（生物物理学专业论文）氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究.pdf

中文摘要 摘要 纳米材料具有许多特性，且产量曰益增加，人们担心纳米材料潜在的对环境 和人体健康的有害影响最终是否会超过它带来的效益，因此需要对纳米材料的环 境行为、生物效应进行研究和评价，并深入探讨其机理，以便能及早采取措施， 使其潜在的对环境和健康的影响最小化。作为获得上述数据的基础研究，本文针 对水生环境从以下几个方面进行了探索： ( 1 ) 本文根据生物毒理学基本理论，将粒径2 0 n m 氧化镍纳米颗粒对小球藻 的毒性定义为慢性3 级有害，且造成的是可恢复性损伤，低浓度氧化镍对小球藻 生长有促进作用。 ( 2 ) 通过i c p m s 检测，得到了不同时间小球藻对氧化镍纳米颗粒的吸收效 率；在发现氧化镍纳米颗粒与小球藻细胞作用后生成毒性更低的零价镍基础上， 通过x 光电子能谱仪( x p s ) 检测分析了不同作用时间的n i 0 2 p n i 2 + 2 p 比率，分 析发现4 8 h 前小球藻对氧化镍的修复主要是吸收作用，4 8 h - 7 2 h 发生的主要是转 化作用。小球藻对氧化镍有很好的吸收和转化能力，吸收和转化率可分别达到 8 4 7 3 和2 8 5 7 ，但处理后的海水中镍元素含量仍高于中国( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 污水综 合排放标准，需做进一步处理才能排放到环境中。小球藻对氧化镍的有效吸收和 转化作用揭示了生物修复环境中氧化镍纳米颗粒污染的潜力。 ( 3 ) 为了进一步探讨小球藻对氧化镍纳米颗粒的生物修复机制，依据毒性实 验和吸收转化实验结果，本文对比了7 2 h 前后受1 5 m g l 氧化镍处理的小球藻与对 照组小球藻蛋白质变化情况，发现了一些可能与转化相关的表达量上调和下调的 蛋白质。 关键词：氧化镍纳米颗粒；生物学效应；生物修复 英文摘要 a b s t r a c t t h en a n o p a r t m e s ( n p s ) d i s p l a yn o v e lp h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ， n e v e r t h e l e s s ，w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fn a n o t e c h n o l o g y , t h e r ei sah i g h e rr i s kf o r p e o p l ea n de n v i r o n m e n t p e o p l eb e g a n t ow o r r yt h a tt h er i s k so fn p si nt e r m so ft h e i r e n v i r o n m e n t a li m p a c tm a yo u t w e i g ht h e i rb e n e f i t s s oi t su r g e n tt os t u d ya n de s t i m a t e t h eb e h a v i o ra n db i o l o g ye f f e c t so fn p s ，a n dt oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s m s i nt h i s s t u d y , as e r i e so fe c o t o x i c o lo g i c a lt e s t so nn p sw e r ed e s i g n e da n dc o n d u c t e da sa n i n i t i a ls t e pt oa d d r e s st h ep o t e n t i a la q u a t i ce n v i r o n m e n t a li m p a c t so fn p s t h em a i n c o n t e m sa n dr e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t sw e r e ( 1 ) t h i sp a p e rb a s e d o nt h eb a s i ct h e o r yo ft h eb i o l o g i c a lt o x i c o l o g y e c o t o x i c o l o g i c a lt e s t so nn i o n p sw e r ed e s i g n e d t h et o x i c i t yi sd e f i n e da sc l l r o m c3 h a r m f u lb yt h ee c s 0v a l u e t h ed a m a g e sc a u s e db yn i o n p sa r er e c o v e r a b l e n i on p s i