（生物化学与分子生物学专业论文）针对hiv1vpr基因的rna干扰作用研究.pdf

f i i y l i j l l l l l j i f f l l 7 1 f i i j l 8 j i l 8 f i i l 5ljfl5ijillrlllllll j 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 日期： 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) o 签名： 导师签名：曲里兰盎日期： 摘要 曼| i _ 一i i i 一 一 i i i 曼皇曼曼! 曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼鼍曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼 摘要 病毒蛋白r ( v i r a lp r o t e i nr ，v p r ) 是h 编码的四个辅助蛋白之一，也 是h i v 非结构蛋白中唯一一个被包装入病毒粒子的蛋白分子，在h i v 的致病机 理中发挥重要作用，是一个多重功能蛋白。v p r 可促进h i v - il t r 的转录；促 进整合前复合体的入核运输；诱导g 2 期阻滞和促进细胞凋亡等。由于v p r 在 h i v - 1 的生命周期中发挥重要作用，使其成为抗h i v 治疗的新靶点。 本课题选择h i v - l v p r 基因作为靶点，采用r n a j 技术干扰其表达。实验中 构建了两个v p r 与荧光蛋白的融合表达载体p e g f p v p r 和p v p r - d s r e d ，以及 1 3 个针对v p r 基因不同位点的s h r n a 表达载体和4 个m i r n a 表达载体。采用 荧光显微镜技术和流式检测技术初步筛选到s h r n a 4 和m i r 2 对g f p v p r 或 v p r - d s r e d 融合蛋白的表达有明显的抑制作用，s h r n a l 4 、s h r n a 7 、和s h r n a 5 次之，而s h r n a l l 、s h r n a 9 、s h r n a l 3 、s h r n a l 0 、m i r 4 、m i r 3 无明显的抑 制作用。在r n a 水平采用r e a l t i m ep c r 技术对v p rm r n a 进行相对定量结果 显示，s h r n a 4 和m i r 2 处理组的2 以q 值仅为0 0 0 9 4 和0 2 0 8 8 ，对v p rm r n a 有明显的降解作用。对s h r n a 进行量效反应关系研究时发现随着s h r n a 4 剂量 的增加，其对靶基因的抑制作用亦增强。在病毒水平上采用假病毒体系的研究 发现s h r n a 4 和m i r 2 可以影响假病毒的包装和复制能力。此外，在相同的实 验条件下针对v p r 基因中同一靶序列时，与采用i i i 型启动子表达s h r n a 的干扰 效果相比，采用l l 型启动子表达m i r n a 对靶基因的抑制作用较强。 关键词病毒蛋白r ；短发夹r n a ；微小r n a ；r n a 干扰 北京x q k 人学理学硕十学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t v p r , o n eo ft h ef o u ra c c e s s o r yg e n ep r o d u c t so fh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s t y p ei ( h i v - 1 ) ，i st h eo n l yn o n s t r u c t u r a lp r o t e i nb e i n gp a c k a g e di n t on a s c e n tv i r i o n s a sam u l t i f u n c t i o n a lp r o t e i n ，v p rp l a y si m p o r t a n tr o l e si nh i v p a t h o g e n e s i s ，s u c h a sb e i n gi n v o l v e di nl o n gt e r m i n a lr e p e a t ( l t r ) a c t i v a t i o n ，m e d i a t i n gt h ea c t i v e n u c l e a ri m p o r to fp r e i n t e g r a t i o nc o m p l e x e s ( p i c ) ，i n d u c i n ga r r e s to ft h ec e l lc y c l ea t t h eg 2p h a s e ，a n dp r o m o t i n ga p o p t o s i s b e c a u s s eo ft h es i g n i f i c a n tr o l ev p r p l a y si n h i v - 1l i f ec y c l e ，v p rb e c o m e st h