（生物化学与分子生物学专业论文）虎纹镇痛肽（hwapi）的药效毒理学研究.pdf

中文擒赛 中文摘要 虎纹镇痛肽- i ( h u w e n aa n a l g e s i cp e p t i d e i ，h w a p i ) ，作茭一 种n 一垂钙离子通遭阻断荆，已有研究表明它具有镇痛活性“1 ，为了迸 一步证蜞它娩镇痛药效，我们建立了不同的动物疼痛模戮，采用硬膜 外给药方式迸行研究，同时对其毒性进行了评价。具体如下： 一、 磺膜於注入虎纹镇痛肽- i ( h w a p - i ) 对大筑燕觉超敏反应妁 影响。采用大鼠蜜蜂毒疼痛模型，硬膜外给药方式，机械刺激测痛法， 以单纯生理盐水传为躺性对照，s n x - i l i 作为浆性对照，观察了给药 厨3 0 分钟时和6 0 分钟时的不同剂量的h w a p - i 的镇痛效应，结果表明 从0 。1 1 1 9 k g 刹爨舞始，黎煮一定戆镇瘸效疲，并存在一定懿歪戆萋效 莱系，根据一系列剂璧组在给药后半小时时的镇痛效果求得给药后3 0 分镑时它穗嚣蚤”舞2 3 瑟g k g 。2 5 g k g s n x - i i 戆镄薅效疲魄簿絮量魏 h w a p i 受强。 二、 硬貘外注入虎纹镇痛获- i ( h w a p - i ) 对犬藏慢悭幸孛经瘸理蒸 的影响。采用大鼠慢性神经瘸理痛模型，硬膜外给药方式，光热辐射 测瘸和杭械刺激测蒹嚣释方法，对不阉索羹昀h w a p l 、s n x i i i 、盏 酸吗啡进行测痛实验，观察给药后3 0 分钟、6 0 分钟、1 2 0 分钟的作用 效果，鳕采表硝h w a f l 能阻断邑建立的大鼠稀经受损膦的热痛遗敏反 成和机械触诱发瘸觉趣敏反应，2 0 p g k g 的h w a p - i 已能明显阻断大鼠 的瘸敏反应，并维持2 个小时以上，4 0 p g k g 的靛酸吗啡只对热痛过 敏产生即对面短暂的阻断效应，且对大鼠的双侧脚均有效，对机械触 诱发痛觉超敏无影响。 三、 皮纹镇瘸驮一i ( h w a p - i ) 的b e a gl e 犬长期毒性实验。皋月 硬膜外给药方武对b e a g l e 犬避行长期毒性实验，采用生埋盐水、低荆 璧、中裁璧、亵粼量、超亵裁量五个鳃。渔大鼠换算残麴憋裁薰，犬 低，中，高，超高( 自设) 荆量分别为：7 4 u g k g ，1 4 8 u g k g ，2 9 7 u g k g ， 及5 9 。3 u g k g 体譬。每鳃6 只动麴，其中3 只毒躲莲续3 个嚣，隧天 主壅塑墨 给蕊l 坎，药蓐恢复嚣周，取血液势处死，取驻器傲各项指标检测； 每组另外的3 只动物连续3 个月，隔必1 次给药，药后2 4 小时内处死， 取盘滚和越器做各项指标捡测( 血液学1 4 顷，血液生化l g 项，病捡 20 项，尿9 项，尿镜检和e c g ) 。检测结聚表明，h w a 卜i3 个月连续 磺貘黪绘药( 共诗给蕊4 0 - 4 4 次) 对b e a g l e 犬芜明显毒剽终麓。 综上所述，h w a p - i 对慢性炎性疼痛及神经病理性疼痛均有一定的 疗效，盈不表巍明显翡毒副镎用。 美健词h w a p - i硬膜外给药 犬羲蜜蜂毒疼痰模穗嚣蚤，。 大鼠慢性神经病理痛模型机械刺激测痛 光热辐射瓣瘸癞觉超敏反应 热痛过敏反成长期毒性熨验 a b s tr a o t h u w o n aa n a l g e s i cp e p t i d e i ( h w a p i ) isan - t y p ec a l e i u mi o n c h a n n e lb l o c k e r 。t h ep r e v i o u sw o r ki no u r1 a bi n d i c a t e dt h a tit h a da n a l g e s i aa c t i v i t y t of u r t h e r i n v e s t i g a t e i t s a i l a l g e s i a e f f e c t w ee s t a b li s h e ds e v e r a ld i f f e r e n tk i n d so fa n i m a lm o d e l s b y a d m i n i s t r a t i o n t h r o u g he p i d u r a ls p a c e a n de v a l u a t e di t s t o x i t y ： i t h es t u d yo ft h ee f f c t so fe p d u r a la d m i n is t r a t i o no fh w a p i o i la l l o d y n i ai nr a t sw i t ht h em o d e lo fb e ev e n o m 。