（应用化学专业论文）烟叶中重要化合物测定方法的研究.pdf

硕十论文 烟叶中重要化合物测定方法的研究 摘要 研究烟叶的化学成分与卷烟的风格特征之间的关系，能够指导中式卷烟的生产，提 高中式卷烟的国际竞争力。本论文以烟叶为研究对象，对其中的重要成分水溶性糖类化 合物、类胡萝卜素化合物、西柏烷类化合物的测定方法进行了研究，主要工作如下： 1 高效液相色谱一蒸发光散射检测器测定烟叶中的水溶性糖类化合物，包括葡萄糖、 果糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖等。用水溶液超声萃取烟样，然后用固相萃取小柱进行 预分离。以w a t e r sc a r b o h y d r a t e 色谱柱为固定相，乙腈、纯水+ o 1 的氨水为流动相进 行等度洗脱分离，对目标化合物进行了线性回归，并进行了精密度试验，回收率试验。 该方法用于测定烟叶中的水溶性糖类化合物得到了良好的结果，适合在卷烟企业技术中 心部门推广应用。 2 高效液相色谱紫外检测器测定烟叶中的类胡萝卜素。烟叶中类胡萝卜素物质的 主要成分为d 胡萝卜素和叶黄素，类胡萝卜素是影响烤烟香气品质和可用性的主要成分 之一，特别是在成熟和调制过程中，类胡萝卜素含量的变化将直接影响烤烟的色泽和香 气风格。以调制后烤烟为材料，对烟叶样品中的类胡萝卜素提取分离，采用高效液相色 谱法，以苏丹i 做为内标，在4 5 0 n m 波长进行紫外检测，建立了对烟叶中类胡萝卜素 测定的方法，重现性好，分析速度快，适合批量样品的分析检测。 3 高效液相色谱紫外检测器测定烟草中西柏烷类化合物。西柏烷类化合物是烤烟 中重要的香味物质，a 和d 一2 ，7 ，1 1 西柏烷三烯4 ，6 二醇( a c b d 和p - c b d ) 是烟草表 面化合物中主要的类西柏烷二萜，也是烟草表面其它类西柏烷二萜形成的主要前体物， 广泛存在于各种烟草品种的烟叶表面。本文建立的高效液相色谱方法一紫外检测器检测 烟叶中西柏烷类化合物的方法，确定了以2 0 r 人参皂苷r h 2 为内标，在2 1 0 n m 波长进 行紫外检测，用内标法相对定量，定量结果显示，在烟叶中两种西柏烷萜烯醇化合物的 含量比例为2 3 6 。 关键词：高效液相色谱法，烟叶，水溶性糖类化合物，类胡萝卜素化合物，西柏烷类 化合物 硕一1 二学位 烟叶中重要化含物测定方法的研究 a b s t r a c t i ti si m p o r t a n tt h a ta n a l y s i so ft h ec o m p o n e n t si nt o b a c c ol e a f , e s p e c i a l l yt h ef l a v o ra n d a r o m ac o m p o u n d s ，s u c ha ss o l u b l ec a r b o h y d r a t e s ，c a r o t e n o i d s ，c e m b r a n o i dd i t e r p e n e sa n ds o o n a sat o o l ，a n a l y t i c a lc h e m i s t r yp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h es t u d yo ft o b a c c ol e a fa n d s m o k e i nt h i st h e s i s ，t h r e ek i n do fi m p o r t a n tc o m p o u n d si nt o b a c c ol e a f , i n c l u d es o l u b l e c a r b o h y d r a t e s ，c a r o t e n o i d s ，c e m b r a n o i dd i t e r p e n e s ，w e r es t u d i e d 1 ah i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o dw i t he v a p o r a t i v el i g h ts c a t t e r i n g d e t e c t o r ( e l s d ) w a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs o l u b l ec a r b o h y d r a t e si nt o b a c c o l e a f , s u c ha sr h a m n o s e ，x y l o s e ，a r o b i n o s e ，f r u c t o s e ，m n n o s e ，g l u c o s e ，s u c r o s ea n dm a l t o s e t h es o l u b l ec a r b o h y d r a t e si nt o b a c c ol e a fw e r es e p a r a t