en o v e lt a r g e ti na n t i h i vr e s e a c h i nt h i ss t u d y , r n a it e c h n o l o g yw a sa p p l i e dt oi n t e r f e r et h ee x p r e s s i o no fh i v - 1 v p rg e n e t w of u s i o np r o t e i ne x p r e s s i o nv e c t o r sw i t hf l u o r e s c e n tr e p o r t e rg e n e ，1 3 s h r n a e x p r e s s i o nv e c t o r sa n d4 m i r n a e x p r e s s i o nv e c t o r st a r g e t i n gt od i s t i n c ts i t e s o fv p rg e n es e q u e n c ew e r ec o n s t r u c t e d i n v e r t e df l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ea n df l o w c y t o m e t r yw e r eu s e dt o s c r e e nt h eg e n es i l e n c i n ge f f e c t s i ts h o w e dt h a ts h r n a 4 a n dm i r 2h a dm a n i f e s t e ds i g n i f i c a n ti n h i b i t i v ee f f e c to nt h ee x p r e s s i o no fg f p v p r a n dv p r - d s r e df u s i o np r o t e i n s h r n a14 ，s h r n a 7a n ds h r n a 5a l s oh a di n h i b i t i v e e f f e c tb u tn o ta sv i g o r o u s l ya ss h r n a 4a n dm i r 2 h o w e v e r , s l l i a 1 l ，s h r n a 9 ， s h r n a13 ，s h r n a1o ，m i r 4a n dm i r 3d i dn o te x h i b i ti n h i b i t i v ee f f e c t r e a l - t i m e p c rh a sb e e na p p l i e dt or e l a t i v e l yq u a n t i f yt h en u m b e ro fv p rm r n ac o p i e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e2 qv a l u eo fs h r n a 4a n dm i r 2i so n l y0 0 0 9 4a n d0 2 0 8 8 r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n gs i g n i f i c a n td e g r a d a t i o no fv p rm r n a t h e r ee x i s t e da d o s e - r e s p o n s i v ee f f e c tf o rs h r n a 4 ，a st h eg e n es i l e n c i n ge f f e c ti n c r e a s e dw i t ht h e h i g h e rd o s eo fs h r n a 4 s t u d i e su s i n gp s e u d o v i r u ss y s t e mr e v e a l e dt h a ts h r n a 4 a n dm i r 2c o u l di n f l u e n c e t h ev i r a l p a c k a g i n g a n dr e p l i c a t i o n i n a d d i t i o n ， e x p r e s s i o no fm i r n au s i n gt y p ei ip r o m o t e rs h o w e dm o r es i g n i f i c a n t l yi n h i b i t i v e e f f e c t st h a ne x p r e s s i o no fs h r n au s i n gt y p ei l lp r o m o t e r , a l t h o u g ht h e i rt a r g e tw a s s a m ea n dc o n d u c t e du n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s k e y w o r d s v i r a l p r o t e i nr ( v p 0 ；s h o