（果树学专业论文）酪氨酸蛋白磷酸酶在植物逆境胁迫与成花诱导中的作用机制.pdf

摘要 酪氨酸蛋白磷酸酶无论在动物还是植物细胞中都起者重要的作用，在植物细胞中虽然越来越 多的p t p a s e 被发现，但对p t p a s e 的具体功能了解甚少。最近，本实验室分别从玉米和拟南芥中 克隆得到两个基因即z m r i d p i 和p t p l 3 5 。z m r d p i 是一个新的p t p a s e 成员，初步研究表明 z m r i d p i 可能参与细胞逆境信息传递；p t p l 3 5t - d n a 插入突变体具有超早花特性，意味着可能 参与开花信息传递。本研究就是在此基础上，通过分子操纵等多种手段，深入探讨z m r i d p i 和 p t p l 3 5 的具体功能，揭示其信息传递的具体机制。 将p g r e e n 0 2 2 9 用m l ui 和k p ni 切除，以除去致死基因蛾同时连入热击应答基因a p x 2 的启 动子。将z m r i d p i 从t 载体酶切位点k p ni 和a p a i 切下，连入p g r e e n 0 2 2 9 即最终构建为p a p x 2 一 z m r i d p i 诱导表达载体。p a p x 2 z m r i d p i 在大肠杆菌d h 5a 扩增后，通过农杆菌介导法转入 拟南芥。获得的t 1 代种子通过1 2 m s 培养基+ b a s r a 除草剂筛选，并p c r 验证，共得到9 株转化 株。经两次筛选后，获得b 代纯和植株。热击可导致”转基因植株z m r i d p i 大量表达，而野 生型植株没有表达，表明a p x 2 可以有效地驱动z m r i d p i 表达且转基因获得成功。热击可导致 t 3 转基因植株r d l 9 ，n c e d 和a a 0 3 大量表达，表明z m r i d p i 可以介导干旱应答基因的表达 且在干旱诱导a b a 信号产生中起着重要作用。 研究表明，p t p l 3 5 和p t p l 3 6t - d n a 插入突变体具有与p h y b 突变体相似的特征。r t - p c r 分析表明，和野生型相比，p t p l 3 5t - d n a 插入突变体中c o ，f t 基因的表达明显增强，且表 达时间延长，说明p t p l 3 5 基因在成花诱导的光周期途径中起作用，其作用位点在c o 基因的上 游。和p h y b 一样，红光可导致p t p l 3 5t - d n a 插入突变体下胚轴伸长，表明这两个基因可能在 红光诱导的p h y b 通路中起作用。进一步的杂交实验得到双杂交f l 代杂合体，杂交杂合体里现出 更明显的p h y b 缺失表型。以上结果表明，p t p l 3 5 可以作为成花诱导信号，操纵上游成花基因表 达从而在植物成花诱导中起者关键的作用。 关键词：酪氨酸蛋白磷酸酶，脱落酸，光敏色素 a b s t r a c t p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ( p t l a s e s ) h a v ec r i t i c a lr o l e soi nad i v e r s es p e c t r u mo fc e l l u l a r a c t i v i t i e si na n i m a la n dp l a n ts y s t e m s r e c e n ty e a r s r e s e a r c h e si np l a n th a v ei d e n t i f i e dm o r ea n dm o r e p t p a s e s h o w e v e r ，o n l y al i t t l ee x a c tf u n c t i o no f t h i sg r o u ph a sb e a nf o u n d i nr e c e n ts t u d yo f o u rl a b ， t w o 玎p a s e s ，z m r i d p ia n df t p l 3 5w e r ec l o n e d z m r i d p ii san e wm e m b e ro fp t p a s ef a m i l y t h e p r i m a r ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a ti tm a yi n v o l v e di nt h es t r e s ss i g n a lt r a n s d u e t i o n ；t h et - d n ai n s e r t e d m u t a n to fp t p l 3 5f l o w e r se a r l i e rt h a nw i l dt y p e t h i sm e a n st h i sm e m b e rm a yi n v o l v e di n t h es i g n a l t r a n s d u c t i o no ff l o w e ri n d u c t i o