（化学工艺专业论文）非水相酶法合成蔗糖6酯的研究.pdf

非水相酶法合成蔗糖6 酯的研究 摘要 本论文对在非水相中脂肪酶区域选择性催化合成蔗糖一6 一位单酯进行 了研究，并合成出两种物质蔗糖咱一月桂酸酯和蔗糖- 6 一油酸酯。 论文主要分为四部分。第一部分研究了化学一酶二步法合成蔗糖一6 一月 桂酸酯。先化学合成蔗糖- 6 - 乙酸酯并对其进行纯化，然后将其与月桂酸乙 酯反应酶促合成蔗糖- 6 - 月桂酸酯，对影响反应的各种因素进行了考察。在 最优条件下，蔗糖的转化率达8 4 3 ，蔗糖一6 一乙酸酯的转化率达2 5 2 。 第二部分探讨了有机相体系中酶促酯交换合成蔗糖一6 一月桂酸酯，系统 考察了反应体系中脂肪酶的种类、溶剂、分子筛、固定化酶的浓度、底物 浓度和反应温度等对反应的影响。在最优反应条件下蔗糖转化率达9 7 2 。 第三部分通过对酰基供体、温度、原料摩尔比和酶浓度等因素的考察， 优化了酶促合成蔗糖- 6 - 油酸酯的反应条件。蔗糖转化率达8 3 7 。 第四部分研究了蔗糖和油酸酐反应的动力学，发现在一定条件下反应 不存在外扩散限制，为动力学控制，符合米氏方程。反应存在底物抑制， 底物浓度对反应速度的影响符合p i n g - p o n g 反应机理，由此推导了反应动 力学模型，并求得各模型参数。 关键词：蔗糖- 6 - 月桂酸酯蔗糖- 6 - 油酸酯油酸酐脂肪酶酶法合成 e n z y m a t l cs y n t h e s i so fs u c r o s e 6 e s t e r i nn o n - a q u e o u sm e d i u m a b s t r a c t l i p a s e - c a t a l y z e dr e g i o s e l e c t i v ea c y l a t i o no fs u c r o s ei nn o n - a q u e o u sm e d i u mw a s r e s e a r c h e di nt h i sp a p e r t w os u b s t a n c e s 6 o - l a u r e y l s u c r o s ea n ds u c r o s e - 6 - o l e a t e , w e r e s y n t h e s i z e d i nt h i st h e s i s ，t h es t u d yi n c l u d e sf o u ra s p e c t s f i r s t , t h ec h e m o - e n z y m a t i es y n t h e s i so f6 - o - l a u r o y l s u c r o s ew a sr e s e a r c h e d s y n t h e s i z i n gs u c r o s e - 6 - a c e t a t eb yc h e m i c a lw a ya n dp u r i f y i n gi t ，a n dt h e nr e a c t e dw i t h e t h y ll a u r a t eb ye n z y m a t i cc a t a l y s i s m a n yk i n d so ff a c t o r sw e r es t u d i e d u n d e rt h eb e s t c o n d i t i o n s , as n e r o s ec o n v e r s i o no f8 4 3 t os u c r o s e 6 一a c e t a t e 。as u e r o s e - 6 - a e e t a t e c o n v e r s i o no f 2 5 2 t o6 - o l a u r o y l s u c r o s e s e c o n d , e n z y m a t i ct r a n s e s t e r i f i c a t i o ns y n t h e s i so f6 - 0 一l a u r o y l s u c r o s ei no r g a n i c s o l v e n tw a ss t u d i e d p a r a m e t e r ss u c ha sl i p a s e , s o l v e n t ，m o l e c u l a rs i e v e s ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r ew e r es t u d i e d u n d e rt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，as u c f o s ec o n v e r s i o no f9 7 2 t o6 - o - l a u r o y l s u e r o s e t h i r d ，o p t i m i z i n gt h es y n t h e s i so fs u c r o s