u s i n gt h ev o n f r e yh a i rm e c h a n i c a ls t i m u l a t em e t h o dt oo b s e r v et h ea n a l g e s i a e f f e c t so fd i f f e r e n td o s e so fh w a p - io n3 0m i n u t e s ；6 0m i n u t e s a f t e rt h ea d m i n is t r a t i o n ，w ef o u n dt h a tt h eh w a p - ib l o c k e dt h e e s t a b l is h e dm e c h a n i c a la l l o d y n i af r o mt h ed o s eo f 0 d t g k g i n t h eb e ev e n o mi n j u r e dh i n d p a wi na p l t l sd o s e d e p e n d e n tm a n n e r c o m p a r e d w it ht h e p u r e s a1i n ea n ds n x iii a n df r o mt h e d o s e e f f e c tc u r v ew ef o u n dt h a tt h ee d 5 eo f3 0m i n u t e sa f t e rt h e a d m i n is t r a t i o nis23 9 9 k g ；a n dt h ea n a l g e s i ae f f e c to f2 5 u g k g s n x - i l ! i sb e t t e rt h a nt h es a m ed o s eo f 辩张p 一 。t h er e s n l to ft h i s s t u d y s h o wt h a ta d m i n i s t e r i n g e p d u r a l h w a p ic a n a i l a y t h e r a t sc h r o n i c i n f l a m m a t o r yp a i n d u et ot h es u b c u t a n o u s a d m i n is t r a t i o i lo fb e ev e n o m 1 i 。t h es t u d yo ft h ee f f e c t so fe p d u r a ia d m i n i s t r a t i o no fh u w e n a a n a l g e s i cp e p t i d e i ( h w a p i ) i n t h er a tm o d e lo fc h r o n i c n e u r o p a t h i cp a i n 。t oc o m p a r e a n dc o n t r a s t a n t i n o c i c e p t i v e p r o p e r t i e so fh w a p i ，z i c o n o t i d e ( s n x ii i ) a n dm o r p h i n e ，u s i n g t h e1i g h t r a d i a t e h e a tm e t h o da n dm e c h a n i c a ls t i m u l a t em e t h o d a n d c o m p a ri n gt h ea n a l g e s i ae f f e c t so f3 0m i n u t e s ；6 0 m i n u t e s ；1 2 0 3 一! ! ! ! ! ! ! 丑一 _ _ _ _ - _ _ _ _ w _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - h _ _ - _ _ _ _ _ h _ “- 一一 疆i n u t e sa f t e rt h ea d m i n i s t r a t i o no fd i f f e r e n td o s eo ft h e m 。w e f o u n dt h a tt h eh w a p - ib l o c k e dt h ee s t a b l i s h e dh e a th y p e r a i g e s i a a n dm e c h a n i c a la l l o d y n i ai nt h ei n j u r e dh i n d p a w 。i n j e c t i o no f 2 0 9 9 k gh w a p - ip r o d u c e dl o n g 一1 a s t i n g ( 2 h ) d i s t i n c tb l o c k a d eo f e s t a b l is h e d h e a t h y p e r a l g e s i a a n dm e c h a n i c a l a 1 1 0 d y n i a 。 