n t h i sr e s e a r c hd i s c u s s e dt h ee x a c tf u n c t i o n so fz m r i d p ia n dp t p l 3 5b y m o l e c u l a r t e c h n i q u ea n do t h e r t o o l s t o f i n do u t t h e m e c h a n i s mo f s i g n a l t m n s d u c t i o n o f t h e t w o p t p a s e s w ec u tt h ep l a s m i dp g r e a n0 2 2 9w i t hm l ui 和k p nit og e tr i do fr f aw h i c hc a l lc a u s eb a c t e r i a d e a d ，w h i l ei n s e r t e dt h ep r o m o t e ro fh e a tr e s p o n dg e n ea p x 2 t h em a i z eg e n ez m r i d p iw a si n s e r t e d a f t e rt h ep r o m o t e rt oc o n s t r u c tt h ef i n a li n d u c i b l ee x p r e s s i o nv e c t o rp a t p 2 一z m r i d p i t h i sv e c t o rw a s t r a n s f o r m e dt oa r a b i d o p s i sb ya g r o b a c t e r i u m w eg o t9t 1p l a n t sb yf i l t e r e do n1 2m s + b e s t ac u l t u r e m e d i u ma n dv a l i d a t e db yp c r r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fz m r i d p ic a nb ep r o m o t e db y a p x 2 p r o m o t e ra n di n d u c et h ee x p r e s s i o no f as t r e s sr e s p o n dg e n er d l 9a sw e l la sn c e da n da a 0 3 ， b o t h o f w h i c ha r er e c o g n i z e da s t h ek e y e n z y m e s o f a b a b i o s y n t h e s i z e w ei d e n t i f i e dt w om u t a n t so fa x a b i d o p s i sp t p st h a tf l o w e re a r l i e rt h a nw i l dt y p ea n do t h e rm u t a n t u n d e rs h o r td a y t h et w om u t a n t sh a v es i m i l a rf e a t u r e sw i t h p h y bm u t a n t t h eg e n ee x p r e s s i o na n a l y s i s b yr t - p c rs h o w e dt h a ti n p t p l 3 5m u t a n t ，t h ec oa n df fe x p r e s s e dm o r ea n dl o n g e rt h a nw i l dt y p e t h e s eg e n e sa r ev i t a li np h o t o p e f i o d i cp a t h w a yo ff l o w e ri n d u c t i o n t h a tm e a n sp t p l 3 5t a k ep a r ti nt h i s p a t h w a ya n dp l a yar o l eu p s t r e a mo fc o w et h e nt r e a t e dt h es e e d l e sw i t hc o n s t a n tr e dl i g h ta n dt h et w o m u t a n t sw i t ht h ep h y bm u t a n ts h o w e do b v i o u s l yl o n g e rh y p o c o t y lt h a nw i l dt y p ea n da n o t h e rm u t a n t f u r t h e re x p e r i m e n ts h o w e dm o r ei n t e r e s t i n gr e s u l t t h ef 1g e n e r a t i o no fd o