e - 6 - o l e a t ev a r y i n ga c y id o n o r , m o l e c u l a r s i e v e s ，t e m p e r a t u r e , t h em o l a rr a t i os u c r o s e o l e i ea n h y d r i d e , a n dt h ee n z y m ec o n t e n t u n d e rt h eb e s tc o n d i t i o n s as u c r o s ec o n v e r s i o no f8 3 7 t os u c r o s e - 6 - o l e a t ew a s a c h i e v e d f o u r t h ，as t u d yo nt h ek i n e t i c so ft h ee s t e r i f i c a t i o no fs u c r o s ea n do l e i ea n h y d r i d e w a sc o n d u c t e d t h ef a c tt h a te f f e c to ft h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no ni n i t i a lr a t eo ft h e r e a c t i o nf o l l o w e dm i c h a e l e s - m e n t e ne q u a t i o ns u g g e s t st h a tt h er e a c t i o na g r e e sw i t ht h e p i n g - p o n gb ib im e c h a n i s m i n h i b i t i o nb ye x c e s so fo l e i ca n h y d r i d eh a sb e e ni d e n t i f i e d t h ek i n e t i cc o n s t a n t sh a v eb e e nc a l c u l a t e df o rt h er e a c t i o ni nt h ea b s e n c eo fa n y s i g n i f i c a n te x t e r n a ld i f f u s i o nl i m i t a t i o n s k e yw o r d s ：6 - 0 1 a u r o y l s u c r o s e ；s u c r o s e - 6 一o l e a t e ；o l e i ca n h y d r i d e ；l i p a s e ； e n z y m a t i cs y n t h e s i s m 广西大学硕士学位论文j e 水相酶法合成蔗l 一6 一目的研究 1 1 课题研究的理论基础 第一章绪论 1 1 1 非水相酶学的发展概况与现状 酶作为生物催化剂，具有专一性、高效性、反应条件温和等优点，因此受到人们 的普遍关注。传统观念认为酶只能在水溶液中发挥其催化作用，而在有机溶剂中酶蛋白 容易变性失活。但是大多数有机物不溶于水，因此限制了酶催化反应在有机合成中的应 用和发展。虽然在非水相中进行酶催化反应早在1 9 1 3 年就有报道，但真正引起大家广 泛的兴趣是在1 9 8 4 年z a k sa n dk l i b a n o v t l l 研究报道在非水相中可进行酶的催化反应之 后。自此非水相酶学成为一迅速发展的研究领域，吸引了大批化学家、生物化学家和化 学工程师的广泛兴趣。通过非水相中的酶催化可以完成多种化学反应，如氧化、脱氢， 还原、脱氨、羟基化、甲基化、环氧化、酯化、酰胺化、开环反应、聚合反应等等郾j 。 并且已被应用于许多方面，如内、外消旋体的拆分、区域选择性转化、酶催化聚合、肽 合成、酶法分析等1 4 5 1 。非水相酶学发展历史见表l - l 。 表1 - 1 非水相酶促反应的发展历史 t a b l e1 - 1d e v e l o p m e n to f e n z y m a t i cc a t a l y s i si nn o n - a q u e o u sm e d i a a r e a $r e s e a r c h e r 1 9 1 3 1 9 6 6 1 9 6 7 1 9 8 4 1 9 8 8 1 9 9 2 1 9 9 3 1 9 9 3 1 9 9 3 s y n t h e s i so f a l k y lg l y c o s i d e su s i n gd r ye m u l s i o n i na l c o h o l c a t a l y s i sb yc h y m o t r y p s i na n dx a n t h i m eo x i d a s e s u s p e n d e d i no r g a n i cm e d i a e n z y m a t i cc a t a l y s i si no r