r t h a i r i nr n a ( s h r n a ) ；m i c r o r n a ( m i r n a ) ；r n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) i v 缩写词 a i d s h i v m t v p r p i c r n a i d s r n a s i r n a r i s c m i r n a s s h r n a k d l b m r n a o d p a g e p b s p c r r p m 英文缩乍j 词 英文缩写词 英文 中文 a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e获得性免疫缺陷综合症 h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s人类免疫缺陷病毒 l o n gt e r m i n a lr e p e a t 长末端重复序列 诉r a lp r o t e i nr p r e i n t e g r a t i o nc o m p l e x d o u b l e s t r a n dr n a s m a l li n t e r f e r i n gr n a s 病毒蛋白r 整合前复合体 r n a 干扰 双链r n a 小干扰r n a r n a - i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e xr n a 诱导的沉默复合体 m i c r o r n a s s h o r th a i r p i nr n a l 【i l od a l t o n s l u r i a - b e r t a n i m e s s e n g e rr n a o p t i c a ld e n s i t y 微小r n a 短发夹r n a 千道尔顿 溶菌肉汤 信使r n a 光密度 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r o u n dp e rm i n u t e 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 转数每分钟 d u l b e c c o 氏改良e a g l e 培 d m e m d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m 一 养基 v v i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 英文缩写词v 目录v i i 第1 章绪论一1 1 1h 概况1 1 1 1h i v 病毒1 1 1 2 抗h i v 治疗2 1 2h i v - 1v f r 2 1 2 1v p r 结构。2 1 2 2v p r 功能3 1 3r n a 干扰4 1 3 1s i r n a 5 1 3 2m i c r o r n a 5 1 3 3r n a i 治疗a i d s 的研究现状6 1 3 4r n a i 治疗中存在的问题7 1 4 研究目的及内容7 1 5 研究技术路线8 第2 章h i v - 1v p r 表达质粒及以纡碾基因为靶点的小干扰r n a 表达质粒的构 i 塞9 2 1 实验材料9 2 1 1 菌株与质粒一9 2 1 2 工具酶与试剂9 2 1 3 序列合成与测序9 2 1 4 主要仪器9 2 1 5 其它需配制的溶液1 0 2 2 实验方法1 1 2 2 1h i v - 1 甲r 基因真核表达质粒p e g f p - v p r 和p v p r - d s r e d 的构建1 1 2 2 2 以印，基因为靶点的小干扰r n a 表达质粒p s u p e r b a s i c - s h r n a 和 p s u p e r r e t r o s h r n a 的构建1 5 2 3 实验结果16 2 3 1h i v - 1 甲r 基因真核表达质粒p e g f p v p r 和p v p r - d s r e d 的构建1 6 2 3 2 以v p r 基因为靶点的小干扰r n a 表达质粒p s u p e r b a s i c s h r n a 和 p s u p e r r e t r o s h r n a 的构建1 8 2 4 讨论2 0 v l i 北京t 业人学理学硕十学位论文 2 5 本章小结2 l 第3 章靶点特异性的s i r n a 对h i v - i 陀r 基因表达的抑制作用2 3 3 1 实验材料2 3 3 1 1 细胞株2 3 3 1 2 细胞培养的相关材料2 3 3 1 3 质粒、工具酶与试剂2 3 3 1 4 主要仪器2 3 3 1 5 其它配制溶液2 4 3 2 实验方法2 4 3 2 1 细胞培养2 4 3 2 2 转染与共转染2 5 3 2 3 流式细胞仪检测g f p 表达情况2 5 3 2 4r e a l t i m ep c r 2 5 3 2 5 假病毒包装能力和感染力测定2 5 3 3 实验结果3 0 3 3 1 荧光显微镜检测g f p v p r 或v p r - d s r e d 融合蛋白的表达3 0 3 3 2 流式细胞仪检测表达g