（应用化学专业论文）有机溶剂中脂肪酶催化制备生物柴油的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名彳可玄刎 时间：x 旬年彭月，二日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 司虿砌 l 锄 时间：，钾年f 月，凋 时间： 年占只l 日 3 摘要 生物柴油是由动植物油脂转化得到的环保型可再生能源。生物酶法合成生物 柴油具有反应条件温和，无污染物排放等优点，是近年来的研究热点。针对目前 生物酶法制备生物柴油反应过程中酶易失活，使用寿命太短，从而导致生产成本 过高的问题，本论文采用在有机介质叔丁醇中酶促油脂甲醇解反应制备生物柴油 的新方法，并系统研究了叔丁醇反应介质中，脂肪酶催化油脂转化为生物柴油的 催化特性。 首先考察了叔丁醇介质中，酶促精制大豆油甲醇解制备生物柴油时脂肪酶的 活性，对影响脂肪酶活性的因素和反应条件进行了优化，并提出了脂肪酶二步催 化油脂的工艺。在优化的反应条件下，生物柴油得率可达9 3 ，在原来的基础上 缩短了一半的反应时间，从而降低了能耗。 论文研究了油脂中磷脂、水分等因素对酶活性的影响。磷脂对l i p o z y m e i m t l 存在可逆抑制，但对n o v o z y m4 3 5 产生的负面影响不可恢复：当反应体系中 的水活度超过0 4 4 ，油脂的最终转化率开始明显降低；油脂中含游离脂肪酸时， 脂肪酸比中性油脂更易被转化为生物柴油，但游离脂肪酸甲酯化生成的水会影响 油脂转化成生物柴油的最终得率。此外，副产物甘油在反应体系中的累积和反应 体系p h 值同样影响着酶促油脂甲酯化反应的进行。 论文采用叔丁醇萃取蓖麻油在脂肪酶催化下制备生物柴油。将原本作为反 应溶剂的叔丁醇作为萃取剂萃取蓖麻籽粉中的蓖麻油，并将萃取蓖麻毛油直接用 作生物柴油的反应原料。从提油率和萃取毛油中的磷脂含量两方面考虑，通过正 交试验选出了最合适的提油条件：溶剂用量为蓖麻籽粉的6 倍，提油时间4 小时， 提油温度2 5 c ，提油率为6 3 ，磷脂含量为0 0 3 7 。采用蓖麻油作原料酶促甲 酯化反应制备生物柴油比以大豆油为原料要节约反应时间，能够大量的降低能 耗。 关键词：生物柴油脂肪酶叔丁醇 甲酯化反应 4 a b s 仃a c t t h eb i o d i e s e li st h ee n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o nr e n e w a b l ee n e r g yw h i c ho b t a i n sb y t h ez o o l o g ya n db o t a n yf a tt r a n s f o r m a t i o n t h eb i o l o g i c a le n z y m es y n t h e s i sb i o d i e s e l h a st h er e s p o n s ec o n d i t i o nt ob et e m p e r a t e ，m e r i ta n ds oo nn o n p o l l u t a n te m i s s i o n , w a s t h er e c e n ty e a r sr e s e a r c hh o ts p o t i nv i e wo ft h ep r e s e n t - i np r o c e s so fe n z y m e p r e p a r a t i o nf o rb i o d i e s e lr e a c t i o n , e n z y m ei se a s yt od e a c t i v a t i o n ，t h ef i f ei ss h o r t , t h u s c a u s e dt h ep r o d u c t i o nc o s t st o om u c h , t h ep a p e ru s et h en e wm e t h o dt h a tt h ee n z y m e p r e p a r a t i o nf o rb i o d i e s e lt h r o u g ha r m o re s t e r i f i c a t i o nr e s p o n s ei nt h eo r g a n i cm e d i u m t e r t - b u t a n o la n dt h ep a p p e rh a ss t u d i e dt h ec a t a l y z e dc h a r a c t e r i s t i co ft h ef a te n z y m ei n t h et e r t - b u t a n o lr e s p o n s em e d i u mw h e ni tc a t a l y s i sf a tt r a n s f o r m e dt ot h eb i o d i e s e l 。 