nl o wc o n c e n t r a t i o nc a np r o m o t et h eg r o w t ho fc h l o r e l l as p ( 2 ) t h ec o n c e n t r a t i o no fn ir e m a i n e di ns e a - w a t e r i st e s t e db yi c p m a s s o nt h e b a s i co fd i s c o r yo fn i oa f t e rn p se x p o s e dt oc h l o r e l l as p ，t h en i 0 2 p n i 2 + 2 pr a t i oi n d i f f e r e n tt i m ei sa n a l y s e db yx p s t h er e s u l t sa l ea sf o l l o w s ：t h em a i nr o l eo fc h l o r e l l a s p t on i on p s i sa b s o r p t i o nb e f o r e4 8 h w h i l eb e t w e e n4 8 - 7 2 hi st r a n s f o r m a t i o n t h e a b s o r p t i o na n dt r a n s f o r m a t i o nr a t eo f n i on p sb yc h l o r e l l as p i s8 4 7 3 a n d2 8 5 7 ，w h i c h s h o w st h a tc h l o r e l l as p c a nb eu s e dt od e a lw i t hw a s t e w a t e r t h ec o n c e n t r a t i o no fn ii s h i g h e rt h a nt h eq u a l i t ys t a n d a r do fw a s t e - w a t e r , s oi t sn e c e s s a r yt od e a lw i t ht h ew a s t e w a t e rb y m o r es t e p s ( 3 ) i no r d e rt os t u d yt h eb i o l o g i c a lr e p a i rm e c h a n i s m sf u r t h e r , t h ep a p e rc o m p a r e d t h e2 - dg e l so fp r o t e i no fc h l o r e l l as p t r e t e db y15 m g ln i on p sw i t ht h ec o n t r o l g r o u pa tt h et i m eo f 4 8 h 7 2 ha n d9 6 h s o m eu p - o rd o w n - r e g u l a t e dp r o t e i ns p o t sw e r ef o u n d , w h i c hm a yr e l a t et or e d u c t i o nr e a c t i o n k e yw o r d s ：n i on a n o p a r t i c l e s ；b i o l o g i c a le f f e c t s ；b i o r e m e d i a f i o n 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成博硕士学位论文竺氢丝鳇麴苤题蕉型型! 堡夔丝生物堂塾廑丛生塑修复受 究 。除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集 体已经公开发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：磁厂一一一，一、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全 文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发 行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密i ( 请在以上方框内打“ ) 论文作者签 名：7 日期：如l 年6 月拍日 氧化镍纳米颤粒对小球藻的生物学效应厦生物隆复研究 1 1 纳米科技简介 第1 童绪论 111 纳米材料的定义 纳米科技州a n o - s n 是2 0 世纪8 0 年代术期剐刚诞生并正在崛起的新科技，它 的基本涵义是在纳米尺寸( 1 0 - 9 1 0 4 m ) 范围内认珏 和改造自然，通过直接操作和安 排原子、分子，创制新物质。纳米技术被认为是下一次的工业革命 1 】，目前发展迅 速，已引起全球范围内的科学技术、工业和农业等发生革命性变革，将给人类社 会带来巨大的变化。