e db ys o l i d ep h a s ee x t r a c t i o nw i t h s e p - p a k c l sc a r t r i d g e t h e s ec a r b o h y d r a t e sw e r es e p a r a t e do nc a r b o h y d r a t ec o l u m n ( w a t e r s c a r b o h y d r a t e ，2 5 0i n n lx 4 6a i mi d ，4 1 x m ) u s i n ga nv ( a c e t o n i t r i l e ) ：v ( w a t e r ) = 7 0 ：3 0a ta f l o w r a t eo f1 0 m l m i n r e g r s s i o ne q u a t i o n sr e v e a l e dl i n e a r r e l a t i o n s h i p ( c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t = 0 9 9 3 1 - 0 9 9 9 2 ) b e t w e e nt h em a s so fc a r b o h y d r a t e si n j e c t e da n dt h e c a r b o h y d r a t e sp e a ka r e a sd e t e c e db ye l s d t h er e c o v e r i e sw e r eh i g ha n dr e p r o d u c i b l e ， r a n g i n gf r o m8 4 0 t o 1 2 0 t h i sm e t h o dh a db e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fs o l u b l ec a r b o h y d r a t e si nt o b a c c ol e a fw i t hg o o dr e s u l t 2 an e wm e t h o d ，u s i n gs u d a nia si n t e r n a ls t a n d a r dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to f c a r o t e n o i d si nt o b a c c ol e a f , i n c l u d ei b - c a r o t e n ea n dl u t e i n ，w a sd e v e l o p e d a c c o r d i n gt o u v - v i sa b s o r p t i o n s p e c t r a ，s u d a ni ，1 3 - c a r o t e n e a n dl u t e i na l lh a da b s o r p t i o np e a k sa t 4 5 0 n m t h e yc o u l db es e p a r a t e da b s o l u t l yb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t h r e t e n t i o nt i m eo f5 8 5 m i n ，8 4 5 m i n ，1 7 2 8 m i n ，r e s p e c t i v e l y t h er e l a t e de q u a t i o n sb e t w e e n s u d a nia n d1 3 - c a r o t e n eo rl u t e i nc o n t e n tw e r eo b t a i n e da n dv e r i f i e db yd e t e r m i n i n gt h e c o n t e n to f1 3 - c a r o t e n ea n dl u t e i ni nt o b a c c ol e a f t h er e l a t i v ee r r o rw a s0 4 f o rd e t e r m i n i n g 1 3 - c a r o t e n ec o n t e n ta n d1 8 f o rl u t e i n i n t r a d a yv a r i a b i l i t yf o ri b - c a r o t e n ew a s5 8 a n df o r l u t e i nw a s7 1 t h em e a nr e c o v e r yo fi - c a r o t e n eo rl u t e i nw a s1 1 6 2 a n d9 6 8 3 a - 2 ，7 ，l1 - c e m b r a t r i e n e - 4 ，6 d i o l s ( a c b