i n j e c ti o n o f 4 0 t x g k gm o r p h i n ep r e d u c e d i m m e d i a t ea n d s h o r t - i a s t i n gb i o c k a d ee f f e c ta n dh a de f f e c to nb i i a t e r a l 。t h e r e s u l to ft h iss t u d ys h o wt h a ta d m i n is t e r i n ge p d u r a lh w a p ic a l l a l l a yt h er a t sc u f f i n d u c e dn e u r o p a t h i ep a i n 。 m 。t h e l o n g t e r m t o x i c i t ye x p e r i m e n t o fh u w e n a a n a l g e s i c p e p t i d e i ( f 鞯a p 1 ) i nt h eb e a 9 1 ed o g s t h ee x p e r i m e n tisc a r r l e d o u t b ye p d u r a l a d m i n i s t r a t i o no fh u w e n a a n a l g e s i c p e p t i d e i ( h w a p i ) i n t h eb e a g l od o g s ，w h i c ha r ed i v i d e di n5 g r o u p s ：t h ep u r e s a li n e g r o u p ；t h e l o w - d o s e g r o u p ；t h e m i d d l e 。d o s eg r o u p ；t h eh i g h d o s eg r o u pa n dt h eh y p e r h i g h d o s e g r o u p ，t h o s ed o s e sw h i g h a r ec o n v e r s e df r o mt h er a t sd o s e sa r e ： 7 4 0 9 k g ，1 4 8 p g k g ，2 9 7 9 9 k ga n d5 9 3 p g k g ，t h e r ea r e6d o g s i ne a c hg r o u p ，h a l fo ft h e ma r ek i1l e di m m e d i a r e l yt od ob l o o d a n a l y s i sa n dp a t h o l o g i c a lt e s tsa f t e rs t o p p i n ga d m i n is t r a t i o n f o r3m o n t h s a n dt h eo t h e rh a l fo ft h e ma r ek i 11 e dt od ot h e s a m et h i n g sa f t e rs t o p p i n ga d m i n i s t r a t i o nf o ra n o t h e r1 4d a y s ， a n da l lt h er e s u l t ss h o wt h a ta 1 1k i n d so ft is s u s e sa n do r g a n s i nt h eb e a g l ed o g sw h i c ha r ea d m i n is t e r e dh w a p ib ye p d u r a lf o r 3m o n t h sh a v en oe x t i n c t r e x i e i t y s i d er e a c t i o d 。 k e yw o r d a h w a p i ： e p i d u r a l 一s p a c ea d m i n i s t f a t i o n b e ev e n o mm o d e l ： e 珧口； t h er a tm o d e lo fc h r o n i cn e u r o p a t h i cp a i n ； 4 竺! 坐竺! m e c h a n i c a ls t i m u l a t em e t h o d ；1 i g h t r a d i a t e h e a tm e t h o d ； h e a t h y p e r a l g e s i a ； m e c h a n i c a la 11 0 d y n i a ； t h o 1 0 n $ 一t o r mt o x i c i t ye x p e r i m e n t 整二主煎篡童壁堡 第一章前言与综述 疼媾是大多数疾病具有的共同症状，是人类热有而个体差异很大 的一种不愉快的感觉。1 9 9 4 年国际疼痛研究学会( i a s p ) 定义：“疼 瘸是一辨与组织损伤戏潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体 验”按疼痛的部位、性质、起因和时程，可将其分为两大类：生理 性瘫和病理性癌，也可称为“急性瘸”和“慢性癌”。 