（市政工程专业论文）植物多酚对藻类生长抑制的试验研究.pdf

北京建筑工程学院硕士学位论文 摘要 本研究针对茶多酚对藻类生长的影响进行了试验研究，分析了茶多酚对藻类的生长抑 制作用及影响茶多酚抑藻效果的因子，并对茶多酚的抑藻机理进行了初步探讨。 试验表明，l o o m g l 茶多酚对绿藻、蓝藻、硅藻的抑制作用明显，具有广谱性抑藻作用， 其中对硅藻的抑制效果最好。将茶多酚投加于自然水体中，抑制效果也较为明显。茶多酚对 藻类生长的作用可以简单的归结为“低促进高抑制”效果。当水体中的茶多酚浓度l o m g l 时，对藻类就有明显的抑制作用，且浓度越高，对藻类生长的抑制效果越明显。当茶多酚浓 度- - s m g l 时，藻类生长速度略微高于空白，说明低浓度的茶多酚对藻类的生长有促进作用。 茶多酚的浓度和反应接触时间直接影响到藻种液的颜色，浓度越高，颜色越重；对于同一浓 度的茶多酚，接触时间越长，色度越高，颜色越重。从茶多酚的应用成本和对水体色度的影 响上考虑，水体中茶多酚的浓度达到1 0 m g l l o o m g l ，可以作为抑制藻类生长的最佳抑制 浓度。外界的条件会影响茶多酚抑藻的效果，高温会降低茶多酚抑藻的效果，温度为 1 5 2 5 时，茶多酚抑藻效果较好；强光会提高茶多酚抑藻的效果，光照强度为5 0 0 0 i x 时 茶多酚抑藻效果最好；在p h = 6 8 8 3 这种弱酸、弱碱条件下，茶多酚抑藻效果较好；水体中 的三价f e 离子因与茶多酚发生络合反应，会降低茶多酚抑藻的效果：增加投加频次可以强化 茶多酚的抑藻效果；当水体中的藻类密度3 1 0 8 几时，茶多酚的抑藻效果较明显。随后， 本文从茶多酚对藻类细胞膜、蛋白质和酶以及叶绿体三方面的影响进行了初步的分析和探索 性研究。最后，对茶多酚的经济效益、环境安全和社会效益进行了分析。 关键字： 茶多酚藻类抑制试验研究 北京建筑工程学院硕士学位论文 a b s t r a c t t h i sp a p e rm a k e sa n a n a l y s i s o n a l g ag r o w t hi n h i b i t e db yp l a n tp o l y p h e n 0 1 t e a p o l y - p h e n o li sc h o s e nt os t u d yt h ee f f e c to na l g ag r o w t ha n di t si n h i b i t i o nm e c h a n i s mi s d i s c u s s e dp r e l i m i n a r i l y t h er e s u l ts h o w st h a t ，w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o li slo o m g l ，a l g ag r o w t hi s i n h i b i t e do b v i o u s l y ，w h i c hp r o v e st h a tt e ap o l y p h e n o lh a sab r o a ds p e c t r u mi n h i b i t i o ne f f e c t t e s t e da l g a em a i n l yi n c l u d es c e n e d e s m u so b l i q u u sk i i t z , m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s aa n dn i t z s c h i a h a n t z s c h i a n a , i nw h i c hn i t z s c h i ah a n t z s c h i a n ag r o w t hi si n h i b i t e dm o s to b v i o u s l y b e s i d e s ，t e a p o l y p h e n o li sa d d e di n t ot h en a t u r a lw a t e rb o d y , w i t ho b v i o u si n h i b i t i o no na l g ag r o w t h t h e r e s u l ta l s od e m o n s t r a t e st h a tl o wc o n c e n t r a t i o nt e ap o l y p h e n o lc a np r o m o t ea l g ag r o w t h ，w h i l e h i g hc o n c e n t r a t i o nh a si n h i b i t i o ne f f e c t w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o li nt h ew a t e r i sm o r et h 赫lo m g l ，i n h i b i t i o ne f f e c to na l g ag r