g a i l i cm e d i aa t1 0 0 e n z y m a t i cc a t a l y s i s i n n o n a q u c o u s s o l v e n t s ( e n z y m ep o w d e r ) c a t a l y s i sb ya - c h y m o t r y p s i ne n t r a p p e di n t o 瓤f 瓣 m o d i f i e dp o l y m e r i cg r a n u l e si no r g a n i cs o l v e n t s r e a c t i o n so f c a t a l y z e d b vp e g - m o d i f i e da p c h y m o t r y p s i ni no r g a n i cs o l v e n t s i l n m o b i l i z a t i o no fl i p a s ef o re f f e c t i v ei n t e r e s t e r i f i c a t i o n o f f a t sa n do i l si no r g a l i i cs o l v e n t w h o l ee e l lb i o c a t a l y s i si nn o n c o n v e n t i o n a lm e d i a 1 9 9 5 e n z y m ea c t i v i t yi ns u p e r c f i t i c a lf l u i d s b o u r q u e l o t b r i d e l d a s t o l if r t 6 k l i b e n o v , am t 1 z a k s ，a a n d l a n d k l i b a n o v , am 7 1 埘e “t s k yy l 【8 1 l j u n g a r g a d l e r c r e n t zp 【9 1 c h o s w , r h e ej s 1 0 】 n i k o l o v ap , w a r d o p t l l l k a m a ts v , b e c h m a n e j 【1 2 】 ! ! 竺i旦堡竺! 竺! i 呈翌兰垒生12 堡型! ! 垒! 里! 壁里坚竺! 翌旦竺 g - 蕾r 大掌硕士学位论文挪- 冰相铀暗成蔗糖6 一旨的訇”宅 袁1 - 1 续表 1 9 9 6m i c r o w a v er a d i a t i o nc a ni n c r e a s et h er a t eo fe n z y m e p a r k e rm c l ”j c a t a l y z e dr e a c t i o n si no r g a n i cm e d i a 1 9 9 7 l i p i d c o a t e de n z y m e sa se f f i c i e n tc a t a l y s i si no r g a n i c o k a h a t ay , m o r it 【1 5 】 m e d i a 1 9 9 7c r o s s l i n k e de n z y m ec r y s t a l so f l i p a s e sa sc a t a l y s t sl a l o n d ej j ，n a v i a m a 1 6 】 1 9 9 8 l i p a s e s ：i n t e r r a c i a l 朗z y m e s w i t ha t t r a c t i v ea p p l i c a t i o n s s c h m i d ，d ，v e r g 盯， r 0 7 1 1 9 9 9 l i p a s e - e a t a l y z e dr e g i o s e l e c t i v ea c y l a t i o no fs u c r o s ei n f e r r e r , m e ta 1 【1 8 】 t w o s o l v e n tm i x t u r e s 2 0 0 1p r o t e i n a s en c a t a l y s e d r e g i o s e l e c t i v ee s t e r i f i c a t i o no fp o t i e rp e ta 1 【1 9 1 s u e r o s ea n do t h e rm o n o a n dd i s a c c h a r i d e s 2 0 0 2e 伍c i e n tt r a n s e s t e r i f i c a t i o no fs u e r o s ec a t a l y s e db yt h e p e d e r s e nn e ta 1 m e t a l l o p r o t e a s et h e r m o l y s i ni nd i m e t h y l s u l f o x i d e 1 2 0 l 2 0 0 3 s y n t h e s i s o fs u e r o l a u r a t eu s i n gan e wa l k a l i n ep e d e r s e nn i 乙e ta 1 p r o t e a s e f 2 l 】 非水介质中酶催化反应是目前酶工程的重要课题之一，它大大扩展了酶的工业应用 领域。 