u b l em u t a n to ft h et w o m u t a n t sh a dm o r es e v e r ep h e n o m e n at h a ns i n g l em u t a n t ，i nc o n t r a s tt ot h ee x p e c t e dw i l dt y p ef e a t u r e t h i sr e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tp t p l 3 5i sa l li m p o r t a n ts i g n a lo ff l o w e ri n d u c t i o nb yc o n t r o lt h e e x p r e s s i o no fu p s t r e a mg e n e si nt h i sp a t h w a y k e yw o r d s ：m a b a ，p h y t o c h r o m e i l l 月i j 茜 蛋白可逆磷酸化作为一种开关机制调节细胞活性，是细胞中普遍存在的一类酶促共价键修 饰反应，通过各种蛋白激酶和蛋白磷酸酶对效应蛋白活性基团的磷酸化或脱磷酸化引起其结构变 化，进而改变蛋白的功能。譬如，磷酸化可以改变酶的构像，可能使底物与酶活中心接触的通路 受阻而改变酶的活性；磷酸化还可以调节蛋白复合体中蛋白成员的相互作用而控制蛋白复合体的 功能；一些蛋白只有经磷酸化后才能被定位于其细胞内的功能靶位。细胞内存在着大量受可逆磷 酸化调节的蛋自也存在着大量蛋白激酶和蛋白磷酸酶，使得蛋白可逆磷酸化几乎涉及细胞功能的 各个方面，包括新陈代谢，细胞周期调控，发育控制，离子运输以及逆境应答。由于蛋白可逆磷 酸化广泛而显著的生物学意义，其发现者i n e b s 和f i s h e r 也因此获得了1 9 9 2 年的诺贝尔奖。 典型的磷酸激酶( p r o t e i nk i n a s e ) 催化包括丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸在内的氨基酸羟基的 磷酸化。根据底物的不同，将磷酸激酶与磷酸酶分为丝氮酸，苏氨酸蛋白激酶，丝氨酸，苏氨酸蛋 白磷酸酶，酪氮酸蛋白激酶，酪氨酸蛋白磷酸酶。酪氨酸蛋白磷酸酶的研究最早开始于动物和酵 母，相关的概念和分类的形成也由动物和酵母中的研究而来。近些年才开始在关于植物中发现酪 氨酸蛋白磷酸酶的存在。随着拟南芥全基因组测序的完成，已有2 0 多个基因通过序列比对分析 鉴定为酪氮酸蛋白磷酸酶，但除了极少部分基因刚开始被研究，其功能仅有部分有鉴定，大多数 基因的功能仍然未知。鉴于酪氨酸蛋白磷酸酶家族在动物中的广泛功能，可以想象它们在植物体 系中不可或缺的作用。 i v a b a ：a b s c i s i ca d d a b a o ：a b aa l d e h y d eo x i d a s e 缩略词 c t a b ：h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d e p c ：d i e t h lp y r o c a r b o n a t e d s p t p ：d u a ls p e c i f i cp r o t e i np h o s p h a t a s e e d t a ：e t h y l e n e d i a a m i n e t e t r a - a e e t i ca c i d f i g ：i s o p r o p h y t h i o - 1 3 - d - g l u c u m n i d a s e k a n ：k a n a m y c i ns u l f a t e l b ：l u r i a b e r t a n im e d i a m a p k ：m i t o g e n - a e t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m s ：m u r a s h i g e & s a l tm i x t u r e n c e d ：9 - c i s - e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e p a o ；p h e n y l a r s i n eo x i d e p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h y ：p h y t o c h r o m e p t k ：p r o t e i n 耐r o s i n ei g n a s e p t p ：p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s d s is o d i u md o d e e y ls u l f a t e t r i s ：a - a m i n o - 2 ( h y d m x y m e t b y l ) 1 , 3 - p r o p a n e d i o l x - g a h5 - b r o m o - 1 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 1 3 一d - g a l a c t o s i d e z e p ：z e a x a n t h i ne p o x i d a s e 独创性声明 y 9 3 9 0 5 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：南恚、啤 时间：土。