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f 薯生粉直接发酵生产l 乳酸及- 岛产菌株的诱变筛选 甘薯生粉直接发酵生产l 一乳酸 及高产菌株的诱变筛选 研究生：王宏伟 指导教师：王关林教授 学科专业：植物学 研究方向：植物基r _ t - 程 中文摘要：运用正交试验理论，对米根霉3 1 1 7 9 发酵产生l 乳酸的优化摇瓶发酵作了初步研 究，确定了优化的发酵培养基和发酵条件。优化的发酵培养基为( ) ：甘薯生粉1 2 ，( n i - h ) - 。s o , 0 3 ，k i 士p o , 0 0 3 ，m g s o 7 1 - i z ) a 0 2 5 ，7 n s 0 4 7 h o0 0 0 5 ，c a c o 。6 。最佳培养条件为： 3 0 。c t f 睹养4 8 h ，摇床转速1 8 0r m i a ，装液量为每2 5 0 m l 三角瓶5 0 m l 。在最佳发酵培养条 件。f ，米根霉3 1 1 7 9 的摇瓶发酵产生峭嚼 的最大质量浓度为8 9 5 9 l ，转化g 垂k 6 2 3 。 以代谢控制发酵理论为依据，利用紫外线对米根霉3 1 1 7 9 进行诱变处理，然后经过多种筛选 培养基，筛选得到株高产【广乳酸的正向突变株w e o ，其平均产酸量为1 1 6 3 8g l ，转化率 为7 3 8 。分别比原始出发菌株提高了3 0 0 3 和1 8 4 6 。 关键词：米根霉l _ 孚l 酸发酵诱变育种 6 l _ 薯生粉直接发酵生产l - 乳酸及高产菌株的诱变筛选 第一部分文献综述 前言 乳酸是一种常见的羟基羧酸，广泛存在于人体、动植物体和微生物体中。乳酸按其旋光 性可分为d 睁乳酸、u + ) - 乳酸和d l 乳酸三种。由于人体只能代谓俐用其中的峭l 酸，因此 世界卫生组织m l o ) 明确规定，成人每天摄 d ( + 乳酸的量不得超过1 0 0 m e k g 体重，对于 三个月以下的婴儿食品中不应加入d m l 酸，而对于u + ) _ 乳酸则不加限制“”1 。 乳酸是世界公认的三火有机酸之一，自从1 7 8 0 年s c h c c l e 发现乳酸以来，乳酸的生产及 应用技术得到大规模的提高。近年来，表面生物转盘法，包埋法，萃取法，膜法发酵等固定 化技术在乳酸发酵过程中得到了极大的应用。同时乳酸的分离技术也得到了极大的提高，从 传统的钙盐法发展到现今的酯化法，电渗析法，溶剂萃取法，吸附法等原位分离技术。由于 乳酸是具有光学活性的最小分子之一，因此人们不仅可以生产蚺砑嗷、d ( + 乳酸或d l 乳 酸而且这些构型不同的乳酸还可以形成化学及物理性质各不相同的聚合物及其他衍生物“。 工，乳酸、皤l 酸盐及其聚合物广泛应用于食品、医药、农业、化工业等领域。尤其近儿 年，人们利用凹l 酸聚合生成的聚l 乳酸蜡生物降解塑料、绿色包装材料及家用薄膜，凭 借其可生物降解，生物相容性等特点，越来越受到广泛的研究和关注，应用前景十分广阔“。 1 1l _ 乳酸的性质及应用 1 1 1l - 乳酸的陛质 乳酸啡a d d ) 学名2 羟基丙酸( 2 - h y d r o x yp r o p a n e i ca d d ) ，结构式为： a 封凸i o h c ( ) c i h 是一种简单的羟基酸”。乳酸按其旋光性可分为l 乳酸、d 乳酸、d l - 乳酸，其物理性质见表1 - 1 。乳酸分子量为9 0 0 8 ，是一种天然存在的有机酸。由于分子内含 有个不对称碳原子，因此具有旋光异构现象，l 尊垤为左旋，但砰l 酸盐或酯却是右旋， 当d ( - ) - - 乳酸萃i m 碍l 酸等比例混合时，即成为消旋的d ，l 广乳酸。 表1 - 1 乳酸异构体的物理性质 t a b 1 - 1 t h e p h y s i c a l c h a r a c t e r o f l a c l i c a c i d i s o m e r 构型慧 专秽解离撒。黜， l5 2 8 - 5 43 31 3 7 1 0 。1 6 8 7 d5 2 8 - - 5 4- 3 31 3 7 x1 矿 1 6 8 7 d l1 6 8 3 01 3 7 1 矿1 1 3 5 o 乳酸是种强的有机酸，能与水以任意比互溶，但不结晶，印以上浓度的乳酸具有 很强的吸湿性。纯净的无水乳酸是白色的晶体，熔点为1 6 8 0 ，沸点为1 2 2 ( 2 k p a ) 相对 密度为1 , 2 4 9 。在6 7 1 3 3p a 的真空矧中f 反复分馏可以得到纯品的乳酸结晶。】。 乳酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物为无色透明或浅黄色糖浆状粘性液体，几乎无臭 或略带脂肪酸臭，味酸，与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶，它几乎不溶_ 】二氯仿、 7 薯生粉直接发酵生产l - 酸及高产菌株的涛变筛选 _ i 油醚、二硫化碳和苯”1 。由丁乳酸含有一个羟基和j 一个羧基，风此它可以参与许多反应。 如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等，充分脱水可形成聚合乳酸”1 。另外，加热 乳酸时发生自动酯化，可形成乳交酯。 