（化学工艺专业论文）以富g寡核苷酸为模板自组装结构的研究.pdf

中文摘要 近年来，由于在癌症治疗和生物传感技术方面的潜在应用，生物大分子自组 装的研究日益引起人们的兴趣，特别是对d n a 纳米组装的研究。d n a 的组装结 构除双螺旋结构之外，还能形成多链结构，如三链、四链和分支导线状结构等， 这些特点使得由d n a 构筑特定几何结构的纳米材料并以此为模板引导其它纳米 粒子的组装成为可能。 本文首先通过紫外可见光谱( u v ) 、圆二色光谱( c d ) 波长扫描及圆二色 光谱( c d ) 热变性实验研究了不同离子存在条件下富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列 的热力学性质，获得相应的热力学数据；进而选用a 8 g 1 2 序列，采用紫外可见 光谱( u v ) 、荧光光谱( f s ) 、原子力显微镜( a f m ) 和透射电镜( t e m ) 研究 了富g d n a 的自组装特性，及其对银纳米簇、纳米金组装的引导作用。 c d 和a f m 表征揭示了a 8 g 1 2 序列形成含有平行g 四链体结构的分支导线 状结构，其组装结构依赖于离子种类、浓度和温育时间。以a 8 g 1 2 序列为模板合 成银纳米簇的研究表明，银纳米簇直接同d n a 碱基发生作用，对g 一四链体构象 影响较小，对a 8 部分构象影响较大，具有典型的吸光特性和荧光特性。对纳米 金和a 8 g 1 2 组装结构的研究表明，加入s h t 1 5 能引导纳米颗粒组装成垂直型导 线，后续a s g l 2 的加入则能引导纳米金颗粒组装成非垂直型导线；相同条件下， m p s 使纳米金和s h t 1 5 组装成有中心的雪花状结构。 关键词：富g d n a 自组装模板纳米簇 a bs t r a c t s e l f - a s s e m b l yp r o p e r t i e so fb i o m o l e c u l e s ，e s p e c i a l l y n a n o a s s e m b l e so fd n a h a v ea t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t sr e c e n t l yd u et ot h e i rp o t e n t i a lr o l e si nc a n c e r c h e m o t h e r a p y , b i o s e n s o rt e c h n o l o g y b e s i d e st h ec a n o n i c a ld u p l e xh e l i xs t r u c t u r e ， d n ac a l lf o r mm u l t i s t r a n d e ds t r u c t u r e ss u c ha st h et r i p l e x ，t h eq u a d r u p l e xa n dt h e f r a y e dw i r ee t c ，w h i c hm a k ei tp o s s i b l et od e s i g nn o v e ln a n o - m a t e r i a l sw i t hs p e c i a l g e o m e t r i e s ，a n dt o o r i e n tt h eo r g a n i z a t i o no fo t h e rn a n o p a r t i c l e sb e y o n dt h e a s s e m b l e dt e m p l a t e s t h i st h e s i sf i r s ts t u d i e dt h et h e r m o d y n a m i cp r o p e r t i e so ft h eg - r i c hd n a i nt h e p r e s e n c eo fd i f f e r e n ti o n s ，t h er e l a t e dt h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e d t h e n b a s e do nt h es e q u e n c eo fa s g l 2 ，t h es e l f - a s s e m b l e ds t r u c t u r eo ft h eg - r i c hs e q u e n c e a n di t si n f l u e n c eo nt h ea s s e m b l yo fs i l v e rn a n o c l u s t e ra n dn a n o 。