年舌月肛日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 南无、 时间： 2 州5 年占月肛日 导师签名：镌毒夥乏 时间：工帅6 年扫月 第一章文献综述 1 植物酪氨酸蛋白磺酸酶研究进展 1 1p t p 及其基本特性 1 1 1p t p 的分类与结构 由于p t p 在植物中的研究还处于初始阶段，一些基本概念和范例都是建立在动物和酵母体系 中p t p 的研究。根据磷酸氨基酸的特异性，p 1 田可以分为酪氨酸特异性p t p 和双重特异性p t p ， 前者脱磷酸酪氨酸的磷酸基，后者既脱磷酸酪氨酸的磷酸基，也脱磷酸化磷酸丝氮酸，苏氨酸残基 ( s t o n e d i x o n ，1 9 9 4 ) 。尽管两大类p t p 的同源性很低，但是他们的催化核心都包含一个信号肽： ( v i ) h c x a g x g r ( s t ) g 并且其中含有个磷酸酶媒介物形成所必需的半胱氨酸残基。催化核心 外的序列决定了p t p 的底物特异性( d e n e ta l ，1 9 9 6 ；t o n k s & n e e l ，1 9 9 6 ) 。 基于酪氨酸特异性p t p 的亚细胞定位。可以将其分为两组( 图1 1 ) ：受体类型p t p ；胞 内p t p ( s t o n e & d i x o n ，1 9 9 4 ；n e e l & t o n k s ，1 9 9 7 ) 。受体类型p t p 结构的共同特征包括：( 1 ) 可变 长度和组成的胞外区域；( 2 ) 单一跨膜区域；( 3 ) 一个或两个胞内催化区域。胞内p t p 的结构特 征是：( 1 ) 单一的催化区域：( 2 ) 多样的n 端和羧基端伸展区。这些伸展区具有类似的信号肽的 氨基酸顺序，它将p t p 分送到细胞的特定位置( m a u r o d i x o n ，1 9 9 4 ；f a nf a c t o re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 圈1 1 酪氨酸蛋白磷酸酶的结构域( l u a n , 2 ) 0 3 1 f i g u r e l 1s t m c l u r a ld o m a i n so f s o m er e p r e s e n t a t i v ep r o t e i nt y r o s i n ep h 0 8 p h a t a s e s ( p t p s ) ( l u a n ，2 0 0 3 ) 双重底物特异性p t p 也是一个庞大的胞内蛋自家族，他们拥有相似的催化区域和不同的非催 化区域。这个家族的原始类型是v h l ，编码牛痘病毒的开放阅读框h 1 ( g u a n 甜以，1 9 9 1 ) 。m k p s 是哺乳动物d s p t p 中最大的一组，至少六个已经被鉴定出来，它们都有各自的底物特异性并且调 节不同的m a p k 通路( k e y s e ，1 9 9 8 ) 。另有一组以c d c 2 5 为代表的d s p t p ，是c d c 2 蛋白激酶 与细胞分化所必需的( d u n p h y ，1 9 9 4 ) o 晶体结构是p t p 催化作用和底物特异性的基础( b a r f o r de ta 1 ，1 9 9 4 ；s t u c k e ye ta 1 ， 1 9 9 4 ；y u v a n i y a m ae ta 1 1 9 9 6 ；h o f f m a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。所有的p t p 含有一个相同的核心结构特征： 中心为四股平行的b 片层，两侧被1 ，4 a 螺旋包被。d s p t p 表现为t s f r p 的截短的部分，信号台 位于蛋白质表面一个裂缝的底部，含有一个单环。半胱氨酸处于对进入的磷酸酪氨馥残基进行亲 核侵袭的有利位置。核心肽的其他部分可以提高半胱氨酸的亲核性，其中精氨酸残基起了重要的 作用。酪氨酸蛋白磷酸酶上裂缝的深度决定了其底物特异性。这样，只有磷酸酪氨酸的长度足以 到达其底部与之作用( d e n ue t a l ，1 9 9 6 ；t o a k s n e d ，1 9 9 6 ) 。 1 1 2p t p 的调节 信号转导分子的一个关键特征即含有可被各种内外信号调节的结构基础。许多f r p 在特定的 组织和发育阶段表达，而且其表达水平会随环境条件的改变而发生变化。p t p 的表达类型与其功 能密切相关。如c d 4 5 主要在哺乳动物淋巴细胞中表达。