、疼痛的来源及有关枫理 疼瘸究竟燕怎样产生麴? 经过多年研究，人们已经认识到大量细 的皮肤感觉纤维( 细的有髓a 纤维和无髓c 纤维未梢) 都是伤害性感 受器，其孛丐羧晴感觉湮度、棍械秘化学期激镌多觉垂感受器燕最豢 见的伤害性感受器。研究还袋明，所有感觉神经冗在发育的过程中都 甓要糖缀营养鬻自褰冀宅霾予。根据残熬e 纤维对营养鬻予霉簧魏不 同，可将c 纤维分为两大类：一类神经元是对神经生长因子( n g f ) 敏 感戆嵇害惶惑受器，舅一爽神经元对胶震蠡稳源洼神经营募霞子 ( 0 d n f ) 敏感，称为g d n f 敏感的伤害性感受器。 这蜀类伤害感受器有各蠹不蔺的功能特性g d n f 敏感的伤害感受 器广泛存在a t p 受体p 2 x 3 ，但只有小部分n g f 敏感的伤害感受器表达 p 2 x 3 研究还表确，n g f 敏感性翡伤害感受器多表巍s p ( p 物质) t r k a 照性，投射到背角i 暇和j i 腿外部，在炎糕诱导的痛敏过程中起重要 律用，耗竭外筒n g f 可导致上皮细胞中伤害感受器末梢分支缺失，并 降低其对伤害性刺激的感受性。n g f 还可调节多静受体蛋白和神经递 质的表达和功能，这一作用在维持炎性痛敏中起照要作用。而g d n f 敏感的伤害性感受器则多表现p k c r e t 麓性，分布在蜚角珏层蠹恻， 谯神经损伤诱导的痛敏中起黧要作用。但氍正常情况下，两者似乎并 不参与热和机械傍害憔裁激数传导过程。疑游，g d n f 孝n g f 均霹转止 神经损伤后相成c 纤维的功能改变，并可防止可能诱导痛敏的有髓纤 维对原元髓纤维分布嚣魏再支配。嚣类不麓傍害惶感受器魏发蒜，_ 怼 璺= 苎堕童皇堡垄 开发薪昀镇燕蓊物可畿有重簧律焉“。 相对伤害性感受器而言，对非伤害性刺激反成的初级感觉神经元 稼乏为“菲伤害性感受嚣”。正常生理状态下，伤害经感受器的激活 是痛觉产生的基础，伤害性感受器的传入冲动，经脊髓背角初步整合 传递蓟藏，经高缎中枢加工后，最终产生痛觉。但是，在瘸理状态下， 攮觉产生机理更为复杂。由神经断裂损伤激活中枢系统引起的中枢性 痛和去传入瘸过敏，不依赖伤害性感受器的活动，而是脊髓背角神经 元可塑性变化的结果。害申经损伤和组织炎症引起的疼痛，不仅包括伤 害性感受器的活动，也包括非伤害性感受器的激活机理。 伤害性枣l 激德受损伤的组织释放致痍豹化学物壤，遵过直接和润 接的作用，激活不同的受体使伤害性感受器去极化，产生传入冲动。 蠢外援组织孛，参与激活孝调割穆骞性转入未楼的化学匆细飕霹子可 分为几大类：( 1 ) 组织损伤产物：缓激肽( b k ) 、前列腺索( p g ) 、5 羟恕胺( s 谨霉) 、组织胺、乙黢艟碱( a c h 、a t p 、嚣+ 、曩等；2 ) 感觉 神经末梢释放物：p 物质( s p ) 、降钙素基刚相关肽( c g r p ) 、兴奋性 氨基酸、一氧化氮( n o ) 、彗嚣肤( g a l n ) 、耀囊姨钴素( c c k ) 、垒长 抑索( s o m ) 等；( 3 ) 交感神经释放物：神缀肽y ( n p y ) 、去甲肾上腺 素、花生疆浠酸代谢麓簿；( 4 ) 释经营养霞予( n g f ) ；( 5 ) 血管滚子： n o 、激肽类、胺类等；( 6 ) 免疫细胞产物：囱细胞介素( i l - 1 ，i l - 8 ) 、 辞瘸坏死浚予。( ( t n f 酝) 、阿片肤、激胶类等。这楚亿学信使通过d r g 感觉神经元的3 种不同类型的受体传递化学信号。 在一般生理状态下，有籀密数萤的c 纤维对常规的伤害性刺激不 反应，但谯组织炎症时，可产生强烈的持续性反应。这类感受器被称 之为“寂静( s i l e n t ) 伤害感受器”，或“睡眠( s l e e p i n g ) 伤害感受 器”，或“枫械不敏感传入( m e c h a n i c a l t y n s e n s i t i v ea f f e r e n t ) ”。 这类感受器起着炎症鉴别器的作用。 外周媲织病理状态下可引起几釉不同性壤姆慢性疼攮状态，辨对 伤害性刺激敏感性增强和反应阈值降低的“痛觉过敏”和非痛刺激( 如 第一章前言与蛛迷 轻触) 引起的“触诱发痛”，以及在损伤区域的“自发痛”。炎症性痛 和神经病理性痛都表现出以上几种症候。炎症引起外周非伤害性感受 器的化学解剖表型改变，其轴突向脊髓痛敏神经元生长新芽，发生新 的突触联系，非伤害性传入可触发和加强痛敏神经元的活动，引起疼 痛而异位放电在神经病理性痛的痛觉过敏形成中起重要作用，神经 纤维间的交互兴奋，可能是形成痛觉过敏的另一机理，神经纤维问的 假突触传递导致神经纤维间的直接通信，可使损伤的伤害性传入纤维 与完整的机械感受性传入闻产生交互兴奋n 1 。 = 、疼痛模型的概述 镇痛药常可分为麻醉性镇痛药与解热镇痛药两类。