 形成c p t - t o p oi d n a 的三元复合物( s t a g ec ) ， 使复制叉( r e p l i c a t i o nf o r k ) 不能进行下去，从而导致细胞的死亡。 图1 - 1 喜树碱作用机理 近来研究表明，t o p oi 在多种肿瘤细胞( 尤其是结肠癌、子宫颈癌等) 9 1 1 1 0 1 中过度表达，含量一般是正常细胞的5 倍，而且其活性在s 期肿瘤细胞中大幅度 提高，因此，喜树碱可以通过选择性的抑制拓扑异构酶i 来抑制肿瘤细胞d n a 复制，表达其抗肿瘤活性。 1 2 2喜树碱类衍生物的构效关系 在近5 0 年的研究中，已合成出一大批喜树碱类衍生物，并且建立了比较完 2 整的构效关系，现将这些化合物的构效关系及研究进展总结如下。 1 、a ，b 环的修饰 最早人们对a ，b 环引入取代基进行相关研究，在a 环的9 、1 0 、1 1 、1 2 位和b 环的7 位进行了多种尝试。 a 环与t o p oi 的a s h 7 2 2 侧链有疏水性作用，同时a 环还处于d n a 的易切断 单链的+ l g 和+ 1 脱氧核糖之间，因而位于切断链切口的+ i g 受核糖磷酸骨架的 限制就相对减弱，更能自由地移向d n a 双螺旋以外空间。实验表明在a 环9 ，1 0 位被氨基、硝基、甲氧基等小基团单取代后的活性至少和c p t 相当或者更强； k i n g s b u r g 对a 环l o 位的研究表明该位置不宜有较大基团取代；而对9 位作的一系 列较大基团取代后发现活性无较大差别【l 。对a 环1 l 位取代发现除o h 、o c h 3 、 c n 外活性均下降或消失【1 2 】。后来对7 e t c p t 的a 环修饰发现，1 l 位f 取代后及 其衍生物对k b 和l 1 2 1 0 极强的细胞毒性【i 埘。对1 2 位进行取代均导致了活性严重 降低【”】，一般认为c p t 的1 2 位域酶d n a 有较紧密接触，空间限制极为严格。对 9 1 2 各位点单取代的活性大小通常可得出下列结论9 2 1 0 1 1 1 2 。 双取代通常会降低活性，9 ，1 0 位经双取代后形成5 6 元环后活性很高【1 4 1 ， 把b 环的7 位域a 环的9 位取代合成5 7 元环，并在六元环的2 或3 位作了o 、s 、n 替代，经过体内测试表明六环系统较c p t 的五环系统有更高的活性。用噻吩、 萘环、毗啶替换a 环，活性都没真正获得提高，但有人为了模拟具有强活性的 1 1 f c p t 的电子效应，用吡啶替代a 环合成了1 1 位n c p t 系列衍生物，在对 t o p oi 可裂解复合物的体外测试中发现1 1 位n - c p t 活性两倍于c p t ”】。可见a 环为发挥活性所必须，且电子效应对其活性有一定影响。 7 位是b 环修饰的重点，引入e t 、c 0 0 e t 、c h 2 0 c o r 、c h 0 、c n 基团后活 性均增加，其中以e t 修饰时活性最强【i 副，这可能是e t 提高了药物对脂质双层的 亲和力。b 环n 原子氧化生成氮氧化合物活性降低：s a w a d a 等将c p t 的b 环还原 成四氢c p t 无抗肿瘤活性i l “。 2 、c 环的修饰 对c 环5 位进行y o n 、o c h 3 、o c 4 h 9 、o c o c 6 h 5 等取代，l 1 2 1 0 体内测试活 性下降或完全消失，在5 位引入的基团有可能通过氢键作用或者空间位阻作用影 响d 环的羰基与酶的相互作用【17 1 。但近来研究发现引x n h c h 3 、n h o h 、n h e t 等有抗肿瘤和抗病毒的活性【1 引。 3 、d 环的修饰 d 环的修饰会引起活性的下降或消失，这是由于c p t 的1 2 ，1 4 位碳和b 环的 氮组成的凹槽可能在药物作用时进入酶d n a 复合物内部，与之紧密接触，从而 导致活性下降或消失1 1 吼。 3 4 、e 环的修饰 酶学研究表明闭合内酯是抑n t o p oi 的必须形式，并且2 0 位必须为s 构型， r 构型则无活性，对e 环的研究主要围绕内酯环和2 0 位羟基。在保持环闭合情况 下，用n 、s 替换内酯中的o ，发现体内外均无活性【2 0 屯2 1 。而内酯环扩环成为七 元环后，e 环变为b 羟基内酯环，其亲电性大为下降，从而稳定了内酯环结构 2 3 。2 5 1 。 采用a b i n i t o 方法计算表明，喜树碱分子2 0 位羟基与酯羰基形成了分子内氢 键，使得内酯环易于受溶剂影响而开环【2 6 1 ，而人体血浆蛋白( h s a ) 与开环形 式的喜树碱选择性的结合，使得喜树碱开环形式与闭环形式的平衡向开环形式 偏移，通过对2 0 位羟基成酯修饰生成前药可以有效阻止分子内氢键的形成从而 抑制内酯环水解，在内酯环的边链上引入一些大极性的基团，也可同时提高这 类化合物的水溶性。 综上所述，喜树碱的构效关系可以用图来总结 图1 2 喜树碱构效关系图 活性增加 1 2 3部分已上市或进入临床的喜树碱衍生物 自上世纪8 0 年代后，经过人们的不懈努力，成功研制了一些喜树碱衍生物 药物，并有许多药物相继进入临床研究。 4 表1 - 1 部分上市或进入临床的喜树碱衍生物药物 萼 结构 名称应用范围临床研究 参考 文献 3 4 5 6 7 主要用于卵 呻一盖孰畜嚣蛳翟孑础， l o p o 眦“ 胞肺癌的治准上市 l 27 j 疗 用于治疗结 l r i n o t