1 1 2 非水相酶促反应的优点 与在水相中进行的酶促反应相比，非水相酶促反应具有许多优越性1 2 2 1 ： ( 1 ) 提高了有机底物的溶解度，使许多不溶于水或在水中不稳定的产品能利用有机溶剂 中的酶来催化生产； ( 2 ) 使某些反应的热力学平衡向合成的方向移动( 如酯键与肽键的形成等) ； ( 3 ) 抑制了水参与的某些不利反应( 如酸酐、卤化物和肽的水解，醌的聚合等) ； ( 4 ) 酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用，产物也易于分离纯化； ( 5 ) 酶的稳定性提高，尤其是热稳定性； ( 6 ) 防止微生物的污染； ( 7 ) 在某些情况下可以改变酶对底物的专一性以用于特殊的用途； ( 8 ) 氨基酸侧链一般不需保护； ( 9 ) 酶可被直接应用于化工过程。 随着人们环保意识的增强和有关环保法规的不断实施。人们对化学产品的要求也不 断提高。而酶催化过程的某些特性使其具有较强的吸引力，如高的选择性、温和的反应 条件、反应过程中功能基团无需保护和去保护以及较少使用有毒化学试剂等。酶催化所 得的产品基本是由“天然原料”经“天然方法”得到的，更易被消费者所接受，具有极 大的市场潜力。 2 广霄大群“曩士掌位论文舶冰相酶 毒争成囊 糖一6 一旨的研究 1 2 水对酶催化的影响 在非水相中，水是酶蛋白所表现出的许多特性的决定因素，如酶的活性，酶的稳定 性和酶的特异性。控制好非水相生物催化体系中水的量和位置是成功应用非水相生物转 化的关键。一般认为，水在酶催化系统中起着正反两方面的作用。 在正的方面，酶在绝对无水的条件下是不可能有催化活性的【2 】。因为是水分子直接 或间接地通过氢键，疏水键，范德华力等作用来维持着酶分子具有催化活性时所必需的 构象。但是也不难设想，水溶液中并不是所有的水分子都与酶的活性有关。实际上只有 与酶蛋白分子紧密结合的单层水分子对酶的催化活性才是至关重要的。维持酶催化活性 所必需的最少量水称为“必需水”，只要这层“必需水”不丢失，酶的催化活性就不受 影响。因而可以把有机溶剂中进行的酶催化反应理解为宏观上的非水相，而微观上是微 水相反应。 在反的方面，水与大部分酶的失活作用有关，尤其是酶的“热失活”。温度升高时， 酶分子首先发生可逆折叠，然后进行下述一种或几种反应 4 1 ；( 1 ) 形成不规则结构；( 2 ) 通过b 消除使二硫键破坏：( 3 ) 天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺；( 4 ) 天冬酰胺残基 的肽键水解。这些过程都需要有水的存在才能进行。z a k s a 等人【1 】报道，在水溶液中， 猪胰脂肪酶在1 0 0 下几乎立即失活，而在水含量极低时0 0 1 5 o 8 ( 质量分数) ， 它在1 0 0 下的半衰期长达数十小时。他们对此作出的解释是：水作为一种“润滑剂”， 给酶分子提供了结构上的高度易变性，而脱水可以使酶结构的刚性增大，从而使其热稳 定性提高。另外，在有水生成的可逆反应( 如酯化反应) 中，水分的存在也对该反应的 热力学平衡不利。 从以上两方面可以看出，在非水相酶反应体系中存在一“最适含水量”。该“最适 含水量”不仅取决于酶的种类，也与所选用的有机溶剂有关。通常这一含量极低，并未 达到水在有机溶剂中的饱和点。有人认为用水的热力学活度来表示非水相体系中的水含 量更为合适i 捌。水活度( ) 可由反应体系中水蒸汽的压力与在同样条件下纯水的蒸汽 压之比而计算出。文献肼】介绍了控制非水相体系中的水活度通常有以下几种方法：( 1 ) 使用分子筛除水；( 2 ) 向反应体系中添加水合盐对；( 3 ) 用饱和盐溶液预先平衡底物溶 液和酶；( 4 ) 使用膜分离除水，众所周知，在低水活度的条件下，酶催化反应的热力学 平衡由水解反应向合成反应方向转移。因此，水活度可用来控制反应平衡。例如脂肪酶 催化的酯化反应速度常数随着的变化而变化。为了弥补低水活度时反应速率低的缺 点，有些人采取了如下措施：让酶反应在高时启动以便得到高的反应速率，然后在 反应末期降低0 w 促使平衡移动从而得到高的产率。 3 广西大学硕士摩啦论文 胄e 水相酶爿暗成另e 囊卜1 6 一借的研究 1 3 有机溶剂对酶催化的影响 13 1 宏观效应 ( 1 ) 溶剂对酶结合水的影响 亲水性溶剂可剥去酶表面结合的基本水，导致酶分子因不能充分水化而失活。 g o r m a n da n dd o r d i c h l 2 5 曾研究过有机溶剂剥去酶分子表面结合水的过程。测量出有机溶 剂三种酶被剥落的结合水( t 2 0 ) ，发现这种剥落过程只需几分钟。有机溶剂从酶表面剥 落水分子和溶剂的极性相关；与溶剂的憎水性( 1 0 9 p ) 也相关，但程度较弱，如甲醇能 去除约6 0 的结合水，而己烷只剥去0 5 。