1 1 2l - 乳酸的应用 乳酸是种多用途的精细化学品，可广泛用于食品、制药、制革、纺织、环保和农业中。 其产品主要表现形式为酸味剂、调味剂、防腐剂、鞣制剂、植物生跃调二1 ，剂、生物可降解材 料和手性药物等。 1 1 2 1 食品工业 由于l ，乳酸对人体无毒副作用，且易吸收，可直接参与体内代谢，因此被广泛的应用于 防腐荆和调味剂，在罐头、酱菜、饮料生产中加入i ，乳酸以替代对人体健康有毒害作用的苯 甲酸钠，在啤酒生产过程中，用王，乳酸代替磷酸来调节p h 值。此外加入少量的乳酸既可以 抑制杂菌的生长又能促进糖化完成，因此还具有保鲜作用，有利于食品卫生。乳酸可使食品 具有微酸性，而又不影响水果和蔬菜天然风味和芳香，因此也广泛用于水果和蔬菜等罐头食 品中。人食入含有乳酸的食物，可解除疲劳、松弛肌肉“”。 1 1 2 2 医药工业 在医药工业中，乳酸除了可以直接用作消毒剂用在病房、手术室、实验室等场所外，在 医药方面广泛用作防腐荆、载体剂、助溶剂、药物制剂、p h 调节女惜“”“。可赢接制成药或 制成盐类，用作含漱剂、涂布剂、膀胱注入剂等，还可内服用于肠内消毒。它能溶解蛋白质 和角质，对病变组织的自趔舴用特别敏感。利用乳酸亲水性的特点与难溶性药物结合，可增 加药物的吸收量，防止副作用产生。乳酸本身含有天然润肤成分，刺激皮肤细胞再生效果明 显，在皮肤、头发的护理中起到保湿滋润，替代甘油作保湿剂，调节酸碱性、抗微生物等作 用，对皮肤无刺激性，兼有剥离性能、抗菌性能和增白性能，对改善皮翅j 织结构，消除皱 纹、色斑，治疗皮肤干燥、座疮等有显著疗效。因此。在化妆品中其用量也逐渐增大。还可 以制成乳酸钠，配成输液治疗酸中毒及商钾血症。l ( 峥乳酸钙、m 碍l 酸亚铁、m 烀l 酸 锌都是补充金属元素的良好药品“。 此外由聚乳酸制成的手术缝合线、生物植片等在临床上都被广泛应用。另外聚乳酸用作 不月j 拆线的外利缝合线作药物、酶和生物制品的微型包囊可缓慢释放药物，囊材不起捧异 反应，经段时间代谢后，能逐步降解排除。它也用于杀虫剂睃囊、人工管等方面”1 。 1 1 2 3 化学工业 在化学领域中，由于i n ) - 乳酸是生物可降解塑料聚乳酸的原料而备受关注。聚乳酸 有望在不久的将来代替p v c 、p p 等各种不可降解的塑料，以消除“白色污染”所造成的环 境危机1 4 。聚。乳酸属于无毒的高分子化合物，具有生物相容性，在人体内能被分解成h 乳 酸，为人体代谢不引起变态反应，因此广泛用于生产缓释胶囊制剂，这样可使血液循环中 药物浓度相对降低，大大提高疗效，降低副作用。聚鹋嚆减与其它材料共聚制成的生物降 解塑料还可用于生产缓释农药，优点在于延长农药使用时间，对农作物和土壤无毒害作用， 提高农药使用效率，国际上正在大力推广麻用。此外聚乳酸还具有良好的初期机械性能、透 明性、透气性等而被人量应用于农业、制造业等领域“”l 。 8 1r 薯生粉直接发酵生产l 乳酸及高产菌株的诱壁筛选 乳酸不仅有多个功能基团，而且这些基团有很好的相互协同佧刖。乳酸是具有光学活性 的最小分子之一，人们不仅可以生产u + ) 乳酸、d ( 斗乳酸或d ，l - g l 酸，而且这些构型不同的 乳酸义可以形成化学及物理性质很不相同的聚合物及其它衍生物。l 乳酸的衍生物在国民生 活的各个颈域也扮演了极其重要的角色“。 l 乳酸钙为白色颗粒或粉末，1 2 0 c 下脱水变为无水物，溶于水，几乎不溶于乙醇，缓慢 溶于冷水中，但迅速溶解于热水中，常温下，1 0 0 n 1 i 冰溶解度为5 昏水溶液p h 值为6 0 - - 7 0 。 时l 酸钙主要用丁_ 食品添加剂，既可作为面包、糕点等缓冲剂、膨松剂，又是儿童、妇女、 老人的优良补钙剂。 l 乳酸锌是l ，乳酸钙与硫酸锌复分解反应生产相品，经过滤，洗净，低温干燥而得，可 做为锌营养强化剂用于乳制品，奶粉，食品饮料等。 硝l 酸钠可用做食品保鲜剂、调味剂、p h 缓冲剂、酪蛋白塑料增塑剂，在医药上可作为 静脉注射液中电介质渗析物吸甘油代用品，也可用于肠内消毒洗涤剂、膀胱注 剂、牧草催 熟剂、饲料添加剂，用于畜肉制品工业，能有效地扼制病源性大肠杆菌0 1 5 7 的繁殖。 峭l 酸亚铁是补铁强化剂，讶动口于奶粉、饼干等中。是缺铁性贫血患者的廉价高效补血 剂。 此外i ，乳酸钾、硝l 酸铵可作为饲料添加剂，l 乳酸锰、l 乳酸锶可作为微量元素补 充剂和药物，i ，乳酸锑、i 羽脬 铜可作为媒染荆和电镀浴原料4 。 1 2l - 乳酸的生产方法 据史料记载，乳酸最早是通过制作酸奶面获得的。在乳酸菌的作用t 牛奶中的乳塘被 发酵为乳酸。经过多年的发展，乳酸的制取技术有了很大的进步“”。目前乳酸的生产主要有 化学合成、生物发酵和酶法三种方法。 1 2 1 化学合成法 1 9 6 3 年，美国斯特林化学公可f 属的蒙桑托( m o n s a n t o ) 公司开始采用化学合麟去生产 乳酸。工业匕化学合成乳酸的方法主要是乳腈法( 也叫乙醛氢氰酸法或醛、酮和h c n 加成法) 和丙酸法一。 1 2 1 1 乳腈法 该法是以乙醛、氢氰酸和乙醇( 或甲醇) 为原料。由于原料价格低廉，因此国外合成乳酸 主要采用此法。该法主要由美国标准化学品公司和日本武藏野化学公司实施。在乙醛中加入 氢氰酸，丁：常压下液相夏直产生乳腈。粗乳腈经过蒸馏回收纯化井用浓盐酸或浓硫酸水解生 成乳酸粗乳酸与乙醇酯化生成乳酸酯，乳酸酯再水解生成稀乳酸及稀乳酸浓缩等工序。