前者以吗啡为 代表，可通过对中枢神经系统中阿片受体的激动作用，缓解锐痛、钝 痛和内脏绞痛；后者以阿司匹林为代表，通过对组织中前列腺素合成 过程的抑制作用，减低神经末梢对致痛物质的敏感性，主要用于解 除炎症性疼痛和其他钝痛应用生物的方法可以对镇痛药进行评价 曲予在动物体上测定疼痛的强度与性质比较困难，人们把动物因伤害 刺激而引起的反应( 逃避或防御反应) 称为“假疼痛反应”，并以抑静j 其 反应的程度作为指示测定镇痛作用的效果。其测定方法按伤害刺激的 种类不同而可分为四大类：热刺激法、电刺激法、压力刺激法和化学 刺激法“。另外在针刺镇痛的基础上建立的新型镇痛模型如坐骨神经 钳夹损伤法和神经源性疼痛模型，也是很有前景的测痛模型 ( 一) 热伤害性刺激法：即用一定的温度来刺激动物躯体的某一体表部 位，使其产生疼痛反应 1 大鼠辐射热刺激法”1 取体重1 0 0 一15 0 9 大鼠，置于特制的大鼠固定筒内，大鼠半身可自 由活动，尾由筒后盖中的小孔处穿出任其自然下垂实验前将辐射热 测痛仪装置安装好，使测痛的鼠尾涂黑部分对准焦点，选择大鼠甩尾 基础病阚为3 秒的为宜，用药前测3 次，取平均值，用药后1 5 分钟测 痛二次，为避免灼伤，如用药后痛阚升高超过基础痛阈的2 0 0 应停 整二兰垫塞妻簦堡一。 止照射，以2 0 0 作为最大僚。光热法还瘕鼻部躐嘴部辐射热测癀， 傻以大鼠热辐射甩尾法最为炎敏，反应恒寇，但由于甩隧反应纯粹是 一种脊髓反射，因此骨髂舰松弛药也会出现阳性结果，成加以注意。 2 小白鼠热板法“ 实验时把选择好的小自鼠赦矗够先如热到5 5 魏金属板上，以甥 腿，舔足，跳跃等作为痛反碰指标。雌性较雄性为常用一般选用反 瘴潜伏期不超过3 0 秒昀小巍鼠毙塞。惩药后小妇魏潜伏期廷长超过 6 0 秒即表示有镇痛作用，应立即取出动物防止烫伤 3 。热烫法 是将小鼠鼠尾漫入5 5 5 8 c 热水中，以其能使鼠尾上举反应延长5 秒教土老力壹藏麓性b e n - b a s s a t e t a l ，1 9 5 9 ) 。也采建寒戒熬太羲， 使鼠尾浸入5 5 的温水中，以反应延长6 秒以上者为阳性( j a n s s e ne t a l ，1 9 6 3 ) 。 4 h a r g r e a v e s 法”，是一种测定神经源性疼摘或炎症存在状态下 静温度敏感柽疼痛，每只小鼠放在猿立的透贸盒子墨，利于蕊寨，测 定前先将动物遣应2 小时，用一束高强度的光束从下方照射足底袭面， 邋遘检测足收缩的反斑潜伏期来裁断疼痛的敏感度 ( 二) 电刺激法：电刺激法的优点是无论弱效或强效药物的镇癍效 应都能测定出来。缺点是随鳃织的阻抗而变而不赫控削并且电刺激 法敏感性不高，其反成的变化与年龄，性别，种族，翔药蓠耀德及其 他多种因素有关 1 。齿髓刺激法 目前公认牙髓神经是对疼痛很敏感的刺激部位，此法适用于狗， 猫，家兔等褰熟，在燕簿扶态下建电锫在动物牙齿上钻一穗，搀电掇 插入齿髓，制成慢性埋藏电极，当电压刺激达到一定程度( 1 0 - 2 0 v ) ， 可见毒因疼瘾出现妁噻嚼运动与摇头等反应，持续约2 爹。耋熬续提 高电压至2 0 3 0 v ，可刺激狗抬高鼻子，头前伸的运动反威，持续2 - 3 秒。些3 0 一4 0 v 裁激靖，裂袁搿彝逐速寝上箍及转离霰| 近等典壁魏反 整二主煎点童簦鎏 应。测定耀药前一小时半的闽值，给药后褥测定一小时半的周值，以 观察阈反应所升高的电压为镇痛药的效戚应用此法实验前需训练 4 5 周，一般农5 v 电压肉即可测得阏值，本法能测定药物利用的强度 及持续时间 2 。小自魏尾刺激法 选体重1 8 - 2 2 9 的小白鼠，装谯小鼠固定筒内，使之不能自由活 动露是露予羚霹，援7 5 强滔糖擦去尾上皮勰，待瀵穗挥发髫，在尾上 均匀涂上一薄屠的导电胶，用方波脉冲电流刺激，刺激参数为：电压 3 一寒v ，凝率6 0 次秒，每次劓激1 2 5 抄，给药蔺毙测定每只动麴楚 痛阈，连续三次( 每次间隔5 分钟) ，若其中两次刺激引起嘶- 1 的可选 髂受实验楚，给药髫，每骣3 分蛰篷上述滏度重复朝激小羲，届连续 刺激两次不嘶叫者表示药物宿镇痛作用 ( 三) 瓿械刺激法 1 大白鼠飚尖部臌痛法”1 逶鬻选蘑敏感性较离的懑尖璜1 3 处，对鬣龄3 - 6 淄魏太藐一觳 转需用4 0 0 5 0 0 m m h g 压力，较大的大白鼠则往往加压至6 0 0 - 8 0 0 m m h g ， 激产生嘶- q 律为痛阈实验时连澜两次作为对照值给药后每3 0 分钟 蒙测痛闽一次，共三次计算痛阚提高酉分率以比较镇痛强度。 2 小白鬣麾根部加压法 一般选用雄性，将其置于金属随上( 便于其撅爪) ，以手指提起尾 部，熊詹用具有5 0 0 9 压力的动脉钳将含有部分肛门黏膜的尾根部夹 往。动脒钳夹往尾根部2 秒钵内，小鼠会姆扭夹转向尾部，引起咬钳 反应，印为正常反应。当确定此反成发生詹，对动物给药啵下注射、 黢腔注射或搿联) ，然螽，每瞩1 5 秒夹住惩粳一次，观察至其产生咬 钳反应为止。如果夹上钳子之后，2 - 6 秒出现上述行为者为部分镇痛， 澎1 5 秒以上来出理上述纛毙者荛宠全镇瘸终麓。夹钳对闽不嶷超过 1 5 秒，以防损伤其组织。采用此法可测定各种麻醉性镇痛药和氨基比 抟魏终蔑强度。 苎二! 蔓点童墼一 ( 四) 化学刺激法 将海性物质注入腹腔，直接激活伤害性感受器弓i 起内脏( 如隔膜下 蚋器官) 和发下组织，许多物质如醮酸，乙酰胆碱，磷酸三腺棼，缓激 肽，高渗盐水，硫酸镁，苯醌都能产生特异性扭体反应例如醋酸扭 体法，楚最学见妁化学致炎模型柳。