f i r s ti n s p e c t e dt h ea c t i v i t yo fl i p a s ew h e ni tp r e s m st h ep u r i f i c a l5 0 y b 啪o i l a l t l l o ra l c o h o l y s i st op r e p a r a t i o nf o rb i o d i e s e li nt h et e r t b u t a n o lm e d i u m t h ef a c t o r a f f e c t e dt h ef a te n z y m ea c t i v i t ya n dt h er e s p o n s ec o n d i t i o nh a v ec a r r i e do nt h e o p t i m i z a t i o n ，a n dp r o p o s e dt h el i p a s et w o - s t e pc r a f t u n d e rt h eo p t i m i z e dr e s p o n s e c o n d i t i o n ，t h eb i o d i e s e lr a t em a yr e a c h9 3 ，r e d u c e dh a l fr e a c t i o nt i m ei nt h eo r i g i n a l f o u n d a t i o n ，t h u sd e c r e a s e dt h ee n 盱g yc o n s u m p t i o n t h ep a p e rh a ss t u d i e df a tp h o s p h a t i d ea n dt h ew a t e rc l a s s i f i c a t i o nf a c t o rh o wt o i n f l u e n c et h ee n z y m ea c t i v i t y t h ep b o s p h a t i d eh a st h er e v e r s i b l es u p p r e s s i o nt o l i p o z y m e l mt l ，b u tt h en e g a t i v ei n f l u e n c ew h i c h4 3 5p r o d u c e st on o v o z y mc a n n o t r e s t o r e ；r h e nt h ew a t e ra c t i v i t ys u r p a s s e s0 4 4i nt h er e a c t i n gs y s t e m , t h ef a tf i n a l c o n v e r s i o nr a t es t ：f st or e d u c eo b v i o u s l y ；w h e nt h ef a ti n c l u d i n gf r e ef a t t ya c i d s ，t h e f a t t ya c i di se a s yt ot r a n s f o r m e da st h eb i o d i e s e lc o m p a r e dt ot h en e u t r a lf a t ，t h e a c c u m u l a t i o no fb y p r o d u c tg l y c e r i n ei nr e a c t i n gs y s t e ma f f e c t st h ee n z y m ea n dt h e r e a c t i n gs y s t e msp hv a l u ea f f e c t st h ea r m o re s t e r i f i c a t i o nr e s p o n s e t h ep a p e ru s e st h et e r t - b u t a n o le x t r a c t sc a s t o ro i lt op r e p a r et h eb i o d i e s e lu n d e r t h ef a te n z y m ec a t a l y s i s t e r t - b u t a n o le x t r a c t st h ec a s t o ro i lf r o mc a s t o rs e e d ，a n du s e t h ee x t r a c t e dc a s t o r - o i lt op r e p a r eb i o d i e s e l t h ep a p p e rc o n s i d e r e df r o mu n r e f i n e d o i l sp h o s p h a t i d ec o n t e n ta n dt h er a t eo fd e l i v e ro i l ，h a ds e l e c t