其 反应式如下： c h 3 a - i o + h c n c h 3 a 玎0 h ) c n a 3 c h ( 0 1 9 + 1 2 s 0 4 + h 2 0 a 3 c h ( 0 h ) ( z ) o h + n h , t h s 0 4 m a p 砌+ q h 5 0 h a 3 硎p h ) c o o c 2 如+ h 2 0 佣3 0 i ( o 均c o o 吲5 + h 扣一c h 3 c h ( o h ) c 0 0 h + c 2 h 5 0 h 9 j 薯生粉直接发酵生产l 4 l 陵及高产菌株的诱变筛选 1 2 1 2 丙酸法 以丙酸为原料，经氯化得2 氯丙酸，再与氢氧化钠反应得粗乳酸，再经酯化、精馏、水 解得到产品，该法原料价格较贵，仅日本大赛路公司等少数厂家采爿j 。反应如。r ： c h 3 c h 2 c o o h + 0 2 一c h 3 c h c l c o o h j 幽l 蝴 3 伽( o h ) c o o h + n a c l 乳酸的其它一些可行的化学合成法包括糖的碱性催化水懈、丙烯乙二醇氧化、乙二醇的 硝酸氧化等。 1 2 2 发酵法 乳酸不仅可用化学法合成制得，更重要的是能用可再生资源( 葡萄糖、淀粉、粮食、纤 维素、工农业及民用废物等) 由发酵法进行大规模生产，而且微生物发酵法生产乳酸，因其 原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高、安全性高等优点而成为生产乳酸的重要方法。 按照发酵微生物的种类可分为细菌发酵和根霉发酵”“。 1 2 2 1 细菌发酵法 用于乳酸生产的菌属主要有乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌属 _ 砌9 0 。g ) 、芽孢杆菌 属( n a c a t u s ) 。 乳杆菌属的菌种有干酪乳杆菌 l c 面蛾耐池，目、嗜热乳杆菌鼢曲陆啦棚i 舭删蝴) 、唾沼曙l 杆菌f l a c t o b a c u s s a m r u s ) 、清酒乳杆菌( 上删曲钟池l s 船k ) 、嘲睃孚l 杆菌( 1 a c t o b a c i l l u s 沈啦动旧、德氏乳杆菌( l 幽c 豇址出勋m c b 的、嗜淀粉乳杆菌 函删出娥缸酬掣啦砷、植物乳汗菌牮。c 口b 2 = 抛f 爿幻；m ) 等。 链球菌属有嗜热链球菌 聊加舭唧航船) 、乳脂链球菌 _ 加c c mc r ：d m ) 、 唾液链球菌钳印幻踊庙l 订等。 芽孢杆菌属主要是凝结芽孢杆菌m 施s 删w 1 。 按微生物发酵糖类经由的过程和生成产物的不同，可将乳酸发酵分为同型乳酸发酵 ( h o m m o f e r m e n l a t i o n ) 、异型乳酸发酵( h e l e r o f e r f e n t a f i o n ) 和混合酸发酵( m i x e da c i d f e r m e n t a t i o n ) 。 ( 1 ) 同型乳酸发酵 乳酸是葡萄糖代谢的唯一产物，采用的是f a v l p # 圣( e m b d e n - - m e y e r h o f p a m a n p a r t h w a y ) ，经过这种途径，l m o l 葡萄糖可生成2 m o l 乳酸，理论转化率为1 0 0 ，但由于发 酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达到1 0 a j 6 ，一般转化率在8 帆以上 的，即认为是同型乳酸发酵“。反应过程为： 岛h d 魄 量丛堡垒- 2 c h a c o c o o h 蠼堂墨墼呻2 c h 3 c h o h c o o h + 2 a t p 2 ( a d p 十h ) n a d h + h ( 2 ) 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵是某些 l 酸细菌利用h m p 途径，分解葡萄糖为5 磷酸核酮糖，再经差向 异构酶作用变成5 一磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生成3 硝酸甘油醛和乙酰 磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸发酵的关键酶。乙酰磷酸进一步还原为乙醇，同时放出磷酸。 1 0 i + 薯生粉直接发酵生产l 乳陵发商产菌株的诱业筛选 而3 磷酸甘油醛经e m p 途径后? r 部分转化为乳酸，同时产生两分f 口。扣除发酵时激活 葡萄糖消耗的i 分子a t p ，净得1 分子a t p 。网此由葡萄糖进行异型乳酸发酵，其产能水平 比同型乳酸发酵低一、p 。异型乳酸发酵产物除乳酸外还有乙醇、c 0 2 和筒r p ”。其总反应式 为： c 甜1 ：1 0 6 + a d p + p i c h 3 c h o h c o o h + c h z c h - ! o h + ( 3 3 2 + a t p 此过程l m o l 己糖生成l m o l 乙醇、l m o l 二二氧化碳和l m o l 乳酸。乳酸对糖的转化率只有 5 0 。 ( 3 ) 混合酸发酵 是同型乳酸发酵菌在某些特殊的情况下如葡萄糖浓度、p h 值、温度等发生变化而采用的 一种乳酸发酵柳篇0 ，它是经由与同型乳酸发酵相同的途径即e m p 途径，但丙酮酸的代谢途 径发生了改变，从而除生成乳酸外，还生成了副产物。此途径中有两种酮解酶参与反应，即 鲫$ 酸果糖磷酸酮解酶和5 磷酸木酮糖磷酸酮解酶，分别催化磷酸果糖和5 ，磷酸木露$ 瞎的 裂解反应，产生乙酰磷酸、禾磷酸赤藓糖和孓磷酸甘油醛、乙酰磷酸“”。其发酵途径如图 i - i 所示。 ( a ) ，乙醐酸啼乙醇 7 ，s 磷酸果糖+ 4 磷酸赤藓藩 葡萄糖 乳酸发酵进行了研究，结果表 明：此法进行乳酸发酵具有发酵速度快、m 吼酸得率高及既能用于连续发酵又能用于间歇 发酵等优点，周h 他们利用发酵与离子交换分离耦合技术进行乳酸发酵研究，简化了后续分 离步骤。 在各种固定化技术中，天然高分子和合成高分子的包埋法是研究最为活跃的微生物细胞 固定化方法。例如使用海藻酸钙固定化米根霉，颗粒表面形成一层菌丝层，有利于氧和底物 的传质1 。用固定化细胞在三相流化床反应器中进行峭l 酸发酵，具有如下优点：结构简单、 所需能量低、混合好、有利于传质“4 。h a n g ”“和h a l m m c i 等人分别对海藻酸钙和海藻酸 钠脚定化米根霉生产乳酸进行了研究。d u 等人。”用海藻酸钙包埋法固定化米根霉，在三相流 化床中进行重复批式和连续生产皤l 酸。以总的反应器体积基础计算生产率，固定化细胞比 1 4 薯生糟直接发酵生产l - 季l 睃驶高产菌株的诱变筛选 传统搅拌罐中游离细胞的生产率高3 倍。李学梅等提出了电渗析发酵生产l 广乳酸过程的数 学模型。用海藻酸钙同定化米根霉，以三相流化床反廊器外部的电渗析仪作为分离器，通过 泵使得发酵液在反应器和分离器之间循环流动。这样，在生产l ，乳酸的同时进行了产物分离。 用聚氨酯泡沫固定化米根霉，在气升式反应器中连续生产【，乳酸。在处于拟稳态时，乳 酸生产率随着稀释率或葡萄糖浓度增加而增加。天滓大学白姝、孙彦等人“采用聚氨酯泡 沫法固定化米根霉发酵生产l 乳酸，速率比游离菌提高了3 倍，固定化方法简单易行，所制 得的细胞稳定性强，容易扩火生产。y i i l 等人”1 采用气升式发酵罐接种米根霉发酵，由玉米 淀粉直接生产l 乳酸，所得乳酸的质量浓度为1 0 2 9 t l ，得率为8 5 。李玉龙等人r “研究了 以聚氨酯泡沫为载体的米根霉固定化技术并建立了描述固定化米根霉间歇生产乳酸过程的双 层反应扩散理论模型。 1 3 2 原位分离技术的应用 乳酸发酵的适宜p h - - 5 5 6 0 ，p h 因素a ( 碳源) 因素q 磷源) 因素e ( 装液量) 因素d 。 根据正交实验结果得出优化的最佳培养基是( j 6 ) 甘薯生粉1 2 ，删l t k s 0 40 3 ，k h 2 i 0 4 0 0 3 ，m g s 0 4 7 h = , o0 0 2 5 ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ，c a c 0 36 。优化的最佳培养条件为：3 0 下培养镐h ，摇床转速1 8 0 r r a i n ，装液量为每2 5 0 m l 三角瓶5 0 m l 。 2 3 4 卜乳酸发酵总过程 采用e 述优化后的最佳培养基，在摇瓶培养条件下进行l 厂乳酸发酵，分别在发酵开始的 2 4 h 、3 曲、4 8 h 、印h 、7 2 h 时取样品进行检测，测定发酵液中鹏l 酸产量和残糖量。结果见 图2 - 1 0 。 巨亘巫画画五三亟圃 o2 43 6 4 8 6 0 7 2 时间( h 1 图2 - 1 0l 4 l 酸发酵总过程 f t g 2 - 1 0 t u n e c o u i t , e o f l - l a c t i ca c i d f e n n e n t a t i o n b y r u t z o p u s o t y z a e3 1 1 7 9 (6)哪姆鬃 5 5 5 5 5 。拈。拍。佰，o 1j，1jj 5；加蚰仲o 【鱼嘲扎毹1蠡 什薯生粉直接发酵生产l - 尊l 艘发高产菌株的诱变筛选 从图2 1 0 中可以看山米根霉3 1 1 7 9 在发酵生产l 乳酸的过程中，碳源消耗迅速，4 8 小 时内碳源消耗殆尽。随着甘薯生粉的消耗，l 广乳酸含量迅速上升，4 8 小时达到高峰，此时 l 厂乳酸质量浓度为8 9 5 觚。对糖重量转化率达6 2 3 。4 8 至7 2 小时，l 哥l 酸产鼙基本没有 明显变化，残糖量也基本保持不变。由于在发酵液中有足够量大的q c o 。做中和剂，闪此整 个发酵过程中体系的p h 变化基本不人。考虑到缩短发酵周期以利于降f 氐成本扩大生产， 故发酵时间定为4 8 小时比较合适。 2 3 5l - 乳酸钙的提取和鉴定 2 3 5 il - 乳酸钙的提取 将米根霉3 1 1 7 9 发酵液瞧温过滤，离心取上清液减压浓缩，放置过夜使l 乳酸钙析出， 滤掉母液放置1 0 0 6 c 烘箱中烘干成粉末状”“。 2 3 5 2l _ 乳酸钙的鉴定 ( 1 ) 纸层析 取球根霉3 1 1 7 9 发酵沿提纯样品、l ，乳酸枋守崖品( s i g m a 公司进口分装) 配成沼掖，分 别点样于新华一号滤纸上，在展开剂中层析后，经显色剂显色后，样品r f 与【，乳酸基本一致。 ( 2 ) 紫外可见分光光度计 发酵液经离心后取e 清液真空干燥，固体经研磨后烘箱内过夜烘干。称取等量的样品与 l 乳酸钙标准品配置溶液，分别加入石英比色杯中，一同在u v - 7 5 0 4 f c 紫外可见分光光度计 中进行2 8 0 6 5 0 n m 全波段扫描。经过比较可以断定发酵液中的确有l 厂乳酸钙存在。如图 2 - 1 1 、2 - 1 2 所示。 图2 1 1l 厂乳酸钙标准品的紫外i 刳谱 f i g 2 - 1 1 t h e u l t r a v i o l e t - v i s i b l e s p e c t r u m o fc a l c i i l i l l l a c t a t es t a n d a r d s a m p l e | 薯生粉直接发酵生产l 乳腋驶高产茁株的诱变筛选 图2 - 1 2 发酵液中峭l 酸钙样品的紫外图谱 f i g 2 - 1 2 t h eu l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c l l l l mo f c a l c i u ml a c t a t ef e r m e n t a t i v es a m p l e ( 3 ) 红外光谱测定 将发酵液烘干结晶，与皤嗽标准品分别加入无水k b r 研磨，用k b r 压片法，在1 7 3 0 i n f r a r e df o u r i e r t r 删o r ms p e c t m m e t e r 型红外光谱仪e 测定红外光谱。红外光谱如下图2 - 1 3 、 2 - 1 4 所示。 幽2 - 1 3l 乳酸钙标准品红外光谱 f i g 2 - 1 3 i n f r a r e ds p e c t n m ao f c a l c i u ml a c t a t es t a n d a r ds a m p l e 什薯生粉直接发酵生产l - - 季l 酸及高产菌株的诱娈筛选 图2 - 1 4 发酵液中l 乳酸钙样品红外光谱 f i g 2 - 1 4 t h e i n f r a r e ds p e c t r u m o f c a l c i u m l a c t a t e f e r m e n t a t i v es a m p l e ( 4 ) 核磁麸振谱测定 取发酵液中提取的乳酸钙样品和。乳酸钙标准品分别溶于氘代试剂( d 2 。) 中，用瑞士 b r u k e r 公司a m5 0 0 m i - i z 核磁共振仪测定。核磁图谱如下图2 - 1 5 、2 - 1 6 所示。 l * - li h * 0 ” i 醮i v 嚣：崾9 vi 簖冀 。i ， 一 = “：篇i “ 善 塞 图2 - 1 5l 乳酸钙标准品核磁共振谱 f i g 2 - 1 5 t h e n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c es p e c t r t t m o f c a l c i u m l a c l a t es t a n d a r ds a m p l e i 薯生粉直接发酵生产l - ! ? l 陂及高产菌株的诱变筛选 曩囊 = ：= # = v 薹； v i 。 图2 1 6 发酵液中i ，乳酸钙核磁共振谱 融2 - 1 6 t h e n u c l e a r m a g n e t i c l x o n a n e e s p e c t r u m o f c a l c i u m l a c t a t e f e n n e n t a d v es a m p l e ( e ) 比旋光度与纯度分析 将从发酵液中提取的乳酸钙配成2 5 的水溶液，用w x g - 4 型圆盘旋光光度仪测定比旋 光度。s i g m a 公司进口分装的l - * l 酸钙【n = 一5 4 0 ，发酵佯品乳酸钙卜】2 0 d = - - 4 9 3 ，与s i g m a 公司的皤l 酸钙比旋光度很接近，可确认为左旋乳酸钙。而礴l 酸钙的理论比旋光度f 。卉 = - - 6 1 3 ，发酵样品中峭l 酸钙的含量可用下式计算： l - * l 酸含景= 实际比旋光度 理论比旋光度 1 0 0 = 8 0 4 2 4 讨论 目前支璋峙最j 酋的多以葡萄糖、玉米淀粉作为碳源，其产酸量约为9 0 i 1 0 9 l 。转化率约 为6 5 蹦。但是甘薯生粉较之葡萄糖和玉米淀粉，原料来源简单，价榭氏廉。如果能进一 步提高产量和转化率，代替现有的葡萄糖和玉米淀粉作为碳源，那么在乳酸生产工业e 便可 大大隔氐成本。然而利用甘薯生粉发酵生产乳酸在实际生产应用上是否可行目前研究的甚少。 本实验利用米根霉3 1 1 7 9 做为出发菌株，甘薯生粉做为原料，通过单因素方差分析和正 交实验结果，得出优化的发酵培养基和培养条件，最佳培养基为m ：甘薯生粉1 2 ，( m l h s o , 0 。3 ，k h 2 p 0 4 0 0 3 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 2 5 ，z n s 0 4 7 啦0 0 0 0 5 ，c a c o a 6 。最佳培养条件为： 3 0 1 _ i _ 培养4 8 h ，摇床转速1 8 0r m i n ，装液量为每2 5 0 m l 三角瓶5 0 m l 。