（药理学专业论文）ae2蛋白在高糖诱导内皮细胞凋亡中的作用.pdf

脉内皮细胞( h u v e c s ) 凋亡中的作 用并初步探讨其可能的作用机制。 方法：将人脐静脉内皮细胞株c r l - 2 4 8 0 ，均匀接种在六孔培养板上，随机 分为六个组：正常对照( c o n t r 0 1 ) 组、低糖( l g ，1 7 8m m ) 组、高糖( h g ， 3 5 6m m ) 组、甘露醇( m n t ，3 5 6m m ) 组、c o n t r o l + s i t s 组以及高糖+ s i t s 组。 各组进行以下指标观察：m t t 法检测细胞存活率：( 虿) r t - p c r 检测删v e c s 中a e 2 m r n a 的表达；( 耍) w e s t e r nb l o t t i n g 检测h u v e c s 中a e 2 蛋白；a n n e x i n - v p i 双 染法检测细胞凋亡的程度；s o d 试剂盒测定细胞内s o d 的活性；d c f h - d a p i 法检测细胞内活性氧( r o s ) 的含量；( d r h o d a m i n e l 2 3 p i 法检测刖v e c s 中线粒体 膜电位变化。 结果：细胞存活率：h g ( 3 8 3 3 6 ) 组、l g 组( 5 5 1 1 0 1 ) 与c o n t r o l ( 9 0 2 9 3 ) 组比较，有显著性差异( p o 0 1 ) ；h g ( 3 8 3 3 6 ) 组较h g + s i t s ( 8 6 4 7 2 ) 组降低4 7 9 ( 尸 o 0 5 ) 。 a e 2 m r n a 的表达：a e 2 各组样本均由对应的b - a c t i n 条带的扫描值标化。a e 2m r n a 在 正常h u v e c s 中呈基础性表达：c o n t r o l 组、l g 组、h g 组、m n t 组a e 2m r n a 表达量 分另0 为o 3 3 0 0 3 、o 6 0 0 0 3 、0 7 9 0 0 3 、0 3 4 0 0 4 。h g 组、l g 组内皮 细胞较c o n t r o l 组a e 2m r n a 转录均显著上调( 尸 o 0 1 ) ；h g 组较l g 组也明显升高 ( p o 0 5 ) 。a e 2 蛋白的表达：a e 2 蛋白各组样本均由对应的1 3 一a c t i n 蛋白条带的扫描值标化。a e 2 蛋白在正常 h u v e c s 中呈基础性表达；c o n t r o l 组、l g 组、h g 组、洲t 组a e 2 蛋白表达量分别为 0 2 5 o 0 4 、0 3 0 0 0 4 、0 3 6 0 0 5 、0 2 6 0 0 4 。h g 组内皮细胞较c o n t r o l 组、l g 组a e 2 蛋白表达显著增加( 尸 o 0 1 ) ；l g 组较c o n t r o l 组a e 2 蛋白表达也 有明显改变( 尸 o 0 5 ) 。细 胞凋亡程度：细胞的凋亡程度通过a n n e x i nv p i 双染色进行分析。与c o n t r o l ( 3 6 0 4 ) 组、l g ( 1 7 6 2 5 ) 组、h g + s i t s ( 1 8 4 2 3 ) 相比，h g 组凋 亡程度明显增加( p 0 0 1 ) ，达到4 5 5 ；l g 组较c o n t r o l 组也有明显增加( p o 0 5 ) 。细胞内s o d 的活性：c o n t r o l 组、l g 组、h g 组、h g + s i t s 组、c o n t r o l + s i t s 组、m n t 组s o d 的活性值分别为( 6 0 2 8 5u m 1 ) ，( 4 5 4 7 7u m 1 ) ，( 3 5 5 3 2u m 1 ) ，( 5 0 6 4 2u m 1 ) ，( 5 8 o 8 2u m 1 ) ，( 5 7 1 9 1u m 1 ) 。h g 组较c o n t r o l 组、l g 、h g + s i t s 组均有显著性差异( 尸 0 0 1 ) ： l g 组较c o n t r o l 组也有明显变化( 尸 0 0 5 ) 。细胞内r o s 的含量：细胞内的r o s 生成使用过氧化物敏感性的荧光探针d c f h - d a 通过流式细胞计量术来检测。 c o n t r o l 组、l g 组、h g 组、h g + s i t s 组、c o n t r o l + s i t s 组、m n t 组细胞内r o s 的平 均荧光强度分别为：2 2 6 2 5 ，5 8 3 3 2 ，1 1 0 4 8 6 ，3 5 0 3 6 ，2 7 5 3 6 ，2 1 8 2 1 。h g 组较其他各组的细胞内r o s 含量明显增加( 尸 o 0 1 ) ，且l g 组与c o n t r o l 组相比较也有显著性差异( 尸 0 0 5 ) 。细胞内线粒体膜电位 的变化：各组细胞内的线粒体膜电位通过罗丹明1 2 3 和p i 染色后的凋亡细胞百分 率来表示，l g 和h g 组均较c o n t r o l 组明显升高( 尸 0 0 1 ) ；而h g + s i t s 组与h g 组 相比明显降低( p o 0 5 ) 。 结论：高糖上调a e 2 蛋白的表达诱导内皮细胞凋亡；高糖诱导内皮细胞凋 亡可能是a e 2 r o s 依赖性的。 