这一有机溶剂剥水过程可通过酶表面亲水 化而减弱。如通过苯四酸二酸酐共价修饰的a c h y m o t r y p s i n ，其稳定性增加，能有效减 弱有机溶剂的剥水作用。 ( 2 ) 溶剂通过与酶蛋白直接作用而引起酶失活 溶剂通过破坏氢键、离子键及疏水键而改变酶蛋白天然构象。当酶在溶剂中可溶时， 酶的失活现象尤为严重。常见的溶解酶的溶剂有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和2 一氯乙醇 等，在这些溶剂中酶的构象可以变为完全伸展状态。通过电子自旋共振光谱的研究表明， 随着溶剂疏水性的增加，酶的活性部位的刚性亦增加。 ( 3 ) 有机介质中酶的结构刚性 酶在有机溶剂中结构刚性的增加对酶的催化作用产生了重大影响，其中一个重要的 方面是p h 的控制。酶的催化活性取决于其带电官能团的正确的离子化状态。在水溶液 中，这些官能团的离子化状态取决于溶液的p h 值。有机溶剂不会改变酶蛋白带电基团 的离子化状态，因此酶在有机溶剂中的化学状态就与从中提取该酶的水溶液中的状态相 同。多种酶( 包括脂肪酶，蛋白酶及氧化还原酶) 的情况证实了这一说法，这些酶在有 机介质中作用的最佳p h 值( 即在一定p h 的水溶液中冷冻干燥后加入有机溶剂中) 与 在水溶液中作用的最佳p h 值相同。有机介质中酶的稳定性也与p h 密切相关。从实用 的角度来说，p h 的优化对酶在有机溶剂中的有效实用是至关重要的。 结构刚性的另一个比较重要的现象是酶的底物专一性的改变。当有机溶剂水含量降 低时，酶的柔度降低，其活性部位就变得较难接受体积较大的底物。 有机溶剂中酶的结构刚性提供了利用溶剂作为调节酶功能手段的可能性。例如将枯 草杆菌蛋白酶在其竞争性抑制剂存在下进行冷冻干燥后，其活性可提高1 0 0 倍以上闭。 1 3 2 有机溶剂对酶促反应动力学的影响 反应介质对酶催化动力学有深刻的影响。酶的底物专一性和催化效率取决于该酶利 用其与底物相结合的自由能的能力，这一结合能反映底物一酶结合能与底物一溶剂结合能 的差别，因而酶的各种动力学参数如k i ( k 。) 、泖。曲将在很大程度上取决于反应的 溶剂参数。 4 广西，叫煳士掌位论文鼍 水相翻h 精成曩 翱r 6 一旨的研究 ( 1 ) 溶剂的憎水性对酶催化作用的影响 关于酶在有机介质中催化活力较水相中低的一个假说是：底物从酶的活性部位被分 配到憎水性的有机溶剂中，从而降低了底物与酶的亲合性，导致底物的表观k l 增大及 酶对憎水性底物的催化效率的降低。 r y uk 等【2 7 l 曾对有机溶剂中辣根过氧化物酶催化酚类物质氧化作用进行了研究，其 中底物与溶剂的憎水性均加以变化。结果发现在缓冲水溶液及各种有机溶剂中过氧化物 酶的催化效率( v 。妇) 均随底物憎水性参数n 增加而线性下降，同时酶的催化效率 也随溶剂憎水性参数1 0 的增加而呈线性下降。然而催化常数( 1 ：c 吐或v 。) 在非水介 质中却并不一定减少，如过氧化物酶催化对甲苯酚氧化反应的催化常数在有机溶剂中反 而得以提高。 ( 2 ) 非水介质中底物专一性( 立体异构专一性) 的变化 由于有机溶剂能够改变底物与酶的亲合力，因而可以预料在有机溶剂中酶的底物专 一性与水溶液中相比会发生变化。在有机介质中，亲水性底物将倾向于分配到酶的活性 部位，这将降低该底物的表观k 。值从而提高其催化效率。溶剂极性还能影响酶的对映 异构选择性。研究发现，介质憎水性提高引起蛋白酶对映异构选择性的下降，对映异构 选择性与溶剂憎水性存在线性自由能关系。 1 4 非水相酶催化反应体系的类型 1 4 1 有机相体系 有机溶剂在非水相酶催化体系中是应用最多的一种。有机溶剂所起的作用主要有二 点：( 1 ) 改变水解酶酶促反应的方向，使反应向合成方向进行；( 2 ) 增加憎水性底物的 溶解度。 一些有机溶剂是可以与水混溶的，比如乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺等。通常酶是可 以溶解在这个有机溶液一水的共溶体中的，从而构成稳定的均相体系。这种体系的优点 是体系均一，传质阻力小。然而当有机溶剂浓度过高时，酶的操作稳定性很低，原因见 表卜2 。有机溶剂的最大加入浓度取决于酶的稳定性和溶剂的种类。 表1 - 2 有机相中酶活降低的原因和解决方案 t a b l e1 2t h em a s 锄dm s o l m j o no f e n z y m e 枷v i 母r e d u c f i o ni no r g 卸i cp h a 5 广西大掣啊甄士掌位论文j 仁水相 圣暗成蔗糖一6 一旨的研究 1 4 2 两相体系 有些有机溶剂不能与水互溶，与水构成两相体系。在这种两相体系中，酶与亲水性 底物在水相，憎水性底物在有机相。 通常在两相体系中，酶的操作稳定性比较好。改变两相体系的一些性质比如p h 值， 可以改变酶的选择性。同时，由于产物和一种底物不溶于水，因而两相体系可以较好地 解决产物抑制和底物抑制的问题。水与有机溶剂的比例范围几乎可以从纯水到纯有机溶 剂。但是为了保持酶的活力通常需要保留一定的水分，只要水分足以在酶周围形成一层 水膜能维持酶活就够了。 