o w t hi so b v i o u s ，a n dt h eh i g h e rt h e c o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o l ，t h em o r eo b v i o u st h ei n h i b i t i o ne f f e c to na l g ag r o w t h w h i l e t h ec o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o li s5 m g l ，a l g ag r o w t hi sp r o m o t e db yi t t h ec o n c e n t r a t i o n o ft e ap o l y p h e n o la n dr e a c t i o nc o n t a c tt i m eh a sad i r e c ti m p a c to nt h ea l g al i q u i dc o l o u r a n d t h eh i g h e rt h ec o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o l ，t h ed a r k e rt h el i q u i dc o l o u ri s t h el o n g e rt h e c o n t a c tt i m e ，t h ed a r k e rt h el i q u i dc o l o u ri s a sar e s u l t ，t a k i n ga c c o u n ti n t oc h r o m aa n dc o s to f t e ap o l y p h e n o l ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no ft e ap o l y p h e n o li n h i b i t i n ga l g ag r o w t hi s 10 m g l - 10 0 m g l i na d d i t i o n ，e x t e r n a lc o n d i t i o n sw i l la f f e c tt h ei n h i b i t i o ne f f e c to ft e a p o l y p h e n o lo na l g a eg r o w t h h i g ht e m p e r a t u r ec a nr e d u c ei n h i b i t i o ne f f e c to f t e ap o l y p h e n o lo n a l g ag r o w t h ，a n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c ti sb e t t e ra tat e m p e r a t u r eo f15 c - 2 5 c ；s t r o n gl i g h tc a l l s t r e n g t h e ni n h i b i t i o ne f f e c to ft e ap o l y p h e n o lo na l g ag r o w t h ，a n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c ti st h eb e s t f o r l i g h ti n t e n s i t yo f5 0 0 0 i x ；w h i l et h ei n h i b i t i o ne f f e c to ft e ap o l y p h e n o lo na l g ag r o w t hi s o p t i m a la tp h6 8 - 8 3 ：a sar e s u l to fc o m p l e xr e a c t i o n sw i t ht e ap o l y p h e n o li nt h ew a t e r , f e r r i c i r o nc a nr e d u c ei n h i b i t i o ne f f e c to ft e ap o l y p h e n o lo na l g ag r o w t h ；i n c r e a s i n gf r e q u e n c yo f a u t o - - a d d i n gt e ap o l y - p h e n o lc a ns t r e n g t h e ni n h i b i t i o ne f f e c to ft e ap o l y - - p h e n o lo na l g ag r o w t h ； w h e nt h ea l g ad e n s i t yi sl e s st h a n3 10 5 l t h ei n h i b i t i o ne f f e c to ft