关键词：阴离子交换蛋白；糖尿病；高糖；内皮细胞；凋亡 国家自然科学基金( 阴离子交换2 ( a e 2 ) 介导高糖引起内皮细胞损伤及其机 制，：3 0 4 6 0 0 4 8 ) m a b s t r a c t a b s t r a c t o b j e c t i v e ：d y s r e g u l a t i o no f e n d o t h e l i a lc e l l s ( e c s ) i sa l li n i t i a la n dc r u c i a ls t e p o fa n g i o p a t h yr e s u l t e di nb yd i a b e t e sm e l l i t u s ( d m ) a n i o ne x c h a n g e r2 ( a e 2 ) i s l i k e l yt op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei na n g i o p a t h y t h ep u r p o s eo f t h i ss t u d yi st oe x a m i n e t h ee x p r e s s i o no fa e 2i nh u m a nu m b i l i c a lv e i nc e l l s ( h u v e c s ) a n di n v e s t i g a t e w h e t h e ra e 2 p a r t i c i p a t e si nh u v e c sa p o p t o s i si n d u c e db yh i g hg l u c o s e m e t h o d s ：h u v e c sw e r et r e a t e dw i t hd m e mc o n t a i n i n gg l u c o s e ( 5 5 ，1 7 8 ， 3 5 6m m o l l ，r e s p e c t i v e l y ) f o r4 8h c u l t u r e dh u v e c sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o s i xg r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ，l o wg l u c o s eg r o u p ，h i g hg l u c o s eg r o u p ，c o n t r o l + s i t s g r o u p ，h i g hg l u c o s e + s i t sg r o u pa n dm a n n i t o lg r o u p a p o p t o s i sw a sd e t e c t e db y a r m e x i n - v p ia s s a y sa n da e 2m r n a 硒w e l la sp r o t e i nl e v e l sw e r ee x a m i n e db y r t - p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g ，r e s p e c t i v e l y i n t r a c e l l u l a rr o sg e n e r a t i o nw a s d e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r yu s i n gp e r o x i d e - s e n s i t i v ef l u o r e s c e n tp r o b ed c f h - d a c e l lv i a b i l i t yw a sd e t e r m i n e du s i n gm t ta s s a y t h ea c t i v i t y o fs o di nc e l l sw a s m e a s u r e du s i n gs o dk i t r e s u l t s ：1 c e l lv i a b i l i t y ：t h ec e l lv i a b i l i t yo fl o wg l u c o s e ( 5 5 1 1 0 1 ) a n d 1 1 i g hg l u c o s e ( 3 8 3 + 3 6 ) g r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e d 谢t l lt h a t o f c o n t r o lg r o u p ( 9 0 2 - - + 9 3 ) ( p o 0 1 ) ；t h ev i a b i l i t yo fh i g hg l u c o s e + s i t sg r o u p ( 8 6 4 - + 7 2 ) i n c r e a s e d4 7 9 c o m p a r e d 晰t l lt h a to fh i g hg l u c o s e ( p 0 0 1 ) ；t h e r ew a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nv i a b i l i t yo ft h eo t h e rt h r e eg r o u p s ，h i g hg l u c o s e + s i t sg r o u p ， c o n t r o l + s i t sg r o u p ( 8 8 6 - + 6 2 ) a n dm a n n i t o lg r o u p ( 8 5 1 1 0 1 ) ，r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t ht h a to fc o n t r o lg r o u pp o 