g o l d w e r e i n v e s t i g a t e dt h r o u g hu l t r a v i o l e tv i s i b l es p e c t r u m ( u v ) ，f l u o r e s c e n c es p e c t r u m ( f s ) ， a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ( a f m ) a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) i ti si n d i c a t e db yu s i n gc da n da f mt h a ta 8 g 1 2c a nf o r mt h es t r u c t u r eo f f r a y e d w i r ec o n t a i n i n gt h eg q u a d r u p l e xb u i l d i n gb l o c k ，t h ed i m e n s i o no ft h i s s t r u c t u r e d e p e n d so nt h ec a t i o n s ，c o n c e n t r a t i o n ，a n dt h ei n c u b a t i o nt i m e u s i n gt h ea s s e m b l yo f a 8 g 1 2a st h et e m p l a t et os y n t h e s i z es i l v e rn a n o c l u s t e r , i ti ss u g g e s t e dt h a t s i l v e r n a n o c l u s t e r si n t e r a c td i r e c t l yw i t ht h eb a s eo ft h es e q u e n c ea n dt h e yh a v eg r e a t e r a f f e c to nt h ea 8s e c t i o no ft h es e q u e n c er a t h e rt h a nt h eg q u a d r u p l e x t h es i l v e r n a n o c l u s t e r ss h o ws p e c i a ll i g h t - a b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c ep r o p e r t y b a s e do nt h e s t u d i e so ft h ea s s e m b l yo fn a n o g o l da n da s o l 2 ，i ti si n d i c a t e dt h a ta d d i t i o no ft h e s h t l5r e s u l t si nt h ef o r m a t i o no fp e r p e n d i c u l a rw i r es t r u c t u r e sw h i l et h ec o n s e q u e n t a d d i t i o no fa 8 g1 2l e a d st on o n 。p e r p e n d i c u l a rw i r es t r u c t u r e s u n d e rt h es i m i l a r c o n d i t i o n s ，a d d i t i o no fm p sr e s u l t si ns n o w f l a k es h a p e ds t r u c t u r e s k e yw o r d s ：g r i c hd n a ，s e l f - a s s e m b l y ，t e m p l a t e ，n a n o c l u s t e r i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均包在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：动欠葱、 签字日期： 山0 1 年 1 月z 铲日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解基鲞基茎：有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丕鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：多火慧， 导师签名： 签字日期：山0 7 年f 月工牛日 签字日期：力眄7 年月形同 天津大学硕士学位论文以富g 寡核苷酸为模板自组装结构的研究 埠 丽青 众所周知，d n a 具有多形性，能形成许多不同的构象。d n a 在基于生物分 子纳米技术领域中是非常有用的模板之一，其具有很多适于分子规模构建的性 质，最重要的是有较大的长度直径比，使其能够形成人们预想的纳米尺度范围 内的线性和分支状的几何构型。富g 寡核苷酸能通过四个氢键的作用形成g 4 平 面，其中每个鸟嘌呤碱基都同时作为供体和受体，和相邻的鸟嘌呤通过h o o g s t e e n 型氢键作用。