e dt h em o s ta p p r o p r i a t e c o n d i t i o nt h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：t h es o l v e n ta m o u n tu s e di sc a s t o rs e e d 5 p o w d e r6t i m e s ，t h ed e l i v e ro n st i m ei s4h o u r s ，t h ed e r i v e ro i l st e m p e r a t u r ei s2 5 ， t h er a t eo fd e r i v e ro i li s6 3 ，t h ep h o s p h a t i d ec o n t e n ti s0 0 3 7 u s et h ec a s t o r - o i lt o p r e p a r eb i o d i e s e lt h r o u g ht h ea r m o re s t e r i f i c a t i o nr e s p o n s ec a ns a v et h er e a c t i o nt i m e a n dr e d u c et h ee n e r g yc o n s u m p t i o n k e y w o r d s ：b i o d i e s e ll i p a s e t e r t - b u t a n o l a r m o re s t e r i f i c a t i o nr e s p o n s e 6 第1 章前言 1 1 生物柴油的兴起 近年来，随着石油储量的日益减少以及人类对石油燃烧所带来的地球环境影响 的关注，开发新的、对环境无害的可再生燃油成为许多科学工作者的奋斗目标。柴 油是许多大型车辆( 如卡车、内燃机车及发电机等) 的主要动力燃料，具有动力大、 价格便宜等优点，在各类石油产品的消费中占有相当大的比例。但是柴油应用中存 在的主要问题是燃烧效率较低，对空气污染严重，如产生大量的颗粒粉尘，c 0 2 排放 量高等。虽然现在人们开始研究采用其他燃料( 如燃料酒精) 代替汽油，但是对大 多数需要柴油为燃料的大动力车辆( 如公共汽车、内燃机车及农用汽车如拖拉机等 主要以柴油为燃料的发动机) 而言，燃料酒精并不适合。因而寻找适合的柴油燃料 替代品成为关注的焦点。 生物柴油，属于可再生能源的一种，是指由大豆油、蓖麻油等植物油或者动物 脂肪等油脂类物质与短链醇( 如甲醇、乙醇等) ，经过酯交换反应 ( t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ) 而得到的有机脂肪酸酯类物质“1 ，如图1 1 。 行宵 f h ：。o - c - r i r - o - c r i 号h 2 - o h l h 也k + ，r o n 坚r ，以如+ ! l 胃宵 i c h , - o 。c 。r 。o d c h - o h 动植物油脂短链醇乍物柴油甘油 图1 1 酯交换反应制备生物柴油 f i 9 1 1p r e p a r a t i o nf o rb i o d i e s e lo nt r a n s e s t e r i f i c a t i o n 其性能与零号柴油相近，但是燃烧生物柴油发动机排放出的尾气，含有害物 比燃烧石化柴油尾气排放有害物降低了5 0 。近年来，欧美国家政府大力推进生物 柴油产业。2 0 0 1 年，欧盟国家生物柴油产量突破1 0 0 万吨，美国2 0 0 1 年的产量为 6 万吨。我国柴油需求量也很大，2 0 0 1 年的需求量约为7 4 0 0 万吨，其需求增长率 远高于汽油的需求增长率，专家预测，二者差距将继续扩大。1 。有关生物柴油的研 究是目前国内外兴起的一个新的研究领域。 1 0 1 2 生物柴油的特点及开发生物柴油的意义 与传统的石化柴油相比，生物柴油有许多不可比拟的优点。1 ： ( 1 ) 制备生物柴油的原料可再生。 ( 2 ) 生物柴油本身环境友好。生物可分解、毒性低，与普通的石化柴油相比，生物 柴油燃烧后的尾气中各种污染物的含量变化如表1 2 所示。 ( 3 ) 闪点高，运输和储藏都更加安全。生物柴油的闪点 1 1 0 。 ( 4 ) 十六烷值高。 ( 5 ) 与石化柴油能以任何比例互溶。 表1 2 生物柴油与石化柴油的污染物比较 t a b l e l 2t h eb i o l o g i c a ld i e s e lo i la n dt h ep e t r i f i e dd i e s e lo i lp o l l u t a n tc o m p a r e s 除此之外，生物柴油还具有以下优点“3 ： ( 1 ) 以可再生的动物及植物脂肪酸单酯为原料，可减少对石油的依赖。据有关 国际机构分析，全世界的石油储量为4 8 6 0 亿吨，其中1 2 1 0 吨已经开采出来，1 6 0 0 亿吨已经探明，还有2 0 5 0 吨有待探明。2 0 0 0 年世界石油开采量为3 7 亿吨。