（化学工艺专业论文）叶黄素酯的提取及酶法合成叶黄素衍生物的研究.pdf

硕卜学位论文 摘要 天然叶黄素酯是一种重要的类胡萝b 素脂肪酸酯。其稳定性优于游 离态叶黄素，同时人体对它的吸收也同样优于游离态叶黄素，所以天然 高纯度叶黄素酯在食品、保健品和药品上的应用将具有更加广阔的前景。 本课题主要研究了固定化脂肪酶n o v 0 4 35 催化合成叶黄素酯。 万寿菊为一年生草本植物，含有丰富的叶黄素酯。为了优化叶黄素 酯的提取工艺条件，采用微波辅助，在单因素试验基础上，用响应曲面 法对叶黄素酯提取率的4 个主要影响因素，即提取温度、提取时间、液 固比和微波功率进行了优化，建立并分析了各因子与叶黄索酯提取率关 系的数学模型。结果表明：原料用量5g ，在提取温度4 0 、提取时间 2 0 s 、液固比2 0m 1 g 、微波功率5 0 0w 时，叶黄素酯提取效果最好，在 此条件下叶黄素酯的提取率达到1 4 5 9 5m g g 。 以叶黄素酯为原料，在超声条件下系统地考察了由叶黄素酯制备叶 黄素的条件。在单因素试验的基础上，用响应曲面法对叶黄素的制备工 艺进行优化，以液固比、超声皂化温度以及皂化时间为因素，分析了各 因子与叶黄素得率的关系。确定最佳皂化反应条件是：皂化时间1 3 8m i n 、 超声皂化温度4 8 、液固比15m l g 。在此条件下叶黄索得率达到7 5 8 m g g 一。 在得到高纯度叶黄素的基础上，以叶黄素为原料，在脂肪酶n o v 0 4 3 5 的催化下，分别和油酸、咖啡酸、没食子酸、苦杏仁酸、l 丙氨酸、l 赖氨酸发生酯化反应，首次合成了叶黄素系列衍生物，并通过i r 、 ”c n m r 、1h n m r 、m s 对它们结构进行了表征。研究了脂肪酶催化叶黄 素合成叶黄素酯的影响因素。考察了酶量、溶剂、体系水分、温度、时 间等因素对酯化反应的影响。结果表明，适宜的工艺条件分别为：酶量 10 m g m l ，溶剂为氯仿，水含量8 0 m g g ，温度4 5 ，反应时间3 0 h ，在 上述条件下油酸转化率可达8 0 4 ；酶量1 0 m g m l ，溶剂为氯仿，水含量 10 m g g ，温度4 0 ，反应时间2 4 h ，在上述条件下咖啡酸转化率可达8 8 ； 酶量1 0 m g m l ，溶剂为氯仿，水含量6 0 m g g ，温度4 0 ，反应时间3 0 h ， 在上述条件下没食子酸转化率可达8 1 8 ；酶量10 m g m l ，溶剂为氯仿， 水含量8 0 m g g ，温度4 0 ，反应时间2 4 h ，在上述条件下苦杏仁酸转化 率可达7 7 8 ；酶量1 0 m g m l ，溶剂为氯仿，水含量8 0 r n g g ，温度4 0 ， 反应时间3 0 h ，在上述条件下l 丙氨酸转化率可达8 1 8 ；酶量10 m g m l ， 溶剂为氯仿，水含量8 0 m g g ，温度4 0 ，反应时间3 0 h ，在上述条件下 l 赖氨酸转化率可达8 0 4 。 叶精袭哺的提取及酶法合p , 髭n l 城豢行f 牛物的研究 关键词：叶黄素酯；叶黄紊衍生物；脂肪酶；油酸；咖啡酸；没食子酸； 苦杏仁酸；l 丙氨酸；l 赖氨酸 i l 硕十。伊论文 a b s t r a c t n a t u r a ll u t e i ne s t e r si sak i n do fi m p o r t a n tc a r o t e n o i d sf a t t ya c i de s t e r s i t ss t a b i l i t yi sb e t t e rt h a np r e c o l u m r il u t e i na n dt h eb i o - a c c e s s i b i l i t yo f l u t e i ne s t e r si sg r e a t e rt h a nt h a to fl u t e i n l u t e i ne s t e r si sw i d e l yu s e di n f o o d ，h e a l t hc a r ep r o d u c t sa n dd r u g s t h em a j o rr e s e a r c ht o p i c s i st h el u t e i n e s t e rw a s s y n t h e s i z e df r o ml u t e i na n da c i dw h i c hc a t a l y z e db yl i p o z y m en o v o 4 3 5 m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o no fl u t e i ne s t e r sf r o mm a r i g o l dw a si n v e s t i g a t e d b a s e do nt h e s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s ，t h e e f f e c