纳米材料处在原子簇和宏观物体的过渡区域，从通常的关于 微观和宏观物体的过渡区域阻及从通常的微观和宏观的观点看，这样的系统既非 微观系统亦非宏观系统，而是一种典型的介观系统。毒理学家所称的纳米颗粒物 ( n a n o p a r t i c u l a t e s ，n p s ) 是指人工设计台成或环境中自然存在的直径小于1 0 0r i m 的物质总称。除人工合成的纳米材料外，环境中也存在着大量天然的和工业生产 所带来的纳米颗粒，如柴油车尾气、焊接尾气、工厂烟囱排出的废气以及垃圾 焚烧、沙尘暴等均古有大量的纳米颗粒，环境科学家称之为超细颗粒物( u l w a f i n e p m i c u l a t e s - u f p ) 。 f i g 1l n a n o m a t e f i 由s a n dc o n v e n t i o n 日d t l p a l t l l l e n t p r o c e s s e ss i z e r a n g e 第1 章绪论 1 1 2 纳米材料的应用现状和发展前景 纳米材料尺、j 很小，结构特殊，因此具有许多优良且奇异的物理化学特性， 这种特性又被称作“纳米效应 ，包括小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应 和介电限域效应等。 由于纳米材料具有上述独特的物理化学性质，在改善人类生活和促进社会发 展的各个方面都具有诱人的前景，纳米科技及纳米材料因此获得了飞速发展，势 必成为未来世界科技创新的主要推动力量之一。目前，已有3 0 多个国家和地区从 事纳米材料的研究丌发工作，纳米技术市场也已初具规模，纳米材料已被广泛应 用于化工、冶金、电子、宇航军事、环境保护、医学和生物工程等国民经济发展 的许多领域。在产业化发展方面，除了纳米粉体材料在美国、日本、中国等少数 几个国家初步实现规模生产外，纳米电子器件材料、纳米生物材料、纳米医疗诊 断材料等产品仍处于开发研制阶段。各种今后几年，随着各国对纳米技术应用研 究投入的不断加大，纳米新材料产业化进程将大大加快，市场规模将急剧增长， 预计到2 0 1 5 年此数值将超过1 万亿美元。统计已发表的有关纳米材料应用和安全 性的报道从1 9 9 5 年的3 0 0 0 余篇增长到2 0 0 8 年的5 2 0 0 0 余篇【3 】。 表1 1 纳米材料的估计生产量【3 】 t a b 1 1e s t i m a t e dg l o b a lp r o d u c t i o nf o re n g i n e e r e dn a n o m a t e r i a l s 氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究 1 2 纳米材料的环境与健康效应 1 2 1 纳米材料生物安全性产生的背景 正因为纳米材料具有奇异的理化性质以及未来大规模的生产和广泛的应用， 其潜在的负面效应已引起各界人士广泛关注。纳米材料可能的负面效应主要来自 两个方面【4 】：一是来自纳米材料独特的纳米效应。例如由于纳米材料粒径的减小， 表面积大幅度增加，表面原子( 或分子) 数的增多，提供了更多的反应位点，从 而导致纳米材料本身的反应活性远远大于与其相对应的大粒径物质的活性。纽约 罗切斯特大学( r o c h e s t e r u n i v e r s i t y ) 医学和牙科学院的毒物学家o b e r d 6 r s t e r 发现， 大多数在含有直径为2 0 n m 的“特氟龙 塑料( 聚四氟乙烯) 颗粒的空气中生活了 1 5 分钟的实验鼠会在随后4 小时内死亡；而暴露在含直径1 2 0 n m 颗粒( 相当于细 菌的大小) 空气中的对照组则并没有致病效应。表面积的增加还使纳米材料能吸 附更多的有毒有害物质，增强其毒性。有研究表明【5 ，6 】：纳米t i 0 2 对a s ( i i i ) 、a s ( v ) ， 尤其是镉均具有较强的吸附能力，并能显著增加鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 对a s ( h i ) 、 a s ( v ) 的富集，提高鲤鱼体内镉的浓度。二是纳米材料化学成分本身所固有的性质。 如量子点纳米晶体( q u a n t u md o t sn a n o c r y s t a l s ) ，暴露在空气中或经紫外线照射后， 无毒的表面涂层很快被消蚀掉，随即表现出极强的细胞毒性【7 捌。由于量子点的主 要成分是硒化镉( c d s e ) ，于是有人预测量子点的毒性效应可能与重金属镉相判4 1 。 因此，人们担心纳米材料潜在的对环境和人体健康的有害影响最终是否会超过他 带给人类社会的效益。 2 0 0 0 年以来，s c i e n c e 和( n a t u r e ) ) 杂志已先后多次发表编者文章，探讨纳 米技术的安全性和纳米材料的生物效应以及对健康和环境的不利影响 9 - 1 4 。2 0 0 4 年在联合国大学美国理事会的“跨千年项目”里，开展了旨在确定和评估纳米技 术在军事上的应用可能导致的环境污染和健康危害的全球问卷调查。