1 4 3 无溶剂体系 无溶剂体系是指反应体系中没有附加的溶剂，只含有反应物和酶。其具有突出的 优点：可避免有机溶剂引起的毒性及易燃问题，这对于食品、化妆品、药物的生产尤为 重要；增大底物浓度；减少反应体积，提高了产物浓度；最终产物易于分离纯化。 无溶剂体系中包含底物的液相和含有酶的固相，因此反应速度受到内、外传质的 限制。而且固定化酶的载体也会影响传质过程，同时反应体系粘度大，底物浓度大，也 会影响传质过程，从而降低产物得率。 1 4 4 超临界体系 超临界流体是一种超过临界温度和临界压力的特殊物质，物理性质介于液体和气 体之间。超临界流体作为酶反应中间介质，具有明显的特点和优点：( 1 ) 似液体的密度、 似气体的扩散性和粘度，因此显示出较大的溶解能力和较高传递特性，从而大大降低酶 反应的传质阻力，提高酶反应速率；( 2 ) 反应底物的溶解性对超l i 每界的操作条件( 如温 度、压力) 特别敏感，通过简单改变操作条件或附加其它设备，就可达到底物和产物分 离的目的；( 3 ) 无毒、不可燃、化学惰性、易于底物产物分离、价格便宜等。这些优点 和特点使其在工业上，尤其是在食品与发酵行业上的应用，具有广阔的发展前景瞄】。 6 - 西大茸t 硕士学位 l 二走 爿 水相摹铀争成蘑糖一6 一冒旨的研究 1 4 5 反股柬体系 由于反胶束体系能较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中，大多数酶能够 保持活性和稳定性，甚至表现出“超活性”。自1 9 7 4 年w e l l s 发现磷酸酯酶a 2 在卵磷 脂乙醚水反胶束体系中具有卵磷脂水解活性以束，国外有2 0 多个实验室对5 0 多种酶 在反胶束中的酶学性质进行了广泛的研究。在反胶束体系中一定的w o 值时，其酶活 是水中的几十倍、几百倍、甚至上千倍，如漆酶在反胶束中的酶活是水中的6 0 倍，过 氧化氢酶为1 0 0 倍，而酸性磷酸酯酶的活性提高2 0 0 倍。近几年，s a n c h e z 等【2 9 】提出是 表面活性剂膜引起了酶分子构象刚性的增加及胶束中结构水的特殊性质共同影响造成 了酶的“超活性”现象。 1 5 非水相催化反应中催化剂酶的形式 酶在有机介质中容易受到各种因素的影响，因此，直接应用游离酶粉反应并不能获 得理想的效果。越来越多的学者对有效催化反应的酶的形式进行了研究，迄今为止，主 要形成了以下几种形式： ( i ) 固定化酶，是一种最常用的催化剂。一般采用吸附法使酶附于多孔的载体上，使 用时能够以特定的活性构象稳定存在，而且有利于酶在有机相中保持良好的分散状态， 减少传质阻力，提高反应效率。固定化酶通常不溶于有机相中，易于回收。固定化材料 本身具有极强的调控水分的能力从而对酶有一定的保护作用。固定化酶既有酶的催化性 质，又有一般催化剂能回收、反复利用的优点，在生产工艺上可以实现连续化和自动化。 固定化后的酶处于载体的特定微环境中，由于载体的物理性质，酶的性质发生了变化： 首先，固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，可能的原因是酶构象的改变导 致了酶与底物的结合能力或催化底物转化能力的改变；或者是载体的存在给酶的活性部 位或调节部位造成某种障碍，影响了酶与底物或其它效应物的作用；固定化酶的扩散速 率限制了底物和酶的作用。在个别情况下，固定化酶由于抗抑制作用的提高使得它反而 比游离酶活高。其次，固定化酶在使用上稳定性提高了，包括对热、各种有机溶剂、p h 等，可能是由于酶与载体多点连接或酶分子间的交联，防止了酶分子的伸展变形，同时 也抑制了自降解反应。另外，酶反应的最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合的结果， 一般情况下，酶固定化后，催化反应的最适温度会提高。酶反应的最适p h 值受微环境 表面电荷的影响，由于载体的带电，其催化底物的最适p h 值也会有变化。 ( 2 ) 交联酶晶体催化剂，是采用酶结晶技术和化学交联相结合的方式制备的，经该技 术处理的酶的稳定性得到增加。当蛋白从溶液环境转变成晶体环境时蛋白质分子中的静 电效应和疏水效应增强，从而增强了蛋白质的稳定性。另外，酶分子之间化学的交联会 促使蛋白质抗热性的增加，并且此方法不需要载体，具有较广阔的应用前景，有些已经 应用于工业上踟。 7 广西大摩“页士掌位论文a 仁水相酶亭毒暗成蘑翱卜6 一旨的研究 ( 3 ) 化学修饰酶，通常采用表面活性剂修饰游离酶粉，因为表面活性剂具有类似酶分 子的疏水部分和亲水部分，它能与酶相互作用从而减少了非极性溶剂对酶的损伤作用。 还可以采用大分子聚合物如p e g 进行游离酶粉的修饰。 ( 4 ) 完整细胞固定化酶，节省了下游对酶进行提纯的成本，一】时较游离酶具有较高的 稳定性和较好的溶解力。此外，由于保留了胞内原有的多酶系统，对于多步催化转化反 应的优势更加明显，而且无需辅酶的再生。最近，g r i l t m 等【3 1 1 深入讨论了在有机相中利 用完整细胞进行生物催化的可能性和优点。需要注意的是在选用完整细胞进行生物催化 时，应考虑到胞内是否存在产物分解系统和其它副反应系统。 