f p v p r 融合蛋白的阳性细胞3 2 3 3 3r e a l t i m ep c r 技术对v p rm r n a 拷贝数进行相对定量3 3 3 3 4s h r n a 对h i v o l 假病毒包装能力及复制能力的影响3 5 3 3 5s h r n a 4 对靶基因v p r 抑制作用的量效关系研究3 8 3 4 讨论4 0 3 4 1 荧光显微技术和流式细胞术快速筛选有效的s h r n a 4 0 3 4 2 有效的s h r n a 可以降低靶基因m r n a 的拷贝数一4 1 3 5 本章小结4 3 第4 章靶点特异性的m i c r o r n a 对h i v o lv p r 基因表达的抑制作用4 5 4 1 实验材料4 5 4 1 1 细胞株( 略，同3 1 1 ) 4 5 4 1 2 细胞培养的相关材料( 略，同3 1 2 ) 4 5 4 1 3 质粒、工具酶与试剂4 5 4 1 4 主要仪器( 略，同3 1 4 ) 4 5 4 2 实验方法4 5 4 2 1m i c r o r n a 表达质粒p c d n a 6 2 g w e m g f p m i r 的改造4 5 4 2 2 筛选可以有效抑制靶基因v p r 表达的m i e r o r n a 4 6 4 2 3 构建基于m i r n a 序列的p s u p e r b a s i c s h r n a m 2 表达载体4 6 4 3 实验结果4 6 4 3 1m i c r o r n a 表达质粒p c d n a 6 2 g w e m g f p m i r 的改造4 6 4 3 2 构建基于m i r n a 序列的p s u p e r b a s i c s h r n a m 2 表达载体4 7 4 3 3 筛选可以有效抑制靶基因v p r 表达的m i c r o r n a 4 8 4 3 4m i c r o r n a 对h i v - 1 假病毒包装能力及复制能力的影响5 0 4 3 5 针对v p r 基因相同靶位点的两种表达载体的干扰作用比较5 1 4 4 讨论5 3 4 5 本章小结5 5 v i i i 目录 结论5 7 展望5 9 参考文献6 l 附录6 5 攻读硕士学位期间发表的学术论文6 7 致谢6 9 x 第1 章绪论 曼i ii 曼曼曼曼鼍曼鼍曼曼皇曼曼曼曼曼蔓曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼! 皂曼曼兰曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼鼍曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼皇曼 1 1h i v 概况 第1 章绪论 艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症( a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e ， a i d s ) 是由人类免疫缺陷病毒( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h i v ) 引起的 传染性疾病。自1 9 8 1 年美国研究人员发现世界首例艾滋病病例后，艾滋病在全 球范围内迅速蔓延，逐渐成为全球关注的重要公共卫生事件和社会热点问题。 据联合国艾滋病规划署统计，目前全球共有3 3 2 0 万名艾滋病病毒感染者。我国 截至2 0 0 9 年1 0 月3 1 日，累计报告艾滋病病例3 1 9 8 7 7 例。据卫生部等单位对 中国艾滋病疫情的估计，中国现存艾滋病病毒感染者和病人约7 0 万。 1 1 1h i v 病毒 导致艾滋病的h i v 病毒，属反转录病毒科、慢病毒属的灵长类免疫缺陷病 毒亚属【l 】。病毒直径约1 2 0 n m ，大致呈球形，其内含有核心蛋白包裹的r n a 分 子和酶( 如逆转录酶、整合酶和蛋白酶) ；病毒外层囊膜为磷脂双分子层，来自 宿主细胞，并镶嵌病毒蛋白g p l 2 0 与g p 4 1 ，分别组成刺突和跨膜蛋白。g p l 2 0 位于病毒表面，与g p 4 1 非共价结合。囊膜内面为p 1 7 蛋白构成的衣壳。 h i v 感染性强，基因结构变异迅速，主要侵染c d 4 + t 淋巴细胞和单核巨噬 细胞，导致免疫功能下降乃至崩溃。h i v 基因组全长约9 7 k b ，在它的两端是 长末端重复序列( l o n gt e r m i n a lr e p e a t ，l t r ) 。h i v 的编码基因处于前病毒 d n a 中部，包括g a g 、p o l 、e n v 三个主要结构基因，t a t 、r e v 两个调节基因，懈 n e f v p r 、v p u 四个编码辅助蛋白的基因( 见图1 1 ) 。h i v 生活周期同一般的反 转录病毒类似，都经历了附着进入、脱壳、逆转录及d n a 合成、转移至胞核、 整合、转录、翻译及修饰、装配、释放、成熟等一系列过程【2 】。 i g a g l t r p o l v p rr e v r e v 缓纛糊 黝缓i 麓 v i ft a t v p u t a t 戮籀搦嬲戮糊 e n v 图1 - 1h w 基因结构 f i g 1 1d i a g r a mo fh i vg e n es t r u c t u r e 母 北京t 业大学理学硕十学位论文 1 1 2 抗h w 治疗 目前，艾滋病依然是人类无法攻破的绝症。