对t 细胞和b 细胞的信号转导作用很重 要：一些受体类型的p t p 选择性地在神经组织中表达，与神经细胞粘连有关；胞内p r p 中s h p l 再造血细胞中表达水平很高，且在淋巴细胞分化过程中起了关键作用；一些d s f t p 对m a p k 通 路有作用，而且可被有丝分裂和胁迫信号表达所诱导；m s 9 5 与信息素信号转导有关且受之调节； a t p t p l 被胁迫信号调控。 另外，p t p 可被磷酸化调节。一些p t p 与肼【相互作用( i d r e e t a l ，1 9 9 4 ；v a n v a c t o r e t a l ， 1 9 9 8 ) 。氧化还原反应也对磷酸酶活性有作用，p t p 的活性需要半胱氨酸处于还原态( d e n u t a n n e r , 1 9 9 8 ) 。共价与非共价修饰对p t p 的作用还未知。 尽管p t p 的催化核心高度同源，但它们又各自含有差异很大的非催化区域，这些区域与特定磷酸 酶的各种调节有关。其最普遍的作用即细胞定位：受体类型的p t p 含用于质膜定位的跨膜区 ( s t o n e d i x o n ，1 9 9 4 ；n e e l t o n k s ，1 9 9 7 ) 。一些d s p t p 如m k p l ，m k p 2 严格定位于细胞核( r o h a n e ta 1 ，1 9 9 3 ；g u a n b u t c h ，1 9 9 5 ) 。一些含有s h 2 结构域的胞内p 邛可与质膜上的受体酪氨酸激 酶相互作用。特异结构域的其他作用还有酶活性的调节，如受体l r l p 受其胞外区域的配基结合调 控。最近的假说推测受体p t p 与配基的结合可使y r p 失活( n e e l t o n i c s ，1 9 9 7 ) 。 1 2 植物中的p t p s 尽管动物和酵母中可逆磷酸化的研究已经广泛而深入p t p 在动物和酵母中至关重要的作 用也已被人们认可，植物中p t p 的发现却仅仅是近十年才开始。1 9 9 5 年，有研究者从绿藻中分 离出典型d s p t p ( h a r i n ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。1 9 9 7 年，l u a n 等人在研究保卫细胞渗透敏感性时，发现 一种m a p k 活性被渗透压调节。至少两种m a p k 活性被胁迫处理激活后又迅速失活，这是由 m a p k 被蛋自磷酸酶脱磷酸化造成的。当用磷酸酶抑制剂冈田酸( o k a d a i c a c i d ，o a ) 和钒酸钠 处理细胞，m a p k 表现出过度的活性；但单独用这两种抑制剂之一处理都没有出现这种现象。由 中国农业大学硕j 二学位论文文献综述 于o a 是p p l 和p p 2 a 的专一性抑制剂，钒酸钠专一抑制酪氮酸蛋白磷酸酶，说明p p l p p 2 a 和 p t p 都与m a p k 失活有关。在动物细胞中发现f r p s l o 年后，x u 通过序列分析得到p t p 几个保 守区( x ue t a l ，1 9 9 8 ) 。用系统p c r 分离出a t p t p l 的c d n a ，含有典型的信号区域。a t p t p l 重 组蛋白特异脱磷酸化由p p 6 0s ( 一种酪氨酸特异激酶) 标记的磷酸酪氮酸，而对被p k a ( 一 种丝氨酸，苏氨酸特异激酶) 标记的底物无作用；其活性可被l m mv a n a d a t e 抑制；用丝氨酸代替 半胱氨酸残基，虽然只是一个原子改变但使得a t p t p l 的活性完全丧失( x ue t a l ，1 9 9 8 ) 。之后， 又在拟南芥中分离出一种d s p t p ( a t d s p t p i ，o u p t ae t a l ，1 9 9 8 ) 。a t p t p l 的其他同源物也在大豆 和豌豆中有所发现( f o r d h a m - s k e l t o n 酣a 1 ，1 9 9 9 ) 。越来越多的p t p 开始在植物中发现，a t m k p l ( u l me t a l ，2 0 0 1 ) ，a t p t p i g s l ( f o r d h a m s k e l t o n 甜口l ，2 0 0 2 ) ，a t p t e n l ，a t f i e n 2 ，a t p t e n 3 ( g u p t a e t a l ，2 0 0 2 ) 。 随着拟南芥基因组测序完成，已有2 0 多个基因被鉴定为编码拟南芥中的p t p s 。其中包括1 7 个d s p t p 及类似d s p t p ，一个p t p ，一个低分子量p t p ，以及一些类似p t p 的基因( d a v i d 2 0 0 2 ) 。 这些拟南芥中的p t p s 以及其他高等植物中的同源蛋白功能仍需确定。 1 3p t p 在植物体中的功能 在动物中，无论是丝氨酸，苏氨酸磷酸化，还是酪氨酸磷酸化，都在细胞信号传导中起着至关 重要的作用，特别是酪氨酸蛋白磷酸化是动物细胞内生长因子调节细胞增殖与分化的一般机制。 在正常细胞中，酪氮酸磷酸化水平决定于p t k 和p t p 的平衡状态，略微的失衡就会导致肿瘤以 及细胞的非正常死亡。