按照 这个速度，目前探明的石油储量只够用5 0 年。当然，每个国家的资源和消费量是 不同的。如果按照发达国家的消费量计算，已探明的石油储量只够用9 年。如果美 国人开采本国石油，其储量仅够开采3 年。如果不加限制，我国最多能开采8 年。 由此可见，世界的石油储量逐渐减少。因此，节约能源、开发新的可再生的替代性 燃料将是2 1 世纪人类的最重要课题。 ( 2 ) 环境友好，采用生物柴油尾气中有毒有机物排放量仅为十分之一，颗粒物 为普通柴油的2 0 ，一氧化碳和二氧化碳排放量仅为石油柴油的1 0 ，无硫化物和 铅及有毒物的排放：混合生物柴油可将排放含硫物浓度从5 0 0 p p m ( p p m 百万分之一) 降低到5 p p m 。 ( 3 ) 不用更换发动机，而且对发动机有保护作用。 在我国发展生物柴油产业意义也十分重大“1 ： 一方面发展生物柴油有益于保护生态环境。生产生物柴油的能耗仅为石油柴油 的1 4 ，可显著减少燃烧污染排放；生物柴油无毒，生物降解率高达9 8 ，降解速 率是石油柴油的两倍，可大大减轻意外泄漏时对环境的污染：利用废食用油生产生 物柴油，可以减少肮脏的、含有毒物质的废油排入环境或重新进入食用油系统：在 适宜的地区种植油料作物，可保护生态，减少水土流失。 另一方面发展生物柴油可增强我国石油安全。2 0 0 1 年我国的原油产量为1 6 5 亿吨，而石油产品消费2 亿多吨，今后长期大量进口石油已成定局，发展生物柴油 在近期能够缓解柴油供应紧张，长期可大量替代进口。若到2 0 1 0 年我国生物柴油产 量达到千万吨以上，将对我国石油安全做出重大贡献。 此外，发展生物柴油还带来了一系列的好处，例如种植油料作物生产生物柴油， 使农产品向工业品转化，产品市场广阔，是一条强农富农的可行途径，创造了大量 就业机会，带动农村及区域的经济发展，为国家和地方增加税收。 1 3 生物柴油的生产方法 从最初开始利用油脂来作为燃料油的历史来看，生物柴油的制造方法经历了以 下四个阶段”1 ： ( 1 ) 植物油直接使用和混合。美国生物柴油最常用的原料为菜油，最常用的混 合比例是2 0 生物柴油和8 0 常规石油( b 2 0 ) 。以菜油替代柴油的优点在于：1 ) 液态、轻便；2 ) 热值高( 为柴油的8 0 ) ；3 ) 容易得到；4 ) 可再生。缺点在于： 1 ) 高粘度；2 ) 低挥发性；3 ) 不饱和碳氢链反应。实验结果显示，脱胶的大豆油与 二号柴油以1 ：2 混合，适于在柴油短缺期间的农用设备使用。使用菜油作燃料的两 个严重问题在于油变质和不完全燃烧。实践证明，以菜油直接替代或混合方法制得 的柴油无论是直接或间接使用到柴油机上都是不太实际的。 ( 2 ) 微乳法。为解决菜油的高粘度问题，可使用甲醇、乙醇和1 一丁醇进行微 乳化，形成微乳液。微乳液是由水、油、表面活性剂等成份以适当的比例自发形成 的透明、半透明稳定体系，其分散相颗粒极小，一般在0 0 1 - - 0 2 u m 之间。在特殊 条件下，由极性有机物、水和油也能形成微乳。微乳化能使燃烧更加充分，提高燃 烧率，降低废气中有害气体的含量。 ( 3 ) 热解。热解是在催化剂作用下，以加热的方式使一种物质转化为另一种。 由于反应途径和反应产物的多样性，热解反应很难量化。热解的原料包括菜油、动 物油、天然脂肪酸和脂肪酸的甲酯。热解的设备较昂贵，此外产品与石油衍生物如 天然气的化学成份类似。 ( 4 ) 酯交换。酯交换是使脂肪或油与短链醇类反应形成酯和甘油，使用催化剂 改进反应速率和得率。 现在所指的生物柴油通常指的是通过酯交换反应得到的脂肪酸甲酯。根据该反 应中选择的催化剂不同，分为化学方法和生物酶法两种方法。 化学方法中使用酸性或者碱性催化剂催化动物或植物油脂与短链醇( 如甲醇) 进行转酯化反应。常用的碱催化剂有n a o h 和c h 。o n a ，碱催化反应比酸催化得快。若 原料油中自由脂肪酸和水的含量较高，则酸催化效果更好。化学方法的优点是反应 时间短，成本较低。但是存在如下一些缺点：工艺复杂，需要使用大量甲醇；反应 物中不饱和脂肪酸在高温下容易变质；生成过程中有废碱液排放，残留碱时柴油中 有皂生成，容易堵塞管道；生成的脂肪酸甲酯、甘油以及多余的甲醇难以回收，处 理成本高。 生物酶法合成生物柴油，是指利用脂肪酶作为催化剂催化动植物油脂和短链醇 ( 如甲醇) 进行转酯化反应，具有条件温和，醇用量小，无污染物排放，反应液静 置分层后即可将脂肪酸甲酯与甘油分离等优点。故而利用酶法生产生物柴油已成为 目前研究的热点。但目前主要存在的问题是酶的价格偏高，且反应过程中酶容易失 活，大大缩短了酶的使用寿命，从而使得生产成本增加；反应时间较长，转化率低。 表1 3 对柴油的几种生产方法的优缺点进行了比较： 表1 3 柴油的生产方法比较 t a b l e1 3d i e s e lo i lp r o d u c t i o nm e t h o dc o m p a r i s o n 此外，利用“工程微藻”生产生物柴油是柴油生产一个新动向0 1 。所谓“工程 微藻”即通过基因工程技术建构的微藻，为柴油生产开辟了一条新的技术途径。