e ap o l y p h e n o lo na l g a g r o w t hi sp r o n o u n c e d t h e nt h i sp a p e rm a k e sap r e l i m i n a r ya n a l y s i sa n de x p l o r a t o r yr e s e a r c ho n t h em e m b r a n e ，p r o t e i na n de n z y m ea sw e l la sc h l o r o p l a s t f i n a l l y , t h ee c o n o m i cb e n e f i t s ，s o c i a l b e n e f i t sa n dt h ee n v i r o n m e n ts e c u r i t ya r ea n a l y z e d k e yw o r d s ：t e ap o l y p h e n o la l g a i n h i b i t i o nt r i a lr e s e a r c h i 北京建筑工程学院硕士学位论文 北京建筑工程学院 硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的 作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本 人承担。 学位论文作者签名：碴国珲 日期：2 0 0 8 年1 2 月2 8 日 北京建筑工程学院硕士学位论文 1 绪论 1 1 植物多酚简介 1 ) 植物多酚”4 j 植物多酚又称植物单宁，是复杂的较高等植物的次生代谢物，广泛存在于植物体内。 除低等植物如苔藓、藻类、地衣不含多酚或含量极少外，在蕨类植物、裸子植物、被子植 物中的叶、果实、树皮、木材中均存在多酚物质。在植物中的含量仅次于纤维素、半纤维 素和木质素，主要存在于植物的皮、根、木、叶、果中。植物多酚在自然界的储量非常丰富， 含多酚较多的常见植物超过6 0 0 种，在某些针叶树皮中多酚含量达2 0 0 o , - - 4 0 ，仅此，每年 即在全球形成了数以亿吨的可再生绿色资源。 植物多酚对微生物具有广谱抗性，其中包括细菌、真菌和病毒等。作为植物的次生代 谢产物，对于植物本身有很好的保护作用，使自身免受食草动物、昆虫等危害，同时也可 以阻止微生物的侵袭。可溶性多酚易与蛋白质结合，可以引起味蕾酶的失活，产生涩味。 迄今为止，人们对植物多酚类物质抑制微生物机理尚未确定p 。j ，估计是多种因素共同作用 的结果。可能的途径：a 蛋白质与植物多酚的高度结合。b 抑制微生物特定的酶，从而破坏 了微生物的代谢过程。c 可能与微生物生长所需的物质结合，使微生物由于缺乏生长所需 的物质受到抑制而死亡。d 多酚类物质分子中多个邻苯二酚结构，使其具有较强的金属结 合能力，可以剥夺铁等离子形成沉淀，从而破坏了微生物的正常新陈代谢。e 植物多酚对 病毒的抑制机理一般认为是多酚与病毒体的蛋白质外壳或寄主的细胞膜特异识别蛋白结 合，使病毒不能附着在寄主细胞上，从而使病毒失去侵蚀力p j 。多酚分子量与其抑菌性之 间存在一定关系，分子量太大其抑菌力下降。目前在抑菌实验中对多酚的研究较多p j 。 近年来，世界范围内赤潮发生的频次有明显增长的趋势。尽管已发展了多种控制赤潮 的方法，但真正能推广应用的方法寥寥无几，寻找新的、高效、经济、无污染的赤潮防治 方法仍然是赤潮领域研究的热点。有人1 1 0 j 研究了杉木粉对赤潮藻塔玛亚历山大藻生长 的影响，并对其机制进行了初步探讨。结果显示，杉木粉能明显抑制塔玛亚历山大藻的生 长，杉木粉对藻细胞有明显的沉降作用，其多酚提取物具有显著的抑藻作用。这些结果提 示，杉木粉可能是一种潜在的控制赤潮藻生长的新材料，其抑藻机制可能与杉木粉中的多 酚类活性物质和杉木粉对藻的沉降作用有关。 还有研究表明【l l ，1 2 】，对藻类的化感作用在水生植物中普遍存在。从水生植物中分离鉴 定出多酚类对蓝藻、绿藻等水华藻类具有一定的抑制作用。 多酚物质在植物不同部位的分布因物种不同而不同。例如柽柳植物中更多的多酚物质 是集中在叶表皮中，而不是小枝中。除此以外，不同地理种源和不同生长季节都影响植物 内部的多酚含量。例如4 月份采集的白桦枝多酚含量是7 月采集的白桦枝的2 倍左右。不 同植物品种的多酚含量也不同。有人在承德采集的白桦枝、柽柳枝、锦鸡儿小枝和芦苇杆 四类样品，两生长季多酚平均含量最高的是白桦枝，多酚含量最低的是芦苇杆，锦鸡j l d , 枝和芦苇杆多酚含量明显低于柽柳枝和白桦枝多酚含量i 叫川。 多酚资源是一种自然资源，用于生物浮岛将解决以废轮胎和废泡沫为载体带来的二次 污染问题，可保障人民的身体健康，具有良好的生态社会效益。北京为缺水城市，草坪、 绿地，植树造林需大量用水，多酚处理过的中水可以达到绿化用水的标准，降低北京的绿 化树种的栽培和维护成本，增加成活率，减少自来水的使用量，为缓解北京市水资源的紧 张状况做出贡献。 2 ) 茶多酚【1 7 1 茶多酚是目前市场上大量生产且已有售的植物多酚，是从茶叶中提取出来的相对分子 质量低的多酚【1 6 1 ，占绿茶干重的3 0 。