0 。6 冰醛酸溶液腹腔给莼，l o m l k g 的剂量，5 分钟后可使动物产生炎症，持续时间大约为3 0 分钟， 爨起深部魏太疆积较持久的疼蒸蒯激，使，l 氯产生拯体反应。要羚 m g s o ，由于其抗炎镇痛影响的缺乏，腹腔前列腺代谢的缺乏，g y i r o s 和t o r m a 建议，m g s o 。露律为急性摄，尊炎憔癍，肄依赖蔺列艨戆伤害 性的镇痛模型，而且注射m g s o 后即发生扭体反应 角叉菜胶i 主射可袭炎症，产生赫敏感，许多翡显戆客发蔫，注射 詹3 - 5 小时有明显的峰出现，但这种影响呵被非类固醇抗炎药，阿片 类耪震爨翻转。角叉蒹靛在垒理釜永中藩趣声渡使其悬浮，2 的浓度， 皮下注射2 0 u l 入右足跗趾闵2 7 号针用h a f g r e a v e s 的测定方法测两 镧薤的疆敏，持续3 。5 至4 5 小时之久。 福尔马林模型：最初是1 9 6 7 年由d u b u i s o na n dd e n n is 所建立 秘，g o 年代t a k a h a s h i i ，h u n s k a a r ，m u r r a y 等“改迸胤在小鼠上， 3 7 ( w w ) 福尔马林溶液皮下注射詹肢脚掌福尔马林注射产生两捆 葳应，第一相为急性疼痛，第二相为炎症慢性疼痛，中间被一个没有 职显疼瘸行为的榴对静止的对期所鼹酝。毒囊叉蒜胶致炎模型不疑， 祸尔马林致痛模型的疼痛行为是自发的，而角叉袋胶致炎模型对温度 和规械索l 激的敏感增加稷尔岛转致炎模型妁褒显饶势是崔( 单一毒性 物质注入同一个体可阿时产出包括急性和慢性疼痛，同样我们可以同 时测定薄糖不麓戆揍害懂感受) 囊一个个体上丐测定嚣释疼癔，虽然不 能说两种疼痛反应间或许有些微的联系，倪我们依然可作为独擞的疼 燕模型。实验前先将小蔑效在透臻妁金子墨逶应3 分钟，在后陂足趾 皮下注射5 福尔马林2 5 u l ( 5 0 u l 注射器，3 0 号针) 注射后放回盒子， 立翠璃察，记录每鬻5 分锋翡漪阍内簿舔，咬等茨应，舞记录一个小 第一章穗弯每蟪避 时。利用舔咬的时问可作曲线图。 舞羚翥辞燕子发下透入致瘾潦“”+ 采惩终2 k g 褥家竞瑷布亮戆穗， 在清醒条件下，罔蛊流钾离子测瘸仪皮下透入k + 以萼l 怒疼瘸刺激电 援莛一个蛊轻建i c m 的澄黟铜鬻，其疼褰毅德彝戴诧舒溶液浸澄静棉 球，经常保持漫澜状态，选择兔左羲肢中段为刺激部位，将刺激电掇 与发获接皴，并如淡鏊定，无关穰辍为2 。5 3 5 c m 魏薄铜片，垫汉浸 涅数理盐承的纱臻，笼子兔右测太腿中下段处，暹翘露，以萼| 起察兔 缭越酶毫流稚律为瘸阗 缓激黢动辣波敲法嘲：动辣蠹逆行注入缓激默，傻动躲产生一蛰 症状，称为簸情感反应( p s e u d o a f f e c t i o nr e a c t i o n ) 表现有嘶叫， 艘傣屡装。爨体方法是：采麓2 5 0 - 3 0 0 9 雄经大盘羲，藤簿嚣分巍一捷 右颈动脉，适心端用动脉夹隘止血液流动，将灌宥肝索生理盐水的塑 料警跌联动脉囊心驻方尚瑟入，瑟藐霹定，皴嚣动脉夹，爨瓣管焚一 端邋遗皮下至肩羽骨附遥穿过发肤，引到体外，缝合创口，掩塑料管 镥菲醉完全恢复后，扶嚣警蠢注入溶予垒堙攘泰蟓缓激获( 2 u g m 1 ) ， 可使太由鼠产生右前肢插曲；头部向右回转及活动亢进，持续1 0 一3 0 秽，如量个症状中癌掰全被辩裁攀认麓寒镇攘效暴。冕一麓攀戆方法 是腹腔理管注射 ( 蠢) 糖缝病理性疼壤横墼： 狰缝瘸理性疼痛( n e u r o p a t h i c p a i 娃或n e u r o g e n i c p a i n ) 是揩审抠 蠛外周潍经系统攘揍或痰病孽；怒鳃疼瘸综合症，激蠹发性露病 ( s p o n t a n e o u sp a i n ) ，瘸觉过敏( h y p e r a g e s i a ) ，癌觉趣敏辘t l d y n i a ) 蔻特征“”。是疼瘸研究瓣蓠言谦题。神经瘸毽幢疼瘸分为s 淞( 突感维 持性疼藏) 謦骝s i p ( 鼍# 交感依赖性疼瘸) 辩大嶷。外斌神经摄铸嚣，交感 静缀带瑟纤维离d r g 巍发茅；与感觉神经菇发垒耩联，蔽及感觉神经 膜上。受依妁可塑性变纯，可能是s m p 影戏帮唯一媳规裁之一。辩缝 瘸理性疼瘸模燮包括神经损穗摸型，糖尿瘸模整及中枢种鬣损伤模型 l l ，! 蘩一毒燕露与综述 ( 1 ) 神经损伤模型可分为五大类型： 8 糖经瘗模型“”：揍睽大蔑鬃管糖经影成神经瘩，戈使活足竞 套去除神经支配，往往也同时切断隐神经。该模烈有助于探明究全支 糖经支戴君戆感觉异鬻撬翎，整不能找表淹庆上紫见翡大多数病理扶 况，且也未表现出人类常见的痛觉异常症状，尤其是自发痛有各种前 觉过敏表现。 b 部分神经损伤横型( p n l ) ：分离坐骨神经部分纡维( 1 2 1 3 ) t 并紧密翁扎，簿致部分基蠛去传入。术后逐速产壅窨发幢痛症状及感 觉异常，知机械感觉过敏，热及机械痛过敏等，井可持续数月，但不 囊现塞曦现象。有时损伤对侧也可密现类似现象“”。 