t so fd i f f e r e n te x t r a c t i o n t e m p er a t u r e ，e x t r a c t i o nt i m e ，r a t i o so fs o l u t i o nt os o l i da n dm i c r o w a v ep o w e ro nt h e e x t r a c t i o ny i e l do fl u t e i ne s t e r sf r o m m a r i g o l dw e r eo p t i m i z e d w i t h r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) am a t h e m a t i c a lm o d e lw a se s t a b l i s h e da n da n a l y z e dt o d e s c r i b et h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h es t u d i e df a c t o r sa n dt h er e s p o n s eo ft h et o t a l e x t r a c t i o ny i e l do fl u t e i ne s t e r sf r o mm a r i g o l d t h eo p t i m u me x t r a c t i o np a r a m e t e r s a r e a sf o l l o w s ：e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 ，e x t r a c t i o nt i m e2 0 s ，r a t i o so fs o l u t i o n t os o l i d2 0m l g ，m i c r o w a v ep o w e r5 0 0 w u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e e x t r a c t i o nr a t eo fl u t e i ne s t e r sf r o mm a r i g o l dc a nr e a c h1 4 5 9 5m g g i n t h i s p a p e r ，l u t e i n w a sa c h i e v e d a s i n g l u t e i ne s t e r s b ys a p o n i f i c a t i o n t e c h n o l o g yw e r es y s t e m i c a l l yi n v e s t i g a t e du n d e ru l t r a s o n i c a l l yc o n d i t i o n s b a s e do n t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h ea f f e c t i n gf a c t o r ss u c ha st h ew a t e r s o l i dr a t i o ( m l g ) ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e a n dr e a c t i o nt i m ew e r eo p t i m i z e dw i t h r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) t h es t u d i e df a c t o r sa n dt h er e s p o n s eo ft h ey i e l do f l u t e i nw e r ea n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e w a st h er e a c t i o na tt h ew a t e r s o l i dr a t i oo f1 5f m l o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ey i e l do fl u t e i nc a nr e a c h o p t i m a ls a p o n i f i c a t i o np a r a m e t e r g ) 4 8 a n d1 3 8m i n u n d e rt h e 7 5 8m g g t h eo l e i ca c i dl u t e i ne s t e rw a sf j r s ts y n t h e s i z e df r o m1 u t e i na n do l e i ca c l d ， c a f f e i c a c i d ，g