与植物多酚结构一样，含有酚羟基结构，具有强抗 氧化性、清除自由基能力以及广谱抑菌性、与蛋白质金属离子络合等性质，已在各个领域 方面被广泛应用，如在医药方面有抗肿瘤、抗突变、抗衰老、防治心脑血管疾病等诸多作 北京建筑工程学院硕士学位论文 用：在化妆品、食品方面还有保健美容、保鲜及除臭等作用。 茶多酚是茶叶中的类主要的化学成分，是一群分子结构中都含有多个酚羟基的复合 体，总称为茶叶的多酚类物质，简称为茶多酚。目前已十分清楚，茶叶中的多酚物质主要 属缩合单宁( 具有良好的防癌抗肿瘤作用) ，并不含鞣革作用的单宁( 即水解单宁，有一定 的致癌作用) 。 茶叶中的多酚类物质大多属于缩合单宁，因其大部分溶解于水，所以又称为水溶性单 宁。它是由黄烷醇类( 儿茶素类) 、花色素类( 花白素和花青素) 、花黄素类( 黄酮及黄酮 醇类) 、缩酸及缩酚酸类组成。除缩酸及缩酚酸类以外，其他儿类化合物由于都具有2 一苯 基苯并吡喃的基本结构，所以可以统称为类黄酮化合物。 黄烷醇类：茶叶中的黄烷3 醇衍生物，俗称儿茶素类，是茶多酚的主体成分，约占茶 多酚总量的9 0 左右，为茶叶中多酚类总量的7 0 8 0 。儿茶素类的主要成分是表儿茶 索( e c ) 、儿茶素( c ) 、表儿茶素没食子酸酯( e c g ) 、儿茶素没食子酸酯( c g ) 、表没食 子儿茶素( e g c ) 、没食子儿茶素( g c ) 、表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g ) 、没食子 儿茶素没食子酸酯( g c g ) 等，其中主要单体只有六种，且以酯型儿茶素( e g c g 和g c g ) 最为重要。它们的结构至少包括a 、b 、c 三个环核，酯化后，还有d 环，是2 一苯基苯并 毗喃的衍生物。 茶多酚作为类黄酮化合物、黄烷醇类化合物、酚酸类化合物等的复合物，易溶于水、 乙酸乙酯、乙醇、丙酮、乙醚和4 甲基戊酮中，而不溶于石油醚和氯仿中。以胶体状态出 现的多酚溶解性一般随p h 值的升高而增大，可逐渐成为澄清的溶液。 多酚化合物因分子中具有酚羟基，可游离出h + ，故显酸性，所以儿茶素也称儿茶酸， 单宁或鞣质也称单宁酸或鞣酸。多酚类酸性强弱和酚羟基数目的多少与其位置有关。 茶多酚在水溶液中是以真溶液( 分子分散态) 和胶体( 分子聚集态) 之间的状态并存， 即属半胶体状态。 因为茶多酚半胶体溶液属于热力学不稳定体系，胶体粒子即可发生凝集而导致沉淀， 又因多酚溶液属亲水胶体，多酚粒子表面的水化可起保护作用，而且多酚胶体粒子表面带 有负电荷，粒子间的电荷排斥作用又防止凝集，但当加入电解质如n a c i ，会使多酚粒子失 电、失水而聚集，从溶液中沉淀出来( 盐析) 。为了提高茶多酚溶液的稳定性，除了合适的 浓度、温度、p h 条件外，还可采用添加分散剂的方法，例如蔗糖、葡萄糖、黏多糖、甘油、 乙二醇、乙醇、丙醇、醋酸、柠檬酸、没食子酸、苯酚、间苯二酚、苯磺酚等都具有使多 酚微粒稳定的作用。 涩味是多酚类的羟基与v i 腔粘膜上蛋白质的氨基结合沉淀形成一个不透水层在口腔上 的感觉。 茶多酚因其分子中所含有的苯环结构，在紫外光区有很强的吸收，这一特性除用以进 行结构鉴定和多酚类的定性定量分析外，还可将日光的强紫外辐射转化为危害较少的辐射， 即起到“紫外光过滤器”的作用。而频率高的近紫外线是光老化的主要原因，因此作为抗 紫外线添加剂的应用日趋受到重视。茶多酚组成主要是儿茶素类( 黄烷醇类) ，其紫外吸收 主要出现在a 环、b 环中苯环的b 带吸收。因此除了2 0 0 n m 附近苯环的e 带吸收外，在 紫外区以一个单峰形式出现。典型的儿茶素通常在甲醇溶液中的入m a x 均在2 8 0 n m 。 茶多酚很易被空气中的氧所氧化，特别在水溶液和多酚氧化酶存在时，酚羟基通过离 解，生成氧负离子，再进一步失去电子，生成邻醌，邻醌可夺取其他物质的氢还原为酚， 也可发生聚合，生成红棕色聚合物。在茶树活体内，由于呼吸基质可提供丰富的氢而不会 使茶叶红变，但若茶叶离开母体，呼吸基质亏缺，邻醌不能及时还原，而过量的邻醌就会 聚合起来发生茶叶的红变。 用酸性氧化和碱性氧化等化学氧化法，均可使茶多酚氧化聚合，产物中含有一定量的 t f 和t r 。 多酚对无机盐是高度敏感的，其作用有两个方面，一是静电作用，另一个是络合作用。 静电作用是通过脱水与盐析促进多酚的沉淀，这是一个物理过程。脱水：多数中性盐 通过静电作用降低了多酚在水中的溶解性，促进多酚的沉淀，这是一个共性，一般金属活 性越强、离子强度越大，多酚分子中的疏水基团( 如没食子酰基) 在水中的溶解越困难， 促使整个多酚分子更易沉淀下来。这是因为无机离子的强烈水化作用，使原来高度水合的 多酚分子发生脱水而易产生聚集沉淀；盐析：中性盐可使多酚溶液发生盐析而沉淀，这主 2 北京建筑 二程学院硕士学位论文 要是因电解质的加入使多酚胶体发生去电荷、去溶剂化作用，既感胶化作用。各种离子加 入亲胶溶液时，发生沉淀多少的次序如下：柠檬酸根 酒石酸根 s o l 一 p o 一 c h ，c o o 一 c l 一 n o ： i 一 c n s 一 m g “ c a 抖 s r “ b a “ l i + n a + k + c s + 。 