c 背根节慢性压迫模型( c c d ) “”：麻醉下暴露大鼠l 5 乳头突和 横突，将一个直径0 。6 m m 昀探钳插入l 5 椎闻毳约4 m m ，籀探针触及背 根节引起同侧下肢肌肉微动，抽出探针将c 型不锈钢丝( 4 m m 长，直 径o 5 - 0 8 m m ) 沿探针方向捅入，维持对背根节的压迫。术后2 天邵 可出现盎发癔和痛觉过敏。 d 低温神经损伤模型“”：冷冻( - 6 04 c ) 坐骨神经造成神经病 理癔。神冷冻术在临床上可燃子治疗外函糖经癌，有趣穗是，正紫丈 鼠坐骨神经局部经- 6 0 c 冷冻后，几乎均出现神经病理痛症状，自噬率 爨现较齑，并偿衰规械感觉过敏，傻对伤寒性冷、热剡激无瘸避敏鬓 象。 e 。蠖性莲遗犍臻傍( c c i ) 摸登1 1 9 1 i l o l泼铬翻羊肠缀器凌轻废鳍 扎坐骨神经干造成的神经病理痛模型，c c i 术后第2 天即出现时热痛 遘敏等燕觉异常，第2 - 4 周达离峰，可持续4 - 1 0 簏“，随后逐步缓解。 这种模型能模拟人类几乎所有神经病理痛癍状，如痛觉过敏，触诱发 瘸及瘩发痛行为等，戮而是应用最广的慢性瘸模耀。 我们在造模过程发现，不仅在大鼠的受损脚产生病觉异常行为， 其对侧脚也出现不嗣程度的痛觉异常行为，如痛觉过敏和触诱发痛过 敏，一种带有倾向性的观点认为“2 1 ，一侧肢体损伤或发炎时，对铡 1 楚= 童堕壹皇竺笙一 缝健康肢体出瓣屡甄反彦毒易化彝缩腱潜伏期缩短，| 冀及瘸耀下黪，甚 黧肿胀等变化，并称之为对侧扩散( c o n t r a l a t e r a ls p r e a d ) 或交叉 燕凳过敏c r o s s e dh y p e r a l g e s i a ) 。有人也黎之为中枢癔过敏“。 ( 2 ) 糖尿病痛模型“”“6 1 译多糖暴瘸入有瘸过敏。应翔镰佐墨( s t r e p t o z o c i n ) 诱导大蔑 糖尿病或自发糖尿病大鼠研究痛觉的改变。 ( 3 ) 串粒损伤燕模整“7 1 激光照射脊髓产生缺血性损伤的模型，动物嫩现持续几天的急性 触诱发蔫，在鸯垫动物产生1 - 6 震翡慢性舷诱发癔。一 曼、国内外有关多肽类镇痛药的研究 多肽类镇瘸药有肉源性翻外源悭药物两类。内源性镇痛药奎要是 阿片肽类药物，而外源性药物则来源于其它各种生物，包括真菌。下 丽将跌两个方鬣分剐讲述。 内源性镇瘸药的研究自t 9 7 5 年发现脑啡肽以来，已发现2 0 凡秘 内源性阿片肤o “。其中最主要的有三种，分别是脑啡肽( e n k a p h a l i n ) 、 内啡肤( e n d o r p h i n ) 和强啡肽( d y n o r p h i n ) 。齄啡默有甲堍氨酸照啡默 ( m e k ) 和亮氨酸脑啡肽( l e k ) 两种：强啡肽有强啡肽a 和强啡肽b 两种： 甏一内啦驶是讶宠褥最为充分戆内啡肤。嬲片豉农体内体建肉源性瓤 基会与相应的受体结合从而产生镇痛作用。 癸嚣性多姨类镇蒺药攮在洼庆土宥更广泛嚣研究。溪蠹最葶舞爱 应用神经毒素作为镇痛药的是广州中山医科大学的药理工作者，他们 将疆镜豌毒壹按稀释，灭菌，剃蔑眼镜蛇毒注射液，用于治疗矗管耱 经性头痛，三叉神经痛，坐骨神经痛，晚期癌症疼痛，慢性关节痛及 各种慢幢瘸，沟宥良好的镇瘸藏果8 ”。 国内研究得最为深入的要数东亚钳蝎毒。全蝎是钳蝎科昆虫东亚 箭蜗的干溱虫体，1 9 8 6 年萧熬报道以全竭虫入药，临床上治疗必痛， 风湿痹痛等痛症有显著的疗效”。蝎毒( s c o r p i o nv e n o m ) 是由全竭尾 部薅臁分泌酶蛋白质毒素，1 9 8 9 年划崇明等首次报道用醋酸扛体法 辐射热甩慝法、蕺热板法等动糨模型充分证嗡蜗毒糨毒对躯体瘸，内 脏瘸有较臻酌抑铺作用”“。不久他稍又发现蜗毒素 一i l l ( t i t y u t o x i n i i i ，t t 一1 t 1 ) 兵有沌租毒瑟强的镇痛作丽。小鬣竞 热惑尾法实验结采示t t - i i i 限4 2 4 m g k g i v ) 使瘸阈提高四倍。荆 耀小蔑扭体实验表明t t - i i i的镇痛作用较粗毒强三倍1 9 9 6 年河南 医科大学王永奎等用柱层析法将蝎粗鸯分离为多个蚕自组分，经大鼠 侧脑室注射筛选，结果初步确定了蜗毒一i v ( s c o r p i o n v e n o m c o m p o t e n t si v ，s v c - i v ) 具有中枢镇痛作用”。 作为临床应用的前掇，几乎同时河南医科大学的王成裕对蜗毒对， 神经系统的作用进行了实验，观察了s v c - i v 对轻度结扎大鼠坐骨神经 所产尘的神经损伤的影响，发现s v c - i v 能促进外周神鳋损伤的康复， 并证明了s v c - i v 对神经损伤康复灼促进作用是由于其娆改善穿卓经损 伤局部粗、细考申经纤维的形态和功熊”。他们着力予开发一种# 4 蝎毒 镇攥町( s c o r p i o nv e n o ma n t i d y n et ir l t u r e ，s v a t ) 戆药。 嚣在国外研究锝最为深入的要数一芋螺毒素- c o n o t o x i n s ， - c t x ) ，它在钙离子遥递的研究中起极为霪簧麓作鬟。