a l l i ca c i d ，m a n d e l i ca c i d ，l a l a n i n ea c i d ，l - l y s i n e a c i dw h i c h c a t a l y z e db yl i p o z y m en o v o4 3 5 ，t h es t r u c t u r ew e r ed e t e r m i n e db yi r ，c n m r ， 1 h n m ra n dm s t h ee f f e c t so fe n z y m ec o n c e n t r a t i o n ，s o l v e n t ，t h er a t i oo fw a t e rt o s u b s t r a t e s ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m e0 1 1t h ee s t e r i f i c a t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sa r e ：e n z y m ec o n c e n t r a t i o n1 0 m g m l ，t h e r a t i oo fw a t e rt os u b s t r a t e s8 0 m g g ，s o l v e n tc h l o r o f o r ma n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r e4 5 r e a c t i o nt i m e3 0h t h eo l e i ca c i dconver s i o nr a t ei s u p t o8 0 4 w h e nt h e e s t e r i f i c a t i o ni sc a r r i e do nu n d e rt h e o p t i m a lc o n d “i o n s ；e n z y m e c o n c e n tr a t i o n 叶奠裘脯的提取，乏酶法合成叶荧袭衍牛物的研究 1 0 m g m l ，t h er a t i o o fw a t e rt os u b s t r a t e s1 0 m g g ，s o l v e n tc h l o r o f o r ma n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r e 4 0 r e a c t i o nt i m e 2 4 h t h ec a f f e i ca c i dc o n v e r s i o nr a t e i s u p t o 8 8 ；e n z y m ec o n c e n t r a t i o n1 0 m g m l ，t h er a t i oo fw a t e rt os u b s t r a t e s6 0 m g g ，s o l v e n t c h l o r o f o r ma n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 r e a c t i o nt i m e3 0h t h e g a l l i c a c i d c o n v e r s i o nr a t ei su pt o8 1 8 ；e n z y m ec o n c e n t r a t i o n1 0 m g m 1 t h er a t i oo fw a t e rt o s u b s t r a t e s8 0 m g g ，s o l v e n tc h l o r o f o r ma n dr e a c t i o nt e m p e r a t ur e4 0 ，r e a c t i o nt i m e 2 4 h t h em a n d e l i ca c i dc o n v e r s i o nr a t ei s u p t o 7 7 8 ；e n z y m e c o n c e n t r a t i o n 1 0 m g m l ，t h er a t i oo fw a t e rt os u b s t r a t e s8 0 m g g ，s o l v e n tc h l o r o f o r ma n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r e4 0 r e a c t i o nt i m e 3 0h t h el - a l a n i n ea c i dc o n v er s i o nr a t ei su pt o 8 1 8 ；e n z y m e c o n c e n t r a t i o n 1 0 m g m l ，t h er a t i o o fw a t e rt os u b