美 国国家可更新能源实验室( nr e l ) 通过现代生物技术建成“工程微藻”，即硅藻 类的一种“工程小环藻”( c y c l o t e l l ac r y p t i c a ) ，在实验室条件下可使脂质含量增 加到6 0 以上( 一般自然状态下微藻的脂质含量为5 - 2 0 ) ，户外生产也可增加 到4 0 以上。这是由于乙酰辅酶a 羧化酶( a c c ) 基因在微藻细胞中的高效表达， 在控制脂质累积水平方面起到了重要作用。目前正在研究合适的分子载体，使a c c 基因在细菌、酵母和植物中充分表达，还进一步将修饰的a c c 基因引入微藻中以获 得更高效表达。因此，利用富含油质的微藻或“工程微藻”生产生物柴油，可以大 大提高生产能力，具有重要的经济意义和生态意义。 1 4 国内外研究现状 美国是最早研究生物柴油的国家，美国是黄豆王国，所以以黄豆油为原料制取 生物柴油比较普遍。美国从2 0 世纪9 0 年代初开始将生物柴油投入商业性应用，迄 今已初具规模。目前已有4 家生产厂( i n t e r c h e me n v i r o n m e n t 、a g e n v i m e n t a l 1 4 p r o d u c t s 、t w i nr i v e r s t e c h n o l o g y ( t r t ) 、n o p o cc o r p ) 生产，总生产能力为3 0 万吨年。美国在黄石公园进行的6 0 万公里的行车实验，没有任何结焦现象，空气 污染物排放降低了8 0 以上。美国b 2 0 是采用2 0 生物柴油的柴油，尾气污染物排 放可降低5 0 以上。1 9 9 2 年美国能源署及环保署都提出生物柴油作为清洁燃料，美 国前总统克林顿1 9 9 9 年专门签署了开发生物质能的法令，其中生物柴油被列为重点 发展的清洁能源之一，国家对生物柴油的税率为o m 。 日本1 9 9 5 年开始研究用饭店剩余的煎炸油生产生物柴油。据报道，日本每年的 食用油脂消耗约为2 0 0 万吨，而废弃的食用油达4 0 万吨，约占2 0 “。在1 9 9 9 年 建立了2 5 9 升天用煎炸油为原料生产生物柴油的工业化实验装置，可降低原料成 本。目前日本生物柴油年产量可达4 0 万吨年。日本研究者已经开展了生物酶法合 成生物柴油的部分研究“1 。 德国目前己拥有8 个生物柴油的工厂，德国2 0 0 0 年生物柴油产量达2 5 万吨。 拥有3 0 0 多个生物柴油加油站。并且制定了生物柴油的标准，对生物柴油不收税“1 。 法国、意大利等欧洲国家都建立生物柴油的企业。法国雪铁龙集团进行了生物 柴油的试验，通过1 0 万公里的燃烧试验，证明生物柴油是可以用于普通柴油发动机 的。其使用的标准是在普通石油柴油中添加5 的生物柴油0 1 。 此外，奥地利、比利时、丹麦、匈牙利、西班牙等国家也都建有生物柴油生产 厂。目前文献研究报道的主要有化学法和脂肪酶催化法合成生物柴油。其中化学法 合成生物柴油的技术已经比较成熟，并且已经有了广泛的应用，生物酶法( 包括胞 外脂肪酶和胞内脂肪酶两种) 合成生物柴油的研究则还是刚刚起步。由于化学方法 带来的高能耗、废液排放等问题，生物酶法合成生物柴油的方式已经引起了国内外 研究者们的广泛关注。 1 4 1化学法合成生物柴油“”1 化学法合成生物柴油包括酸催化剂和碱催化剂两种。酸催化剂主要有硫酸、磷 酸、盐酸以及磺酸等；碱催化剂则主要包括n a o h 、k o h 、碳酸盐和醇盐( 如甲醇钠、 乙醇钠等) 。 般来说酸催化比碱催化的速度要慢得多，但是当反应原料中含有较多的水和 游离脂肪酸时，使用酸催化剂则更合适，否则在碱性催化剂环境中，游离的脂肪酸 容易发生皂化反应生成脂肪酸盐，不仅消耗了碱催化剂，降低了反应速度，而且生 1 5 成的皂化物增大了反应体系的粘度和甘油分离的困难。 i a 等人“”研究得到只有当原 料油中游离脂肪酸含量低于0 5 时，才适合使用碱催化剂。影响该反应转化率的主 要因素有油醇比和催化剂的类型。大量的研究发现高的甲醇量可以获得较高的反应 转化率，而且在各种碱催化剂中以甲醇钠的催化效果最好，目前工业生产通常都采 用6 ：1 的醇油比例碱催化生成的甲酯含量可以高达9 8 。 1 4 2 酶法制备生物柴油研究进展 生物酶法所用的催化剂有脂肪酶( 胞外脂肪酶) 和微生物细胞( 产胞内脂肪酶) 两大类。可用于催化合成生物柴油的脂肪酶有酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、毛霉脂肪 酶、猪胰脂肪酶等。由于脂肪酶的来源不同，其催化特性也存在很大差异。n e l s o n 等“”在正己烷体系中利用不同脂肪酶催化油脂和短链醇的转酯反应合成生物柴油， 结果发现在油脂与伯醇的转酯反应中，来自彪m i e h e i 的脂肪酶催化活性最高，而 在油脂与仲醇的转酯反应中，来自a n t a r c t i c a 的脂肪酶催化活性最高。k a i d e 等“”在无溶剂体系中研究了水对c ，增，d 船、尸c e p a c i a 和p ， u o r e s c e n s 三种脂 肪酶催化油脂醇解合成生物柴油的影响，结果表明前两种脂肪酶在水含量较高时活 性较高，而来自pf u o t e s c e d s 的脂肪酶则随着水含量的增加酶活性下降。 