d ) ，p - 2 ，7 ，11 - c e m b r a t r i e n e 一4 ，6 - d i o l s ( p - c b d ) a r ep r e c u r s o r s o fi m p o r t a n tt o b a c c os m o k ef l a v o ra n da r o m ac o m p o u n d s ah p l c - u vm e t h o d u s i n g2 0 ( r ) - g i n s e n o s i d e r h 2a si n t e r n a ls t a n d a r dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to fc e m b r a n o i dd i t e r p e n e si nt o b a c c ol e a f , w a sd e v e l o p e d m e a n w h i l e ，as i m p l ea n de f f i c i e n tp r e t r e a t m e n tm e t h o df o re x t r a c t i n gc e m b r a n o i dd i t e r p e n e si n t o b a c c ol e a fw a sd e v e l o p e d t h er e l a t i v ee r r o rw a s0 6 ，f o rd e t e r m i n i n ga - c b dc o n t e n ta n d2 2 f o r i ! i a b s t r a c t 烟叶中蕈要化合物测定方法的研究 p - c b d i n t r a d a yv a r i a b i l i t yf o ra - c b dw a s9 8 a n df o rp - c b dw a s7 9 t h e r e s u l tr e v e a l e dt h e c o n t e n to fa - c b di nt o b a c c ol e a fw a s6 2 0 m g g ，a n d1 3 - c b dw a s2 6 2m g g ，t h er a t i ow a s2 3 6 ， a c c o r d i n gw i t ht h er e s u l tw h i c hw a si nr e p o r t e dp r e v i o u sl i t e r a t u r e s k e yw o r d s ：h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , t o b a c c ol e a f , c a r b o h y d r a t e ， c a r o t e n o i d s ，c e m b r a n o i dd i t e r p e n e s i v 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名：皇峰p 7 年g 月2 多日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 呷年鹛日 硕 ：论文烟叶中重要化合物测定方法的研究 1 绪论 我国常年吸烟人口高达3 5 亿人，约占世界烟民的2 5 ，是全球最大的卷烟消费市 场；同时，我国烟叶产量和卷烟产量也位居全球首位，分别占据世界总量的3 5 和3 2 ， 中国是名副其实的世界烟草第一大国。然而，中国烟叶和卷烟出口仅占世界总量的3 5 和1 8 ，“大 而不“强是目前我国烟草行业在全球市场上的重要特础1 1 。 我国加入w t 0 后，中国烟草已站在更具竞争性的平台上，在更大的范围、更广的领 域直接参与国际竞争，直接面对美式、同式、英式卷烟的挑战。2 0 0 3 年，国家烟草专 卖局已提出把中式卷烟作为我国卷烟科技发展和烟草前进的方向。中式卷烟以国内烟叶 为主体原料，具有明显的中国烟叶香气特征，在香气风格和口味特征上与英式、美式和 日式等卷烟不同，能使卷烟消费者在吸食的第一反应中分辨出来。中式卷烟包括中式烤 烟型卷烟和混合型卷烟，烤烟型卷烟，占总消费量9 0 以上，是我国发展中式卷烟主导 方向。 随着省级工业企业与所属卷烟工业企业合并重组的加快推进，国内卷烟市场格局已 向大企业、大市场、大品牌转变。卷烟工业企业迫切需要适应新形势，实现从省内市场 依赖型向着眼于全国统一大市场的跨越，实现从立足国内市场向面向国际市场的跨越。 为实现两个跨越，需要全面剖析中式卷烟的风格特色，全面掌握国产代表性卷烟品牌的 风格特征，并深入研究、比较中式卷烟与美式、英式、日式等卷烟品牌的风格差异，建 立能够准确表征卷烟风格特征的评价体系。确立中式卷烟比较优势，培育能与国际品牌 抗衡的中式卷烟大品牌，提高中式卷烟的核心竞争力提供理论依据和技术支撑。 1 1 烟草化学成分研究 分析化学是进行烟草化学研究、弄清烟草内在化学成分的必要手段。