s t r a t e s 8 0 m g g ， s o l v e n tc h l o r o f o r ma n dr e a c t i o nt e m p er a t u r e4 0 r e a c t i o nt i m e 3 0h t h el l y s i n e a c i dc o n v e r s i o nr a t ei s u pt o8 0 4 k e yw o r d s ：l u t e i ne s t e r s ，l u t e i nd e r i v a t i v e s ，l i p a s e ，o l e i ca c i d ，c a f f e i c a c i d ，g a l l i ca c i d ，m a n d e l i ca c i d ，l - a l a n i n ea c i d ，l - l y s i n ea c i d 兰州理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： t 彳建j 訇 日期：z 口年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权兰州理工大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 彳建i 虱 日期： 和f 。年6 月9 日 导师签名：扬厶嵌日期：矧啤6 月i o 园 硕卜何论文 1 1 叶黄素酯简介 第一章绪论 1 1 1 叶黄素酯的来源、组成和理化性质 天然叶黄素酯是一种重要的类胡萝b 素脂肪酸酯。它广泛存在于万 寿菊花、南瓜、甘蓝、苜蓿等植物体内【1 1 。其中，在力寿菊花中含量最 为丰富，高达3 0 4 0 。 在万寿菊花和其它植物中，叶黄素一般与脂肪酸( 如月桂酸、棕榈酸 等) 结合成酯的形式存在1 2 】。自然界中的叶黄素酯可分为反式叶黄素酯和 顺式叶黄素酯，是以全反式分子构型为主。全反式叶黄素酯又可分为： 叶黄素单酯和叶黄素二酯。 在常温下，高纯度的叶黄素酯( 含量6 0 9 5 ) 呈金黄色至橙红色粉 末。它易溶于氯仿、二氯甲烷、二氯化碳等氯代烃，可溶于正己烷、丙 酮、乙酸乙酯、乙醇等溶剂。其稳定性较强，只有高温、强酸、铁离子 和氧等因素对叶黄素酯破坏较大。 1 1 2 叶黄素酯的体内转化特征 在消化过程中，人体可高效地水解叶黄素酯，并释放出游离叶黄素， 然后被吸收进入血液。研究表明，摄入的叶黄素酯，可提高血液和视网 膜黄斑中的叶黄素水平。一旦叶黄素吸收到血液中后，身体不能分辨出 该叶黄素的来源。在人体内，把叶黄素酯转化为叶黄素是一个自然的生 理过程1 3j 。科学支持与临床证据叶黄素酯已经被科学团体公认为叶黄素 的安全来源之一。大量确凿的临床证据表明，人体的消化道中存在高效 的水解酯化物系统。同时也确认了由类胡萝b 素酯化物分解得到的类胡 萝b 素具有的生物利用率。由类胡萝b 素专家p h y l l i sb o w e n 教授进行的 一项平行对照实验发现，叶黄素酯分解得到的叶黄素的生物利用率要高 于游离态叶黄素。数据分析显示：由科宁公司提供的“叶黄素酯化物分 解得到的叶黄素的生物利用率，比未酯化的叶黄素高6 1 6 ”1 4j 。 1 2 叶黄素酯的功能 1 2 1 叶黄素酯的着色作用 天然叶黄素酯是一种重要的类胡萝b 素脂肪酸酯，主要的构型为全 反式，具有c = c 长链的发色集团，表现出艳丽的金黄。两侧没有活泼的 羟基，因此也就决定叶黄素酯是一种十分稳定的食品着色剂15 i 。对光、热 和空气非常稳定，可广泛使用于食品、饮料、化妆品等应用领域，具有 n f - 嚣袭酯的提取及酶泫合成叶美粜f i t 牛物的研究 广阔的应用前景。同时，它经过乳化以后，可以制成水溶性着色剂。天 然叶黄素酯将替代化学合成的食用级着色剂，提高人们的健康水平。 1 2 2 叶黄素酯的预防a m d 用途 叶黄素的一个重要的生物学功能就是保护视网膜，防止紫外线的损 伤。目前，全球发现的老年性黄斑变性( a g e r e l a t e dm a c u l a rd e g e n e r a t i o n ， a m d ) 是6 5 岁以上人群的主要致盲眼病。 天然叶黄素酯和玉米黄素酯被摄入体内后，在人体脂肪酶的作用下， 水解成游离态的叶黄素和玉米黄素。它们以高浓度沉积于人眼底黄斑中， 可作为近紫外蓝光的吸收剂，通过捕获自由基、防止或降低氧化和自由 基对视网膜带来的伤害而行使保护功能，可以有效降低a m d 的发生率1 6 】。 至今为止，已有不少数量的关于叶黄素酯的研究在科学刊物上发表， 包括许多针对人类的临床试验。一系列研究表明，摄入叶黄素酯后，血 液中叶黄素的水平升高，证实了叶黄素酯在体内可容易地转化为游离的 叶黄素。进一步的实验研究了增补叶黄素酯对增加视网膜黄斑色素密度 的效果。这些研究发现，摄入叶黄素酯后，黄斑色素密度有显著的提高。 在健康人群和初期a m d 患者中都出现了这一现象。这说明，病变的黄斑 也可从叶黄素酯中获得稳定的叶黄素，甚至已经确诊为a m d 的病人也能 从叶黄素酯的增补剂中受益。