利用脂肪酶催化油脂醇解合成生物柴油，酶在反应过程中容易失活，并且脂肪 酶价格昂贵，使用酶作催化剂时生产成本较高。为了开发有效的生物酶法制备生物 柴油的工艺，国内外研究者“”1 开展了多方面的研究。 油脂醇解反应生成的副产物甘油吸附在脂肪酶表面，容易堵塞颗粒状固定化酶 的孔径，使固定化酶的使用寿命大大降低“1 ，并且甘油吸附在酶表面阻碍了反应物 向酶扩散而降低反应速率。b d l a f i b a k 6 等。1 发现脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 催化葵花籽油 醇解合成生物柴油的过程中，副产物甘油会影响脂肪酶的催化活性，反应速率和生 物柴油得率均明显降低，采用膜解析的方式及时分离甘油，可使脂肪酶的使用寿命 延长。华南理工大学的吴虹等人伽1 利用脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 催化餐饮业废油时，发现 甘油吸附于固定化酶载体表面使脂肪酶的催化活性迅速下降，采用丙酮洗涤脂肪酶 除去酶上吸附的甘油可以提高酶的稳定性。d o s s a t 等”证明，在用来源于 r h i 2 z o m u c o rm e i h e i 的固定化脂肪酶l i p o z y m e o r 催化高油酸葵花籽油与丁醇的连 续化转酯反应中，甘油完全吸附于固定化酶载体的表面他们认为甘油在酶表面的吸 附会使酶微环境的水活度降低，偏离反应的最适水活度：另外，甘油可在酶表面形成 1 6 一亲水层，阻碍了疏水性底物的扩散，增大了传质阻力，导致酶反应速度迅速下降 d o s s a t 等田1 用脂肪酶l i p o z y m e “r m 催化油脂三步甲醇解时，发现反应第一批 次的生物柴油得率可达9 5 ，但是脂肪酶在回用时表面所吸附的甘油使得其催化活 性迅速下降，使用丁醇等有机溶剂洗涤溶解脂肪酶表面的甘油，可以在一定程度上 恢复脂肪酶的催化活性。 1 5 有机相中的酶催化 传统观念认为，生物体内具有催化作用的酶只能在水溶液中发挥作用，一旦与 有机溶剂接触则会失去其催化活性，而1 9 8 4 年美国麻省理工学院的k l i b a n o v 在 s c i e n c e 上报道了脂肪酶不仅能够在有机溶剂中保持稳定，还能显示出很高的催 化转酯活力。1 。从此，人们迅速认识到有机相中的酶催化反应所具有的许多新特征 和优势乜9 1 ：可催化水不溶性化合物的转化；可防止由水引起的副反应，催化水 解的酶可催化转酯、酯化、酯交换、氨解等反应；由于酶不溶于大多数有机溶剂， 反应后易于回收和重复利用；使用挥发性有机介质，反应后产物分离能耗降低等。 正是由于酶促反应在有机相体系中的应用发展，促成了脂肪酶催化非水溶性底物油 脂转酯合成生物柴油的研究。 1 5 1有机相体系中水对酶催化反应的影响 严格地说，酶在完全无水的条件下是没有催化活性的，因为水分子直接或间接 地通过氢键、静电作用、疏水键、范德华力等分子力维持着酶分子的活性构象、3 ”。 但并非水溶液中所有的水分子都与酶的催化活性构象有关，只有那些与酶分子紧密 结合的一层单分子水化层( 。水化外壳”) 才对酶的催化活性构象至关重要。维持 酶的催化活性构象的最少水量称为酶的“必需水”，只要这层“必需水”不丢失， 其它大部分水即使被有机溶剂所替代，酶仍可维持催化活性构象并具有催化活性。 酶分子维持其催化活性所需“必需水”的多少依不同酶而异，如脂肪酶只需几个水 分子啪1 ，而多酚氧化酶、乙醇脱氢酶则需几百个水分子才显示催化活性。 对于有机相中的酶催化反应而言，水是决定酶催化性能的一个重要因素。亲水 性很强的有机溶剂能够从酶分子表面剥离出水分，从而导致酶分子因水化不足而失 活。溶剂的这种“剥离”作用与溶剂的极性和疏水性有着一定的关联性。在无水状 态，酶分子的带电基团或极性基团可能形成了闭合的无活性构象。加入少量水后， 水分子与这些基团之间形成氢键，加强了离子之间的静电作用，而静电作用是影响 有机相酶催化行为的一个重要因素。但体系中过多的水的存在会导致酶分子结团， 从而降低酶分子的表观催化活性“1 。 ， 1 5 2 有机溶剂对酶催化的影响 通常用l o g p ( p 是溶剂在正辛醇与水两相间的分配系数) 作为研究溶剂对酶反 应影响的参数啪1 。一般来讲，l o g p 值高( 1 0 9 p ) 4 ) 的疏水性溶剂不容易使酶失活， 而l o g p 值在0 和2 之间的有机溶剂最易使酶失活。但亦有一些文献报道了偏离l o g p 理论模型的实例。”，这说明有机溶剂的疏水性并不是导致酶变性失活的唯一原因， 酶的失活还可能与溶剂的溶解能力和分子几何构型有关。 有机溶剂主要从以下三个方面来影响酶催化4 ： ( 1 ) 有机溶剂直接作用于酶微环境的水化层：极性有机溶剂能够从酶分子表面剥离 出水分，从而导致酶失活，而疏水性有机溶剂对酶的必需水化层影响很小，不会使 酶失活： ( 2 ) 有机溶剂会影响底物或产物在水相和有机相中的分配，从而改变底物或产物在 酶分子表面的浓度，影响酶促反应； ( 3 ) 有机溶剂直接与酶作用，影响酶蛋白活性构型的氢键、疏水作用等，从而影响 酶的催化活性。 