核酸碱基对间的氢键在生物大分子，如d n a 、r n a 的自组装和空 间排列上起着重要作用。而由g 四链体构筑的分子纳米线在纳米电子学上有重 要应用。这种纳米线是在一定离子环境中，g 四集体以四链螺旋的形式进一步排 列而成。 研究d n a 的自组装性质是基于其在癌症化学治疗和生物传感器技术方面的 应用。除标准的双螺旋结构外，寡核苷酸还能形成多链结构，如三链、四链和多 链结构。近年来，许多研究表明富含鸟嘌呤的d n a 可形成特异结构，如g 四链 体，分支导线状结构等。g 四链体的特点之一是：金属离子在螺旋轴内和其周围 的四个鸟嘌呤共同作用，进一步稳定了g 四链体，螺旋轴的中轴方向上有一极 性的中央孔道，其大小决定了能和其作用的金属离子种类。研究表明，富g 寡 核苷酸能在特定离子的存在下组装成g 四链体结构，而更高度有序的平行g 。四 链体长链则被称为g 导线( g w i r e s ) 结构，此结构是由g t e t r a d 平面堆积而成， 具有一定的刚性、长度、纳米机械功能及大的表面积，这些都使其具有好的传导 性质，可用于纳米电子学，也有利于开发新的生物材料。由此可见，富g 核酸 在纳米材料合成、组装领域有着广阔的应用前景。而随着研究的进一步深入，利 用分子组装技术研究更为复杂、有序的功能化分子组装体，有更广阔的应用前景。 含有连续终端鸟嘌呤的寡核苷酸能自组装成分支导线状结构，其主干部分由 相互作用的鸟嘌呤组成，分支部分由以单链形式存在的腺嘌呤组成。含有5 8 个 连续终端鸟嘌呤的寡核苷酸一般形成四链螺旋结构，而含有更多数目连续终端鸟 嘌呤的寡核苷酸则形成分支导线状结构。短的互补序列能通过碱基互补作用连接 到分支导线状结构的分支上，而不破环主干部分的结构，由此证明主干和分支部 分是相互独立的，其中鸟嘌呤单链形成的分支部分有重要应用，不仅能和其互补 序列作用，形成网络结构；还可用于生物技术方面，连接上非d n a 分子，如酶 和荧光探针，这并不会改变其所形成的分支导线状结构，且酶仍保持活性。影响 h 舌 分支导线状结构热稳定性的因素是，序列中鸟嘌呤的排列顺序，连续鸟嘌呤的数 目越多，形成的分支导线状结构越稳定。 d n a 参与的纳米组装的研究是近年来在化学、生物学和材料科学领域广受 关注的研究方向之一。所获得的纳米组装体具有特殊的环境响应和量子效应，在 生物检测、诊断和传感等方面相对于传统材料均表现出了高的效率，具有潜在的 应用前景。在纳米粒子的自组装技术中，d n a 分子或其片段作为一种组装模板 引起人们的广泛关注。相比较而言，d n a 以其独特的纳米尺寸效应、分子线性 结构、物理化学稳定性、力学刚性、自我识别能力和自组装的优势，正逐渐应用 于纳米电子学的各个领域。应该强调，由于自组装的驱动力主要来源于纳米团簇 外包敷分子的分子识别能力，因此采用这种自组装方法就有可能实现不同种类、 不同粒径纳米团簇，又呈现特定结构的复合组装。显然，这对于制备具有特定性 质和要求的纳米器件等方面具有潜在的重要应用价值。线性双螺旋d n a 的利用 似乎受到了一定限制，但目前人们已能设计合成出分子以组装成稳定的分支结 构，分支d n a 分子通过粘性末端相互作用进行组装，导致结构的进一步复杂化。 粘性末端除了具有定的多样性外，还使结构具有可预言性，这一特点可用于抗 体抗原的设计。 本文将在前人研究的基础上，用c d 、u v 、f s 、a f m 和t e m 研究不同离 子条件下，富含鸟嘌呤的寡核苷酸的热力学性质；对富g d n a a s g l 2 序列的自 组装结构及其性质进行研究，并以a 8 g 1 2 序列的自组装结构为模板合成银纳米 簇，研究d n a 自组装结构在合成银纳米簇过程中所起到的作用，并对所生成银 纳米簇的性质进行表征；同时本文还对纳米金和s h t d s h t l s 序列在不同条件 下的组装进行研究，以获得t c e p 和m p s 对所形成组装结构的影响规律。 天津大学硕士学位论文以富g 寡核苷酸为模板自组装结构的研究 第一章文献综述 分子自组装在近期作为化学合成、纳米技术、高分子材料和工程等技术的一 种新方法，得到快速发展。分子自组装系统已成为分子生物学、化学、材料学和 工程技术等学科的交汇点。许多自组装系统得到发展，有着广阔的应用前景【i 】。 1 1 纳米技术 1 1 1 生物纳米结构的性质和优点 生物纳米结构的一个最关键性质是分子识别功能，可自组装并作为原子或分 子结构的模板，如两条互补的d n a 链可形成双链。d n a 具有自组装的两个特点， 分子间有较强的相互作用力，其形成的结构可以预测。所以人们不是把宏观的物 质分散开，而是用很精密的方法来构造自下而上的纳米结构。 构造自下而上纳米结构的优点为：化学多样性是其一个明显的优点。细胞结 构表面的每个单元都有很多特点，一个复杂的化学物质能作为构筑模块，人们可 控制其取向和位置。而自上而下的组装则不具有这种多样性。第二个优点是化学 规模的巨大性。如p m o l 的物质就可能含有1 0 1 2 个组成单元，所以人们可设想在 较大的区域内，组装预定结构的二维或三维复杂结构。 1 1 2 纳米技术的应用 过去几十年里，以硅材料为基础的集成电路元件尺寸显著减小。