在最佳发酵培养条件 下，米根霉3 1 1 7 9 的摇瓶发酵产生l ，乳酸的鼹大质量浓度为8 9 5 扎，转化率达6 2 3 。 在各项因素中，掘源、碳源、磷源对乳酸发酵的影响最大。由上述i 式验得知米根霉3 1 1 7 9 董1 1 善 一 1 了萝 下1 r 一 | l f 薯生粉直接发酵生产l 一乳酸及高产菌株的西坐筛选 可以利用包括无机氨和有机氮在内的多种氮源。然而在实验过 g 中发现，米根霉对无机蟹c 的 利j 1 j 率远大于对有机氮的利用率，这可能是因为米根霉体内缺乏降解利用有机氮的酶这和 刘娟等人”的结论一致，其具体原因需进一步研究。磷酸盐对发酵反应的影响也非常大。这 是因为磷是核酸和蛋白质的必要成份，也是能量的重要传递者，在代谢途径的调节方面起着 重要作, l t t ”1 。磷有助于糖代谢的进行，可刺激微生物的生长，但磷过量时许多产物的合成将 会受到抑制，所以其加量应严格控制。 此外在实验过程中发现，添加一定星的粗制糖化酶可以大大提高l 乳酸的产量及转化 率。这是因为地瓜生粉中除了含有大量的淀粉颗粒外，还含有一定量的粗纤维、粗蛋白和粗 脂肪等多种物质，这些物质将淀粉颗粒包裹，使得反应不能，彻晓进行”1 。虽然米根霉自身能 够分泌起糖化、液化效果的酶，但量毕竟是少数。米根霉所分泌的糖化酶对淀粉颗粒的分解 速度除了与淀粉颗粒的形态、晶格和直链淀粉的含量有关外，还与结合在淀粉颗粒e 的粗纤 维、粗蛋白和粗脂肪的量有关，结合的越多，分解的速度也就越侵。加入的糖化酶方面可 以水解长链的淀粉颗粒，另一方面可以部分水解粗纤维，使其缠绕的淀粉颗粒暴露，以利于 反应的彻底进行。因此在反应中加入工业级粗制糖化酶对工业e 降低成本、提高效率有重要 意义。 通过e 述的实验结果表明，利用甘薯生粉直接发酵生产l 乳酸是可行的，可以降低生产 成本，提高甘墓的利用率。但目前的菌株还需要增加产量，提高转化率。此外，由于乳酸发 酵的原料、菌株及发酵过程的复杂性，乳酸发酵的模型也需要不断建立和完善。关于通过基 因修饰选育高效菌株是进步深入的研究方向。 r 薯生粉直接发酵生产l 乳暇肚高产裔株的诱变筛选 第三部分高产菌株的诱变及筛选 3 1 前言 基因突变( g e n em u t a t i o n ) 简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构 突然发生的可遗传的变化。突变几率一般在1 矿1 旷范围内“。 突变的类型很多，其中产量突变型是通过基因突变而获得的，在有用代谢产物产量上高 于原始菌株的突变株，也称高产突变株( h i g hp r o d u c i n gm u t a n t ) 。由于产量性状是由许多遗 传因子决定的因此，产量突变型的突变机制是很复杂的，产量的提高般也是逐步累积的。 这类突变在生产实践e 异常重要。 诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率显著 提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突交株，以供 生产实践或科学实验之用。在诱变与筛选两个主要的环节中，筛选的重要性更为突出。 诱变育种具有极其重耍的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产 菌株，儿乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能。诱变育种除能提高代谢产 物的产量外，还可达到改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。从方法上来说，它 具有简便易行、工作进度快和收效显著等优点，所以仍是目前广泛使用的一种育种手段。 诱变剂可以提高突变率，不同的诱变剂其作用方式不同，即使是同诱变镕吼也常有多 种作用方式。 g l n 诱变剂紫外线( u v ) 的生物学效应主要是由于它能引起d n a 结构变化造 成的。d n a 分子强烈吸收紫步 线，可引起d n a 链的断裂、d n a 分子内部和分子闾的交联、 嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚体。其中胸腺嘧啶二聚体的形成是紫外线改变d n a 分子结 构及生物活性的主要途径。脆腺嘧啶二聚体的形成在理论上具有重要的生物学意义。d n a 两 条链间的胸腺嘧啶形成二聚体，会妨碍d n a 双链的正常解开与复制；同一条链相邻胸腺嘧 啶形成二聚体，会妨碍碱基的正常配对，从而引起生物体的基因突变或死亡。 本实验的主要工作就是筛选以米根霉3 1 1 7 9 为亲本的基因突变型的优良菌种。 3 2 实验材料与仪器设备 3 2 1 实验材料 米根霉( r h z o p u s o r y z a e ) 3 1 1 7 9 ，购自中科院北京微生物所。 3 2 2 试剂与仪器 本实验主要试剂均为国产或进口分装。 