此外，p t p 在动物中还有很多作用。受体类型的p t p 的胞外区域含有与细 胞粘连分子极相似的结构域，对细胞间的粘连起了关键作用。含有s h 2 结构域的p t p ( s h p s ) 在哺乳动物，蛙类和果蝇中都有发现。脊柱动物中的s h p l 已被证明对造血细胞通路有负调控作 用。而d s p t p 的一个家族也已被证明在m a p k 通路的调节中起了关键作用。d s p t p 的一个重要 亚组c d c 2 5 蛋白磷酸酶是细胞周期过程所必需的。最近，d s f r p 的一个以f t e n m m c i 为代表 的亚组被鉴定为一种癌抑制物。 相对于人基因组中1 0 0 多个p t p s ，酵母中只有6 个p t p s ，而拟南芥中只有2 0 多个f t p s ， 对它们功能的研究才刚刚开始。 1 3 1 植物p t p s 在逆境胁迫和m a p k 调节中的作用 在酵母和动物体系中，受细胞分裂和逆境信号的诱导，其活性依赖双羲磷酸化，一种d s p t p 仅以一种或两种m a f k 为底物，并通过脱磷酸化使之失活。d s f t p 的底物特异性与其功能相关。 这些与m a p k 作用的f r p 又称为m k p m a p k i n a s e p h o s p h a t a s e ) 。通过分子克隆，一些m a p k 已经在高等植物中被鉴定出来。过去几年的研究表明，植物m a p k s 在大量信号通路中起作用。 如m a p k s 可被各种逆境信号( 冷、早、伤、氧化作用) 激活，也可被病原引发体和病原反应中的 信号分子水杨酸激活。除此之外，m a p k 还参与激素应答和发育过程。 对高等植物的一些研究表明，m a p k 活性伴随着酶蛋白的酪氨酸磷酸化。这些研究为植物 m a p k 可能在酪氨酸残基被m a p k k 或其他酪氨酸激酶磷酸化提供了强有力的证据。这些研究也 表明，植物可能含有p i e 以使得m a p k s 在信号转导过程中脱磷酸化失活。现在，a t p t p i 已经 中国农业大学硕士学位论文)献综述 被分离出，其表达似乎被逆境( 高盐，冷) 调节( x u 鲋a 1 ，1 9 9 8 ) 进一步的生化研究表明a t p t p l 脱磷酸化脱磷酸化了拟南芥中的一种m a p k 并使之失活( h u a n g e t a l ，2 0 0 0 ) 。另一项研究表明， 其他植物中也含有a t p t p l 的同源物( f o r d h a m s k e l t o ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。a t p t p l 也被证明可使同种 植物中的m a p k 脱磷酸化并失活。生化分析和遗传学资料证明了植物m a p k 活化和p t p s 活性 之间的生理联系( g u oe t a l ，1 9 9 8 ； l e n a e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在用u v 一辐射筛选的突变体研究中t 发 现了一个类似d s p t p 的基因，命名为a t m k p l ，能够抗u v 一辐射。在u v 一辐射条件下，这个 突变体表现出高的m a p k 活性，证明在u v 一反应中，a t m k p l 使m a p k s 的一个负调节因子 ( f o r d h a m - s k e l t o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。在a t p t p l 缺失突变体中，一些m a p k 异构体比野生型的活性 更高然而，在转基因植物中，过量表达的a t p t p l 导致m a p k s 延迟活化( l a a n ，2 0 0 3 ) 。尽管 a t d s p t p l 和其他推测的d s f t p s 是否在体内控制m a p k 活性有待进一步证实，但在植物中同动 物中一样，m a p k 是p t p s 的一个主要靶位。 最新的证据表明，酪氨酸脱磷酸化对在a b a 介导的种子后熟发育中的m a p k 有负调控作用 ( d a v i d e t 吐2 0 0 6 ) 。同样使用p t p s 的特异性抑制剂氧化苯肿( p a o ) 增加了拟南芥种子对a b a 的敏感性，严重抑制了种子的萌发。由于m a p k 在a b a 介导的种子后熟发育中起作用，所以， 很有可能是p 1 哼s 活性的抑制导致了m a p k 激活状态的维持而增加了种子对a b a 的敏感性。这 些研究表明f r r p 应答许多胞外信号并调控m a p k 通路。进一步的研究需要鉴定磷酸酶的活体目 标蛋白及其在植物细胞与发育进程中的作用。 1 3 2p t p s 在气孔运动和叶片运动中的作用 众所周知，气孔关闭是形成气孔的保卫细胞中的溶质，尤其是k + 穿过液泡膜外流的结果。而 保卫细胞中9 0 以上的溶质贮存于中心液泡中，作为膨压调节的主要因素。如果要减少保卫细胞 膨压，关闭气孔，大量的溶质需要穿过液泡膜从液泡运至胞质并通过质膜离子通道最终运至胞外。 在过去的一段时间内，我们对质膜离子通道及其调控因子如a b a 等的已取得长足的进步，但是 对液泡膜离子流的理解仍然十分有限。