然而当电路 元件的尺寸降低到一定尺度以下( 如1 0 0 n m ) 时，光学图样技术变得非常复杂， 其它一些技术包括扫描探针平印术和电子束平印术等等也因为比光学技术更加 复杂，同时缺乏测量性而难以实施，因此纳米技术应运而生，它主要包括两种方 法：一是“自上而下”( t o p d o w n ) ，主要原理是通过精细的微观操作技术直接在 原子或分子上操作。例如在室温下，利用扫描探针的针尖沿阶梯方向施加控制位 移来重新定位单原子c u 表面上c 6 0 分子的吸收【2 】；另一种是“自下而上” ( b o t t o m u p ) ，主要原理是基于分子的自我整合和自组装p j 。 纳米科学已成为现代科学中最重要的研究领域和前沿学科之一。纳米技术在 工业制造、国防建设、医药技术、光学器件、微电子等方面都有广泛的应用。在 第一章文献综述 各种各样的纳米材料中，尺寸在1 1 0 0 n n 的纳米管因其具有特殊形状和性质，在 化学、材料学及生物学等学科中具有潜在的、广阔的应用价值。借鉴生物体系的 自组装和自组织现象，近年来，化学家们制备出许多具有特殊结构的有机小分子， 它们能通过非共价相互作用力自组装形成稳定的纳米管道结构。许多研究表明人 工合成的有机纳米管道在生物和物理化学方面具有很多的特殊性质，可作为离子 通道、酶反应器、选择性键合分子，甚至具有抗菌或抗癌活性，在化学、生物、 医药和材料方面具有广阔的应用前景。 纳米技术的诞生使得人们能够在微观领域获得更小尺寸的材料。由于测试手 段的不断提升，人们可在可控尺度范围内利用纳米技术进行纳米材料的构筑及在 其基础上进行改性来获取令人满意的各种性能。通常来说，纳米技术的实现会选 用一些生物分子作模板，而模板在一定范围内决定着纳米材料的最终性能。生物 分子( 核酸、蛋白质、多肽等) 都可作为模板，近年来对生物分子自组装的研究 越来越引起人们的广泛兴趣。 1 2 纳米结构的自组装方法 纳米结构体系具有奇特的物理现象，是制造下一代量子结构器件的基础。根 据纳米结构体系构筑过程中的驱动力是靠外因还是内因，可大致将纳米结构组装 体系分为两类：一是人工纳米结构组装体系；二是纳米结构自组装体系和分子自 组装体系。 人工纳米结构组装体系是按人们的设想，利用物理和化学方法人为地将纳米 尺度的物质单元组装排列构成一维、二维和三维纳米结构体系。人的设计和参与 制造起着决定性作用，就好比人们用自己制造的部件装配成非生命的实体一样， 人们同样可合成具有各种对称性和周期性的固体，人们也可利用物理和化学方法 生长出各种各样的超晶格和量子线。这种体系既具有纳米微粒的特征，如量子尺 寸效应、小尺寸效应、表面效应等特点，又存在由纳米结构组合引起的新的效应， 如量子耦合效应和协同效应等。其次，这种纳米结构体系很容易通过外场( 电、 磁、光) 实现对其性能的控制( 这就是纳米超微型器件的设计基础) 。 近十年来，纳米结构体系与新的量子效应器件的研究取得了引人注目的新进 展。纳米结构和量子效应原理性器件是目前纳米材料研究的前沿，并逐步将制得 的纳米微粒、纳米棒、纳米管组装起来，获得自然界尚不存在的新的物质体系， 从而创造出新的奇迹。 纳米结构自组装体系是指通过弱的和较小方向性的非共价键，如氢键、范德 华力和弱的离子键协同作用把原子、离子或分子连接在一起，构筑成一个纳米结 天津大学硕士学位论文以富g 寡核苷酸为模板自组装结构的研究 构或纳米结构花样。自组装过程的关键不是大量原子、离子、分子间弱作用力的 简单叠加，而是一种整体的、复杂的协同作用。纳米结构自组装体系的形成有两 个重要条件，一是有足够数量的非共价键或氢键存在，这是因为氢键和范德华力 等非共价键( 2 4k j m o l j ) 很弱，只有足够量的这些作用力存在，才能通过协同 作用构筑成稳定的纳米结构体系；二是自组装体系能量较低，否则很难形成稳定 的自组装体系。 分子自组装指分子与分子在平衡条件下，依赖分子间非共价键作用力自发地 结合成稳定的分子聚集体( a g g r e g a t e ) 的过程。可以这样理解分子自组装体系的 形成：第一，通过有序的共价键，首先结合成结构复杂而又完整的中间分子体； 第二，由中间分子体通过弱的氢键、舢键、范德华力及其它非共价键的协同作 用形成结构稳定的大的分子聚集体；第三，由一个或几个分子聚集体作为结构单 元，多次重复自组装排成纳米结构体系。因此设计自组装体系的关键是要正确调 控分子间的非共价连接，并克服自组装过程中热力学的不利因素【4 j 。 1 2 i 胶态晶体法自组装纳米结构 胶体具有自组装特性，而纳米团簇又可在适当的溶剂中分散形成胶体溶液， 因此，只要具备合适的条件，就可将纳米团簇组装起来形成有规则的排布，得到 纳米团簇超晶格。这一自组装过程所需要的条件是：硬球排斥；均一的粒径； 粒子间的范德华力；体系逐渐的去稳定。其中条件和是纳米团簇胶体溶 液体系本身固有的性质，条件主要通过纳米团簇制备条件的控制和适当分离方 法的应用来实现，因此实际上组装过程中的可操作因素主要是对胶体溶液体系稳 定性的控制。影响体系稳定性的重要因素包括粒径、团簇、包覆分子的性质、溶 剂的种类和纳米团簇的浓度等。