a m d 患者可从叶黄素增补剂获益的事实是 通过叶黄素抗氧剂增补试验证实的。这是一个为期1 2 个月，以安慰剂为 对照的干预实验i ，实验对象为老年a m d 男性患者，实验以叶黄素或叶 黄素与抗氧化剂混合对实验对象增补。实验结果发现，受试对象的黄斑 色素密度提高了5 0 ，并且眼睛功能也得到了相当的改善。 1 2 3 叶黄素酯增强免役作用 最新的研究发现，在动物的整体水平上，向体内补充叶黄素可以促 进抗原刺激的淋巴细胞增殖反应，并可影响细胞表面分子的功能性表达。 叶黄素对细胞免疫的调节作用主要表现在与细胞凋亡和基因调节的关系 上。 s n o d d e r ly 和c h e w i8 j 分别在19 9 5 年和1 9 9 6 年提出，叶黄素和玉米黄 素在减少癌症的发生、发展、增强免疫功能和预防老年黄斑变性方面有 独特的生物功能。他们的研究表明，喂养高叶黄素含量的食物后，小鼠 体内可移值性乳腺癌细胞的生长减慢，同时增强了淋巴细胞的增殖效应。 细胞培养的研究结果表明，叶黄素和玉米黄素在抑制细胞脂质的自动氧 化和防止氧化带来的细胞损伤方面比1 3 胡萝卜素更有效。而细胞脂质的 过氧化可能与肿瘤的生长有关。 2 硕f j 学何论文 1 2 4 叶黄紊酯的护肤保心作用 叶黄素酯作为一种强抗氧化剂可抑制活性氧自由基活性，能阻止活 性氧自由基对币常皮肤细胞的破坏。因此，叶黄素酯可以被制成多种护 肤用品和化妆品，用来保护皮肤的健康，防止皮肤受损。 心血管疾病是主要死亡原因之一，病因十分复杂。有研究指出，经 常食用类胡萝b 素的人群患心血管疾病的危险性降低。19 9 4 年，m o r r i s i 9 j 等研究发现，血液中总类胡萝卜素水平与冠心病的发病危险成反比。同 年，s t r e e t i 1 0 j 等的研究表明，叶黄素和玉米黄素均可显著地降低心肌梗塞 的发病率。1 9 9 7 年和19 9 9 年，i r i b a r r e n 和s t e p h e n i1 1 】等研究了血液中的 q 胡萝b 素、8 胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、隐黄素和番茄红素等对 颈总动脉内膜血管中层增厚的影响，发现在所研究的类胡萝卜素中，叶 黄素和玉米黄素降低颈总动脉内膜血管中层增厚的能力最强。 可见，用酶合成法把叶黄素重新做成容易水解得到叶黄素单体的酯 类物质具有很大的商业、科研和医疗价值，另外也可以提高叶黄素活性， 扩展叶黄素的应用范围。 1 3 合成方法 目前，合成叶黄素酯的方法主要靠传统的有机合成方法。油酸叶黄 素酯的合成路线如图1 1 1 66 1 。 图1 1 油酸叶黄素酯的合成路线 从图1 1 中可以看出，此合成路线一共有3 步，步骤比较繁琐。而用 酶催化方法合成，只需一步。 酶催化反应在有机化学中是一种必需工具，酶专一性使许多反应可 通过一步反应合成其它手段需要多步合成的化合物。另外，酶催化反应 的一些特点( 低温、高选择性和副产物少等) 为其在脂质合成工业化生产中 发挥重要作用；但目前酶缺点是成本较高。但随着生物技术发展，低成 本酶出现，可为其在酯质合成领域应用提供更为广阔前景。 3 叶靖素酯的提取及酶法合成叶靖袭衍生物的研究 1 4 国内外研究进展 近几年来国内外酶法合成主要应用于甘二酯、单甘酯、生物柴油和 风味酯的合成。 1 4 1 甘二酯 甘二酯是一类广泛应用于食品工业的乳化剂，商业上的产品是甘一 酯和甘二酯混合物，一般是通过化学甘油分解方法生产，在平衡状态下， 甘二酯中1 ，3 和1 ，2 ( 2 ，3 ) 一异构体比例约为1 5 ：1 ( m o l m 0 1 ) 。除作乳化剂 外，甘二酯还可作为含脂食品、甘三酯结晶改良剂、合成药物、磷脂和 糖脂中间体。由于这些应用需纯的立体异构体，而脂肪酶具有立体选择 性，因此脂肪酶是合成甘二酯理想催化剂。其主要制备机理包括：( 1 ) 甘 三酯选择性水解，如o t e r o 1 3 l 等用游离和固定化脂肪酶作为催化剂对三丁 酸甘油酯进行选择性水解。( 2 ) 甘三酯甘油解f 1 4 16 1 ，如h o l m b e r g 1 7 l 等研 究甘三酯在水相和非水相微乳化体系中酶法甘油解；t s u n e oy a m a n e 1 8 j 等通过氢化牛油固相酶法甘油解，采用程序降温法提高甘二酯产率。( 3 ) 采用甘油与不同酸基供体( 脂肪酸或脂肪酸甲酯) 直接酯化，如r o x a n a r o s u 1 9 】研究甘油和游离脂肪酸在无溶剂体系下采用酶法直接酯化合成 1 ，3 一甘二酯，其中游离脂肪酸熔点小于4 5 ，如不饱和脂肪酸和中碳链 脂肪酸；采用4 0 0p a 真空度在反应器中反应1 小时，蒸发产物中水，使 反应物和水保持一定化学计量( 摩尔比) 范围内；其研究表明：饱和及 碳链越短脂肪酸有利于1 ，3 一甘二酯和1 ，2 一甘二酯合成。 1 4 2 单甘酯 单甘酯是一种广泛应用于食品、化妆品和医药等表面活性剂。工业 上单甘酯是通过化学法合成，是在高于2 0 0 高温下以碱作为催化剂通过 甘三酯甘油水解完成。