2 0 0 5 2 0 0 6 年，一些行业权威期刊如 c a r b o n 、( ( e n v i r o n m e n t a lh e a l t hp e r s p e c t i v e s ) ) 、( ( j o u r n a l o f n n o p a r t i c l er e s e a r c h ) ) 、( ( n a n o t o x i c o l o g y ) ) 、 ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e & t e c h n o l o g y ) ) 等纷纷开辟专栏或出版专刊，探讨纳米颗粒的应用与生物和环境的安全问题。2 0 0 7 年2 月美国国家环保局( e p a ) 出版了纳米技术白皮书，不仅指出纳米技术在环境 保护领域的应用，同时也关注纳米材料的环境暴露可能导致的风险，从而促进可 第1 章绪论 持续和负责任地发展纳米科技。除政府部r - j # l , ，国际环保组织( 如绿色和平组织) 和地区非政府组织( 如英国基因观察组织和加拿大e t c 组织等) 都将目光投向纳 米技术，2 0 0 3 年，上述组织在布鲁塞尔召开讨论会，旨在唤起公众重视纳米技术 的潜在危害。 2 0 0 4 年1 2 月，以“纳米尺度物质的生物效应( 纳米安全性) 为主题的第2 4 3 次香山科学会议在北京召开，表明纳米材料的潜在环境和健康危害已引起国内科 学界的重视。会议中心议题有：( 1 ) 纳米物质与细胞及生物分子的相互作用及其 对生命过程的影响；( 2 ) 纳米物质的生物效应及负效应消除；( 3 ) 纳米生物效应 实验技术和应用；( 4 ) 纳米尺寸效应对生物效应的影响；( 5 ) 纳米物质的生态环 境效应，大气纳米颗粒的来源，浓度，尺寸分布等；( 6 ) 纳米物质安全性评估与 纳米标准等。与e t c 组织呼吁在危害没有得到明确前暂停纳米技术的研究的做法 不同，会议建议以“科学发展观”为指导，在发展纳米技术的同时，应同步开展 其安全性的研究，使纳米技术有可能成为第一个在其可能产生负面效应之前就已 经过认真研究，引起广泛重视，并最终能安全造福人类的新技术。 纳米材料的生物安全性研究受到如此关注的主要原因是：纳米科技的迅速发 展正在引起2 1 世纪的工业、农业和科学技术等发生革命性变革；目前纳米尺度物 质已经渗透到染料、涂料、化妆品、医药工业和环境污染治理等各个领域。人们 在研究、生产和生活中接触到纳米材料的机会越来越多。有的纳米材料可以通过 工业生产、纳米产品分解、纳米材料自组装等途径释放到环境中，并与环境中的 化学污染物、重金属、各种细粒子结合，反应生成二次粒子，使毒性增魁5 , 6 , 1 5 】。 1 2 2 纳米材料生物效应的研究进展 国内外有关纳米材料生物效应的研究都刚刚起步，相关的研究成果在文献期 刊上的报道不多。本文总结了最近几年有关的研究资料，探讨了生物对纳米材料 可能的暴露途径，也归纳了纳米材料的某些生物效应以及可能的作用机制，以期 为下一步的纳米技术和纳米材料的环境和健康风险研究提供参考。 物质对生物产生毒性效应，必须将生物暴露于该种物质，纳米材料亦不例外。 ( 1 ) 从生产源头而言，纳米技术工人对纳米材料的暴露，更多的是通过直接 的皮肤吸收、口鼻吸入或是口腔摄食。目前的研究结果显示：纳米材料渗透入皮 氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究 肤的模式如图1 3 所示【1 9 1 ，作用的特点主要是：与纳米材料粒径有关，粒径越小 越易渗透进人皮肤：进入真皮层的纳米材料性质决定了其对皮肤的刺激作用； 可以溶解的物质、金属等的浸提液、纳米颗粒较易渗透入皮肤。纳米材料通过 口鼻吸入或摄食进入人体导致的生物效应，目前因为缺乏实验依据还需要进一步 验证。但从对小鼠和大鼠的研究中发现：受到t i 0 2 纳米颗粒作用时，尽管肺部细 胞启动自我保护机制诱导了抗氧化酶的生成，却未能消除t i 0 2 纳米颗粒产生的毒 副作用，如图1 4 【1 9 】所示。同时纳米t i 0 2 引起了支气管肺泡灌洗液内总蛋白质含 量、乳酸脱氢酶及f j 葡萄糖苷酸酶的活性普遍升高，而且比表面积效应曲线与实 际的炎症情况有很好的相关性，这意味着t i 0 2 纳米物质的生物效应与小尺寸效应 有关【2 3 1 。因此，我们在讨论纳米材料生物效应时，即使是同一种材料，也需要注 明纳米物质的具体尺寸大小( 这和常规物质有很大的不同) ，因为纳米尺寸的改变 会引起其生物效应发生改变。纳米材料除了这种直接暴露，还可以透过“血脑和 肺脑屏障 ，发生生物体内的转移，如图1 2 所示。另外，食物中的纳米颗粒能渗 入进消化道淋巴管，并且与其他大颗粒物相比，更容易在其他组织和器官分布【l 刨。 c o n i n gl 蚴墨船c 印黜 图1 2 暴露于1 3 c 纳米颗粒6h 后1 3 c 在大鼠肺部( 1 u n g ) 、嗅球( o l 矗l c t o 巧b u l b ) 、大( c e r e b r u m ) 和小脑( c e r e b e l l u m ) 组织中的浓度随时间的变化过程。