1 5 3 酶在有机介质中的特性 酶在有机介质中具有一定的“刚性”，这使得脂肪酶具有p h “记忆”和分子印 迹等特殊的性能”。由于在有机介质中质子化或去质子化作用难以进行，酶分子 可以保持其在水溶液中的电离状态，即酶能“记住”其最后所处的水溶液的p h 值， 这就是所谓的p h “记忆”功能。在水溶液中，由于酶分子的柔性和伸展松散从而导 致“酶记忆”功能的丧失；此外，酸性或碱性有机底物也可能使酶失去p h “记忆”。 控制有机介质中酶分子的电离状态的方法是：将酶溶于一定p h 值的缓冲溶液中，再 将其真空冷冻干燥即可。 与p h “记忆”特性相似，酶分子还具有对配体的“记忆”功能。当酶溶于高浓 度配体溶液中时，即使两者之间仅有弱结合能力，但借助质量作用定律，仍会形成 大量的弱结合复合物。冻干后用无水溶剂洗去配体，获得的酶分子中会有许多与配 体结合时留下的“印迹”。由于酶分子在有机介质中具有“刚性”结构，这些“印 迹”得以保持，利用该特性可以提高酶的选择性和专一性。 此外，有机相中酶分子的热稳定性较高。这是由于酶热失活的几个主要反应， 如脱氨基、肽链水解、胱氨酸分解等过程都需要水的参与，因此在低水有机介质体 系中，这些失活反应被大大削弱“”。另外，有机介质中酶分子的“刚性”结构也是 其具有较高热稳定性的一个重要原因。 与在水相中的酶催化相比，有机介质中的酶催化还表现出许多不同的特性，如 底物选择性、对映体选择性、区域选择性及基团选择性等删。 1 5 4 有机介质中酶促油脂醇解研究进展 n e l s o n 等“5 1 在利用固定化尼m i e h e i 脂肪酶催化油脂与甲醇的转酯反应时发现， 有机溶剂体系的反应效果要明显优于无溶剂体系：在无溶剂体系中，生物柴油得率 只能达到1 9 4 ，而在正己烷体系中，生物柴油得率可达9 4 以上。m i t t e l b a c h 等 人呻1 分别在石油醚和无溶剂体系中使用pf u o r e s c e n s 脂肪酶催化葵花油的的甲醇 解反应，结果发现石油醚体系中的产物得率( 7 9 ) 要远高于无溶剂体系( 3 ) 。 s o u m a n o u 等1 研究了不同有机溶剂对脂肪酶催化葵花籽油醇解反应的影响，在正己 烷和石油醚等非极性溶剂中生物柴油得率最高( 8 0 9 6 ) ，而在极性溶剂如丙酮中，生 物柴油得率只有2 0 。m o h a m e d 等“的研究表明亲水性强的有机介质如丙酮( 1 0 9 p = 一0 2 3 ) 中，多种脂肪酶的活性均很低，4 8 小时油脂转化率均未超过2 5 ；在疏 水性的有机介质如正己烷( 1 0 9 p = 3 5 ) 中酶保持较高的活性。“”，但是甲醇和甘油 不能在疏水性溶剂中充分溶解，对酶催化反应的负面影响仍旧存在，固定化酶回用 几批后活性就开始下降”1 “。 1 6 本文研究的主要内容及意义 1 6 1 选题背景 能源危机以及现有化石能源燃烧后所导致的环境污染等问题促使人们进行石油 替代能源的开发和研究。j 妻中，利用可再生动植物油脂资源制备而成的生物柴油成 为新能源研究与开发的热点。发展生物柴油，不仅可减少环境污染，同时还可以节 省进口石油用外汇，并增加就业机会，是一举多得的好方案。 目前已实现产业化的生物柴油都是用化学催化工艺生产，化学法中大量碱( 酸) 的使用容易对环境造成二次污染。生物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、无污 1 9 染物排放等优点，具有环境友好性，符合绿色化学的发展方向，因而日益受到人们 的重视。但利用生物酶法制备生物柴油目前存在着一些亟待解决的问题，反应物甲 醇容易导致酶失活、副产物甘油影响酶反应活性及稳定性、酶的使用寿命太短等， 这些问题是生物酶法工业化生产生物柴油的主要瓶颈。 因此，探索生物酶法制各生物柴油的新方法，提高脂肪酶的催化活性和稳定性， 从而降低生物柴油的生产成本，对推动生物酶法制备生物柴油的产业化和促进我国 可再生资源利用均具有重要的意义。 1 。6 2 本研究的意义及主要内容 针对常规酶法工艺中的瓶颈问题，为了从根本上消除传统工艺中反应物甲醇及 副产物甘油对酶反应活性及稳定性的负面影响，本课题组采用了在有机介质叔丁醇 中酶促油脂甲醇解制备生物柴油的新方法，并系统研究了生物柴油合成过程中各种 反应条件对脂肪酶的催化性能的影响。 本论文为生物酶法制备生物柴油提供了新的思路：此外，作为有机相体系酶催 化反应的一个重要应用领域，本论文的研究为有机相酶催化反应理论提供了新的佐 证，为生物柴油工业中酶工程技术的进一步应用提供了实验依据和理论参考。 本论文中主要进行了以下内容的研究： 。 l 在叔丁醇反应介质中，脂肪酶催化大豆油甲酯化合成生物柴油：探讨了叔丁 醇作为反应介质的可行性；研究了反应体系各物质的互溶性与酶活性的关系：系统 研究了各种反应条件对该酶促反应的影响；探讨了不同催化性能的脂肪酶催化效果； 考察了叔丁醇介质中，酶促油脂甲酯化过程采用二步甲酯化的优越性和可行性，并 且对二步反应影响较大的反应做了系统研究； 2 在叔丁醇反应介质中，油脂原料关键组分对脂肪酶催化性能的影响：探讨了 油脂原料中脂肪酸、磷脂、水含量等因素对脂肪酶催化性能的影响： 3 在叔丁醇反应介质中，采用叔丁醇萃取蓖麻油在脂肪酶催化下可以制各生物 柴油。