0 5 ) 2 e x p r e s s i o no fa e 2m r n a ：t h e e x p r e s s i o no fa e 2m r n ai nt h eh i g hg l u c o s eg r o u p ( o 7 9 0 0 3 ) w a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r o lg r o u p ( o 3 3 o 0 3 ) ( | p o 0 5 ) 3 e x p r e s s i o no fa e 2p r o t e i n ：a e 2p r o t e i ni sab a s i ce x p r e s s i o ni nc o n t r o lg r o u p t h e e x p r e s s i o n e l e v e l so fa e 2p r o t e i ni n h i g hg l u c o s eg r o u p ( 0 3 6 0 0 5 ) w a s c o n s i d e r a b l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a to fc o n t r o lg r o u p ( 0 2 5 0 0 4 ) ( p 0 0 1 ) h o w e v e r , t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nm a n n i t o lg r o u pa n dc o n t r o l g r o u pp 0 0 5 ) 4 c e l la p o p t o s i sl e v e l s ：i nh i l g hg l u c o s eg r o u p ，t h ea p o p t o s i s i v a b s t r a c t i n c r e a s e dc o m p a r e dt h a to fc o n t r o lg r o u p ，w h i l e a p o p t o s i sw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d 5 a c t i v i t y v i t yo f i n t r a c e l l u l a rs o di nh i g hg l u c o s eg r o u p ( 3 5 54 - 3 2u r n l ) s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e d 、 ，i n lt h a to fc o n t r o lg r o u p ( 6 0 2 8 5o m l ) ( 尸 o 0 1 ) ；a n dh i g h g l u c o s e + s i t s ( 5 0 6 4 2 u m 1 ) a l s oh a da s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e d 砸t l l1 1 i g hg l u c o s e ( p 0 o1 ) ，o t h e rg r o u p sh a dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ep 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pe x c e p tl o wg l u c o s e g r o u p 6 r o sp r o d u c t i o n ：m e a nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ( m f i ) i n h i g hg l u c o s eg r o u p w a sm o r es t r o n g e r , t or e a c h110 4 ，c o m p a r e d 谢mt h a to fc o n t r o lg r o u p ( 2 2 6 士2 5 ) 妒 o 0 1 ) ，a n dh i g hg l u c o s e + s i t sa l s oh a v eas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e d 、) i ，i n l l l i g hg l u c o s e 妒 o 01 ) o t h e rg r o u p sh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ee x c e p tl o wg l u c o s e g r o u pc o m p a r e dw i t h c o n t r o l g r o u pp 0 0 5 ) 7 m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l ：t h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a lw a sd e m o n s t r a t e db yt h ea p o p t o s i s r a t ea f t e rs t a i n e d 、砘t l lr h o d a m i n e12 3a n dp i t h el gg r o u pa n dh gg r o u pw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r