h i v 病毒突变率极高，更新药 物、寻找新的药物靶点成为迫在眉睫的要求。 针对h i v 生活周期不同阶段的不同靶点，已有3 2 种抗逆转录病毒药物用 于治疗h i v 感染，包括h i v 吸附进入抑制剂、融合抑制剂、整合酶抑制剂、反 转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂【2 】。 寻找h i v 治疗新靶点的研究也在大量展开，这些新的靶点既包括与病毒复 制相关的宿主细胞因子，也包括病毒自身的调节蛋白和辅助蛋白，比如：细胞 内在抗h 因子a p o b e c 3 g 1 3 】；h i v 整合酶共作用因子l e d g f p 7 5 4 】；抑制 h i v - 1 感染的细胞因子恒河猴t r i m 5 a ( r h t r i m 5 a ) t 5 1 ；h w - 1 编码的小跨膜蛋白 v p u 6 等。 现在的抗h i v 治疗方法存在着安全性和有效性问题，如药物毒副作用、药 物间相互作用和抗药性等。所以，探索抗h i v 治疗的新方法基因治疗，已成 为当前抗h i v 研究的热点。随着人类基因工程研究的深入，部分临床实验室工 作者和基础科学研究人员开始注意到核酶( r i b o z y m e ) 在基因治疗中的应用潜 力。已有研究者针对不同的h i v 靶点，设计相应的核酶，对靶基因的表达起到 了较好的抑制作用r 7 8 】，现已有核酶类基因治疗药物进入艾滋病治疗的临床试验 阶段。此外，用于基因治疗的另一有效工具一i 斟a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ， r n a i ) ，也成为抗h i v 研究的热点。h i v 病毒蛋白r ( v i r a lp r o t e i nr ，v p r ) 在 病毒复制中起到了重要作用，是抗h i v 治疗的新靶点，所以，本课题中，我们 旨在采用r n a i 沉默v p r 基因的表达，达到抑制病毒复制的目的。 1 2h i v - 1v p r v p r 蛋白是h i v 编码的四个辅助蛋白之一，它在h i v - 1 复制周期中发挥了 重要作用，是一个多重功能蛋白，也是h i v 非结构蛋白中唯一一个被包装入病 毒粒子的蛋白分子。 1 2 1v p r 结构 v p r 基因由2 9 i n t 组成，不含内含子，与v f 7 r 基因有6 i n t 的重叠序列。v p r 蛋白由9 6 个氨基酸组成，包括三个0 【螺旋和与其紧邻的柔韧n ，c 末端，图1 2 显示了v p r 的n m r 结构p ，l 们。与蛋白酶、逆转录酶、e n v 、g a g 蛋白类似，v p r 也包含多重c t l 抗原决定簇】。h i v - 1 的v p r 序列是高度保守的。在h i v - 2 、 s i v m a c 、s i v s m 中，与h i v - 1v p r 相关的功能分离为两个基因：v p r 和v p x 。其 中任一基因缺失对病毒复制没有影响，但两者均缺失时，则严重影响病毒的致 2 第1 章绪论 病力【1 2 】。 图l _ 2 基于n m r 的v p r 结构不意图 f i g 1 - 2t h es t r u c t u r eo f v p rb a s e do nn m r 1 2 2v p r 功能 v p r 蛋白对h i v 病毒和被感染的细胞均产生多重生物学功能，如参与病毒 的复制和整合，影响被感染细胞的转录、繁殖、分化和凋亡。 ，： ( 1 ) v p r 促进h i v - 1l t r 的转录 v p r 作为接头分子连接转录复合物和共作用因子，以此增强h i v - 1l t r 和 其它几种启动子的转录。h o t t i g e r 等报道转录共作用因子p 3 0 0 可以介导v p r 对 h i v - 1l t r 的转录激活效应【13 1 ，使h i v - 1l t r 起始的转录增强6 8 倍【1 4 】。此外， v p r 通过调节细胞周期，使细胞滞留在g 2 期，为病毒的大量复制提供有利的细 胞内微环境【1 5 】。 ( 2 ) v p r 能够促进整合前复合物的入核运输 h i v - 1 逆转录过程产生的双链d n a 与病毒及宿主的相关蛋白质结合形成整 合前复合体( p r e i n t e g r a t i o nc o m p l e x ，p i c ) 。p i c 必须通过由布满核孔复合物 ( n u c l e a rp o r ec o m p l e x ，n p c ) 的双层核被膜才能进入细胞核。v p r 存在于p i c 中，作为核质转运因子直接将p i c 结合到细胞核核孑l 上，促进p i c 向非分裂细 胞的核内运输，从而为h i v - 1c d n a 整合到细胞基因组奠定基础【1 6 】。 ( 3 ) v p r 影响细胞周期进程 细胞的分裂周期需要大量的辅助蛋白参与，v p r 可将感染的增殖t 细胞停滞 在细胞分裂的g 2 期，) 白h i v - 1 的基因表达创造有利的细胞内微环境f 1 8 ，19 1 。