由于烟草不同 于一般的普通植物，一方面它是世界上化学成分最为复杂的植物之一，根据1 9 8 3 年 f d a b e 的报道【2 j ，烟叶中共有2 5 4 9 种化学成分被鉴定，随着分析手段的发展，到现在 被鉴定的烟草化学成分己超过6 0 0 0 种；另一方面，烟草化学成分对烟草品质的影响不 但取决于其在烟草中的总量，而且更主要的是取决于它们与烟草中其它化学成分的比例 关系及相互协调性。 1 1 1 烟草和烟气化学成分种类 m f d u b e 和c r g r e e n 在1 9 8 2 年1 2 月召开的3 6 届美国烟草化学工作者会议上( t c r c ) 的评述中曾报道，存在于烟草和烟气中的化学成分如下：只存在于烟草中的化学成分有 1 4 1 4 种；只存在于烟气中的化学成分有2 7 4 0 种；烟气和烟草中共有的化学成分有1 1 3 5 种； 1 绪论 烟叶中重要化合物测定方法的研究 共计5 2 8 9 种【3 1 。2 0 0 7 年，中国科学院大连化学物理研究所许国旺课题组采用全二维气相 色谱飞行时间质谱技术共计在烟草和烟气中鉴定出6 1 7 1 种化合物。与郑州烟草研究院 “中国烟草基础数据库 比对分析，发现3 1 9 8 种未包含在中国烟草基础数据库中【4 1 。表1 为主流烟气在主要化合物类别鉴定出的大致组分数，表2 为烟叶的化学成分。 表1 1 主流烟气在主要化合物类别鉴定出的大致组分别3 1 t a b 1a p p r o x i m a t en u m b e ro fc o m p o u n d si d e n t i f i e di ns o m em a j o rc o m p o u n dc l a s s e s 2 1 c l a s s n u m b e r a m i d e s ，i m i d e s ，l a c t a m s c a r b o x y l i ca c i d s l a c t o n e s e s t e r s a l d e h y d e s k e t o n e s a l c o h o l s p h e n o l s a m i n e s n - h e t e r o c y c l i c s h y d r o c a r b o n s n i t r i l e s a n h y d r i d e s c a r b o h y d r a t e s e t h e r s 2 3 7 2 2 7 1 5 0 4 7 4 1 0 8 5 2 1 3 7 9 2 8 2 1 9 6 9 2 1 7 5 5 1 0 6 1 1 4 2 3 1 1 t o t a l4 7 2 0 表1 2 烟叶的化学成分 5 , 6 1 t a b 2 c h e m i c a lc o m p o n e n t si nt o b a c c ol e a v e s 化学成分j含量范围化学成分含量范同 蜡和蜡酯o 6 6 1 2 0烟碱0 2 8 4 0 0 茄尼醇和酯0 8 0 2 0 0氨基酸0 2 5 3 0 0 有机酸3 0 0 7 6 7纤维素和术质素2 5 0 0 2 8 5 0 多酚0 7 5 5 7 0挥发油0 2 5 1 0 0 还原糖0 8 0 2 5 0 0蛋向质1 0 0 3 0 0 非还原糖1 0 0 5 0 0 水( 游离态和结合态)1 1 0 0 2 4 0 0 淀粉和果胶0 0 0 8 0 0 2 硕：t 论文烟叶中重要化合物测定方法的研究 1 1 2 烟叶致香物质研究 烟叶的致香物质一般不是烟草碳、氮等基本代谢过程的直接产物，而是先合成脂类、 萜类等不具挥发性的大分子化合物，然后进一步在酶或非酶的作用下，分解转化形成的。 一种香气前体物可以行程特定的致香物质成分，按照致香物质和香气前体物之间的关系 可把致香物质分成以下几类： ( 1 ) 异戊间二烯类和降异戊二烯类。包括类胡萝卜素、无环类异戊间二烯、带环的 类胡萝卜素降解化合物、双萜类、降赖百当类、碳环的倍半萜烯和单萜烯。烟 叶在成熟和调制过程中，类胡萝b 素、西柏三萜烯醇等大分子化合物碳链氧化断 裂，直接形成或进一步转化形成醛、酮、酸类挥发性成分，其中包括许多重要的 香气成分，如4 ，6 ，8 巨豆三烯3 酮异构体、2 氧代紫罗兰醇、大马士酮、d 紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、茄酮掣。7 踟。 ( 2 ) 类脂的代谢产物( 包括从类脂衍生的低分子量化合物) ，包括甘油酯类、糖酯类、 磷脂类、神经鞘脂类等的降解产物，如蔗糖酯( s e ) 是香料烟、和部分雪茄烟 特有的一种酯类化合物。在烟叶成熟和调制过程中，蔗糖酯水解产生葡萄糖酯， 如三乙酰葡萄糖吡喃糖苷和四乙酰葡萄糖吡喃糖苷，进一步水解产生挥发性酸类 物质，它们是香料烟重要香味物质异戊酸、1 3 - 甲基戊酸、异戊酸的前体物1 9 。1 2 j 。 ( 3 ) 糖和氨基酸非酶棕化反应产物。这类香气物质包括氮杂环类的吡啶、吡咯、吡嗪 类衍生物以及呋哺、酸类和羰基化合物等【1 3 】。 ( 4 ) 生物碱及其转化产物。