由于低温时甘油在甘三酯中溶解性较差，从而导 致产品中单甘酯和甘二酯得率较低，反应产物中约有5 0 单甘酯( 主要是 1 或3 位异构体) 和2 5 甘二酯。通过分子蒸馏可得到高纯度( 9 0 ) 单甘 酯，并己在工业生产中得到广泛应用；然而，由于反应温度过高，会导 致产品出现令人不悦气味，色泽加深和脂肪酸氧化等问题。 m c n e i l l 2 0 】等在探讨温度对酶催化甘三酯甘油解时发现，在产品混合 物变为固体临界温度以下，产品中单甘酯含量迅速增加。尽管反应混和 物变为固体，但酶催化反应不受影响，临界温度( ( t c ) 主要是由甘三酯熔 点决定，如牛油是4 2 ，橄榄油10 等。这种作用主要是通过单甘酯选 择性结晶实现，事实也表明，饱和脂肪酸在单甘酯s n 1 ( 3 ) 位上产品单甘 酯具有较高熔点。b o r n s c h e u e r 和y a m a n e t 2 1j 等已采用此法合成纯度为 7 0 9 9 单甘酯。 4 硕十伊论文 1 4 3 生物柴油 酯交换法i2 2 l 是目前生产生物柴油主要方法，酯交换法主要有酸催化 酯交换、碱催化酯交换、酶法催化酯交换、多相催化酯交换、均相体系 催化酯交换和超临界酯交换等。目前，生物柴油主要是用化学法生产， 即用动物和植物油脂与甲醇或乙醇等低碳醇在酸或碱性催化剂和高温 ( 2 3 0 2 5 0 1 下进行转酯化反应，生成相应脂肪酸甲酯或乙酯，再经洗 涤干燥即得生物柴油。但化学法合成生物柴油有以下缺点：工艺复杂、 醇必须过量，后续工艺必须有相应醇回收装置，能耗高，色泽深；由于 脂肪中不饱和脂肪酸在高温下容易变质，酯化产物难于回收，成本高， 生产过程中有废碱液排放。 k a l k u g a w a 2 3j 等纯化一种合成糖脂酵母k u r t z m a n o m y c e s s pi 1 1 产生 胞外脂肪酶；p h 范围1 9 7 2 ，p h 低于7 1 时，该酶活性很稳定，优先选 择十八碳酞基；在质量分数为4 0 各种有机溶剂中其活性也十分稳定； 尽管该酶n 末端序列与南极假丝酵母脂肪酶n 木端序列十分相似，但二 者所适用p h 范围却显著不同。k a m i n i 2 4 l 等生产并纯化来源于一种隐球 菌脂肪酶，该酶在p h7 0 ，温度3 7 时活性最高：在p h5 0 9 0 、温度 5 0 时活性依然稳定；原质量分数为5 0 各种有机溶剂中存在6 0m i n 后 活性也很稳定；添加适量二甲基亚砜或二乙醚可显著提高该酶活性，而 添加苯却抑制该酶活性；此酶对油脂选择性很宽，且该酶具有作为工业 催化剂许多功能，这对于工业规模生产生物柴油尤为重要。 1 4 4 风味酯 脂肪酶也是生产奶酪和其它食品风味酯一种重要生物催化剂【2 引，而 这些风味酯不能通过传统化学方法合成。如来自mu c o rm i e h e i 和r h i z o p u s a r r h i z u s 脂肪酶是风味酯生产中重要两种脂肪酶【26 1 。c a v a i l l e l 2 7j 等用来自 m m i e h e i 和c a n t a r c t i c a 脂肪酶在无溶剂体系下合成短碳链风味酯。 t a l o n l 2 8j 等在s t a p h y l o c o c c u sw a r n e r i 和s x y l o s u s 脂肪酶作用下合成风味 酯。k a r r a l 2 9j 等通过m m i e h e i 脂肪酶在无溶剂体系合成一种重要具有芳 香味香叶醇酯。i z u m i l 3 0 l 等在不同来源脂肪酶作用f 通过3 ，7 一二甲基 一4 ，7 一辛二烯一1 一醇酯交换反应成功合成香料工业一种重要香味物质 玫瑰醚。 1 5 本课题研究的主要研究内容 1 5 1 提取叶黄素酯 万寿菊为一年生草本植物，含有丰富的叶黄素酯，是生产叶黄素酯 的理想原料。从万寿菊中提取天然叶黄素酯的方法主要有溶剂萃取法、 超临界萃取法和超声波辅助萃取法，目前工业上主要采用有机溶剂萃取 5 叶黄袭酯的提耿殷酶法合成叶煎袭衍牛物的仍f 究 法。与传统有机溶剂萃取法相比，微波辅助提取法具有加热速度快、加 热均匀、节能高效、易于控制、安全无害等优点。目前对于以万寿菊为 原料，采用微波辅助提取叶黄素酯的研究还是一个空白。 本课题采用微波辅助提取叶黄素酯，微波技术可以大大缩短提取时 间，传统溶剂提取需要1 小时，超声波辅助提取也要4 0 m i n ，而用微波皂 化只需2 0 s ，并在常温下进行，这样有利于对叶黄素的保护。并借助统计 软件s t a t i s t i c a6 0 ，采用中心复合设计( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ，c c d ) 对各主要影响因子提取温度、提取时间、液固比、微波功率之间的单一 和交互作用等进行了较深入的研究，得出最佳的提取工艺参数，建立相 关工艺模型，为工业化生产技术提供科学依据。 