b a w e n d i l 5 1 等人将包覆t o p o ( 三辛基氧膦) 和 ( t o p ) ( 三辛基膦) 的c d s e 纳米团簇在一定压力和温度下溶解于辛烷和辛醇的 混合溶剂中，然后降低压力使沸点较低的辛烷逐渐挥发，由于包覆t o p o 和t o p 的c d s e 纳米团簇在辛醇中的溶解度较小，就使得纳米团簇的胶态晶体从溶液中 “析出”。经高分辨电镜( h r t e m ) 分析，这样组装得到的超晶格其有序排列范 围可达数微米尺寸。p i l e n i l 6 等人则发现如果将a 9 2 s 纳米颗粒的胶体溶液滴到一 定介质上，待溶剂挥发后就可得到规则排布的纳米超晶格膜。超晶格膜的有序程 度与胶体溶液的滴速有很大关系，当逐滴滴加( 每加一滴都等溶剂挥发后再滴下 一滴) 时只能得到较小面积的膜；而当同时滴加几滴然后再等溶剂挥发则得到的 膜面积要大得多。 因为组装过程中分子识别作用较弱，所以这类组装过程都较难控制，对组装 条件的要求非常严格。但用胶体溶液的方法可组装得到三维超晶格，这也是其它 第一章文献综述 方法很难做到的。这种自组装纳米结构体系的物性可通过胶体晶体参数进行调 制。 1 2 2 模板法自组装纳米结构 利用模板法组装纳米颗粒时，由于选定的组装模板与纳米颗粒间的识别作 用，而使得模板对组装过程具有指导作用，组装过程更完善。所选用的模板可以 是固体基质、单层或多层膜、有机分子或生物分子等。 1 固态高分子膜模板法 a l f o n sv a i lb l a a d e r e n 川等人利用固体模板完成了微米级粒子的三维组装。他 们用电子束在高分子薄膜上打出规则排布的孔洞，这些洞的深度和直径与被组装 粒子相匹配，将这些高分子薄膜作为组装模板对分散于溶液中的微米粒子进行组 装，通过选择适当的混合溶剂和调节离子强度，使粒子一层层沉积在模板上形成 三维有序结构，他们把这种方法称为“胶体外延法。利用胶体外延法实现纳米颗 粒组装的最大困难是有序排列的纳米级孔洞的制备，常见的物理方法很难达到要 求，而化学方法则提供了一些可能。s p a t z i s 等人用嵌段共聚物所形成的反胶团制 备出金纳米颗粒，溶剂挥发后在电镜下观察到金纳米粒子呈非常规则的排布。由 于嵌段共聚物在固态膜中可形成规则分布的维区结构，因此这类体系可作为有潜 在应用价值的纳米团簇组装模板。 2 单分子膜模板法 单分子膜技术发展到今天已非常成熟，由于单分子膜具有非常规则的结构排 布，因此很适合于作为纳米团簇的组装模板。a l i v i s a t o s 9 等人利用两头有活性基 团的分子在金属表面上组装出暴露端为一s h 的单分子膜，通过c d s 纳米晶体与 s h 的相互作用而将它组装到单分子膜上，从而得到纳米晶体二维膜。 3 简单有机分子模板法 1 9 8 0 年，s a g i v ! l o 】将羟基化的s i 片浸入十八烷基三氯硅烷( o t s ) 的稀溶液 中，o t s 分子首先吸附在基底表面，然后发生水解作用，s i c l 键被s i o s i 网状 结构代替，形成单层超薄有序的有机分子自组装膜。这是第一例有关自组装技术 的例子，此后分子自组装在合成的复杂性和表征的深度上有很大提高，许多自组 装体系被研究。研究自组装单层膜的同时，s a g i v t 】、u l m a n b 2 等人又报道了对 有机长链分子自组装多层膜的研究，由于有机长链分子多层膜的自组装覆盖度很 低，只能达到二三层的组装，因此随后的多层膜组装中引入了功能分子和金属离 子。这样不仅能得到完美的自组装多层膜，而且还可用于光、电特性的研究。如 作为纳米团簇组装模板的有机分子通常两头有配位基团，通过它们与纳米团簇表 面金属离子的配位作用而将纳米团簇组装起来。最常用的化合物为双硫醇，由于 天津大学硕士学位论文以富g 寡核苷酸为模板自组装结构的研究 硫醇对一些贵金属具有很强的配位能力，因此组装这类金属非常有效。s c h i f f r i n 1 3 】 小组用二硫醇将金纳米团簇组装得到了所谓“超级团簇”结构。 另一种制备多层粒子膜的方法是采用纳米粒子的水溶胶作亚相，上面铺展能 够与其发生作用的长链有机分子，然后通过l b 技术转移到固体基片上，形成夹 心式的有机与无机交替的l b 多层膜。l b 膜与自组装膜的异同为：l b 膜和自组 装膜均为分子的超薄膜组装，但两者有区别，在膜的稳定性方面，自组装技术比 l b 技术优越，自组装分子与基底通过共价键或离子键结合，而l b 膜与基底则 靠范德华力结合，但l b 膜通过压缩能更好地控制单层膜的状态。 4 生物分子模板法 在纳米粒子自组装技术中，d n a 分子或其片段在用作纳米团簇组装中是一 种很有特色的模板，这种模板与简单有机分子模板不同，其组装过程不仅通过模 板与纳米团簇的简单相互作用，也可通过与纳米团簇结合的低聚核苷酸分子与模 板间的分子识别来实现。众所周知，d n a 分子是由两条脱氧核苷酸链通过碱基 配对组合而成，具有完善和严密的分子识别功能，使得组装过程具有高度选择性， 或者说定向组装的功能要强得多。组装后模板也很容易破坏，只要将组装起来的 纳米团簇加热到一定温度，随着d n a 分子的受热使碱基配对性被破坏，纳米团 簇即重新分散，进一步说，随着现代生物学和分子生物技术的发展，将d n a 进 行任意裁减或用不同种类官能团进行化学修饰，各种大量的具有特定长度和特定 序列的d n a 可在d n a 合成器中自动生成，凡此种种均为采用d n a 来精确控制 纳米粒子组装的不同复杂结构提供了强有力的手段【1 4 】。 