多酚中大量的酚羟基可使其与大多数三价的金属离子和过渡金属离子发生络合，这是 酚类化合物的共性。虽然络合主要发生在多酚分子两个相邻的酚羟基上，茶多酚中含黄烷 醇类、黄酮及黄酬醇类、花色素类，还有酚酸类，它们的酚羟基数目与位置都会对金属离 子的络合。 多酚与蛋白质发生结合大多是可逆结合，原冈是疏水键一氢键的键合力弱，只有在某 些外界因素( 如氧、金属离子和酸) 的作用下，使接近的两个分子可能产生共价键连接， 或在酶的时候，或原花色素在酸催化下黄烷醇间连接键断裂形成正碳离子，邻醌和正碳离 子都是高亲电中心，与蛋白质的亲核基团( - n h 2 、s h ) 形成共价键结合，这种结合才是 不可逆的。 茶多酚的游离酚羟基，可与蛋白质和氨基酸结合，使蛋白质沉淀，这是茶多酚杀菌抗 病毒作用的基础。另外，茶多酚与口腔黏膜上皮组织的蛋白质相结合，凝吲成一不透水层， 这是味觉的涩味。由于简单儿茶素的羟基数目相对较小，所以刺激性较弱，滋味爽口，而 复杂儿茶素酚羟基数目多，收敛性强，涩味重些。 多酚类能在多个位点与蛋白质表面结合。在低浓度蛋白质中，多酚类从一个点或多个 点结合，从而形成一种层状结构。在高浓度的蛋白质中由于多酚类与蛋白质结合，或由于 环齿状多酚类结合了多个不同的蛋白质分子，形成疏水的表面层，于是就产生了沉淀现象 【1 8 】。 多酚对酶的抵制，可采用一些去抑制剂，以解析或防止生成多酚一酶复合物。如提高 体系p h 值，或加入咖啡碱、有机溶剂而得到保持活性的酶蛋白。实际应用较多的是在制 各酶时加入丙酮和聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 。因这些化合物与多酚之间的结合力强于多酚对 酶蛋白的结合，可从多酚一酶复合物中把多酚结合出来，从而消除多酚对酶的抑制。 茶多酚中含有多羟基结构，使其表现出一系列理化性质。多羟基结构使其易溶于水， 又因分子中的大量酚羟基和苯环使其以氢键和疏水键发生分子缔合，这是一种不引起化学 性质改变的分子间可逆聚集作用，因此，茶多酚在水溶液中实际上是以半胶体状态存在， 即茶多酚水溶液为亲水性胶体。 酚羟基与口腔黏膜上蛋白质的氨基结合沉淀形成一不透层使儿茶素具有一定的涩味。 各种儿茶素的滋味有所不同，简单儿茶素收敛性较弱，为爽口不苦涩；复杂儿茶素收敛性 较强，在高含量下有苦涩味。 儿茶素本无色，但极易被氧化。酶催化氧化生成茶黄素、茶红素和茶褐素而呈棕红色； 非酶催化反应多生成寡聚体，发生红移现象使颜色加深，所以茶多酚的提取过程中或多或 少总会有儿茶素的氧化而使产品呈浅棕黄色或棕红色。 茶多酚能与一些试剂进行反应产生颜色，茶多酚的多种特征显色反应常被用于定性检 验和定量分析。 茶多酚与金属盐类、咖啡碱、蛋白质、氨基酸等都可发生络合反应。茶多酚与蛋白质、 氨基酸的络合：茶多酚的游离酚羟基，可与蛋白质和氨基酸结合，使蛋白质沉淀，这是茶 多酚杀菌抗病毒作用的基础。茶多酚与口腔黏膜上皮组织的蛋白质相结合，凝固成一不透 水层，这是味觉的涩味。多酚与蛋白质发生结合大多是可逆结合。茶多酚络合蛋白质，一 方面，茶多酚与微生物膜蛋白络合可降低其侵染活性；另一方面，更重要的是使微生物酶 类失活，干扰代谢而抑制微生物活性。茶多酚可直接进入脂质双层，以多酚羟基与脂质的 亲水端结合，扰乱细胞膜的脂质双分子结构，破坏栅栏的保护功能，导致细胞膜功能丧失 和微生物死亡。茶多酚与酶结合后，可抑制酶的变构效应，从而抑制酶的催化活性。低聚 多酚含量与甲烷细菌活性呈负相关。聚合开始时，低聚多酚含量逐渐增加，抑菌作用逐渐 增强，直至达到最佳抑菌效果；继续聚合，低聚多酚含量下降，抑菌作用减弱。这与多酚 抗病毒构效关系相似，即缩合多酚的活性取决于分子中的没食子酰基数目。 - 3 北京建筑工程学院硕士学位论文 1 2 浮游藻类 1 ) 藻类的基本知识 1 9 2 2 l 藻类一词没有标准的定义，有人将藻类定义为具有叶绿体，可进行光合作用的单细胞 或多细胞小型原生生物。 其特征是：一般具有光合色素能进行光合作用，制造营养以供自身需要。组织的分化 甚少，不具备真正的根、茎、叶。因种类不同，其色泽和形态有很大差异。其构造比较简 单，被认为是最低等的植物。藻类的生殖方式是决定其亲缘关系和分类地位的重要依据之 一。多数藻类能进行有性繁殖、无性繁殖和营养繁殖等3 种方式。有性繁殖的生殖细胞叫 配子，无性繁殖的生殖细胞叫孢子，而营养繁殖又分为细胞分裂法和断裂法两种，前者主 要发生于许多单细胞藻类，是由细胞分裂而产生两个细胞，分开成为两个新的个体，有时 候子细胞不分开而成为暂时性的群体。后者多被用于结构较复杂的藻类，植物自行断裂为 几个小部分，每个小部分均可长大成为一个新的个体。 藻类的种类非常多，不过却具有许多共同的特性，例如，借着光合作用利用二氧化碳 来生产有机物，故属于自养性生物；生长密度自水面向下递减，主要是光线越来越弱的原 因；大量繁殖会耗掉水中二氧化碳，使p h 值上升，但在黑暗中会耗掉水中溶氧，放出二 氧化碳使p h 值下降；以及会吸收水中的营养元素，如氮( 常以n o ；形式吸收) 、磷( 常 以磷酸盐形式吸收) 、硫( 常以s o i 一形式吸收) 和一些微量元素如钠、钾、钙、镁、铁、 铜、钼等。 藻类的分类依生长方式不一，有些微小的藻类漂浮在水中称浮游藻类，有些附着在其 他生物或无生命体上生活称为同着藻类。