1 6 脂肪酶催化酯交换的机理 图1 - 1 脂肪酶催化酯交换反应的机理 f i g 1 ic a t a l y t i cm e c h a n i s mf o rl i p a s e - m e d i a t e de n z y m a t i ci n t e r e s t e r i f i e a t i o n s 广西大掌习n b 掌位爿 文 爿e 水相晦翻暗成蔗稠卜_ 6 一i 的研究 固定化脂肪酶催化酯交换的反应符合p i n g - p o n g 反应机理。此反应有一酰基酶中间 体和两个过渡态。一个用于酶的活性丝氨酸的酰基化，另一个用于中间体丝氨酸的脱酰 化，具体见图1 - 1 3 2 1 。酶催化反应实际上是酸和碱催化，这可能是因为蛋白质结构解离 的氨基酸残基在活性部位起着酸和碱的作用。起碱催化作用的酶活性部位主要由一个催 化三联体构成( a s p g l u ，h i s ，s e r ) ，通过电荷传递系统中的组氨酸残基和天冬氨酸残 基，谷氨酸残基使得丝氨酸亲核催化活性提高。而起酸催化作用为所谓的氧阴离子穴，其 由几个氢键供体所构成，主要为酶骨架或其侧链中的酰胺的质子，这些形成了几个可结 合于过渡态氧阴离子氢链键。 1 7 课题的研究现状及应用前景 1 7 i 蔗糖酯的应用现状 蔗糖脂肪酸酯( s u c r o s ee s t e r ，s e ) 简称为蔗糖酯，是一种新型的多元醇型非离子表 面活性剂，由蔗糖与正羧酸反应生成的一大类有机化合物的总称。蔗糖分子中含有八个 羟基具有强亲水性；而动植物油所含的脂肪酸基却具有较长的碳链，是典型的亲油基。 调节好蔗糖同脂肪酸的结合比例( 酯化度) ，便可以获得宽范围的h l b ( 亲水、亲油平 衡值) 值。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、润滑、渗透、起泡、粘度调节、防止 老化、抗菌等性能；同时，它还具有无毒、易生物降解等特性。联合国粮农组织( f a o ) 以及世界卫生组织( w h o ) 分别在1 9 6 9 年和1 9 8 0 年批准蔗糖酯为食品添加剂。目前 己在欧洲、美国及日本等国得到普遍使用。 不同取代度的蔗糖酯已被广泛地应用于食品、医药、日化和农药等行业中 3 3 - 3 5 1 。此 外，它们的抗肿瘤 3 6 1 、抗菌 3 i 和杀虫活性【3 8 1 也已被报导。蔗糖酯商业上的制备通常是 通过蔗糖和酰氯的酯化或蔗糖和脂肪酸酯的酯交换反应实现。由于这些方法制备蔗糖酯 不能区域选择，产品中有大量的异构体，因此限定了蔗糖酯的应用范围。而区域选择性 酯化的蔗糖酯具有传感、特殊稳定和乳化等功能特性，可望作为经皮和局部药物传输的 吸收剂、内膜蛋白分离表面活性剂、人造血液乳化剂、抗菌剂、活性杀虫剂和药物中间 体等而得到广泛应用 3 9 1 。 1 7 2 酶促合成蔗糖酯的现状 蔗糖酯的传统合成方法是采用化学催化的方法。此法虽然具有工艺流程简单，易于 大批量生产的优点，但是有以下几大缺点【舯l ：( 1 ) 需要耗费巨大的能源，造成环境污染； ( 2 ) 由于蔗糖上存在八个羟基，且其微环境又相似，使得产物单一性很差，因此限定 了蔗糖酯的应用范围；( 3 ) 用化学方法生产的蔗糖酯有时对人体具有副作用。 所以当今不论学术界还是工业界，都越来越把注意力集中到生物方法上来。生物制 备主要有两种方法：微生物发酵法和酶促合成蔗糖酯。前法存在产物分离比较困难的问 9 f - 西大掣啁毗七掌位甚! 文 枷；水相嗣i 亭考叫 成蔗翱卜_ 6 一t 的研究 题；后者则由于酶的高度立体和区域选择性，近些年来，成为研究的热点。 蔗糖的化学酰化和酶酰化有不同的区域选择性。在大多数实验条件下，化学酰化的 区域选择优先顺序是6 - o h _ 6 。o h 1 o h s e c o n d a r y o h s l 4 1 】；而酶促反应中，不同的酶 其区域选择性足不同的。众多学者对蛋白酶、脂肪酶、抗体酶合成蔗糖单酯、二酯、线 性聚酯的研究成果大致如表卜3 所示。 表卜3 酶促合成蔗糖酯一览表 t a b l e1 - 3e n z y m a t i cs y n t h e s i so f s u c r o s ee s t e l - s 类型位置产物 酶文献 单酯 l 1 d 一丁酸蔗糖酯 s u b t i l i s i n 【4 2 1 ，- d 丁酸蔗糖酯 s u b t i l i s i nb p n 4 3 】 1 d - ( 丁、己、辛、癸) 酸蔗糖酯p r o t e a s e n ( a m a n o ) 4 4 】 l ，- d 甲基丙烯酸蔗糖酯p r o t e i n a s en ( f l u k a ) 1 9 ，4 5 】 1 ，_ o - ( 辛、癸、月桂) 酸蔗糖酯 l d - 丁酸蔗糖酯 b i o e n z y m e2 4 0 4 6 】 l ，d 己酸蔗糖酯p r o l e a t h e r 2 2 d - 月桂酸蔗糖酯 b a c i l l u sp s e u d o f i r m u s 【2 1 1 a l 一8 9 2 d 月桂酸蔗糖酯t h e r m o l y s i n【2 0 