宰表示差异显著( 则0 5 ) b g f i g 1 2t i m ec o u r s eo f ct i s s u ec o n c e n t r a t i o n si nl u n g , o l f a c t o r yb u l b c e r e b r u ma n dc e r e b e l l u mo f r a t sf o l l o w i n ga6 - h r i n h a l a t i o ne x p o s u r et ou l t r a f i n e ( 3 6n l nc m d ) e l e m e n t a l ”cp a r t i c l e s ( n = 3r a t s p e rt i m e p o i n t ) 十i n d i c a t e sv a l u e ss i g n i f i c a n t l yg r e a t e rt h a nc o n t r o l s ( p 0 0 5 ) 第1 章绪论 目1 ”3 警菜篇皮肤蒯”图纳米材料通过皮肤的方式”1 f i g 13p e n e t r a t i o n p a t h w a y s o f t o d i e a l l ya p p l i e ds u b s t a n c e s t h r o u g h t h es k i n 。，蠢。譬磅 ( 2 ) 消费品生产运输和消费过程中也可能溢出纳米材料。美国学者o b e r d t s r s e r 认为水环境可能通过径流、排污或空气沉降接受更多的纳米粒子。目前仍然不能 氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究 确定纳米材料在环境中处于什么样的数量级别，并且由于纳米材料被应用的数量 越来越多和范围越来越广，实际上也难以对其在环境中的数量级别作出预测。考 虑到某些纳米材料，比如富勒烯( c 6 0 ) ，正被成吨生产，其在环境中的浓度极有可 能达到可检出的水平。o b e r d s r s e r 报道了未被修饰的富勒烯c 6 0 ，( 俗称“巴基球 ) 对水生生物的健康危害。大嘴黑鲈( m i c r o p t e r u ss a l m o i d e s ) 暴露于0 5 m g l 未修 饰的n c 6 0 4 8 小时后，发现脑组织产生严重的脂质过氧化现象。 ( 3 ) 从消费者的角度出发，含有纳米材料的消费品使用将使消费者面临纳米 材料暴露的风险，特别是那些与人体直接接触的商品，如防晒剂和化妆品等。 o b e r d e s r s e r 和s a u n d e r s 也在毛囊角质层和毛乳头处发现了防晒霜中的超细t i 0 2 颗 粒的沉淀【2 0 ，2 1 1 。有文章报道在目光中紫外光线的照射下，由于纳米级尺寸的t i 0 2 颗粒具有较强的光催化作用，使得防晒品中的有机成分发生降解产生毒害皮肤的 物质【2 2 1 。纳米材料出于诊断或者医疗的目的可以被设计并直接引入人体【1 6 1 。特别 是在给药方面，比如纳米磁性药物微球，在体外强磁场引导下能定向移动，已成 为肿瘤靶向治疗及药物新剂型研究的热点【1 7 】。 图1 5 人工纳米材料进入环境的途径和生物体( 包括人类) 可能的暴露途径【1 8 1 f i g 1 5s o m ep o s s i b l ee x p o s u r er o u t e sf o rn a n o m a t e r i a l sb a s e do nc u r r e n ta n dp o t e n t i a lf u t u r e a p p l i c a t i o n s s o u r c e ：r o y a ls o c i e t ya n dt h er o y a la c a d e m yo fe n g i n e e r i n g 第1 章绪论 可见，纳米材料在生产运输和使用过程中可能产生的暴露是近期人们关注的 主要问题之一。以广泛应用于机械、轮胎、燃料、微电子、纤维、化工染料等许 多产品中的纳米物质为例，可能随产品的使用、分解，而释放或流入、渗入到大 气、水体和土壤中。研究表明，纳米材料可以以极快的速度转移至水相中，一旦 进入水体，由于食物链的原因，会对水体生态环境、动植物造成很大的影响。从 长远来看，随着纳米材料的应用越来越广泛，数量越来越多，通过大气、水和土 壤等途径将不可避免地造成对整个生态系统的暴露( 图1 5 ) 。因此有必要对纳米 材料的生物效应进行抢先的研究，以评价纳米材料的环境和健康风险。 1 2 3 水生环境纳米毒理学研究进展 1 2 3 1 纳米材料在水环境中的聚集、沉淀和修饰 纳米材料的表面性质是制约其胶体分散系统稳定和动态变化或其在水环境系 统中聚集的、沉淀成较大颗粒的关键因素。在研究纳米材料的毒性机制方面，稳 定的纳米材料胶体悬浮液是纳米材料与藻类相互作用的先决条件，土壤中孔隙水 中纳米材料的流动性对于纳米材料与植物根系、藻类或者真菌菌丝的相互作用至 关重要。鉴于纳米材料复杂的表面特性，我们只做一些粗略的估计。 金属纳米材料表面经常涂有无机或有机化合物，如柠檬酸，半胱氨酸，碳酸 盐或表面活性剂，如十二烷基硫酸钠，保持胶体的稳定【5 2 1 。