其中从一种海 巾食鱼螺魔术家芋螺中分离出来的m v i i a 是一种2 5 ( c k g k g a k c s 襄糯￥蚤e e 羊g s 镰s 漯e ) 胶，它属于可逆结合的 一鍪窀压敏感登钙离子通 遵隘断韵。黼i i - a 灼溶液结构已厢二维n m r 溯定，有三对二硫键。蛐5 当发巍了- c t x 的镇痛作用，但并末开发成临床药物时，人们就 开始了对已无药可医的病入避行实验，发现芋螺毒用于治疗顽固性疼 痛具有特效，且不成瘾。据报道美函n e u r e x 公司在1 9 9 6 年已进行了 3 0 0 倒临床实骏，病人均是目前所有镇痛药无效者。将m v i i a 直接注 入到病人的脊髓，能有效地阻止那里的神经继续传递痛感，由于m v i i a 是直接作用于c a 通道，而不需要第二信使或g 蛋白，因此不成瘛 m v i i a 在经过许多次的实验后证明具有明显的镇痛作用，大量合 成并进入临床研究取名为s n x - 1 1 1 ，1 9 9 6 年s s c o t t等报道了 s n x 一1 1 1 作为一种n 一型电压敏感型钙通道阻断剂对大鼠医梗尔冀捧注 繁一章蓠蠢与缘逮 射而弓 起的第一棚急性瘸和第二拥持续性疼痛均有趣好妁镇蒸效皋。 1 9 9 7 年d a w n m c g u i r e 譬壤遭s n x 一 i l 是豢广泛戆貉凑用途，龟括缔铺 伤害性疼痛，神经性疼痛并对局郏缺敷引起蟪艟损傍有抟经保护髂周。 1 9 9 7 年d a w n 滋磷究s n x - 1 1 1 佟建第一释 l 一攘电蹑敏感爨神经镯遗遭 限断剜进入临床使用为掰的，释一次诚实了s ，s c o t 戢s n x - 1 1 i 扮裁 壤零舄拣零l 起戆急缝攥静持续犍疼薅豌鐾论，共律簏氇毙嗨唏强。而 且逃一步研究袭明它对翅部齄檄馋媳神经元具蠢保护捧爆船“。 多骏爽镇瘸药懿研究正在遂步深入，箕镇痛藏采与喝啡褶沌浙其 蠢的显著憾、独酶性葶豁不成痣性等姆淼，为黢藤提供了广阚浆雇耀蒋 爨。 翻、额药的瞄藤髓弹债洲 一“ 临床綮评徐的主簧任务楚发现薪麴和评选新药发现新药昀冀作 包括药燕戆黼备秽韧筛。译选辩药姆王俸在筠理和毒理学方羲，毽括 骛效研究、药代动力学研究及毒理掌研究。通过婚床前的评选要确定 一个斯健舍辏是否避入试验戆条律。这蹬彀王终酶簸君煞瑰黟式蔻完 成金都申报临床试验所需的资料。 荽囊学 p 蠢8 f n a e 。d y 稚嚣氆le s ) 1 、特殊药效学遁过该项研究，确定新药予期用于临床防、诊、 涤嚣姥匏骜效，楚一留王髂戆基旗，疾病不麓，译徐方法备异。逶遘 评价明确受试化龠物的 宦用强度和特点，与老楚相比霭竹么侥缺点， 跃游决定莛器奏避一步系统 孚徐褥徐 璧。鑫译徐特殊薄效的箍懿，如 果w 能还鹿阕明特殊药效的作月部位釉机理，圈冀律月巍测静研觉是 药藏研究翡补兖，对译贽一个薪药麓徐僮巍是稷有意义的。 2 、一般药效学，这部分工律妁瓣的是发现药麴对瓿傣瘸烈秘不 裂麓律建，楚研巍药魏在宅子鹚孀子瓣床以外的广泛药理作用。鄄在 各主簧器富系统遴行研究，如对运毒、一般行为，；囊管、蹲爱、潍 经豢统及药耪相蕊依霜等方面酌研究。该项工作在新药研制的发展过 程申也矮毒鬟簧雄髑。毽嚣里基组织t 9 7 5 事翩定酶“薪药译徐蟪籀萼 篁= 兰煎童童堡鋈一 一 原则”的技术报告中指出“当发巍一种亿合物有菜种药理活性对，瘟 进行广泛的动物药理学实验，以测定其可能有的其他药理活性”。“斑 在机体的主要器官系统上避行研究，以揭示药物的其他效应可能的不 良反应，哪种组织成特别作形态学研究”。英国制药工业协会1 9 7 7 年 制定的“新药临床前试验的指导原则”也明确规定，新药在人体试用 前，“应在多种哺乳动物身上研究其主要器官系统的药理作用”我潜 1 9 8 5 年颁布昀新药审批办法) ) 附件五新药药理、毒理研究的技术 要求中也要求对新药进行一般药理研究。观察药物对神经系统、心 血官系统和呼吸系统的作用。由此可见，一般药效学研究是临床前药 效评价中不可缺少的内容之一。 ( 一) 药代动力学( p h a r n a c o k i n e t i c s ) 从广义上来讲药代动力学是指机体处疆药物的全过程。在药物 与机体的捆受作用中着重硪究药物及其代谢物在体内转变化过程。速 方嚣的资料砖予估计药效和毒性大煮好处。药代动力学的研究成果对 撵导薪药设计、磅究药物结构活性关系、侥选给药方案、改进药物剂 型、提供高教、速效、长效低毒的药物及给药方案，以及加深对药耪 耀歪髂蔫及机理辅认识等方蟊发挥重要的作蔗。我函新药审箍办法洚 中，对新药稿床翁药理评价时的药代动力学研究也作了比较喇确的规 定。要求徽吸收、分布和擗澄的研究。对动物的选择、剂董的要求， 分布试验的器官组织、藏射性标记化合物的纯度、血浆蛋白结合试验 及药代动力学所要求提供的基本参数等都散了规定。 ( 三) 临床前毒理学( p r e - c l i n l i c a tt o x i c 0 1 0 9 y ) 没有一种物质谯任何条件下都是无害的。汪百年前p a r a c e l s a s 就指出“万物皆毒，毒物与药物的唯一区别是剂量”。凡经动物实验确 认对某些疾病的实验治疗确有良好疗效的药物，特别是与巳知药相比