主要是氮杂环类的香气成分，如烟碱、去甲基烟碱、假木 贼碱等，其相应降解物有烟酸、烟酰胺、3 吡啶基甲酮、可的宁等”1 9 】。 ( 5 ) 苯丙氨酸和木质素类代谢产物。主要有苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、苯乙醇、2 呋喃甲醛等 1 3 1 。 我国曾将烟叶和烟气中的香气物质归纳为以下五类【2 0 j ： ( 1 ) 挥发性醇类、醛类、树脂、酮类、低级脂肪酸及脂类。这些物质大多数是烟叶挥 发性芳香油的组成成分。 ( 2 ) 类胡萝卜素和非环萜烯及其降解产物。在烟叶中这种物质有近1 0 0 种，其中3 0 种是非萜烯类降解产物，7 0 是类胡萝卜素的降解产物。 ( 3 ) 类西柏烷类、巨环萜烯及其降解产物。如西柏三烯二醇是鲜烟蜡质的主要成分， 生成醇类为酮类、醛类等致香成分。 ( 4 ) 赖百当类双萜烯及其降解产物。这类物质主要存在于香料烟中，是叶面分泌物的 成分。 ( 5 ) 氨基酸与糖的非酶棕化反应生成的化合物。已发现的香味成分主要有酸类、醛类、 酮类、吡喃、吡咯、吡嗪、吡啶等类。 1 绪论 烟n t - c 9 重要化合物测定方法的研究 1 2 烟草分析方法研究进展 在对烟草样品进行预处理之f i ，需进行样品的采集和制备。采取烟草上、中、下部 位的叶片，并根据烟叶等级进行挑选，比例合适。用软毛刷刷去叶面的细土和沙粒，抽 去烟叶主脉，然后将其剪成碎块或细丝；成品烟则要去掉过滤嘴和包装纸。将碎烟片或 烟丝放入低温烘箱内，在3 5 4 0 c 的温度下烘3 4 h ，然后在研钵或研磨机内磨成4 0 孔 筛的粉末【2 1 1 。 1 2 1 烟草样品处理方法 根据研究目的的以及采用方法的不同，所采用的样品处理方法也有很大差别。采用 气相色谱方法分析烟样中的挥发性与半挥发性成分，液相色谱法分析烟草中的半挥发与 非挥发性成分。表3 为烟样中挥发性与半挥发性成分分析常见预处理方法。 表1 3 烟样中挥发性与半挥发性成分分析常见预处理方法 t a b 1 3 s a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o d sf o rv o l a t i l ea n ds e m i v o l a t i l ei n g r e d i e n t si nt o b a c c ol e a v e s 4 硕1 ：论文烟叶中重要化合物测定方法的研究 针对不同的样品基质，采用的预处理方法有很大不同，如蒸馏仅限于挥发性的化合 物，冻干通常限于生物样品的纯化与处理。针对液体样品，常采用液液萃取和液固萃 取方法。用液相色谱研究烟草香味物质，常采用的样品处理方法有超声波萃取、索氏提 取、加速溶剂萃取、超临界流体萃取、微波辅助萃取、固相萃取等。 1 2 1 1 超声波萃取 超声波萃取( u e ) 主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物 与样品基体之间的作用力从而实现固液萃取分离。超声波萃取有如下特点：( 1 ) 无需高 温，可以最大的保证样品成分不因高温蒸煮而被破坏；( 2 ) 常压萃取，安全性好，操作 简单易行，维护保养方便：( 3 ) 萃取效率高，萃取充分；( 4 ) 超声波萃取对溶剂和目标萃 取物的性质( 如极性) 关系不大，因此可供选择的萃取溶剂种类多，目标萃取物范围广； ( 5 ) 萃取工艺成本低，能耗低。超声装置亦分为浸入式和外壁式两种，采用复频共振方 式，比单一频率提取效率大大地提高。 储志兵等幽l 确定了制备烟碱分析样品的超声波提取条件：0 4 n a o h 溶液为溶 剂，液固比4 0 ：1 ( m l g 。1 ) ，提取时间4h 。确定了高效液相色谱法检测烟碱含量的条件 为k r o m a s i lc 1 8 色谱柱( 2 5 0m i l lx 4 1 6m i l l ，5 “m ) ，检测波长2 5 9n n l ，检测温度3 5 ， 流动相c h 3 0 i - i 0 0 2m o l l - 1 磷酸盐缓冲溶液mv ) 为6 0 4 0 ，流速1 0m i m i n ，进样量 1 0 此。平均加样回收率9 8 8 ，相对标准偏差1 2 。结果表明超声提取高效液相色谱 法是一种准确度高，速度快的测定烟草中烟碱含量的检测方法。 1 2 1 2 加速溶剂萃取 加速溶剂萃取( a s e ) 是在密闭容器中进行，以常用有机溶剂在较高的温度( 5 0 一 2 0 0 ) 和高压( 1 0 0 p s i - - 3 0 0 0p s i ) 下从固体样品中提取可溶性被测物的样品前处理方 法。 刘芳等【2 9 1 建立了加速溶剂萃取( a s e ) 超高效液相色谱( u p l c ) 同时测定烟草中6 种多 酚物质的快速方法。用5 0 的甲醇水溶液在5 0 下对烟草样品加速溶剂萃取5r a i n ，循环 萃取2 次，将萃取液定容过滤后，用配置二极管阵列检测器的u p l c 进行分析。应用此方 法对1 8 种单料烟和1 4 种成品卷烟中的6 种多酚成分进行了测定，此方法具有操作简单、 重现性好、分离效率高、分析时间短，适于批量试样的快速分析等特点。 