因此，纳米材料在水 悬浮液中的性质强烈依赖于这些材料的性质，一般情况下，在中性p h 值环境中， 带负电荷的纳米材料更容易聚集【2 4 ，2 5 1 ，金属氧化物纳米材料的表面性质也取决于 它们的酸度常数和零点电荷数。比如，纳米t i 0 2 在p h 7 环境中带负电荷；而s i 0 2 粒子通常带有负电荷，因为它们的零点电荷数位于p h 2 周围。另外，一些其他金属元素纳米氧化物也许具有类似的表面特性，因为它们 表面覆盖有钝化氧化涂层1 2 7 2 引。一些非金属纳米材料，如碳纳米管或富勒烯具有 疏水表面，这些纳米材料可以通过在其表面添加亲水基团增加其溶解性，否则， 疏水性碳纳米管的表面与疏水或两亲化合物相互作用。 粒子的聚集与沉积是两个紧密相关的现象【2 6 1 。聚集描述的是相互作用的两个 物体，而沉积是指相互作用物体的不动阶段。有限的研究表明，纳米材料在水体 当中的聚集沉积可能仍然保持原先的特性。沉积聚集过程是由纳米表面性能决定， 氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究 这主要是依赖于一系列参数，如温度，离子强度，p h 值，颗粒浓度和大小等。 例如，增加离子强度，从而减少两个对象之间静电排斥，能垒减弱，更容易富集。 在纳米粒子聚集和沉积的过程中还会有其他作用力参与，例如，空间位阻斥力， 水化作用，疏水相互作用，磁场的吸引力或不均匀分布于颗粒表面的电荷，所有 这些还有待于进一步检测【2 9 1 。此外，与纳米材料结合的天然有机质( n o m ) 或人 工合成的有机质都会进一步增加纳米材料与水体的相互作用。事实上，大部分天 然有机质，如蛋白质，多糖，核酸，脂类等等，来源于植物、藻类或真菌。以浮 游植物或真菌分泌的富含多糖的纤维素为例，它们与纳米物质的相互作用与腐殖 酸有着很大的区别。这些富含多糖的纤维素被认为是纳米材料在淡水或海洋中形 成较大颗粒而发生聚集沉积过程的关键因烈6 5 】。因此，更好地了解纳米材料聚集 沉积过程，将帮助我们更好地预测纳米材料在环境中的命运，以及它们的生物效 应。 图1 6 纳米粒子与毒物a ，b 和盐离子以及有机质相互作用示意图【2 6 j f i g 1 6s c e n a r i oo fn a n o p a r t i c l e s 0 岬) i n t e r a c t i o n sw i t ht o x i c a n t s ( t o xa a n db ) ，s a l ti o n s ( s i ) ，a n d o r g a n i cm a t t e r ( o m ) s u c ha sh u m i ca c i d so rc o m p o u n d sr e l e a s e db yp l a n t s ，f u n g i ，b a c t e r i a , a n da l g a e s o m ec o m p o u n d sp r e s e n ti ne n v i r o n m e n t a lm a t r i c e sm i g h ti n c r e a s et h en p s s t a b i l i t y ( o m ) a n dt h u s b i o a v a i l a b i l i t y ( r e p r e s e n t e da ss o l i da r r o w se n t e r i n go r g a n i s m s ) ，w h e r e a so t h e r s ( s a l ti o n s ) m i g h t f o s t e rt h ea g g r e g a t i o no f n p s ，t h u sr e d u c i n gt h e i rb i o a v a i l a b i l i t y ( r e p r e s e n t e da sd o t t e da r r o w sn o t e n t e r i n go r g a n i s m s ) ，o rp h y s i c a l l yr e s t r a i n i n gn p o r g a n i s mi n t e r a c t i o n s i no t h e rc a s e s ，n p s b i o a v a i l a b i l i t ym i g h tb ee i t h e ri n c r e a s e do rd e c r e a s e d 第1 章绪论 1 2 3 2 纳米材料水生毒理学进展 水环境可能受来门消费品生产、运输、消费和处置过程中溢出的纳米材料污 染，废弃的纳米材料或污染事故也可能导致纳米材料泄漏进入水环境中。日前关 于水生毒理学的研究不多见，本文选取了纳米材料水生毒理比较有代表性的研究 见表1 2 。尽管如此，仍然缺乏有关纳米材料的暴露和剂量一效应的毒理学数据， 而且其中的绝大多数还仅仅是急性曝露的毒性结果，缺乏低剂量长期慢性曝露下 的毒理学数据，因而目前尚难以开展对纳米材料的危害鉴定和风险评价。因此， 迫切需要采取多种不同类型的检测方法来评价纳米材料对其相关生态受体的潜在 效应。