浮游藻类通常多属于单细胞，而肉眼无法明视； 固着藻类虽有不同生长形态，但以丝状藻占绝大部份，且多为多细胞藻类。浮游藻类利用 太阳能效率高、生长繁殖迅速、对环境的适应性强、容易大量滋生，因而比较受到重视。 相比之下，固着性多细胞丝状藻类因繁殖较慢，通常仅着生在池岸或浅水域的底床，对水 质之影响较小。因而，在讨论富营养化水体中藻类过度生长时，主要是以浮游藻类为探讨 对象。 浮游藻类在大小和体积上具有显著的差别：大型的种类肉眼可见，如团藻和微囊藻的 个体常常大于l m m ；小型的种类大小不到1um 或比细菌还小。绝大多数的浮游藻类是肉 眼看不见的，依据它的个体大小可分为：网采浮游藻类( 2 0 2 0 0l jm ) 、微型浮游藻类( 2 2 0 pm ) 及超微型浮游浮藻类( 小于2um ) 。浮游藻类是蓝藻门、绿藻门、硅藻门、隐藻 门、甲藻门、金藻门、黄藻门和裸藻门的成员。藻类的另外的3 个门分别是：轮藻门、褐 藻门和红藻门。其中轮藻类是大型沉水藻类，多为淡水产；后两者绝大多数为大型海产种 类，海带和紫菜分别是褐藻门和红藻门的典型代表。淡水水华的优势藻种多为蓝藻门、硅 藻门的藻类，也包括绿藻门的一些藻类；海水赤潮优势藻多是硅藻门的种类，另外也包括蓝藻 门的个别种类。 2 ) 水体富营养化 众所周知，富营养化己成为全球关注的问题。工业污水、生活废水和农业退水大量进 入水体，引起了水体的富营养化，使藻类尤其是一些浮游藻类大量繁殖，形成水华或赤潮， 而由此会进一步加重水体的污染。水华不仅导致水产养殖业蒙受经济损失，同时也破坏水 域生态景观，导致生态系统失衡，危害人体健康。一次严重水华或赤潮造成的经济损失难 以想象，每年因藻毒素而导致的人体中毒事件也有无数【z 略。因此，有效控制富营养化水 体中的藻类，防止水华发生成为目前环境领域的研究热点和前沿。 国际经合组织对湖泊富营养化的定义为：水体中由于营养盐的增加而导致藻类和水生 植物的生产力增加、水质下降等一系列的变化，从而使水的用途受到影响的现象。与湖泊 富营养化伴随的一个普遍现象就是许多浮游植物，尤其是那些具有浮力或能运动的藻类， 通常会过度生长，形成藻类的水华，从而导致水质的下降及一系列严重的水环境问题。水 华，通常是指浮游藻类的生物量显著地高于一般水体中的平均值，并在水体表面大量聚集， 形成肉眼可见的藻类聚积体；水华又称水花，通常指的是淡水水体中出现的现象；当此现 4 北京建筑工程学院硕士学位论文 象出现在海洋时即称为赤潮1 2 2 1 。 水体发生富营养化时，溶解性营养盐类( 主要是n h 3 n 、n o ，n 、n o ，- n 、p 0 4 一p ) 使 水中藻类等浮游生物大量生长繁殖，继而引起异养微生物旺盛的代谢活动，耗尽水体溶解 氧，使水体变质。正如前面介绍，水体富营养化实质上是由生态系统受到污染造成的，主 要受排放的生活污水和含氮、磷较高的工业废水和农田冲刷水的污染。一般认为，水体形 成富营养化的指标是：水体中含氮鼙大于0 2 - 0 3 m g l ，含磷量大于0 0 1 m g l ，生化需氧 量( b o d 5 ) 大于1 0 m g l 2 2 l 。当水体形成富营养化时，水体中藻类的种类减少，而个别种 类则迅速生长，大量繁殖。目前，中国的许多水库和湖泊都出现了不同程度的水体富营养 化现象。许多大型湖泊如滇池、太湖、巢湖、鄱阿l 湖和抚f i i l 湖等已经处于富营养化状态。 研究表明，我国目前有6 6 以上的湖泊、水库处于富营养化的水平，其中重富营养和超富 营养的占2 2 。海洋频频爆发的赤潮，流动的河流如现已知道的乌江、汉江暴发的藻类水华 都是水体富营养化现象的反映。 3 ) 藻类控制的国内外研究现状 目前，国内外尚无一种有效的方法可以马上将藻类消灭，而不伤害到水中其他生物的。 因此在兼顾其他水中生物的安全考虑之下，还衍生了许多除藻的方法，一般可将它们归类 为：物理控制法、化学控制法、生物控制法和综合治理法。 a 物理控制澍1 9 2 3 2 4 i 物理控制法又称机械控制法，它是一种最安全的方法。这个方法采用打捞、超声波、 微波、粘土等物理方法抑制藻类的过度繁殖。对丝状藻而言，使用本法具有某种程度的时 效，可以将大部分的丝状藻从水中移走。但对单细胞藻类则效果极为有限，即使运用机械 过滤方式来处理，不仅既费电力，且过滤微细藻类的效率也不佳。 机械控制法特别有利于着生在岸边的丝状藻的移除，但对于水底丝状藻的移除，则较 为困难，因为它们不容易被发现。使用过滤设备要滤除微细藻类时，因受到处理效率的限 制，也只能应用于小池子，故本法并不能真正解决富营养化的藻华问题。 b 化学控制法【1 9 ，2 3 t 2 4 i 化学控制法是一种最有效但却是最不安全的方法。这个方法是使用化学药品作为除藻 剂或者使用混凝沉淀的方法将水中藻类除掉。目前有很多人用此法米控制过度生长的藻类， 虽然它的安全性堪虑，但与机械控制法相比较为经济，故仍然受到欢迎。 使用化学控制法，需要根据除藻剂的品质与种类、所要控制藻类的种类、鱼的安全性、 施用的时间与技术，以及使用时的专业程度而定。 现有的除藻剂种类很多，在选择使用时，最好选择一些已经被证明可用于控制藻害， 以及正确使用对鱼虾也很安全的产品使用，不宜任意使用及滥用。除藻剂的使用剂量也会 直接影响其成效，剂量使用不足，除藻的效果不明显；若使用过量也可能对鱼虾造成伤害。 