通过辐射示踪流分析，m a c r o b b i e 对a b a 和其他刺激引 起的鸭趾草气孔关闭过程中的k + 穿过液泡膜的外流的研究作出了巨大贡献( m a c r o b b i ee ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。现已证实，a b a 激发k + 从液泡至胞质的大量瞬时外流，这与a b a 诱导的质膜k + 离子 外向通道的激活相平行，共同促进k + 流出细胞，减少膨压而引起气孔关闭。在这个过程中，除 了钙离子的变化，绝大多数中间信号组份仍然未知。而且，钙离子的作用机理也还不清楚。 m a c r o b b i e 使用几种p t p 特异抑制剂，表明p t p 在a b a ，外部c a ”，黑暗，啦0 2 四种因子 诱导的气孔关闭过程中是必不可少的。p t p 抑制剂影响了液泡膜k + 的外流而对穿越质膜的离 子流无影响，表明一种与液泡膜k + 离子通道有关的蛋白受到磷酸化与脱磷酸化的调节。 d a b a 聪鳓蛳 c a 2 + - i n d e p e n d e n t h 2 0 2a n do t h e r p 叩a y艄咖卿 l c a 2 + - d e p e n d e n t 土岫哪、盯p p m c h a 、n n e l 8k t o 吒n h o 钳p l m a s c l t s 、 ，、”薯_ ? 4 ”i4 。、。 匕 ， 。、。、+ 。； 4 一k ，u o p e n s t o m ac l o s e ds t o m a 图1 2a b a 诱导气孔关闭的简单模式( l u s h 。2 0 0 2 ) f i g u r e1 2 a s i l n p 髓c dm o d e lo f a b a - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e ( l u a n ，2 0 0 2 ) 研究表明，含羞草肌动蛋白酪氨酸磷酸化的状态与含羞草叶片运动相关。p t p 抑制剂氧化苯 胂阻断含羞草叶枕细胞中肌动蛋白的酪氨酸脱磷酸化作用，从而抑制触摸引起的叶柄弯曲运动， 表明肌动蛋白的酪氨酸脱磷酸化作用对叶柄的弯曲是必须的( k a m e y a m ae ta 1 。2 0 0 0 ) 。植物叶片 运动现象是由定位于小叶片叶柄的运动蛋白的k + 离子的内外流动引起的，所以，肌动蛋白的酪 氨酸磷酸化可能与运动蛋白的k + 相关。 1 3 3p t p s 在植物生长发育中的作用 c d c 2 5 蛋白磷酸酶( c e l ld i v i s i o nc y c l yp h o s p h t a s e s ) 是d s p t p 的一类，在酵母与动物中发 现并证明在细胞周期过程中起作用。c d c 2 5 磷酸酶可以使周期蛋白依赖激酶( c y c l i n - d e p e n d e n t p r o t e i nk m a s e s ，c d k s ) 上起抑制作用的磷酸化酪氨酸残基脱磷酸化，激活c d k s ( d u n p h y , 1 9 9 4 ) 。 由于细胞周期的调控机制在所有真核生物中具有高度保守性，所以期望在植物中具有同样的周期 调控机制，但是高等植物中一直没有关于c d c 2 5 同源基因的描述。有研究提供了一些p t p 可能 调节植物c d k 的证据( m e s z a r o se t a l ，2 0 0 0 ) 。在这些研究中，植物c d k s 可被酵母或果蝇中的 c d c 2 5 激活，表明c d k 酪氨酸磷酸化可能是负调控的一步，如果植物不含典型c d c 2 s ，其他f r p 可 能代替它调节c d k 活性以控制细胞周期。基于序列比对，在拟南芥中找到一个c d c 2 5 直向同源 基因a r a t h ；c d c 2 5 ，i s a b e l l e 等人在2 0 0 4 年首次报道了a r a t h ；c d c 2 5 的特性( i s a b e l l e 2 0 0 4 ) 。 拟南芥c d c 2 5 包含一个保守活性域，缺少人类c d c 2 5 的n - 调节域，其在大肠杆菌中的原核表达 表明其具有酪氨酸磷酸酶活性，核磁共振n m r 分析了其晶体结构，在c 端有一个z n 指结构，并有 5 一 礴 中国农业大学硕士学位论义文献综述 z n 存在该结构可能在植物同源基因中保守。植物中c d c 2 5 磷酸酶基因仍有待鉴定与深入研究。 d s p t p 的另一类酶p t e n 具有p t p s 的催化核心序列，并与张力蛋白( t e n s i n ) 由高度的相似 性( “e t a l ，1 9 9 7 ；l i a we t a l ，1 9 9 7 ) ，在动物中具有撺制缨胞生长的功能，是一种肿瘤抑制因子 ( m a e h a m a d i x o n ，1 9 9 9 ) a t p t e n l 是拟南芥中一个p t e n 类似基因，重组的a t p t e n i 是 个有活性的磷酸酶，能够水解多肽上的磷酸化酪氮酸残基，也能使p i p 3 脱磷酸化。