这些方法既有传统的短期( 急性) 和长期( 慢性) 毒性测试方法，也包括 根据纳米材料的独特性质开发出的或对传统方法进行修改得到的具有创新性和新 颖的测试方法。 表1 2 几种纳米材料的水生毒理学研究 t a b 1 2t h es t u d yo fs e v e r a ll l a n o - m a t e r i a l s a q u a t i ct o x i c o l o g y 氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究 1 2 4 纳米材料生物效应可能的作用机制 纳米科技将来势必会给人类社会带来巨大进步，我们不能因为纳米材料可能 会对环境造成危害而停止对纳米技术和相关产品的研究，重要的是要努力在纳米 科技的发展和其潜在的毒性研究中找到平衡。而且，应用纳米尺度物质某些“毒 理”效应，还可以产生有益的结果，包括比如对病变细胞的控制和病变组织的修 复；利用纳米尺度物质的生物效应来进行某些病变的早期诊断；在不改变其功能 性质的基础上通过物理化学修饰消除其有害效应；研究纳米材料对生物体的毒性 效应和相互作用机理，不仅可以展示纳米材料对生物体的损伤，还可以从侧面反 映生物体应对外来毒物的抗性和修复机制，用以修复纳米材料对环境的污染，保 证纳米科技的可持续发展。 1 2 4 1 有毒物质的生物转化 无特殊作用或可能产生毒害的外来物一旦进入生物体内，生物体的反应是将 其排泄或将其转化为较容易排除，抑或是转化为毒性更弱的代谢物( m e t a b o l i t e ) ， 而后者一般被称为生物转化( b i o t r a n s f o r m a t i o n ) 3 0 1 。生物转化属于生物体内代谢 作用的一部分，依其功能可分为两个不同阶段的作用，并通常需要借助许多不同 的酶来完成。图1 7 表示外来物经过生物转化的第一阶段及第二阶段的生化反应 后，排出体外的过程。 导入富裁圃 ； 台威反应旎基 l 上a 弋p a p s - - 泸 图1 7 外来物经两阶段生物转化的过程，并以苯被代谢的过程为例 f i g 1 7t w o - s t a g ep r o c e s so fb i o t r a n s f o r m a t i o nf o re x t e r n a lo b j e c t s t h ep r o c e s so fm e t a b o l i s mo fb e n z e n ea sa ne x a m p l e 第1 章绪论 第一阶段( p h a s ei ) 生物转化的最主要作用是将具极性的官能团( f u n c t i o n a l g r o u p s ) 加于外来物上，以增加其水溶性并有利于排出体外。常见的官能团有羟基 ( ，o h ) 、氨基( - n h 2 ) 、羧基( c o o h ) 等。若此代谢物仍无法被排除，该代谢 物则进入第二阶段( p h a s ei i ) 的作用过程。在第二阶段的酶的作用下，代谢物经 合成反应( c o n j u g a t i o n ) 加入一更大型的分子，并形成次代谢物。在第一阶段，与 环境中有毒污染物较有关的是多功能单氧酶( m i x f u n c t i o nm o n o o x y g e n a s e ，简称 m f o ) ，又被称为细胞色素p 4 5 0 ( c y t o c h r o m ep 4 5 0 ) 1 拘酶系统【3 0 1 。其基本反应如图 1 8 所示。 m 强 谢物) 图1 8m f o 酶系统作用的过程 f i g 1 8t h ep r o c e s so ff u n c t i o no fm f oe n z y m es y s t e m 由于m f o 系统是代谢外来物的主力，为了应付较高的污染物负荷，细胞会产 生更多的酶以加速代谢作用，而其体内的含量则因此而升高，此现象称为诱导效 应( i n d u c t i o n ) 。生物体中的m f o 酶受污染物的诱导可作为该生物受暴露程度的 一种指示物( b i o m a r k e r ) ，并可用于污染预警。生物转化可能发生在生物体内的任 何部位，只要该处的细胞具有此特殊代谢的功能。 许多生物体内均含有一些特殊的能与金属结合的蛋白质，其中一类称为金属 硫蛋白( m e t a l l o t h i o n i e n ) 。它是一类低分子质量( 6 k d - - - , 7 k d ) 、富含半胱氨酸的金属 结合蛋白，是机体内唯一一种在金属代谢中起明确作用的小分子蛋白质。由于m t 具有调节微量元素代谢，颉颃有害重金属毒性、捕获自由基、抗氧化应激等独特 的生物学功能。金属硫蛋白的结构能提供7 个键结位置与二价金属结合，并能作 为储存体内过多金属的场所，因而可减少其毒害。由于金属硫蛋白能被不同的金 属所诱发( i n d u c t i o n ) ，而导致其在生物体内含量增加，因而我们可将其视为一金 氧化镍纳米颗, l , - r c d , 球藻的生物学效应及生物修复研究 属的解毒机制( 结合含量增加，毒性降低) 。