】 6 6 d - 癸酸蔗糖酯m u c o rm i e h e i【4 7 】 6 - d - 月桂酸蔗糖酯，6 - 0 棕榈酸蔗糖酯h 1 a n u g i n o s a 18 】 6 - d - 月桂酸蔗糖酯t 1 a n u g i n o s u s【4 3 】 6 d - 丙烯酸蔗糖酯p s e u d o m o n a ss p 4 8 】 6 - d - 辛酸蔗糖酯 a b z y m e【4 9 6 d 丁酸蔗糖酯，6 o - 癸酸蔗糖酯 n o v y m4 3 5【5 0 】 6 d - 丁酸蔗糖酯，6 o - 月桂酸蔗糖酯n o v y m4 3 5【5 1 6 i67 d 丁酸蔗糖酯，6 ，d - 癸酸蔗糖酯 n o v y m4 3 5【5 0 6 ，d 丁酸蔗糖酯，6 d - 月桂酸蔗糖酯n o v y m 4 3 5 5 1 】 二酯6 ，l 6 d - 十二酰基1 0 - 己基蔗糖酯 c h r o m o b a c t e r i u m 【3 9 】 v i $ c o s u r f l 6 o - 月桂酸1 - o - q 日基丙烯酸蔗糖酯p r o t e i n a s en【4 5 】 6 ，1 - - - 丁酸蔗糖酯b i o e n z y m e2 4 0 4 6 】 p r c l l e a t h e r 6 ，6 -6 ，6 - o - 二月桂酸蔗糖酯n o v y m4 3 5 3 7 】 6 ，6 - 0 - - - 丁酸蔗糖酯n o v y m4 3 5 5 0 】 线性聚酯6 ( 或6 ) d - 己二酸蔗糖酯为单体p r o l e a t h e r 4 6 】 酶促合成蔗糖酯虽然具有许多的优点，但却受到这样一个事实的限制：在能溶解蔗 糖的极性溶剂( 例如d m s o ，d m f ) 中大多数生物催化剂会失活。 迄今为止，为克服这一特殊的限制而发展形成的方法大致可分为两类。第一类方法 是寻找这样一种媒介：它不但能同时溶解蔗糖和酰基供体，并且不影响酶的催化活性 1 0 广西大掌硕士茸啦论文非水相酶 盼成蔗囊卜_ 6 一旨的研究 4 2 , 4 3 5 25 3 。第二类方法是通过不同的方式对蔗糖进行修饰 4 8 , 5 4 , 5 5 】，增加其疏水性。从而 使得到的蔗糖衍生物能够在无溶剂状态下和脂肪酸发生酯化反应，或者是通过活化酯进 行酯交换。 1 7 3 论文设计方粟 区域选择性合成的蔗糖月桂酸酯作为一类新型蔗糖酯衍生物，具有许多重要的用途， 比如它具有乳化、抗菌等功能。另外，由于蔗糖月桂酸酯具有无刺激性和能快速降解的 特性，可望作为经皮和局部药物传输的吸收促进剂。 酶促区域选择性地合成蔗糖月桂酸单酯的研究，目前主要取得以下一些成果：p o t i e r 等用蛋白酶p r o t e i n a s e n 催化合成出蔗糖1 月桂酸单酯；p e d e r s e n 等用蛋白酶 m e t a l l o p r o t e a s et h e r m o l y s i n 、b a c i l l u sp s e u d o f i r m u sa l 8 9 催化合成出蔗糖- 2 月桂酸单酯； w o u d e n b e r g 等用c a n d i d a a n t a r c t i c al i p a s e 催化合成蔗糖_ 6 月桂酸单酯，但同时也生成 了等量的蔗糖6 - 月桂酸单酯，并且反应7 天后转化率才达3 7 ；f e t t e r 等用h 1 a n u g i n o s e l i p a s e 催化合成蔗糖6 月桂酸单酯，产率为5 1 。 本研究旨在建立一种高效合成蔗糖6 月桂酸单酯的方法，并能将此方法应用于其它 蔗糖6 酯的合成。实验拟从以下方面进行： 思路一；通过对蔗糖进行修饰，增加其疏水性，从而使得到的蔗糖衍生物能够更容易地 反应生成所需要的蔗糖酯。实验路线：首先通过化学的方法由蔗糖制备蔗糖一6 一 乙酸酯，然后在酶催化的作用下将其与月桂酸( 或其酯) 反应合成蔗糖一6 一月 挂酸酯。 思路二：寻找高效催化合成蔗糖- 6 - 酯的生物催化剂；寻找合适的反应媒介：它不但能 同时溶解蔗糖和酰基供体，并且不影响酶的催化活性；再在此基础上寻找合适 的酰基供体以便快速、强选择性的合成特定的蔗糖一6 一酯。实验路线：酶催化 作用下，由月桂酸乙烯酯和蔗糖反应合成蔗糖一6 一月桂酸酯以及由油酸酐和蔗 糖反应合成蔗糖- 6 - 油酸酯。 g - 西大掌硕士掌位论文 j e 水相酶诗暗成蔗 一6 - 旨的研究 2 1 实验材料 第二章实验材料与分析方法 实验使用的材料如表2 - 1 所示： 表2 - 1 实验材料 t a b l e2 - 1e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 1 2 广词大学闷e 士学位论文 爿譬水相葺谢睹成蔗翱r 喝一旨的研究 2 2 实验仪器 实验使用的仪器如表2 2 所示： 表2 - 2 实验仪器 t a b l e2 2e x p 鲥m ta p p a 咖 广西大掣q 页士学位论文 j b 扣相酶曲暗成蔗糖- 6 一前 的研究 2 3 分析方法 2 3 1 蔗糖