o lg r o u p 妒 0 01 ) ，w h i l et h eh i g l lg l u c o s e + s i t sg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fh gg r o u p 妒 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：h i 【曲g l u c o s eu p r e g u l a t e de x p r e s s i o no fa e 2p r o t e i na n di n d u c e d h u v e c s a p o p t o s i s h i g hg l u c o s e - i n d u c e da p o p t o s i s o fh u v e c s i s a e 2 r o s d e p e n d e n t k e yw o r d s ：e n d o t h e l i a l ；a n i o ne x c h a n g e r ；h i g l lg l u c o s e ；a p o p t o s i s ；d i a b e t e s v 目录 录 第一章引言l 第二章材料与方法3 2 1 主要材料及试剂3 2 2 实验主要仪器和设备4 2 3 实验步骤5 2 3 1 试剂的配制5 2 3 2 实验分组6 2 3 3h u v e c s 存活率的测定6 2 3 4 刖v e c sa e 2 m r n a 含量检测7 2 3 5w e s t e r nb l o t t i n g 法检测h u v e c sa e 2 蛋白的表达9 2 3 6 刖v e c s 凋亡程度的检测l l 2 3 7h u v e c ss o d 活性的检测1 1 2 3 8h u v e c sr o s 含量的检测13 2 3 9 流式细胞术检测h u v e c s 线粒体膜电位变化1 2 2 4 数据处理1 2 第三章结果1 3 3 1 培养人脐静脉内皮细胞的一般特性1 3 3 4 高糖对h u v e c s 存活率的影响”1 3 3 2 高糖上调h u v e c s a e 2m r n a 的表达”1 4 3 3 高糖上调h u v e c s a e 2 蛋白的表达1 5 3 5a e 2 介导高糖引起h u v e c s 凋亡1 5 3 6 高糖对h u v e c ss o d 活性的影响17 3 7 高糖对h u v e c sr o s 含量的影响1 7 3 8 高糖对h u v e c s 线粒体膜电位的影响“1 8 第四章讨论2 0 第五章结论2 4 v l 致谢2 9 附录3 0 攻读学位期间的研究成果。3 7 a e 2 英文缩写及全文和中文对照表 英文缩写及全文和中文对照表 a n i o ne x c h a n g e r 2 阴离子交换蛋白 h u v e c s h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i u m 人脐静脉内皮细 c e l i s l o wg l u c o s e h i g hg l u c o s e m n tm a n n it o l 胞 低葡萄糖 高葡萄糖 甘露醇 s i t s 4 - a c e t a m id o 一4 一is o t h io c y a n a t o 一4 一乙酰胺基- 4 - e c l g l y s o d s t i b e n e 一2 ，2 一d i s l f o n i c a c i d d i t h i o t h r e i t 0 1 e n h a n c e dc h e m il u m i n e s c e n c e f e t a lb o v i n es e r u m g l y c i n e h o r s e r a d is hp e r o x i d a s e s u p e r o x id ed is m u t a s e 异硫氐一2 ，2 一 二磺酸 二硫苏糖醇 增强化学荧光试 剂 胎牛血清 甘氨酸 辣根过氧化物酶 超氧化物歧化酶 d m e m d u l b e c c o sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m达尔伯克培养基 m r n a m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y lt h i a g o l 一2 一y l - 信使核糖核酸 四甲基偶氮唑蓝 o d p b s p k c 英文缩写及全文和中文对照表 d i p h e n y t e t r a 9 0 1 i u mb r o m i d e o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e rs a lin e p r o t e i nk i n a s ec p m s f p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e 光密度 磷酸盐缓冲液 蛋白激酶c 苯甲磺酰氟 t e m e d n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n 一四甲基 t r i s t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t w e e n2 0 p o l y o x y e t h y l e ns o r b it a nm o n o l a u r a t e