1 2 1 3 索氏提取 索氏提取一直是固体提取中应用最广的一种方法，样品置于活动的多孔容器( 套管) 中，回馏溶剂不断流过该套管，溶解被测物，连续收集到蒸馏瓶中。以纯溶剂提取，样 品在溶剂的沸点处必须稳定，该方法回收率较高，常用作固相萃取法的参照标准。 自动索氏提取将热溶剂浸出与索氏提取结合，套管中的样品先浸没在沸腾溶剂中， 然后抬高，进行常规索氏提取用回馏溶剂淋洗，最后浓缩。所用溶剂少于传统索氏提取 法，溶剂重新回收利用，同时减少了提取时剐3 0 j 。 1 绪论烟叶中蕈要化合物测定方法的研究 1 2 1 4 超临界流体萃取法 超临界流体具有气体质量传递的性质和液体溶解度的性质，且有比液态溶剂高得多 的溶剂萃取效率和速度。目前，超临界流体萃取已被广泛用于提取固体基质中的非极性 和中等极性被测物。能用于超临界流体萃取的流体包括c 0 2 、n h 3 、n 2 0 和戊烷。n 2 0 和 戊烷易燃，n h 3 具有化学活性和腐蚀性。因此c 0 2 用于s f e 最多，c 0 2 安全、无毒性、无 毒、无腐蚀。 邵惠芳等【3 l 】综述了超临界c 0 2 萃取技术在烟草烟碱、茄尼醇和烟用精油萃取、烟草 化学成分分析、烟草品质改善和烟草风味改良等方面的应用，指出该技术在烟草领域有 广泛的应用前景。 1 2 1 5 微波辅助溶剂萃取法 在吸收微波的溶剂提取中，样品与溶剂置于密封的不同吸收微波的容器中。微波辐 射将溶剂加热至沸点温度以上，该热溶剂在适当的压力下，能快速提取被测物。一般的 微波灶能同时提取多个样品，m a s e 使用者不接触( 往往有毒的) 提取溶剂。 最近发展的动态m a s e 3 2 】，由于萃取时随时引入的新鲜溶剂，使得萃取效率更高，导 出的萃取液与s p e 或h p l c 联用、检测，其装置易自动化。 1 2 1 g 固相萃取 固相萃取技术( s p e ) 就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品 的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合 物的目的。它有着如下的优点：萃取被测物更彻底；分离被测物与干扰物的效率更高； 降低有机溶剂消耗：易于收集全部被测物；手工操作更为方便；能去除微粒：易于自动 化。 固相萃取是一种比液液萃取效率更高的分离方法，更容易获得高回收率的被测物。 使用s p e 的主要目的有：1 除去干扰物和色谱柱“杀手”；2 浓缩或痕量富集被测物；3 除 盐；4 更换溶剂；5 现场衍生化；6 样品储存与运输。s p e 方法简历一般包括四个步骤： 1 润湿活化填料；2 。加样；3 冲洗填料( 除去干扰物质) ；4 回收被测物。 李忠【2 7 1 研究了固相萃取技术在几类重要烟草化学成分分析中的应用，建立了“固相 萃取高效液相色谱测定烟草样品中的植物色素 ；“固相萃取高效液相色谱质谱法测 定烟草样品中植物多酚”；“固相萃取高效液相色谱法测定烟草中的糖和烟草料液中 的糖和多元醇”的方法体系。 以上处理方法在方法建立时间、回收率、重现性上大致相当，其主要差异在于提取 速度、有机溶剂的应用、自动化程度和价格。超临界流体萃取由于基质影响等原因，所 需建立时间一般较长。加速溶剂萃取、现代索氏提取和超临界流体萃取比微波辅助溶剂 萃取的自动化程度较高。m a s e 、超声、s f e 比a s e 有优势。 6 硕十论文烟叶中重要化合物测定方法的研究 1 2 2 烟草分析技术研究 根据烟草化合物的物理化学性质，常采用色谱、光谱、质谱进行研究，或采用仪器 联用技术进行分析。烟草行业常见的方法有气相色谱法、气相色谱质谱联用法、顶空采 样气相色谱法、固相微萃取气相色谱法、毛细管电泳色谱法、高效液相色谱法、高效 液相色谱质谱联用法、二维液相色谱质谱联用法、近红外线光谱法等。 1 2 2 1 气相色谱法及气相色谱质谱联用 2 0 世纪5 0 年代初期，气相色谱被应用分析烟草中存在大量的挥发性、半挥发性化合 物，如烟草中的生物碱f 3 3 1 、游离甾醇1 3 4 1 、醇类f 3 5 】等物质，用气相色谱质谱联用法分析 烟草中的烃类【3 6 1 、甾醇【3 7 1 、亚硝胺类【3 8 1 、挥发酸【3 9 】、咖啡因【删、多环芳烃【4 1 1 、芳香胺 1 4 2 】等化合物。气相色谱、气相色谱质谱联用技术是迄今为止烟草化学中应用最为广泛的 分析方法。 李军【4 3 】等用固相微萃取气相色谱质谱联用方法测定了2 种国产名牌卷烟和仿冒卷 烟的挥发性和半挥发性成分，根据其化学组成的差别，分别选取了1 2 种和1 7 种成分的峰 建立了卷烟的特征指纹图谱，并与其仿冒产品对照用于真假卷烟的鉴别。结果表明：固相 微萃取一气相色谱一质谱分析是一个有效、简便、快速的真假卷烟鉴别方法，仅使用少 量的样品，经过简单的处理，可以从复杂的烟叶成分中得到部分的香味成分构成指纹图 谱，通过它们的峰位置和大致的比例关系，清楚地表达了指纹图谱鉴别的专属性，从而 可以用于鉴别真假卷烟。 1 2 2 2 液相色谱法及液相色谱质谱联用 烟草中存在许多非挥发性成分，目前常采用的分析方法有：一，通过衍生化后用气 相色谱法分析，二，用液相色谱方法进行直接分析分析。