因此，在使用除藻剂时，必须适当地控制浓度，使它正好能达到灭藻又不伤害鱼类的最佳 范围内。 从毒物生物累积层面考虑，除藻剂的使用频率要越少越好，因为一般除藻剂对鱼或多 或少有直接的毒害，长期使用除藻剂对鱼虾的健康仍有不良影响，同时除藻剂是否会累积 于鱼体中还不太清楚，如果过度滥用，也可能间接对人体造成伤害。 目前常用除藻剂是硫酸铜除藻剂，硫酸铜( c u s o 。) 是一种有效且价格低廉的除藻剂， 也是传统上常用来消除池中过多藻类的化学处理藻剂。就抑制藻类生长繁殖而言，硫酸铜 不失为一种良好的化学药剂。其优点是除藻效率高、成本低廉，以及持续时间长；其缺点 是水中铜离子无法排出，易造成铜离子在水体中累积，甚至于累积于养殖生物体内。 硫酸铜的灭藻原理是借由铜离子的毒性去干扰藻类光合反应系统，使之无法正常行使 光合作用而逐渐达到灭藻的目的。故使用硫酸铜作为除藻剂时，应同时打动水车，供应足 够氧气，以免因藻类无法行光合作用放出氧气，又大量消耗氧气，使鱼虾有缺氧的危险。 因铜离子在呈碱性的水质中，易形成氢氧化铜沉淀，而逐渐丧失其药效，所以同一剂量的 硫酸铜，在酸性水域中使用比在碱性水域中使用要来得有效，或要达到相同的效率，则碱 性水质的用量应大于酸性水质的用量。 硫酸铜不适合用于海水养殖作为除藻剂，因为海水的p h 较高，铜离子在水中停留的 时间较短，很容易产生氢氧化铜沉淀。此时不妨考虑改用螯合铜，如e d t a 铜，它是一 5 。 北京建筑工程学院硕士学位论文 种淡蓝色的粉末，对鱼的毒性远较硫酸铜低，而且在海水中可以保持一段时间内不沉淀， 以及不会冈为高硬度的水影响而减低其效果。故使用一次后，至少可维持两星期。但e d t a 铜的除藻效率比硫酸铜差得多，必须提高e d t a 铜的剂量才能达到火藻目的，可是这样 又会增加铜在水体中的累积量。 c 生物控制法刈 生物控制法是一种最自然但也最不容易采用的方法。这个方法基本上是利用生物竞争 生存资源的原理，间接抑制藻类的过度生长，或利 j 食物链的原理直接消耗藻类的生长， 例如滤食性鱼类( 鲢鱼、鳙鱼) 浮游动物、挺水或浮游植物、细菌等。 国内外有许多研究是利用生物控藻技术解决富营养化湖泊的水华问题。目前主要有三 个方面，是以鱼类控制藻类的生长【2 6 2 7j 。可以混养一些食藻性的鱼贝类，直接以藻类为食， 以控制藻类浓度而达到改善养殖环境的目的。有一些滤食性的贝类可以直接摄取单细胞藻 类，也有一些食藻性鱼类对丝状藻特别偏爱。故可以考虑在水中放养一些食藻性生物，有 助于藻类的控制；二是以水生高等植物控制水体富营养盐及藻类【2 引。藻害的形成通常与水 质恶化有密切关系，其中又以硝酸盐和磷酸盐的含量过高为主要因素。如果能引入或繁殖 其他伤害性较少或较有用的水生植物于水体中，并与藻类竞争硝酸盐及磷酸盐，应该可以 有效降低两营养盐的浓度，使藻类繁衍速度受到适当的控制；三是用微生物来控制藻类的 生长。其中由于微生物具有易于繁殖的特点，使得微生物控藻成为生物控藻技术中最有前途 的一种控藻方式。这些杀藻微生物主要包括细菌( 溶藻细菌) 、病毒( 噬藻体) 、原生动物、 真菌和放线菌等五类。国内外对杀藻微生物的分离和鉴定有一些报道【2 9 ，3 0 j ，但都不够系统 和全面。 生物控制法最困难的地方在于选择何种生物进行藻类控制。具体地说，就是水体环境 中种植的水生植物的选择，食藻的鱼贝的种类筛选以及它们能否在相同的放养环境中正常 生长等问题，这些都是生物控制法的难剧憎】。 d 综合治理法l j l “1 综合治理法就是将控制外源性营养盐输入与消除内源性营养盐影响的治理相结合。 外源性营养盐输入就是指以点源、面源的形式通过河渠、径流等水文过程向湖体排放 工业、生活和农业废水。内源性营养盐影响是指人们通过湖泊围垦、湖岸村砌、水产养殖 等破坏自然生态环境，减少营养盐输出途径，动力作用导致底泥悬浮，影响了底泥中营养 盐的释放。 国际上对于湖泊富营养化治理的经验表明，即使流域上的外源污染排放降到历史最低 点，湖泊富营养化问题依然存在，其原因与湖泊底泥所造成的内源污染有关。动力作用导 致底泥悬浮，影响了底泥中营养盐的释放，也影响水下光照和初级生产力。 控制湖泊富营养化，既要控制外源性营养物质的输入，又要通过底泥疏浚、底泥氧化、 覆盖底泥层等技术方法达到治理内源污染的目的。只有采取这种“内外兼治”的措施， 才是防治水华的最有效、最根本的方法。 物理控制法、化学控制法、生物控制法这几种方法，各有各的优点，但都有不足的地 方。作为庞大的富营养化湖泊，单纯的利用其中任一种方法来控制藻类的生长从而改善水 质，是有很大的难度的。只有综合治理，权衡利弊，从长远着手，才能彻底解决水体的富 营养化问题。 1 3 研究意义 本文考虑采用化学法和生物法相结合，应用植物的化感作用产物一植物多酚控制藻类 生长，选择茶多酚为试验药剂，试验其对水体中藻类生长的抑制作用，并对其抑制机理做 6 北京建筑工程学院硕士学位论文 初步的探讨。 研究意义在于使得富营养化水体中的藻类得到有效控制，从而为植物多酚应用于生物 浮岛提供参考，利用生物浮岛的缓释作用，对水体实行连续性低剂量给药，从而降低水华 发生风险。 