c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a d e f c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d m s o d i p h e n y l a m i n e r e v e r s e r t p c r t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n p i p r o p i d i u mi o d i d e r o sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s p 1 3 k p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e i x 乙二胺 三羟甲基氨基甲 烷 聚氧乙烯山梨糖 醇 互补d n a 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 逆转录聚合酶链 反应 碘化丙啶 活性氧族 磷脂酰肌醇( 一3 ) 激酶 第一章引言 第1 章引言 糖尿病( d i a b e t i cm e l l i t u s ，d m ) 是以高血糖为特征的全面代谢紊乱性疾 病，常伴有重要脏器的功能和结构性的改变，而心、脑血管及外周血管的病变 是d m 患者致死和致残的主要原因之一。目前认为，d m 患者发生心脑血管事件的 危险性可较正常人增加3 4 倍，严重威胁d m 患者的生活质量和生存质量【1 1 。 d m 血管病变主要受累及的血管有主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉、肠系膜上 动脉等。研究表明，d m 血管病变主要以动脉硬化为特点，该类病变早期表现为 血管内皮功能紊乱【2 】。血管内皮细胞( v e c s ) 是血管壁的第一道屏障，可分泌多 种自体活性物质如一氧化氮( n o ) 、内皮素一1 ( e t 一1 ) 、前列环素( p g l 2 ) 、血 管紧张素i i ( a n gi i ) 、血管假性血友病因子( v w f ) 、黏附分子( 如i c a m - i 、v c 肿1 ) 等，它们之间的相互作用，对于维持血管正常舒缩功能，调节炎性反应及凝血 状态等具有重要意义【引。在抑制动脉硬化的发展过程中，保持内皮细胞正常功能 对于稳定内皮细胞层，降低白细胞和单核细胞的迁移、抑制平滑肌细胞的过度 增殖、改善脂蛋白的摄取和代谢等方面均有重要影响【4 】。 大量研究证实糖尿病或和其他高糖因素在体内外会引起内皮细胞毒性产 生，表现为细胞过度增殖，细胞周期紊乱，d n a 损害增强以及细胞凋亡或坏死。 另外，高糖还影响内皮细胞上黏附分子的表达，同时加重中性粒和单核细胞的 黏附。有研究认为，血管内皮损伤在糖尿病血管病变中是一早期的关键过程【5 1 ， 找到其病变的分子机制并研究其作用靶点的药物是当今一大热点。糖尿病血管 病变的发病机制有许多学说，目前较公认的主要有糖基化终产物( a g e ) 学说和氧 化应激学说1 6 1 。有研究证明高糖状态下的内皮细胞损伤与核转录因( n f - kb ) 丝 裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 【7 1 、p 1 3 k n f kb 、p 1 3 k r o s 钔、a s k l p 3 8 m a p k 9 1 、蛋白 激酶c ( p k c ) r o s 1 0 1 、j n k 1 1 】等信号通路有关，同时钠氢交换蛋白( n h e ) 1 2 】，n 0 【1 3 】 也参与了内皮细胞的损伤和凋亡过程。虽然高糖引起内皮细胞损伤的机制已证 实有多条通路，但与c 1 - 通道蛋白有关的研究却很少。 c l 广泛存在于各种细胞内，为主要通透性的阴离子，参与了细胞多种活动 和功能调节过程，如细胞电活动调节、容积调节、细胞内p h 值调节等，且在细 胞免疫应答、细胞迁移、细胞增殖和分化及细胞凋亡中发挥一定的作用【1 4 l 卯。内 皮细胞内的c 1 。通道蛋白目前证实的主要有阴离子交换蛋白【1 6 1 ( c 1 h c 0 3 - 离子交 换系统) 和n a + 一i c - 2 c i 同向转运体、n a + 依赖性n a + 一c l 。转运体、k + - c l 共同转运 第一章引言 体【1 刀以及新发现的c 1 。o h 。交换体【1 8 1 等， 其中c 1 h c 0 3 离子交换系统起主要作 用。近年来，人们对该交换系统，进行了大量研究。 目前已知的c i h c o ；交换体主要是由两大不相关的超家族编码，i i p s l c 4 和 s l c 2 6 。 s l c 4 家族是研究的比较多的一个，它主要包括四种多肽产物：n a + 非依 赖性的阴离子交换蛋白( a e l ， a e 2 ，a e 3 ， a e 4 ) ，n a + h c 0 3 。同向转运蛋白 ( s l c 4 a 7 n b c n l ) 以及n a 十依赖性c 1 h c o , 。( s l c 4 a 8 和s l c 4 a i o ) ，其中研究最广泛 的是三种n a + 非赖性c i h c 0 3 。，即常说的a e s 家族蛋白【悖】。红细胞的带3 蛋白 ( a e l ) 是最早被确定的阴离子交换蛋白，主要分布在红细胞膜( e a e i ) 和哺乳 动物的肾集合管的a 型闰细胞的基底面( k a e l ) ；a e 2 蛋白最早是从人红白细胞系 k 5 6 2 中分离出来的，是a e s 蛋白家族中表达最广泛的亚型，几乎存在于所有上皮 细胞基底浆膜内【2 蚴】，近年在细胞的高尔基体也检测到了a e 2 【2 4 】；a e 3 蛋白主要 分布在可兴奋组织如脑，心脏，视网膜，平滑肌中，在上皮细胞的项部和基底 部有少量表达瞄j 。