由于衍生化操作步骤可能带来 的误差造成回收率较低，而液相色谱分析时所需样品处理比较简单，液相色谱、液相色 谱质谱联用技术在烟草化学分析中得到越来越广泛的应用。 应用液相色谱法分析烟草中的亚硝胺类【4 4 1 、多环芳烃【4 5 】、有机酸】、生物碱【4 7 1 、 可溶性糖【4 8 】、酚类化合物【4 9 】、多酚化合物【5 0 1 、芳香胺【5 1 】等。常用的检测器有紫外检测 器，选择性荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器等。 烟草中作为一种天然产物，其中含有不少的未知化合物，质谱联用技术得到了广泛 应用，用于分析烟草中羧酸、亚硝胺、糖肽、茄尼醇、烟碱及其代谢物、酚类及多酚类 等。 1 2 2 3 多维色谱联用技术 通常的一维色谱技术很难满足烟草组分的全组分分析，将分离机理不同的色谱分离 模式联用，构建多维分析技术平台，能够大大提高分离能力，多维色谱联用技术已逐渐 应用到烟草化学分析中。 d a l l u g e 5 2 】等最早应用全二维气相色谱飞行时间质谱研究分析烟气组分，路鑫1 5 3 】等 7 1 绪论 烟叶中蓖要化合物测定方法的研究 应用全二维气相色谱飞行时间质谱分析了烟气中的酸性、碱性及烃类化合物，李海峰 等【5 4 】建立了烟叶中挥发性、半挥发性碱性化合物组成研究的全二维气相色谱飞行时间 质谱( g c x g c t o f m s ) 分析方法，并用所建立的方法对香料烟中碱性化合物进行了表征。 1 2 3 数据处理方法 1 2 3 1 指纹图谱 指纹图谱是指复杂物质经过适当处理，如同时蒸馏萃取、液液萃取、固相微萃取等， 然后运用色谱或其它分析方法分析其中的复杂成分，借以化学计量学、统计学、应用数 学等其它数学方法，来鉴别物质的真伪与质量的稳定性的一种模式。常用分离、分析手 段有光谱、色谱、电泳等等。 指纹图谱具有整体性、模糊性两大特征，在物质质量评价中能够尽可能多地反应物 质的全貌，但不需要清楚每一个组分的化学结构，不需要对每个组分都进行定量，只要 求不同批号的同一种类物质的指纹图谱保持一致。 指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究为依托，应体现系统性、特征性、重现 性3 个原则。 ( 1 ) 系统性是指指纹图谱中反映的化学成分反应包括所含大部分成分的种类，或 指标成分的全部。 ( 2 ) 特征性是指指纹图谱所反映的化学成分信息是具有高度选择性的，这些信息 的综合结果将能特征的区分产品的真伪与优劣，成为产品自身的“化学条码 。 ( 3 ) 重现性指所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同 的实验室应能做出相同的图谱，其误差在允许的范围内，这样才可以保证指纹图谱的使 用具有通用性和实用性，也作为标准方法所必备的特征之一。 郭方道【5 5 】建立了茵陈挥发油g c m s 指纹图谱，将正交投影算法用于不同样本中 共有峰的提取，提高了共有峰的识别能力，降低了由于保留时间的漂移、质谱检索匹 配度不高以及色谱峰重叠而引起的共有峰识别的难度采用共有峰率、变异率及相似度 等几个指标对4 个不同产地的茵陈挥发油成分进行了评价，从共性、差异和整体性等 多个方面全面表征茵陈挥发油的化学模式特征。 钟科军等【5 6 l 探索了香精样品的定性分析和指纹图谱的评价，进行了相似性判别。并 采用主成分分析法对烟用香精的模式识别进行了一定的研究与探讨。主要目的是为了 建立烟用香精数据库，提高香精的鉴定和质量控制手段。利用气相色谱和气一质联用技 术，建立基于香精提取物指纹图谱和化学计量学的识别技术，可为香精香料配方及质量 提供有效的工具，图1 1 表示六个不同批次a b l 香精气相色谱图。 不同批次的样品之间尽管存在着某些差异，但其主流是稳定可靠的，共有峰率和谱 图的相似度都较高，从特征和整体上都体现出该产品具有相对较高的稳定性。色谱指纹 8 硕f 二论文烟叶中季要化合物测定方泫的研究 图谱就是这样一个有可测性、通用的鉴定方法，它强调物质的共有特征，谱中反映的化 学成分信息( 具体表现为保留时间和物质的质谱) 是具有高度选择性的，这些信息的综合 结果能特征地区分香精的真伪与优劣，成为香精自身的“化学条码 。以此可以在性质 上与其他种类的香精相区别，是一种很有效的化学鉴定方法。以上结果也充分体现出了 指纹图谱的整体性和模糊性两大基本属性。 图1 1 六个不i 司批次a b l 香精气相色谱图 f i g1 1g a sc h r o m a t o g r a m o fa b lf r a g r a n c ei ns i xb a t c h e s 1 2 3 4 化学计量学方法 获得信息化后的指纹图谱后，需要研究如何来利用这些信息，即实现指纹图谱知识 化。指纹图谱知识化包括信息解读、比较和判断，化学信息和药效信息相关性研究和信 息的利用，即从大量指纹图谱数据中得到有关规律和知识。常采用的数据分析方法有： ( 1 ) 直观比较法：根据图谱外观和所得数据，对供试样品与标准样品指纹图谱的特征 进行直观的分析、比较、判断。