1 5 2 制备高纯度叶黄素 万寿菊的有机溶剂萃取物含有大量叶黄素酯，经皂化后可转变为游 离叶黄素，其中的花青素、叶绿素及其衍生物和类黄酮易溶于去离子水 和低级脂肪醇中1 3 ，叶黄素酯大部分皂化成游离叶黄素和高级脂肪酸盐， 高级脂肪酸盐溶解于热水中，其中还有一小部分未皂化高级脂肪酸酯和 油溶性较好的其它类胡萝卜素仍然分布在非极性溶剂中，依此选择溶剂 进行重结晶得到高纯度叶黄素。若第一次纯度不高可采用二次，三次重 结晶。 1 5 3 叶黄素衍生物的合成 由于叶黄素性质极不稳定，保存起来代价太高且纯度下降明显，很 难成为高附加值的商品，也是不能实现工业化的。为此，把它重新做成 容易水解得到叶黄素单体的酯类物质具有很大的商业、科研和医疗价值， 另外也可以提高叶黄素活性，扩展叶黄素的应用范围。本文主要研究了 脂肪酶催化合成叶黄素衍生物，使叶黄素分别与油酸、咖啡酸、没食子 酸、苦杏仁酸、l 丙氨酸、l 赖氨酸发生酯化反应，首次合成了叶黄素 系列衍生物( 叶黄素酯) 。 6 硕十 何沦文 第二章响应曲面法优化微波辅助提取叶黄素酯 叶黄素酯是一种重要的类胡萝卜素脂肪酸酯1 32 1 。在植物组织中，叶 黄素以叶黄素酯的形式存在，在人体内，叶黄素酯可转化为叶黄素，进 一步被吸收利用1 3 引。临床医学发现，多食用富含叶黄素的食物，可以大 大减少癌症的发病率，并有效预防和延缓老年性视网膜黄斑退化和白内 障疾病，降低动脉粥样硬化和冠心病的发病率 3 4 - 3 7 】。 万寿菊为一年生草本植物，含有丰富的叶黄素酯，是生产叶黄素酯 的理想原料【3 8j 。从万寿菊中提取天然叶黄素的方法主要有溶剂萃取法、 超临界萃取法和超声波辅助萃取法，目前工业上主要采用有机溶剂萃取 法。与传统有机溶剂萃取法相比，微波辅助提取法具有加热速度快、加 热均匀、节能高效、易于控制、安全无害等优点【39 。从而有效地加快了 萃取速率和产品收率。同时，由于传统的单因素和j 下交考察已不能满足 实验要求，与实际误差较大，响应面法系数学与统计学的结合，它有助 于快速建模、缩短优化时间和提高工程应用可信度。 本实验研究了采用响应曲面法优化微波辅助提取叶黄素酯的工艺， 借助实验设计软件s t a t i s t i c a6 0 ，采用中心复合设计( c e n t r a lc o m p o s i t e d e s i g n ，c c d ) 对各主要影响因子提取温度、提取时间、液固比、微波功 率之间的单一和交互作用等进行了较深入的研究，得出最佳的提取工艺 参数，建立相关工艺模型，为工业化生产技术提供科学依据。 2 1 材料与方法 2 1 1 试验材料 发酵压制的万寿菊花棒状颗粒( 巾3 m m ，l 0 5 c m 1 5 c m ) ，由甘肃省丰 蕾天然色素有限公司提供。经真空干燥处理后粉碎、过6 0 目筛备用。 试剂：石油醚、正己烷、丙酮、无水乙醇、甲苯均为国产分析纯。 2 1 2 主要仪器 k q 一10 0 d e 型数控超声波清洗器( 昆山市超声波仪器有限公司) ； t u 18 10 紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器有限责任公司) ； r e 5 2 a 真空旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) ；真空干燥箱d z f 6 0 2 1 ( 上海中友仪器设备有限公司) ；f a10 0 4 电子分析天平( 上海恒平科学 仪器有限公司) 。 7 叶旋袭哺的提取殷酶泫合成叶煎豢衍生物的研究 2 1 3 试验方法 2 1 3 1 叶黄素含量测定方法 本实验中均采用a o a c 法测定叶黄素的含量l 4 0 1 ，吸收波长为4 7 4 n m 。 叶黄素提取率cm g g ，= 望弓雾荔筹 2 1 3 2 叶黄紊酯的微波辅助提取 精确称取万寿菊粉5 0 9 ，加入一定量的提取溶剂，按照试验设计方案 的条件进行微波辅助提取。 2 1 3 3 单因素试验 本试验中主要考虑提取温度、提取时间、料液比、微波功率作为影 响叶黄素酯的单因素，在各因素试验中采用如2 1 3 2 所述的方法进行叶黄 素酯的提取。试验中用叶黄素酯提取率的变化评价其提取效果。 1 ) 不同提取温度对叶黄素酯提取效果的影响 在提取时间2 0 s 、液固比2 0 m l g 、微波功率5 0 0 w ，研究提取温度分别 为2 0 、3 0 、4 0 、5 0 时对叶黄素酯提取效果的影响。 2 ) 不同提取时间对叶黄素酯提取效果的影响 在提取温度3 0 、液固比2 0 m l g 、微波功率5 0 0 w ，研究提取时间分 别为10 s 、2 0 s 、3 0 s 、4 0 s 时对叶黄素酯提取效果的影响。 3 ) 不同液固比对叶黄素酯提取效果的影响 在提取温度3 0 、提取时问2 0 s 、微波功率5 0 0 w ，研究液固比分别为 10 、2 0 、3 0 、4 0m l g 时对叶黄素酯提取效果的影响。 4 ) 不同微波功率对叶黄素酯提取效果的影响 在提取温度3 0 、提取时间2 0 s 、液固比2 0 m l g ，研究超声功率分别 为3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、6 0 0w 时对叶黄素酯提取效果的影响。 