本文采用原本作为反应溶剂的叔丁醇作为萃取剂萃取蓖麻籽粉中的蓖麻油， 并将萃取蓖麻毛油直接用作生物柴油的反应原料。从提油率、萃取毛油中的磷脂含 量和蓖麻油的反应效果三方面进行实验，结果表明了叔丁醇作为萃取溶剂的可行性 和蓖麻油在作为生产生物柴油的原料方面具有很大的潜力。 第2 章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 酶 固定化脂肪酶l i p o z y m e i mt l ( 催化活力：2 5 0 i u n g ，1 个i u n 定义为7 0 c ， 酶用量为1 0 时初始速率达到每分钟转化0 0 1 的硬脂酸甘油脂) ，来源于 t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s ，物理吸附于硅胶，由诺维信公司提供； 固定化脂肪酶n o v o z y m4 3 5 ( 标称活力：1 0 0 0 0 p l u g ，p l u g 为每1 9 酶生成的 月桂酸丙酯单位) ，来源于c a n d i d aa n t a r c t i c a ，物理吸附于大孔阴离子树脂，由 诺维信公司提供； 固定化脂肪酶l i p o z y m e i mr m ，来源于r h i z o m u c o rm i e h e i ，物理吸附于苯酚 型大孔阴离子交换树脂，由丹麦n o v o 公司赠送。 2 1 2 主要原料与试剂 精制大豆油由北京艾森绿宝油脂有限公司生产； 脂肪酸甲酯标准品：肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚 油酸甲酯、亚麻酸甲酯、十七碳酸甲酯、蓖麻油醇酸甲酯和硬脂酸甘油酯购于s i g m a 公司，色谱纯。 大豆磷脂( 磷脂酰胆碱p c 2 3 ，磷脂酰乙醇胺p e1 9 ，总磷脂含量 9 6 ) 购于 清华紫光公司。 其他试剂均为市售分析纯。 2 2 仪器及设备 气相色谱分析：气相色谱仪g c l 4 b ( s h i m a d z uc o r p ，k y o t o ) ；浙大n 2 0 0 0 色 谱工作站；检测器：f i d ；毛细管柱c b f f a p ( 0 3 2 r a m x 2 5 m ；c h r o m a p a c k ) d b 一1 ( 0 2 5 m m x1 5 m ；j a ws c i e n t i f i c ，f o l s o m ，c a ) ；h p 一2 0 m ( 0 2 咖x5 0 m ，h e w l e t t p a c k a r o ，u s a ) ； 高效液相色谱仪：s h m a d z u ，日本岛津公司； 恒温摇床：h q 4 5 a ，中国科学院武汉科学仪器厂： 电子天平：e x p l o r e n ，美国o h a u s 公司； 台式离心机：t g l 一1 6 c ，上海安亭科学仪器厂； 卡尔菲休水分测定仪：c a 一0 5 ，日本三菱化学工业公司； 真空冷冻干燥机：f d u 一8 1 0 ，日本东方日化公司： 冰箱：b c d - 2 1 6 ，美菱冰箱厂； 循环水式真空泵：s h i d ，巩义市英峪予华仪器厂； 真空干燥箱：d z f - 3 ，上海福玛实验设备有限公司； 液体快速混合器：y k h i ，江西医疗器械厂； 微量取样器( 1 0 ul ) ：l f b g 一0 0 1 ，上海安谱科学仪器有限公司； 紫外可见分光光度计：8 5 0 0 ，上海天美科学仪器有限公司： 分光光度计：7 2 2 s ，上海第三分析仪器厂； 旋转蒸发器：r e - 5 2 c ，上海亚荣生化仪器厂； 低温浴槽：k f 一4 ，上海医用仪器厂 高温箱式电阻炉：r j x 一5 - 1 3 ，天津实验仪器厂。 2 3 实验方法 2 3 1 油脂皂化值的测定 称取2 9 精制油或毛油于5 0 0 r a l 锥形瓶中，加入0 7 0 9 氢氧化钾固体，再移液取 2 5 0 m 1 9 5 乙醇加入到试样中，并加入一些沸石，连接回流冷凝管与锥形瓶，并将 锥形瓶放在磁力搅拌器上慢慢煮沸，维持沸腾6 0 m i n 。然后在热溶液中加入3 5 滴 酚酞指示剂，并用0 5 m o l l 的盐酸溶液滴定到指示剂的粉色刚消失。空白实验时不 加油，其他相同”1 。 用下列公式计算结果： 皂化价：( v o - v , ) x c x 5 6 1 m 式中为空白实验所消耗的盐酸溶液体积( 1 i l l ) ；“为试样所消耗的盐酸标准 溶液的体积( 1 i l l ) ：f 为盐酸标准溶液的浓度( m o l l ) ；历为称取油的重量( g ) ； 5 6 1 是氢氧化钾的分子量。 由中性油脂的皂化价可计算其平均分子量： 分子量= 等 2 3 2 油脂酸价的测定 配有关溶液：0 i n 氢氧化钠标准溶液，1 酚酞乙醇指示剂。 操作方法：称取均匀试样3 5 9 ，注入锥形瓶中，加入无水乙醇5 0 m l ，摇动使 试样溶解，再加三滴酚酞指示剂，用0 1 n 碱液滴定至出现