仪器设备名称生产单位 h i ) - 1 3 6 0 超净t 作台 北京东联哈尔滨仪器有限公司 y x o - l s - 7 5 si i 全自动不锈钢双层立式上每博讯实业有限公司 压力蒸汽灭菌锅 ”薯生粉直接发酵生产l - $ l 敞及高产菌株的诱娈筛选 b s2 2 3 s 电子分析天平 s h2 6 0 2 1 2 6 0 2 精密酸度计 b c d - 2 2 6 雪g 冰箱 h z 0 d 恒温振荡器 7 9 1 恒温磁力搅拌器 d y 譬理稳压稳流电泳仪 j g p 1 0 0 4 型超声波清洗仪 j y 9 2 - 1 1 型超声波细胞破碎仪 2 0 2 - 1 型电热恒温干燥箱 u v - 7 5 0 4 p c 紫外可见分光光度计 1 7 3 0i n f r a r e df o u r i e rt r a n s f o r m s p e c t r o m e t e r 红外光谱仪 r s g - 1 a m 5 0 0 z 核磁共振仪 w x g - 4 型圆盘旋光光度仪 s a n o n u s ( g r 多利斯蚣司 上海犬普仪器有限公司 上海西i 、j 子公司 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 深圳国华仪器公司 北京六一仪器厂 湖南? 州山河电子设备厂 宁波新芝生物科技| l 殳份有限公司 上海浦东荣丰科学仪器有限公司 上海欣茂仪器有限公司 美国p e r k i n - e l m e r 公司 瑞士b r u k e r 公司 上海申光仪器有限公司 3 2 3 培养基 ( 1 ) 甘薯淀粉平板( ) ：甘薯淀粉6 ，( n h 4 ) ：s 0 4 0 3 ，k h u p 0 4 0 0 3 z n s 0 4 7 哟0 0 4 4 ，溴钾酚绿0 0 1 ，脱氧喇0 1 ，琼脂2 。 ( 2 ) 甘薯生粉平板( ) ：甘薯生粉6 ，( n i 峭o , 0 3 ，k h 2 p 0 4 0 0 3 z n s 0 4 7 即( 1 0 4 4 ，溴钾酚绿0 0 1 ，脱氧胆酸钠0 1 ，琼脂2 。 m g s 0 4 7 啪0 0 2 5 m g s 0 4 。7 h p0 1 y 2 5 ( 3 ) 溴钾酚绿平板( ) ：p d a l 0 0 m l ，溴钾酚绿0 0 1 ，脱氧胆酸钠0 1 。 ( 4 ) 圈4 和r 平板( ) ：k m n 0 4 0 2 ，k b r 0 2 5 ，琼脂2 。 ( 5 ) 琥珀酸平板( ) ：琥珀酸3 ，州h 4 璐0 40 6 ，k h 。p 0 40 0 2 ，m g s 0 4 7 h z o0 0 2 5 ， z n s 0 4 7 珏p0 0 4 4 ，f e s 0 40 0 0 1 ，琼脂2 。 ( 6 ) 高葡萄糖平板( ) ：葡萄糖2 0 ，( n - h ) r s o _ 4 0 6 ， 毋0 4 n 0 3 ，m g s 0 4 7 2 0 0 0 2 5 z n s 0 4 - 7 h 妇o 0 4 4 ，c a c 0 37 0 ，琼脂2 。 ( 7 ) 高乳酸平板( ) ：葡萄糖5 ，0 , a - h ) 2 s o , 0 6 z n s 0 4 7 啦0 0 0 4 4 ，乳酸1 0 ，琼脂2 。 ( 8 ) 纯乳酸平扳( ) ：尿素0 2 ， 2 p 0 4 0 0 6 ，m g s 0 4 7 1 1 2 0 0 0 2 5 ，z n s 0 4 7 1 - 1 2 0 0 0 4 4 ， 乳酸5 ，琼脂2 。 3 2 3 1 培养基灭菌方法 以上培养基全部采用1 2 1 c ，2 0 l a i n 湿热灭菌，其中葡萄糖采用0 0 5 m p a 、3 0 m i n ，尿素 0 0 7 5 m p a 、3 m i n ，乳酸和琥珀酸分别用1 2 1 ( 2 ，2 0 r a i n 湿热灭菌后再加入，c a c 0 32 0 0 干 热灭菌。 3 2 3 2 培养基培养方法 以上培养基均在3 0 避光培养2 4h 4 8h 。 3 3 实验方法 i 薯生粉直接发酵生产l 乳酸发商产菌株的诱变筛选 3 3 1 高产菌株的诱变、筛选 3 3 1 1 筛选方案 关于筛选方案，一般认为筛选过程分为初筛和复筛。前者以量( 选留菌株的数量) 为主 后者以质( 测定数据的精度) 为主。初筛的要求是根据在平板上的直观反应挑选高产蘸株。 所谓平板上直观反应，是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示剂作用后的变色圈、 透明圈、生长圈、抑菌圈或沉淀圈。因为它可以粗略的表示菌 朱产生某些生理物质活性的高 低。复筛的过程是在代谢控制发酵育种中对突变株发酵培养基的组成( 包括碳源、氮源、无 机盐、生长因子等) 、种子培养、接种量、培养温度、培养时间、p h 、供氧等参数进行精确 的测定，找出最佳发酵条件，以便放大“。 本课题的筛选方案如卜- ： 第一轮：一株出发菌株型丝墅l 选出二十株单苗落一初筛，每株一瓶一选 出十株一复筛，每株三瓶一选出三株 第二轮：三株出发菌株j 趔型盟一选出二十株一初筛，每株一瓶一选出十株 一复筛，每昧三瓶一选出三株 第三轮、第四轮( 同第二轮) 。 以上筛选工作可以连续进行多轮，直至获得良好结果为止。采用这种筛选方案，不仅可 以通过较少的工作量得到较好的菌株，而且还可以使某些眼前产量虽不高，但有发展前途的 优良菌株不致落选。 3 3 1 2 快速筛选方法的建立 微生物育种工作中筛选环节所花的时间和精力是相当惊人的，因此寻找种高效、快速、 准确的筛选方法是提高效率的重要手段。育种工作者总是希望找到选择性强、准确度高的筛 选方案。