北京大学曾文炉等人【3 2 】利用海藻酸钠 c a c l 2 凝胶包埋法固定转小鼠金属硫蛋白i ( m m t - i ) 基因聚球藻，结果发现固定化 藻细胞呵有效提高藻细胞对重金属的耐受性和对重金属的去除效率。 1 2 4 2 纳米材料与生物体相互作用机理 目前关于纳米材料与生物体相互作用机理方面的研究主要是在分子层次进行 的，以期能解释纳米材料产生生物效应的原理。图1 9 是n e l 等 1 2 】提出的纳米材料 与生物组织相互作用机理，图中表明生物组织相互作用与纳米材料的组战、电子 结构、表面键合物质、表面覆盖( 活性或惰性) 和溶解性等性质有关，另外还与 其他环境因素( 如u v 活化) 有关。例如，尺寸减小会导致纳米材料产生不连续 的晶面，使得结构缺陷增加，这些缺陷可能会提供新的生物作用靶点。大多数纳 米材料表现出毒性是由于材料的电子活性点( 给电子或受电子基团) 能与氧分子 发生作用，形成超氧阴离子，通过歧化反应产生额外的r o s ，导致细胞氧化损伤。 纳米颗粒载带的可溶性重金属离子被认为是产生自由基的主要原因。除了氧化应 激和炎症之外，纳米材料还可能会造成蛋白质变性、细胞膜破坏、d n a 损伤、免 疫反应和异物肉芽瘤。蛋白质在纳米材料表面的变性或退化导致其结构和功能发 生改变，包括对酶功能的调控改变。不仅如此，纳米物质与蛋白质结合后形成的 络合物可能具有更高的机动性，进入通常难以到达的生物组织。北京大学与高能 所纳米生物效应实验室合作研究了水溶性单壁纳米管在小鼠体内的分布，发现水 溶性多羟基化单壁碳纳米管能非常容易、迅速地分布到小鼠的各种组织和脏器。 研究发现：分子量高达6 0 万的单壁碳纳米管，在生物体内的行为与小分子相似， 对于这种现象，现有的生理学知识还无法解释。目前，由于受生物体内纳米尺度 物质定性、定量检测方法的限制，纳米颗粒在体内的吸收、分布、代谢和清除方 式等实验数据还很少。 纳米颗粒进入机体后，具有引发严重毒性效应( 如致炎反应和免疫反应等) 的可能。但是，相关的纳米颗粒毒性作用机制目前仍不清楚【1 6 1 。考虑到以下两点： ( 1 ) 目前有关纳米颗粒的毒理学数据极为缺乏；( 2 ) 尽管纳米颗粒和超细材料有 所区别，但是两者的粒径范围相同( 1 0 0 n m ) ，因而两者的生物效应作用机制在 某些方面可能存在一定的相似性。因此，本文借鉴有关超细颗粒毒性作用机制的 第1 章绪论 一些假设，以期阐明纳米颗粒的作用机制。 图1 9 纳米材料与生物组织相互作用的可能机理 f i g i9 t h e m e c h a n i s m o f i n l 9 r o c t l o n b e c w c 盯i n a n o - m a t e f i a l sa n d b i o l o g i c a l t i s s u e 根据目| j i 的研究，超细材料导致肺部组织炎症的细胞及分子生物学机制的假 设为图i1 0 1 3 1 】：颗粒对细胞产生氧化胁迫，导致脂质过氧化产物的生成和氧化型 谷胱甘肽( g s s g ) 的产生。细胞内的这一氧化还原平衡遭到破坏的结果是使一些 组蛋白发生乙酰化作用，导致这些组蛋白与d n a 的结台松开，提供转录混合物到 达致炎基因启动子区的途径。氧化胁迫引起转录调控因子n f r , 8 转移到细胞核中， 并到达关键致炎基因的启动子区调控基因的转录。受n f - r , b 调控的致炎基因包 括t n f a ，i l - 8 ，i l 2 ，i l 一6 ，0 m - c s f ，i c a m - l 和e - 选择i n o s 等，因此n f - r , b 的活化可被认为存在高致炎作用。而且氧化胁迫或者直接与颗粒的相互作用都 能刺激细胞溶质c a 2 + 浓度的上升，这也会引起n f - r , b 的活化。钙离子信号也可能 控制能导致正反馈机制的活性氧的产生。上述过程的联合作用，将使基因的转录 达到顶点，导致发炎和抗氧化剂生产的上升。 氧化镍纳米颗粒对小球藻的生物学效应及生物修复研究 颗粒物袭面镣致的瓴纯 胁追 炎藏 图1 1 0 细胞暴露于超细颗粒导致致炎基因转录的假设示意图 f i g 1 10d i a g r a mo fh y p o t h e t i c a le v e n t st h a tl e a dt ot r a n s c r i p t i o no fp r o - i n f l a m m a t o r yg e n e si n p a r t i c l ee x p o s e dc e l l s 1 3 蛋白质组学简介 1 3 1 蛋白质组学研究方法 目前，蛋白质组学的研究主要依赖三大技术：蛋白质分离技术，蛋白质鉴定 技术和蛋白质生物信息学。 ( 1 ) 蛋白质分离技术。常用的蛋白质分离技术主要分为两大类，电泳技术和 层析技术，并以此为基础衍生出诸多具体方法。 双向凝胶电泳技术( t w o d i m e n s i o n a lp a g e ，简称2 - d e ) 是目前蛋白质分离 的主要技术，能够有效的分离一个复杂生物混合物中的蛋白质，分辨出成千上万 个蛋白质点，但对于偏酸、偏碱、高分子量、微量蛋白质及难溶性蛋白质分析仍 感困难。2 - d e 的基本原理是，首先根据蛋白质等电点不同在p h 梯度胶中等电聚 焦将其分离，