以d n a 为模板进行纳米粒子自组装，最早应归功于c o f f e r 1 5 】及其同事们的 工作。将低浓度的d n a 与c d 2 + 溶液混合，借助于排布在d n a 分子双螺旋结构 外侧又具有负电荷的磷酸骨架，使带正电荷的c d 2 + 通过静电吸引而连接到d n a 模板上，然后再将d n a 分子吸附到新解离的云母片上，最后在h 2 s 气氛下获得 有序粒子的纳米结构。 该结果清楚地表明，c d s 自组装粒子与d n a 分子磷酸骨架间的静电相互作 用，作为一种驱动力，确实使d n a 分子起到自组装模板的作用，显然这也为制 备其它粒子自组装纳米结构提供了可能。鉴于d n a 模板的形状、长度与序列都 可人为控制，因此有可能制得各种几何构型的自组装纳米结构。 如果无机纳米粒子自组装的驱动力来源于d n a 或其片段间的分子识别作 用，通常能得到纳米粒子在二维或三维方向上的网络组装体系，这就更加接近实 用宏观材料的形态，拓宽了纳米材料的应用范围。近年来，有关d n a 本身导电 性的研究重新令人瞩目，因为d n a 分子在两个电极间的导电行为很可能像宽禁 带半导体一样，由此可想象它们在特定的电压电流区域内应该是导体，意味着 第一章文献综述 可被用来设计各种新型的以d n a 为基础的互联功能器件。 5 混合模板法 纳米团簇的组装还可利用一些其它的方法，如a n d r e w s 1 6 】等人在组装二维金 团簇超晶格时所用的方法是：使金团簇外包一层十二硫醇分子，将它们在s i 0 2 基质上组装成单分子膜，然后用两端带有与金有强结合力官能团的分子取代硫 醇，使金团簇互相紧密结合而又不破坏原来的单层膜结构，这样就得到非常稳定 的金团簇的二维超晶格。 1 3 分子自组装 分子自组装就是在适当条件下，分子间通过非共价键相互作用自发组合形成 的一类结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构i l 。 用这一方法可得到所谓自组装纳米材料，这种材料可能具有新奇的光、电、催化 等特性，在分子器件、分子调控方面有潜在应用价值。因而分子自组装体系的设 计与研究引起学术界广泛的兴趣。非共价键包括：氢键、离子键和范德华力等， 虽然这些键都很弱，但共同作用可得到结构稳定的材料。分子自组装源于受体与 供体间的化学互补性和结构相容性，一个例子就是蚕丝的自组装：蚕丝的丝蛋白 单元长度约是l g m ，但是单根蚕丝可通过单元的自组装生成超过l 公里长的丝质 材料，这约是蚕丝蛋白单元的两百万倍【ls j ，如此惊人的自组装工程是目前人类技 术无法实现的；又如每个核苷酸单元约是0 3 4 n m ，人体内的第2 2 条染色体通过 自组装能延伸至大约1 2 c m ，是单体的3 5 0 0 万倍【l 圳。 1 4 多肽分子自组装 多肽分子自组装是生物体中广泛存在的一种现象，多肽自组装在生物体系中 扮演着重要角色，它对我们理解生命现象，探索生命起源都有重要意义。通过自 组装，多肽分子可结合成具有不同功能的蛋白质分子。一种有生物功能的蛋白质 分子，其特定空间结构的形成实际上就是其组成氨基酸分子中各基团组装的结 果，因此多肽分子自组装可在分子水平上进行精巧设计，从而控制组装体的形状 和结构，这在生物活性肽类药物及生物医学材料的研制方面有着巨大潜力。近年 来，多肽分子自组装进展迅速，在模拟天然生物分子功能、药物载体及合成多肽 药物等方面得到应用。自1 9 9 2 年美国麻省理工学院的张曙光博士从酵母蛋白中 发现组异乎寻常的能自组装的离子短肽( 含1 6 个氨基酸残基) 1 2 u j 后，开拓了 一个分子自组装技术的新领域。1 0 年来又有一系列可自组装的离子短肽被设计， 天津大学硕士学位论文以富g 寡核苷酸为模板自组装结构的研究 其组装的纳米尺寸材料具有广泛的潜在用途，包括：作为创伤修复支架，用于组 织工程和药物释放，及用于生物材料表面工程等方面。 目前对多肽自组装纳米管的研究日益引起人们的兴趣，其是有机化学最活跃 的研究领域之一，应用不同的多肽，通过多肽分子内或分子间的氢键和疏水相互 作用等多种非共价相互作用进行多肽自组装已有大量报道。 1 5d n a 结构 1 d n a 一级结构 尽管d n a 分子的形状和大小多种多样，但主要成分都是由腺嘌呤、鸟嘌呤、 胞嘧啶和胸腺嘧啶四种基本碱基组成的脱氧核苷酸，分子中被修饰的碱基含量很 少。而且作为遗传的物质基础，d n a 基本结构又存在许多共同特点。 d n a 一级结构指组成d n a 的诸脱氧核苷酸间连键的性质及在d n a 分子中 的排列顺序。各种d n a 分子特有的碱基排列方式决定了它们携带的信息及行使 的生物功能。 2 d n a 二级结构 1 9 4 4 年a v e r y 首先证实d n a 是基本的遗传物质，这一发现大大激发了人们 对核酸结构和功能的研究兴趣。为了搞清楚d n a 是如何进行自我复制并将遗传 信息传给子代的，不仅需要了解d n a 的化学组成，更需要详细研究d n a 中各 个原子是怎样通过共价键连接在一起再构成三维空间结构的。 