快速筛选方法具有很强的针对性，不同的菌株，不同的目的，具有不同的快速筛选 方法。本文根据产物的性质特征，找出了一种快速筛选高产l 导l 酸米根霉菌株的方法。 ( 1 ) 初筛方法的建立 乳酸是一种酸性物质，能够使些酸碱指示剂变颜色。利用产物是酸性物质这特征， 设计了一种筛选方案，即在培养米根霉3 1 1 9 的p d a 培养基里加入酸性指示剂溴钾酚绿 将诱变后的待筛菌涂布于此培养基上培养。米根霉生长过程中产生的乳酸可以使菌落周围的 培养基出现黄色的变色圈。通过测量黄色变色圈直径与菌落直径，计算二者的比值，比值较 大者可初步判断为产量较高菌株，保藏这些菌株进行第二次初筛。 为了减少工作量还设计了第二次平扳初筛方法，将第一次初筛得到的黄色变色圈大的培 养基，用平板挖井法移入k m n 0 4 - k b r 平板中进行第二次初筛。培养2 4 小时后，菌株生长产 生的乳酸会分泌到k m n 0 4 - k b r 培养基中，这样鞘菔会反应产生特异性透明圈，同样测量透 明圈亩径与菌落直径，计算二者比值。选取比值较大的菌株保藏，进行复筛。 为了使诱变得到的突变株更符合正向突变的要求，本实验还设计了第三次平板初筛方法。 将k i v l n 0 4 - i k b r 平板中产生特异性透明圈的菌株移八斜面培养基保存，无菌水打f 孢子制作 l j 。薯生粉直接发酵生产l 乳般发商产菌株的诱变筛选 孢子悬浮液，紫外线照射后涂布于琥珀酸平板中。挑出比原始对_ 菌株生k 明显缓慢的保存 丁：斜面培养基中。 ( 2 ) 复筛方法的建立 将突变菌株和原始出发菌株分* 4 接种于种子培养基中，培养2 4 小时后，按照1 0 的接 种量接种于优化发酵培养基中进行摇瓶发酵，测定l ，乳酸的产量和转化率。 3 3 2 诱变实验设计方法 葡萄糖经e m p 途径生成丙酮酸丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用f 生成乳酸。乳酸的前体 物丙酮酸除生成乳酸外，还在丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的作用下生成乙醇，也可以在 丙酮酸羧化酶的催化下通过二氧化碳作用生成苹果酸和富马酸，丙酮酸经丙酮酸脱氢酶系进 入t c a 循环以提供足够的能量和合成菌体的中间产物。因此，要想提高乳酸的产量，必须 切断或减弱丙酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化反应。 根据对育种的经典方法的研究和对糖酵解途径的分析，本实验特制定了以下的育种思路： ( 1 ) 紫外线照射后利用溴钾酚绿平板筛选出产酸的菌株。( 2 ) 再利用高锰酸钾平板筛选出产 乳酸的菌株。( 3 ) 利用琥珀酸平板筛选出e m p 途径强化，t c a 途径减弱的菌株。( 4 ) 利用 高糖、高酸平板筛选出耐高渗的菌株。( 5 ) 利用纯乳酸平板筛选出不分解利用乳酸的菌株， 即所需要的目的正向突变株。 因此根据米根霉发酵乳酸的代谢机制，k 乳酸高产菌株应具备以下生化特征：( 1 ) 有较 高的乳酸脱氢酶活性。( 2 ) 弱化的丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶活性减弱或失活。( 3 ) 强化的 e m p 途径、弱化的t c a 循环的菌株。( 4 ) 能耐高葡萄糖、高乳酸，不具有以乳酸为唯碳 源而生长的能力。 3 3 3l d h 活性测定 取发酵4 8 小时后的菌丝体洗酐净，压挤水分。称取6 9 湿菌体，按湿菌体重：缓冲液 体积- - 2 ：5 加入0 1m o l l 磷酸缓冲溶液( p 7 5 ) ，在超声波细胞破碎仪中冰浴破碎，然后 以6 ( ) 0 0 r m i n 冷冻薄b 3 0 r a i n ，取e 清液。上清 磅漕先进行硫沉( 4 0 饱和度的( n 地嫡0 4 溶 液，4 1 2 ，2 h ) ，再将硫沉溶液静0 ( 8 ( 0 0 1 0 0 0 0 r r a i n ，2 0 m i n ) ，得到的沉淀物用0 1 m o l l 磷酸缓冲溶液( 证i - 7 5 ) 溶解，并定容至加l n i ，得到乳酸脱氢酶的粗酶液。 取2 只光径为l c m 的石英比色杯，一只比色杯作空白对照，加入3 m l0 1 m o l l ，d h7 5 磷酸盐缓冲液，放入紫步h 分光光度计中，调节为零：另一只比色杯记录l d h 活力， 依次加入2 9 m l 丙酮酸钠溶液和0 1 m ln a d h 溶液，加盖摇匀，测定并记录a l 狮。再加入 稀释后的酶液1 0 u l ，摇匀后，每隔o 5 分钟测定a 值，连续测定3 分钟，记录a 减少 值。 p 岫x 稀释倍数 l d h 活力单位( u m l 酶液) = 酶液加入量( 1 0 u 1 ) 1 0 - 3 t 薯生粉直接发酵生产l 广乳艘及高产荫株的诱垒筛选 3 3 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳的测定 分别取突变菌和原始菌，加入无菌水并_ 】 j 接种环打f 孢予，制成孢子悬浮液，离心 ( 4 0 0 0 f r a i n ，l o m i n ) 取沉淀，按照体积比1 ：4 加入样品缓冲液，沸水浴中加热4 m i n