由于a e s 大量存在于机体中，因此，本研究室对培养的血管内 皮细胞a e s 的表达情况进行了初步的研究，预实验结果发现，a e l 和a e 3 在内皮细 胞中均未见表达，因此，本课题主要针对a e 2 蛋白进行后续实验研究。 a e 2 是一种多功能嵌膜蛋白，激活它能够将细胞外的c 1 。泵入而将h c 0 3 泵出， 使细胞酸化，调节细胞内外的p h 值，同时也增加细胞内的溶质的浓度和调节细 胞c 1 。，h c o ；和旷的电化平衡【2 6 2 7 , 2 8 】。 已有大量实验证明，a e 2 蛋白参与了多种损伤过程，视网膜上皮细胞凋亡f 2 9 j ， 肾小管上皮功能的紊乱引起的肾小管酸中毒【3 0 】以及心肌细胞的缺血再灌注损伤 p i j 等，但至今国内外尚未见a e 2 蛋白与糖尿病关系的报道。为此，本次试验拟 采用h u v e c s 建立高糖模型，并利用w e s t e r nb l o t ti n g ，r t p c r 等技术方法来观 察h u v e c sa e 2 在高糖模型中的表达变化情况，以探讨a e 2 与糖尿病的相关性， 进一步阐明糖尿病发病的分子机制，为寻找糖尿病血管病变防治的新分子靶点 拓展新的思路。 2 第2 章材料与方法 第2 章材料与方法 2 1 主要材料及试剂 实验用细胞株：购自北医肿瘤所的人脐静脉内皮细胞株 刖v e c 一19 ( c r l - 2 4 8 0 ) 。 d m e m 培养基：g i b c ob r l 公司 胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司 胰酶( t r y p s i n ) ：s i g m a ，美国 青霉素钠盐：江西东风药业有限公司 链霉素：华美生物有限公司 a n n e x i n v f i t c 凋亡试剂盒：肋b i o s c i e n e e s s o d 活性试剂盒：南京建成生物工程研究所 罗丹明1 2 3 ( r h o d a m i n e1 2 3 ) ：s i g m a ，美国 h e p e s ：s i g m a ，美国 二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f i d e ，d m s o ) ：s i g m a ，美国 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t o l ，d t t ) ：s e r v a ，美国 溴酚蓝( b r o m o p h e n o lb l u e ) ：a m e r e s c o ，美国 聚氧乙烯山梨糖醇( t w e e n - 2 0 ) ：a m e r e s c o ，美国 苯甲磺酰氟( p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e ，p m s f ) ：s i g m a ，美国 叠氮钠：北京华美生物工程公司 丙烯酰胺：北京华美生物工程公司 n ，n ，一亚甲双丙烯酰胺：北京华美生物工程公司 四甲基乙二胺( t e m e d ) ：a m e r e s c o ，美国 甘氨酸( g l y c i n e ) ：b i o m o l ，美国 抑肽酶( a p r o t i n i n ) ：s i g m a ，美国 亮抑肽酶( l e u p e p t i n ) ：s i g m a ，美国 硫酸十二烷基钠( s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e ，s d s ) ：b i o m o l ，美国 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) ：r o c h e ， 美国 1 7 0 k d 蛋白m a r k ：f e r m e n c h ，加拿大 第2 章材料与方法 a e 2 多克隆抗体：s t a k r u z ， 美国 b - a c t i n 多克隆抗体：s t a k r u z ，美国 s o d 多克隆抗体：s t a k r u z ，美国 6 0 a ta n t i - r a ti g g h r p ( 辣根过氧化物酶) ：北京中山生物技术有限公司 醋酸纤维膜( n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e ，n c ) ：a m e r s h a m ，美国 丽春红( p o n c e a us ) ：s i g m a ，美国 增强化学荧光试剂( e c l ) ：浙江大学医学院分子生物学实验室 t r i z o l 试剂：i n v i t r o g e n 公司 m m l v 逆转录酶( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ) ：p r o m e g ac o r p o r a t i o n r n a 酶抑制剂( r n a s i n ) ：p r o m e g ac o r p o r a t i o n d n t p ：p r o m e g ac o r p o r a tio n 0 1 i g o ( d t ) 1 5 ：p r o m e g ac o r p o r a t i o n t a q 酶：宝生物工程( 大连) 有限公司 引物：上海生工生物工程技术服务有限公司 溴化乙锭：a m e r s c o ，美国 d l 2 0 0 0 一m a r k e r ：北京鼎国生物技术中心 2 2 实验主要仪器和设备 二氧化碳培养箱：长沙长锦应用技术研究所 倒置显微镜：o l y m p u s ，日本 超净工作台：苏州净化设备厂 7 5 2 紫外分光光度计：上海第三分析仪器厂 肋一2 0 0 3 型电子天平：上海第三分析仪器厂 t g l - 1 6 g 高速台式冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂 m l - 9 0 2 定时恒温磁力搅拌器：上海浦江分析仪器厂 p h s - 2 5 型p h 计：上海精密科学仪器有限公司 全自动生化分析仪：美国b e c k m a n 公司 6 5 2 一酶联免疫检测仪：l a b s t s t e m s ，芬兰 超低温冰箱( - 7 0 ) ：s a n y o ，日本 e p p e n d o r f 加样器：e p p e n d o r f ，德国 4 第2 章材料与方法 垂直电泳一转膜装置：b i o - r a d 3 0 0 ，美国 p c r 扩增仪：p e 公司 2 3 实验步骤 2 3 1 试剂的配制 p b s ：n a c l8 0 0g ，k c l0 2 0g ，n a 2 h p 0 4 h 2 01 5 6g ，k h z p 0 40 2 0g ，少 许三蒸水溶解，调整p h 为7 4 ，加入三蒸水至i 0 0 0m l ，高压蒸气灭菌，4 保 存。 d - h a n k s 液：n a c l8 0 0g ，k c l0 4 0g ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 0 3 7g ，k h 2 p 0 4 o 0 6g ， n a h c o 。0 3 5g ，酚红o 0 2g ，用三蒸水溶解，调整p h 为7 2 ，加入 三蒸水至i 0 0 0m l ，高压蒸气灭菌，4 保存。 0 2 5 胰蛋白酶( 含0 0 2 的e d t a ) ：胰蛋白酶0 2 5g ，0 0 2ge d t a 用 d - h a n k s 液溶解，调整p h 为7 2 ，加入三蒸水至1 0 0m l ，经正压过滤除菌分 装，于4 保存。 d m e m 培养液：m e m 一包加三蒸水i 0 0 0m l ，加入青霉素i 0 0u m l ，链霉素i 0 0 u m l ，n a h c 0 32 3g ，过滤除菌，临用时加入1 0 的f b s ，并调整p h 为7 3 5 。 细胞裂解液( 1 y s i n gb u f f e r ) ：t r i s5 0m mp h8 0 ，n a c l1 5 0m m ，s o d i u m d e o x y c h o l a t e1 ，s d s0 1 ，n p 一4 0 1 ，p m s fl m m ，a p r o t i n i nl ol ig m l ， l e u p e p t i ni 0pg m l 。 3 0 凝胶储存液：单体丙烯酰胺2 9 1g ，双体n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺0 9 g ，加三蒸水至1 0 0m l ，过滤后，备用。 1 mt r i s h c l 溶液：t r i s1 2 1g ，加三蒸水至8 0m l ，用浓h c l 调整p h 为6 8 ，混均后加三蒸水至1 0 0m l 。 1 5 mt r i s h c l 溶液：t r i s1 8 1 2g ，加三蒸水至8 0m l ，用浓h c l 调整 p h 为8 8 ，混均后加三蒸水至1 0 0m l 。 5 s a m p l eb u f f e r ：t r i s - h c l0 2 5m ( p h 6 8 ) ，s d s1 0 ，d t t0 2m m ， g l y c e r o l2 0 ，b r o m o p h e n o lb l u e0 5 。 电泳缓冲液：t r i s - h c l2 5i i l m ( p h 8 3 ) ，g l y c i n e1 9 2i l l m ，s d s0 1 。 半干转移缓冲液：t r i s - h c l2 4m m ，g l y c i n e1 9 2i i l m ，m e t h a n o l2 0 。 t t b s ：t r i s h c l2 0l i l m ( p h 7 5 ) ，n a c l5 0 0m m ，t w e e n 2 00 0 5 。 5 第2 章材料与方法 封闭缓冲液：脱脂奶粉3 0g ，t t b s3 0m l 。 考马斯亮蓝染液：0 2 5g 考马斯亮蓝r - 2 5 0 溶解于1 0 0m l5 0 乙醇：冰乙 酸( 9 ：1 ) 混合液。 洗脱液：5 0 乙醇：冰乙酸( 9 ：1 ) 混合液。 丽春红染液：0 2 5g 丽春红溶解于5 0m 1 含0 1 m l 冰乙酸的蒸馏水中。 含不同浓度葡萄糖的培养液：配置正常d m e m 培养液各5 0 0m l ，分别加入葡 萄糖1 1 9 和2 7g ，使其终浓度分别为1 7 8i l l m 和3 5 6i i l m ，过滤除菌，4 。c 保 存。 甘露醇培养液：甘露醇2 7 3 2g 溶解于5 0 0m l 正常d m e m 培养液中，终浓 度为3 5 6i l l m ，过滤除菌，4 保存。 s i t s 储存液：称取s i t s 粉剂0 0 0 5g ，溶解于1 0m 1o 9 9 6 的生理盐水中， 终浓度为0 1i i l m ，过滤除菌，4 保存。 罗丹明1 2 3 储存液：将罗丹明1 2 3 粉剂0 0 0 2 5g 溶解于5m ld m s o 中，- 2 0 保存。 2 3 2 实验分组 共分6 组，每组复孔，重复4