7 北京建筑工程学院硕士学位论文 2 研究内容和方法 2 1 研究内容 根据课题研究目的，确定本论文的主要研究内容为： 1 ) 茶多酚对藻类的抑制作用指标和方法的选择以及可行性验证； 2 ) 确定茶多酚抑藻效果是否具有广谱性抑藻效果； 3 ) 确定茶多酚抑制藻类生长的最低浓度； 4 ) 确定茶多酚抑制藻类生长的最佳浓度范围； 5 ) 研究不同温度对茶多酚抑制藻类生长的影响； 6 ) 研究不同光照强度对茶多酚抑制藻类生长的影响： 7 ) 研究不同p h 对茶多酚抑制藻类生长的影响； 8 ) 研究三价铁离子对茶多酚抑制藻类生长的影响； 9 ) 研究不同投加频次对茶多酚抑制藻类生长的影响； 1 0 ) 研究不同藻浓度对茶多酚抑制藻类生长的影响； 1 1 ) 对茶多酚的抑藻效应机理进行初步分析探索； 1 2 ) 对茶多酚的使用安全性和效益进行分析。 2 2 技术路线 茶多酚对藻类的生长抑制效应主要从下这两方面进行研究探讨。 1 ) 对藻类的生长抑制作用 茶多酚对藻类的抑制作用从藻类评价指标和试验方法的确立、可行性验证入手，确定 茶多酚的抑藻效应是否具有广谱性；然后通过试验分析，确定最佳茶多酚抑藻浓度以及这 种抑藻效应的影响因子，从而找出最佳抑藻条件以及需要控制的环境因子。 2 ) 抑藻机理的初探 茶多酚的抑藻机理主要从相关文献查阅和试验两方面入手。查阅相关文献进而了解茶 多酚的化学组成、物理及化学性质；然后根据其性质，探讨茶多酚对藻类生长抑制的影响 机理，并从藻细胞形态和膜通透性等方面着手试验，并进行机理的初步探索分析。 一8 北京建筑工程学院硕士学位论文 茶多酚 指标与方法的确立 性质 占 对绿藻对蓝藻对硅藻对自然 r 作用作用作用水样作用 茶多酚 l 可能对 l 藻类的 l善 影响 最佳抑藻的茶多酚浓度抑藻效应的影响因子 l ll l 茶多酚抑藻机理初探 茶多酚对藻类的抑制 i 1 l 茶多酚对藻类生长抑制效应研究 l 2 3 研究方法 图2 - 1茶多酚对藻类生长抑制效应研究技术路线 1 ) 植物多酚的选择 目前的植物多酚主要有葡萄多酚、茶多酚和苹果多酚。现在国内外研究使用的葡萄多 酚颜色较深，呈棕红色：苹果多酚颜色较浅，呈淡黄褐色，但二者的成本较高；茶多酚颜 色介于苹果多酚和葡萄多酚之间，成本相对较低。故在本论文中，考虑采用茶多酚作为试 验使用。茶多酚( t p 9 8 2 ) ，由安徽省歙县茶叶生物碱厂生产，其多酚含量为9 8 ，淡黄 色粉末，较易溶于水。 2 ) 标准生物品的选种 斜生栅藻种( s c e n e d e s m u so b t i q u u sk t l t z ，中国科学院水生生物所) ，用s e 培养基培养。 铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ，中国科学院水生生物所) ，用b g l l 培养基培养。 菱形藻( n i t z s c h i ah a n t z s c h i a n a ，中国科学院水生生物所) ，用d l 培养基培养。 3 ) 实验仪器与设备 高压灭菌锅、电子分析天平、微孔滤膜、生物显微镜、电子显微镜( z e i s s ，a x i o s k o p4 0 ) 、 超净工作台、生化培养箱、抽滤机、紫外可见分光光度计( s h i m a d z uu vm i n i12 4 0 ) 、 p h 计及p h 精密试纸、p h o t o - p a m 叶绿素荧光仪( 德国w a l z ) 、电导仪、d e l t a t o x 毒 9 一 北京建筑工程学院硕士学位论文 性检测系统、试管、烧杯、锥形瓶、封口膜、称量纸、滤纸、滴管、浮游植物计数框等。 4 ) 藻的培养 将藻种液置于生化培养箱中静置培养，温度2 0 + l ，光暗比1 2 h ：1 2 h ，每日摇动瓶子 3 到5 次，每隔1 0 到1 5 天，取一定量藻培养液转接到灭菌的新瓶中，倒入灭菌的新鲜培 养基，进行藻的接种培养。培养若干天后，再将藻种转接到新培养基中，按同样的培养条 件培养。所有转接均应在无菌条件下进行。 1 0 北京建筑- 1 二程学院硕士学位论文 3 茶多酚对藻类的抑制 3 1 试验方法与评价指标 3 1 1 藻类生长评价指标 目前，藻类生长及藻类化感作月j 的评价指标主要有藻类生长综合评价、藻类抑制程度 表观评价、藻的生长状态评价、藻类生长潜力评价等【3 3 4 6 1 。 1 ) 藻类生长综合评价 主要用藻类的生长曲线变化做出评价。藻类的生长曲线是藻类对某些胁迫因子做出的 综合性回应。所以利用生长曲线的变化能较好地反应影响发生的阶段和综合胁迫程度。但 藻类的生长周期一般较长，所以生长曲线的测定周期一般也需要花费较长时间。 2 ) 藻类抑制程度表观评价 主要用藻类生长抑制率做出评价。藻类生长抑制率指某一时刻实验组生物量相对于对 照组生物量的减少率。该评价法能较直观地反应某种环境胁迫对藻类生物的影响程度。 3 ) 藻的生长状态评价 主要用藻类光合活性( 光合效率) 做出评价。在光照下光合作用进行时，只有部分电 子门处于开放态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的 能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为f m 。根据f m 和f