2 1 3 5 微波辅助提取条件优化 根据单因素试验结果，以提取温度( x 1 ) 、提取时| 、日j ( x 2 ) 、液固 比( x 3 ) 、微波功率( x 4 ) 4 个因素与叶黄素提取率进行响应面试验设计 ( 表2 1 ) ，优化叶黄素酯提取工艺。通过s t a t i s t i c a6 0 软件对试验数 据进行回归分析，预测叶黄素酯提取的最优工艺参数。 表2 1 微波辅助提取叶黄素酯试验冈素水平及编码 编码 x 1 提取温度( ) 3 03 54 04 5 5 0 x 2 提取时间( s ) 1 01 52 02 53 0 8 硕十伊论文 x 3 液i 司比( m l g ) 1 0152 02 53 0 x 4 微波功率( w ) 3 0 04 0 05 0 06 0 07 0 0 2 2 结果与分析 2 2 1 单因素试验结果 2 2 1 1 不同提取温度对叶黄素酯提取效果的影响 由图2 1 可知，提取温度在2 0 5 0 范围内，叶黄素酯提取率呈先逐 渐上升的趋势，随后趋于下降。提取温度为4 0 时，叶黄素酯提取率较 高。在微波条件下，叶黄素酯在较低的提取温度条件下即可溶出。 i 。r 2 03 04 0 提取温度 图2 1 不同提取温度对叶黄素酯提取效果的影响 2 2 1 2 不同提取时间对叶黄素酯提取效果的影响 由图2 2 可见，当提取时间小于2 0s 时，随着时间的延长，叶黄素酯 提取率呈逐渐增大的趋势。当提取时间超过2 0s 时，叶黄素酯提取率呈逐 渐下降的趋势。这是因为微波辐射对叶黄素酯具有一定的破坏作用，从 而导致叶黄素提取率的下降，微波辅助提取时间以2 0s 为宜。 l o2 03 04 0 提取时间s 图2 2 不同提取时间对n 1 。黄素酯提取效果的影响 9 o o o o o o o 2 o 9 8 7 6 旨鬻罾取 5 o 5 o 5 o n ” 坨 他 n 。哳m诗苷鞘 叶受豢酯的抛l ) ( ，乏酶i 上含j , 览n t 黄豢f 了牛物的j f i j f 究 2 2 1 3 不同液固比对叶黄素酯提取效果的影响 由图2 3 可知，选择液固比2 0m l gl 匕较合适。料液比过高或过低都不 好。这可是冈为溶剂加的太少，会使物质不能充分溶解，从而使提取率 下降：而溶剂加的太多，会影响颗粒的分散( 由于提取时间太短) ，使提取 效率受到影响。 图2 3 不同液同比对叶黄素酯提取效果的影响 2 2 1 4 不同微波功率对叶黄素酯提取效果的影响 由图2 4 可见，随着功率增加，叶黄素酯提取率逐渐升高，而后略有 下降。超声波功率小，叶黄素酯提取不完全，功率太大可能造成叶黄素 酯降解，提取率下降。微波提取功率以5 0 0 w 为宜。 1 5 o 1 4 0 的 乙1 3 0 宣 誓1 2 0 簧 皲 1 1 o 1 0 0 l 一一 3 0 0 w4 0 0 w5 0 0 w6 0 0 w 功率w 图2 4 不j 司微波功率对叶黄素酯提取效果的影响 2 2 2 响应曲面优选叶黄素酯工艺参数 对叶黄素酯提取温度( x 1 ) 、提取时间( x 2 ) 、液固比( x 3 ) 、微波 功率( x 4 ) 4 因素5 水平晌应面分析试验，试验设计与结果见表2 2 。利用 s t a t i s t l c a6 0 软件对表2 数据进行二次多元回归拟合，得到叶黄素酯提 取率预测值( y ) 对编码自变量x l 、x 2 、x 3 和x 4 的二次多项回归方程： 1 0 ，矿 一 删一 一 m o 0 o o o o o m 地 儿 m 9 8 k瓣铎裂 硕f j 学伊论文 y ；- 1 1 8 1 7 + 3 2 1 2 x 1 0 0 3 4 8 x i + 2 4 2 x 2 - 0 0 3 8 2 x ；+ 1 1 8 2 x 3 - 0 0 3 2 2 x ；+ o 1 4 8 x 4 0 0 0 0 1 3 4 x ： - 0 0 1 8 2 x l x 2 + 0 0 0 2 2 8 x l 屯- 0 0 0 0 4 4 4 x l x 4 + 0 0 0 0 0 7 4 f l x 2 x 3 0 0 0 0 4 0 7 x 2 工4 + o 0 0 0 1 7 8 x 3 x 4 表2 2 微波辅助提取叶黄素酯试验设计与结果 3 515154 0 0 3 515156 0 0 3 5152 54 0 0 3 5152 56 0 0 3 52 5154 0 0 3 52 5 156 0 0 3 52 52 54 0 0 3 52 52 56 0 0 4 515154 0 0 4 515156 0 0 4 5 152 54 0 0 4 5152 56 0 0 4 52 5154 0 0 4 52 5156 0 0 4 52 52 54 0 0 4 52 52 56 0 0 3 02 02 05 0 0 5 02 02 05 0 0 4 0102 05 0 0 8 5 2 1 1 9 4 7 6 3 1 3 9 2 9 4 3 1 3 0 7 1 0 0 5 1 3 4 8 7 9 0 1 1 6 2 8 8 8 1 2 1 l 7 1 6 1 0 6 8 8