根据碱基的物理化学性质、d n a 碱基组成的规律及d n a 纤维x 射线衍射 分析结果，w a t s o n 和c r i c k 于1 9 5 3 年提出d n a 双螺旋分子模型( 即标准的b d n a 结构) 。b d n a 是由两条反向平行的多核苷酸链绕着同一个中心轴构成的双螺旋 结构。两条链都是右手螺旋，碱基在螺旋内侧，碱基平面与纵轴相垂直；磷酸基 与脱氧核糖在外侧，彼此间通过磷酸二酯键相连，形成d n a 骨架，两条多核苷 酸链彼此依靠碱基对间形成的氢键连接在一起。 3 d n a 三级结构 在细胞内部环境中，双螺旋d n a 分子并不是以细长的链状高分子自由状态 存在，而是采用更高级的形式，这是由它周围的离子环境、细胞内p h 值和与 d n a 形成复合物的d n a 结合蛋白的性质决定的。d n a 三级结构指的是d n a 双螺旋的进一步扭曲。核酸三级结构包括线状双链中可能有的扭结和超螺旋、多 重螺旋和分子内单链形成的环及环状d n a 中诸如结、超螺旋和连环之类的各种 拓扑学状态。其中超螺旋是d n a 三级结构的一种最常见形式，d n a 在核小体结 构中的扭曲方式也是一种超螺旋结构。 第一章文献综述 4 d n a 三链、四链结构 1 9 7 5 年，f e l s e n f e l d 等第一次描述了由两条多聚尿苷酸和一条多聚腺苷酸组 成的三链复合物。此后人们描述了多种由多聚核苷酸组成的三链复合物【2 。目前 三螺旋核酸的定义是双螺旋d n a 的大沟中，第三条寡核苷酸链与其同型嘧啶- 同型嘌呤束道的互补嘌呤链通过h o o g s t e e n 或反h o o g s t e e n 型氢键结合，而形成 的三链复合物。 5 四链体结构 大量研究表明富含鸟嘌呤( g ) 的寡核苷酸链可形成特殊的d n a 结构，如： g 四链体( g q u a d r u p l e x ) 、分支导线状结构( f r a y e dw i r e ) 等。富g d n a 单链， 在特定离子强度和p h 值条件下，通过单链问或单链内对应的g 残基间形成 h o o g s t e e n 型碱基配对，从而使四条或四段富g d n a 单链旋聚成一段平行右旋 的四链体d n a 2 2 1 。由于富g d n a 中的g 残基都是成串排列的，因而当四条或 四段富g 单链d n a 的g 残基肩并肩形成h o o g s t e e n 型碱基配对时，就形成g 四链体。在四链体中鸟嘌呤杂环之间借兀电子相互作用，从而形成一个由四个g 残基的杂环平面联合而成的g 平面( 见图1 1 ) 1 2 3 j 。 图l - 1g - 平面结构图 f i g u r e1 - 1 t h es t r u c t u r eo f g - q u a r t e t 在g 四链体d n a 的中轴方向上有一极性的中央孔道，这个孔道可螯合离子 半径较小的离子，如：n a + 、k + 等。研究发现，溶液中适当浓度的n a + 、k + 、m 9 2 + 等阳离子有助于g 一四链体d n a 的形成及稳定。这可能是因为阳离子能抵消主链 骨架上磷酸残基的负电荷，从而减弱了四条单链靠近时的静电斥力。 天津大学硕士学位论文以富g 寡核苷酸为模板自组装结构的研究 富g d n a 形成的几种g 四链体见图i - 2 所示【2 3 1 。 圈圈 单分子椅式构象 u n i m o l e c u l a rc h a i r 单分子篮式构象 u n i m o l e c u l a rb a s k e t 目 削 双分子椅式构象 d i m e rc h a i r 双分子篮式构象 d i m e rb a s k e t 四聚体 t e t r a m e r 图1 2g 四链体结构图 f i g u r e1 - 2p o l y m o r p h i cs t r u c t u r e so f g - q u a d r u p l e x e s 1 6d n a 纳米技术 自1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 发现d n a 双螺旋结构开始，围绕d n a 这一生命 体中重要遗传物质的研究在遗传学和分子生物学领域受到广泛关注。作为遗传信 息的载体，d n a 在生物体中参与遗传信息在细胞内的存储、编辑、传递和表达， 从而促成新陈代谢的全部过程及其控制。近年来，随着纳米技术的迅速发展和各 种功能性纳米材料被相继合成，人们开始将目光注意到某些纳米尺度上具有有序 结构和排列的生物分子，期待以其为模板合成得到结构或功能类似于生物模板的 系列仿生材料，从而进一步获得特殊功能。 d n a 分子由于其特有的纳米尺度的双螺旋结构( 2 n m 的宽度和每个核苷酸 分子0 3 4 n m 的长度) 、骨架磷酸根的负电性和碱基的特异性配对( a ，t ，c ，g ) 等性质及末端易功能化、引入功能性基团( 如氨基、巯基或荧光活性基团) 和本 身可通过链聚合反应( p c r ) 进行大规模增殖等特点1 2 4 j ，已被广泛用于纳米材料 的组装和纳米器件的构建等方面，并在基因诊断、治疗、传感等领域得到广泛应 用【2 5 , 2 6 1 。