此法适用于样品的定性快速鉴别或图谱中数据比 较少的情况； ( 2 ) 量化数据比较法：即引入共有峰、重叠率等量化数据，对供试样品与标准样品指 纹图谱进行分析、比较、判断。此法较为客观、准确，具有一定的实用性； ( 3 ) 化学模式识别法：是根据物质所含化学成分用计算机对其进行分类或描述。若将 其与数学统计学、计算机图谱解析和识别技术结合起来，其应用更为准确可靠、 快速方便。图1 2 为常用的s i m c a p 软件的分析流程图 9 1 绪论 烟叶中重要化合物测定方法的研究 图1 2s i m c a - p 分析流程图 f i g1 2 f l o wp r o c e s sc h a r to fs i m c a - p 1 3 烟叶中重要化合物测定方法研究进展 1 3 1 水溶性糖类化合物分析 随着市场对卷烟产品质量要求的不断提高，建立烟草中各种单糖和低聚糖的测定方 法，对烟草生产、改善卷烟配方和吸烟与健康的研究具有实际意义。烟草中的水溶性糖， 尤其是还原糖，与烟草的香味、吃味及焦油生成量密切相关。不同类型、不同产地、不 同部位的烟草，其水溶性糖的含量大小不同，导致了烟草品质间的差异性。烟叶中的碳 水化合物包括水溶性糖和不可溶性多糖： ( 1 ) 可溶性糖有单糖和双糖。烟草中的水溶性糖有多种，主要为葡萄糖、果糖、蔗 糖等。通常把那些具有还原性的糖称为还原糖，双糖经水解后与单糖一起称为水溶性总 糖。烟叶中的可溶性糖主要是单糖，其含量约占可溶性总糖的8 0 以上，其它可溶性糖 如双糖、三聚糖等总共只占可溶性总糖的2 0 左右。烟叶中的糖量与烟叶品质有密切关 1 0 硕 ：论文 烟叶中重要化合物测定方法的研究 系，在一定范围内，含糖量较高的烟叶燃吸时所产生的烟气多呈酸性反应，气味较柔和 【5 7 j 。但糖量过高，则表现出香气平淡，吃味也差。还原糖类燃烧时，其裂解产物( c 0 2 ) 具有酸性反应，可使烟气中碱性物质降低。 ( 2 ) 不溶性的多糖属于高分子碳水化合物，烟叶中的多糖包括淀粉、纤维素和果胶 等，多糖与单糖双糖不同，它即不溶于水，也无还原能力，但在酸性条件下和酶的作用 也能水解成单糖，但数量很少，所以在烟叶中起的作用也较少。 目前，烟草中总糖和还原糖的测定方法主要有费林试剂法【5 8 】、流动注射分析法【5 9 1 、 毛细管电泳法【鲫、气相色谱法【6 1 】和高效液相色谱法【6 2 击5 1 。表1 4 为糖类化合物常见的高 效液相色谱分析方法总结。 表1 4 糖类化合物的高效液相色谱分析方法 t a b 1 4a n a l y s i so fc a r b o h y d r a t e sb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 1 绪论 烟叶中重要化合物测定方法的研究 1 3 2 类胡萝卜素化合物分析 烟叶质体色素主要包括叶绿素a 、叶绿素b 、b 胡萝b 素、叶黄素、新黄质、紫黄质 等【蚓，在调制后的烟叶中，主要含有d 胡萝卜素和叶黄素。p 胡萝卜素和叶黄素化学结 构式如图1 3 ，1 4 所示。 图1 3p 一胡箩卜素化学结构式 f i g 1 3t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f1 3 - c a r o t e n e 图1 4 叶黄素化学结构式 f i g 1 4t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fl u t e i n 胡萝卜素是一类由8 个异戊二烯单元相连接且分子两端各有一个不饱和己烯环的四 萜化合物的总称。常见的胡萝卜素有a 、d 、丫3 种异构体，以1 3 胡萝卜素为主。b 胡萝b 素( c 4 0 h 5 6 ，相对分子质量5 3 6 8 7 ) 为红褐色或暗红色结晶或结晶性粉末，熔点1 8 1 ， 呈藻类提取物的特有气味。受光、热、空气影响后色泽变淡。溶于三氯甲烷、j 下己烷、 石油醚，微溶于乙醇、乙醚、食用油，几乎不溶于水、酸、碱，稀溶液显黄色。对空气、 热、光敏感，在溶液中格外敏感，易氧化变为无色、无活性产物。c 【、p 和丫胡萝卜素常共 存于烟叶、茶叶、蔬菜等许多植物中，其中以p 胡萝卜素的含量最高，这些植物在受热分 解过程中能产生一系列挥发性致香物质，是重要的香料体化合物1 6 7 1 。 刘维涓【6 剐较系统地总结了近年来有关p 胡萝卜素降解反应方面的研究进展。p 胡萝 卜素的主要降解方式包括高温氧化降解、热裂解、化学氧化降解、光氧化降解、生物氧 化及酶催化氧化降解等，主要产物种类包括碳数为2 以上3 0 以下的醛、酮、醇、羧酸及 其酯类等沸点较低的含氧有机化合物，其降解机制依据降解方式各不相同。p 胡萝卜素 的降解产物对于制备香精和香料具有重要价值。 d 胡萝卜素在1 0 0 和不同反应时间形成的产物含挥发性物质和非挥发性物质两大 类，主要的挥发性物质有2 ，6 ，6 三甲基环己酮、2 ，6 ，6 三甲基2 环己烯酮、2 羟基2 ，6 ， 6 三甲基2 环己醛、2 羟基2 ，6 ，6 三甲基2 环己酮、b - 环柠檬醛、5 ，6 环氧d 紫罗兰 酮、二氢猕猴桃内酯等。非挥发性物质有金色