a t p t e n l 在 花粉粒中特异表达，而a t p t e n l 基因沉默会导致花粉发育后期发生细胞死亡( g p t ae t a l ，2 0 0 2 ) 。 生物信息学分析表明a t 3 9 5 2 1 8 0 与i o f a d n 同源，为d s 墨含有g a s 0 ( i n a t l i n t e r e c t i o ns e q u e n c e ) 结构域( 其他基因如a t 3 9 0 1 5 1 0 及其玉米同源基因) ，含有叶绿体转运信号序列。a 0 9 5 2 1 8 0 全部和 部分体外g s t 融合蛋白表达s d s p a g e ，共沉淀证明a t 3 9 s 2 1 8 0 蛋自古有糖结合结构域，可与淀粉，支 链多聚糖，直链多聚糖, p u l l u l a n 作用。免疫实验证明a t 3 9 5 2 1 9 0 与体内淀粉结合，免疫定位表明 a t 3 9 5 2 1 8 0 定位于叶绿体基因徽矩分析表明a t 3 9 5 2 1 8 0 与淀粉代谢蛋白( 葡聚糖水双激酶蛋白 g w d l ，和g w d 3 表达相关) 而a t 3 9 0 1 5 1 0 也与淀粉脱支酶i s a 2 相关( d a v i de ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 另外，在动物中还存在一种类似l r r p s 的蛋白( p t p - i i k e ，p t p i ) ，虽然与p t p 相似，但不具 有磷酸酶活性( u w a n o g h oe t a l ，1 9 9 9 ) 。植物中也发现了这种蛋白p a s 2 ( y a n n i c k ，2 0 0 2 ) ，并证明它 与细胞的分裂有关。 以反磷酸酪氨酸抗体做探针，一项研究表明，大量假定的p t p 可能改变植物发育阶段和状况 ( b a r r i z a e t a l ，1 9 9 9 ) 。h u a n g 等( 2 0 0 3 ) 证明酪氮酸磷酸化可能参与拟南芥下胚轴外植体脱分化 再分化过程。这些研究将很可能揭示更多的可在酪氮酸残基上磷酸化的蛋白并为未来以基因和 基因组为工具的研究提供了更多的分子目标。 还有一些直接证据表明酪氨酸磷酸化在高等植物中十分重要。如在一些植物细菌病原体中， 酪氨酸激酶对病原的括性很重要( 1 l a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。根中生根基因的转录伴随着酪氨酸激酶活性 的存在( r o d r i g u e z a p a t ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这些研究表明，酪氨酸磷酸化在植物墩生物相互作用中 起了重要作用。 2 植物逆境信号传导 作为植物五大激素之一的脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) ，在植物的生长发育中具有广泛的调 控功能，尤其在植物对环境胁迫的反应中起着十分重要的作用。主要体现在a b a 不仅可以作为 细胞逆境信号直接调控众多抗逆基因的表达，而且还可以作为长距离传递的信号使植物实现整体 水平上的抗逆反应：而a b a 之所以能够作为逆境信号，其根本基础在于环境胁迫特别是水分胁 迫fa b a 可以发生快速和大量的积累，而一旦胁迫解除a b a 信号又会迅速的消失。 显然，环境胁迫下a b a 合成的调控机制或者说a b a 信号的发生机制是植物整个逆境信息 传递中的核心问题之一。a b a 的生物合成与代谢是一个非常复杂的过程，而水分等环境胁迫下 a b a 的积累是由a b a 生物合成途径中几个少数关键酶控制的，因此对调控a b a 积累的关键 酶的研究是近年来的一个重要课题。无论a b a 的积累是由何种酶控制的，归根到底是由水分等 环境胁迫下的酶的活性变化调控的。水分等环境胁迫下a b a 生物合成途径中关键酶活性的变化 6 过程实际上是一个细胞逆境信息传递过程，即从细胞对水分等环境胁迫的识别、转导到细胞内的 信号传递赢到最终编码a b a 生物合成关键酶基因的表达调控。不难理解。从细胞对环境胁迫原 初信号的识别到a b a 积累的信号传递是整个细胞逆境信号网络中最为重要的信号传递链之。 2 1 a b a 作为细胞信号介导植物的抗逆反应 环境胁追下植物细胞可通过一系列生理生化过程的调节使植物产生各种抗逆的反应。植物抗 逆的生理生化反应是非常复杂的，其中包括了众多的物质代谢和运转的变化，如渗透物质及抗逆 蛋白的积累，自由基的清除及离子的运转或区隔等。令人关注的是，许多环境胁迫都可导致a b a 的大量积累，但是与渗透调节等过程相关的物质积累不同的是，a b a 不是作为一种功能物质直 接参与植物的抗逆性。而是作为重要的细胞信号物质介导一系列的抗逆反应。a b a 之所以被认 为是信号，原因在于a b a 可以介导许多逆境应答基因的表达。近年来在植物抗逆机制的研究中， 一个重要的领域就是对a b a 应答基因的研究，目前已经鉴定出上百种不同的a b a 应答基因 ( c h a n d l e r e t a l ，1 9 9