v p r 通 过激活由a t r c h k l( a t a x i a t e l a n g i e c t a s i aa n dr a d 3 r e l a t e d c h e c k p o i n tk i n a s e1 ) 蛋白介导的检查点通路，干扰细胞周期调节因子与m e k 2 一e r k ( m i t o g e n 3 北京t 业大学理学硕十学何论文 e x t r a c e l l u l a rl 【i n a s e2 一e x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s e ) 通路，从而导致g 2 期停 滞【2 0 1 。v p r 也可直接结合细胞染色质，造成细胞d n a 损伤，间接激活a t r 通路。 在g 2 m 检验点，以依赖于a t r 的途径激活c h k l 激酶，使c d c 2 5 a 和c d c 2 5 c 降解， 从而阻止了细胞周期素依赖蛋白激酶l 一细胞周期素蛋白b 复合物的去磷酸化和激 活，最后致使细胞g 2 期阻滞【2 l 】。 ( 4 ) v p r 能够诱导细胞凋亡 h i v 可导致a i d s 患者中c d 4 + t 细胞衰竭，最终破坏免疫系统。导致c d 4 + t 细胞衰竭的主要原因是细胞凋亡。v p r 通过与d n a 结合蛋白1 ( d n ab i n d i n g p r o t e i nl ，d d b l ) 结合，干扰d n a 修复，激活a t r 通路，导致g 2 期阻滞和 细胞凋亡 2 2 】。v p r 诱导的凋亡细胞中，细胞周期调节激酶w b e 1 的活性也降低， 提示g 2 期停滞与v p r 诱导的细胞凋亡有关。但反过来v p r 诱导细胞凋亡作用并 不依赖于细胞g 2 期停滞【2 0 】。 v p r 可以使线粒体膜去极化，释放细胞色素c ，通过c a s p a s e 介导的内部途 径致使细胞凋亡，此外v p r 还通过与腺苷酸转运子( a d e n i n en u c l e o t i d e t r a n s l o c a t o r ，a n t ) 相互作用促进凋亡过程 2 3 , 2 4 。 ( 5 ) v p r 影响细胞内基因的转录和p r e m r n a 的剪接 h i v - 1 感染细胞内表达v p r ，可以影响细胞内一些基因的转录，比如s r 蛋 白和核内异质性核糖核蛋f 兰t ( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n s ，h n r n p ) 而这些蛋白分子是调控细胞内p r e m r n a 剪接所必需的，此外，v p r 通过干扰 s a p l 4 5 s a p 4 9 复合体的形成，阻止剪接体的组装，从而抑制细胞内p r e m r n a 的剪接【1 3 , 2 5 】。 此外，由于v p r 具有诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡的作用，v p r 已被 应用到抗癌治疗当中。k a r r u p i a h 研究显示f 2 6 1 ，将v p r 转染到多种肿瘤细胞系， 可以有效抑制肿瘤细胞的分裂增殖。 1 3r n a 干扰 r n a i ，又称为依赖于r n a 的基因沉默机制，指通过双链r n a ( d o u b l e s t r a n d r n a ，d s r n a ) 特异性地抑制与其序列同源的靶基因m r n a 表达的现象。即在 胞质中，双链r n a 引发了同源m r n a 的降解，故也被称为转录后基因沉默现 象( p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e n e s i l e n c i n g ，p t g s ) 。r n a i 现象广泛存在于真核生物 中，是生物界古老又保守的细胞反应通路。由于它在基因研究、临床治疗中所 具备的优势和潜力，使其被发现的不到十年时间里，成为科学研究的宠儿。2 0 0 2 和2 0 0 3 年连续两年被s c i e n c e 杂志评为十大科学突破之一。从r n a i 作用机制、 r n a i 技术在基因功能研究领域的应用，乃至临床应用等众多领域都有大量突 破性成果涌现，r n a i 已成为基因功能研究和基因治疗研究等领域的最热门技 4 第1 章绪论 术之一。 1 3 1s i r n a 小干扰r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a s ，s i r n a ) 是r n a i 作用赖以发生的重 要中间效应分子。它是长约1 9 2 3 n t 的双链r n a 小分子，与靶m r n a 序列具有 同源性。较长的d s r n a 在a t p 参与下被r n a s e i i i 样的特异核酸酶d i c e r 切割， 加工成1 9 2 3 n t 的由正义和反义链组成的s i r n a ；s i r n a 在a t p 参与下进一步 被r n a 解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成有活性的r n a 诱导的沉 默复合体( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) 。