可见d n a 纳米组装这一领域当前正处于一个飞速发展的成长期。 目前为止，用于自组装最成功的物质是d n a 2 7 j 。d n a 参与的纳米组装研究 是近年来在化学、生物学和材料科学领域广受关注的研究方向之一。所获得的纳 第一章文献综述 米组装体具有特殊的环境响应和量子效应，在生物检测、诊断和传感等方面相对 于传统材料均表现出高的效率，具有潜在的应用前景。在纳米粒子自组装技术中， d n a 分子或其片段作为一种组装模板引起人们的广泛关注【2 8 捌。相比较而言， d n a 以其独特的纳米尺寸效应、分子线性结构、物理化学稳定性、力学刚性、 自我识别能力和自组装的优势，正逐渐应用于纳米电子学的各个领域。应该强调， 由于自组装的驱动力主要来源于纳米团簇外包敷分子的分子识别能力，因此采用 这种自组装方法就有可能实现不同种类、不同粒径纳米团簇，又呈现特定结构的 复合组装。显然，这对于制备具有特定性质和要求的纳米器件等方面具有潜在的 重要应用价值。线性双螺旋d n a 的利用似乎受到了一定限制，但目前人们已能 设计合成出分子以组装成稳定的分支结构，分支d n a 分子通过粘性末端相互作 用进行组装p 0 1 ，导致结构的进一步复杂化。粘性末端除了具有一定的多样性外， 还使结构具有可预言性，这一特点可用于抗体抗原的设计。 d n a 纳米技术的主要目标之一是用d n a 作为骨架来明确结晶学上生物大 分子的人工可控性【删；第二个目标是组装出可用于纳米电子学的结构。这些应用 都涉及到把d n a 组装成周期性的网络结构，其组装成的一维结构可进一步组装 成二维或三维结构。在电子器械上，生物材料的使用提供了很多传统方法所不具 备的优点，包括对纳米级别空间上的控制、操纵和纠正电子组分在装置上的平行 自组装等。实现生物直接自组装的关键因素是能够确定其兼容性、生物无机材 料间的作用、构筑模块的合成及对构筑模块自组装过程的理解和控制。 在自然生物系统中，宏观分子对无机核、相稳定性和组装都发挥着一定的控 制作用 3 1 , 3 2 。生物系统能把纳米规模的构筑模块组装成完美的、大小可控的、统 一的复杂功能化结构。这些材料都非常软，且只是通过分子构筑模块间的简单作 用形成的( 如脂、肽和核酸) ，如骨骼、壳、硅藻属和一些细菌中的蛋白质能使 无机结构从纳米规模组装成肉眼可见的规模。另外分子规模的选择性和识别性是 生物体系的显著特点，最明显的例子就是抗体抗原间的相互作用，不象半导体 工业在电路上连续构造小的结构，有机体在许多方面实现构筑功能时，其识别和 作用是同时进行的。 1 6 1 利用d n a 分子本身自识别，眭质进行的自组装 主要通过合成不同碱基序列的分叉d n a 分子( b r a n c h e dd n a ) ，然后将含 有一定互补序列的d n a 分子按不同比例混合，进行互补碱基的配对过程( 杂交) ， 随后分离获得具有一定结构特征的d n a 分子。s e e m a n 在2 0 世纪9 0 年代前后提 出这一获得大环、四边形、绳结甚至笼等一系列复杂d n a 超结构的方法f 3 3 - 3 5 1 。 虽然该d n a 有机结构仅能通过原子力显微镜表征，且整个合成方法具有产率低、 天津大学硕士学位论文以富g 寡核廿酸为模板自组装结构的研究 产物稳定性差，及在一定环境下容易发生解链变性等缺点限制了其应用但这 利用d n a 碱基互补性质进行可控组装的思想为后续d n a 分子器件的构筑及可 控调变3 6 , 3 7 啪将该一组装概念延伸到r n a i 圳，进而获得系列功能性材料的研究 奠定了方法学上的基础。 1 6 2 利用单链d n a 分子碱基互补配对性质进行的纳米组装 该工作主要利崩两条互补堆链d n a 碱基配对原则，在每条单链d n a 的末 端分别进行功能基团修饰引入功能性成分( 纳米颗粒、酶或高聚物) ，然后通过 阿条单链的杂交，程序化地实现各种功能性成分的卒州有序排列，获得功能性纳 米材料。美国西北大学m i r i k i n l 3 9 】的研究小组率先于1 9 9 6 年提出这一方法，井采 用水端巯基修饰的互补单链d n a 实现了盒纳米颗粒的二三维空间有序自l 装( 图 l 一3 ) 。 ，嚣：；= ，嚣篇：未 。o 飞- a2 蹲 = = = ? r 罔1 3 甚于d n a 的金纳米托了组装机理币意豳及组姨牲r 的t e m 图 f o g ti - 3a s s e m b l ys c h e m e o f t h e d n a - l i n k e d g o l d p a n l c i d t e m i m a g e s o f t h ec o m p l e x 由于d n a 般链的碱基依靠氢键形成配对，随温度，卜高该相互作用被削弱， 并最终存某个温度下职链完全解丌，原先形成的金纳米颗粒的密堆积结构被打 破重新恢复其胶体性质，该双链随温度变化表现出町逆的配对 1 解链性质，所 以该d n a 纽装体且胄很好的温度响应行为。 在随后的几年里，采用类似的方法，更多类型的d n a 组装体，例如量子点 ( c d s e z n s ) 1 4 0 1 、磁性纳米颗粒(