活化的r i s c 通过碱基配 对识别互补的靶m r n a 。s i r n a 反义链在r i s c 中换位，并在距s i r n a 的37 末 端1 2 n t 处切割靶m r n a ，导致m r n a 的降解，从而干扰基因表达【2 7 ，2 8 1 ，其作 用机制示意图见图1 3 。 r t t a le x p r e s s i o n v o c i o f c h e m i c a l 妁，n m 熔，胁v b ob a n s c r i p t j o n ， 、 班哑班哑班四班敷胡髓班圜卿 l o n gd s l 曲i a s i r n a 1 3 2m i c r o r n a 图i - 3r n a 干扰机制2 8 】 f i g 1 3t h em e c h i n i s mo fr n ai n t e r f e r e n c e 内源性表达的小调节r n a 也称微小r n a ( m i c r o r n a s ，m i r n a s ) ，也能 诱导r n a 干扰( 见图1 - 3 ) 。m i r n a 的转录初级产物( p r i - m i r n a ) 被r n a s e i i i 北京下、i p 大学理学硕十学何论文 d r o s h a 切割成前体m i r n a ( p r e - m i r n a ) ，出核后被核酸内切酶d i c e r 识别并切 割成2 2 n t 的成熟微小r n a ( m a t u r em i r n a ) 。m i r n a 随后与r i s c 结合，抑制 靶基因m r n a 的翻译。与s i r n a 相比，m i r n a 有两种干扰方式：一是通过与 靶m r n a 的非翻译区不完全配对，起翻译抑制作用；二是与靶m r n a 完全配 对并降解m r n a ，实现基因沉默作用【2 8 】。 1 3 3r n a i 治疗a i d s 的研究现状 s i r n a s 或m i r n a s 可以特异地结合靶m r n a ，引起靶m r n a 降解或翻译 抑制，最终导致基因特异性沉默。研究显示，h 复制所必需的g a g 基因与体 内高效复制必需的他， 基因都可通过r n a i 进行沉默。r n a i 技术很可能为抗 h w 治疗的研究打开突破口。现已有研究显示采用r n a i 技术，可以实现对h w 感染的阻止和对h i v 复制过程的抑制。 辅助受体( c c r 5 或c x c r 4 ) 是h i v 进入被感染细胞所必需的。研究发现， c c r 5 基因d e l t a 3 2 序列缺失可以减缓或抵抗h i v - 1 感染f 2 2 1 ，但机体未出现免疫 异常。因此抑制c c r 5 基因的表达、减少细胞膜表面上的c c r 5 数目是一种非 常理想的抗h i v - 1 感染的方法。另有研究显示将针对c c r 5 基因的s i r n a 转染 到外周血c d 4 + t 淋巴细胞中，可以明显抑制c c r 5 基因的表达，使c c r 5 阳性 细胞下降1 0 倍，并且被病毒感染的细胞数减少了6 倍【2 9 】，提示抑制c c r 5 基因 表达可以有效阻止病毒侵染宿主细胞。 n o v i n a 等用针对c d 4 的s i r n a 转染m a g i c c r 5 细胞，可以特异性抑制 c d 4 受体的表达，其抑制强度达7 5 ，从而阻断了h w - 1 病毒进入细胞【3 0 1 。 l e e 等在h i v - 1 病毒基因组的t e l , , 和t a t 基因中分别选取2 i n t 的序列为靶点，采 用r n a i 技术可以使h i v - 1 的p 2 4 抗原下降达9 0 ，而细胞的生长未受影响。 h i v - 1 在细胞内的生活周期可分为早期和晚期。早期包括病毒侵入细胞后， 以基因组r n a 为模板反转录合成c d n a ，进而合成双链d n a 整合到宿主细胞染色 体中；晚期则是合成子代基因组r n a 与蛋白质，病毒粒子装配和出芽分泌。s i r n a 对h i v 生活周期各阶段都可以有抑制作用 3 1 , 3 2 】。其中对早期阶段的抑制效果较显 著。但在实验中发现经过长时间的病毒传代培养，s i r n a 抑制病毒的效果将逐步 下降甚至丧失。提示h i v - 1 可能通过突变或其他机制逃逸s i r n a 或m i r n a 的干扰 作用。为长期保持抑制病毒的活性，就需要破坏或避开h i v - 1 的逃逸机制，这也 是r n a i 技术应用于抗h i v 感染面临的重要阻碍。 6 第1 章绪论 1 3 4r n a i 治疗中存在的问题 1 3 4 1s i r n a 稳定性差 体外合成的s i r n a 进入细胞后容易被r n a 酶降解，这种不稳定性直接降 低了基因抑制的效率。因此为了提高基因抑制效果，应该寻找更好的办法构建 能在细胞内稳定表达s i r n a 的载体3 3 1 ，利用转染技术将其导入细胞。研究表明， 腺病毒载体等具有感染细胞范围广、转染效率高、不受细胞周期影响等优点， 同时含有反义r n a 的重组腺病毒能更彻底地抑制细胞表面受体表达【3 4 , 3 5 。 1 3 4 2 靶序列识别障碍 m r n a 的一些识别位点具有二级结构或高度折叠，还有一些m r n a 与细胞 内蛋