（分析化学专业论文）激光诱导分子结的形成及新型sers生物传感器的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 表面增强拉曼散射( s e r s ) 是以拉曼散射为基础建立起来的分析表征技术。 由于其高灵敏度、高分辨率、水干扰小、稳定性好等优点，在材料、表面科学、 分析化学、传感器、生物学、诊断学等方面都得到了广泛应用。本文利用s e r s 技 术研究了分子与金属纳米粒子间的相互作用，同时发展了一系列灵敏度高、操作 便捷和响应快速的s e r s 生物传感平台。具体包括： 在第二章中，借助于s e r s 技术，系统研究了激光诱导4 氨基苯硫酚( p a t p ) 在金纳米粒子( a un p s ) 表面的吸附行为。研究发现：通过激光获得额外能量， 醌式p a t p 分子在纳米粒子间形成分子结；分子结的形成与否取决于激光照射时 间、纳米粒子的团聚状态及p a t p 分子的表面覆盖度。此外，分子结的形成过程是 可逆的，受激发光功率和激光照射时间的影响。 在第三章中，利用s e r s 技术发展了一种基于多层金属分子金属纳米结的超 灵敏的h i v d n a 检测方法。利用完全互补的两条d n a 链之间的杂交作用力，a u n p s 间形成了金属分子金属纳米结，使得其标记分子的拉曼信号显著增强。这种 h i v 1d n a 检测方法达到1 0 0 9m ( 1 0 。2 3m 0 1 ) 的检测限，成功实现了近单分子水 平的简易s e r s 检测。 在第四章中，发展了一种基于静电相互作用的凝血酶检测生物传感器。这种 检测利用捕获分子( 凝血酶核酸适体) 和探针分子( 结晶紫，c v ) 的静电相互作用。 凝血酶和核酸适体间的特异性相互作用，削弱了正电性的结晶紫由本体溶液经核 酸适体( 电负性) 自组装层向金纳米粒子表面扩散的静电位阻效应。因此，在相 同拉曼检测时间点，键合的凝血酶越多，金纳米粒子表面附近的c v 分子越多，所 观察到的结晶紫的s e r s 信号越强。结果表明：在优化条件下，凝血酶在o 1n m 到 1 0n m 浓度区问的呈线性关系，检测下限约为2 0p m ，并且具有高选择性，实现了 在人血清溶液中的直接检测。 关键词：表面增强拉曼光谱；生物传感器；分子结；4 氨基苯硫酚；核酸适配体； 凝血酶；静电作用 i i 金属纳米分了结的形成及s e r s 生物传感器的研究 a b s t r a c t s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) i sah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e t o o lf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fb i o l o g i c a lo rc h e m i c a la n a l y t e sb a s e d o nr a m a ns c a t t e r i n g i t sn a r r o w ，w e l l r e s o l v e db a n d s ，l o ws e r si n t e n s i t yo fw a t e ra n dh i g hs t a b i l i t ym a k e s e r sw i d e l yu s e di nm a t e r i a ls c i e n c e ，s u r f a c es c i e n c e ，a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，s e n s o r s b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o na n dd i a g n o s t i c s i nt h i st h e s i s ，t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e n m o l e c u l e sa n dm e t a l l i cn a n o p a r t i c l e s ，a n dt h en o v e la n ds i m p l es e r s b a s e db i o s e n s o r p l a t f o r m sw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gs u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y ( s e r s ) t h e d e t a i l sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 l a s e rp o w e rd e p e n d e n c eo fp a m i n o t h i o p h e n o l ( p a t p ) a d s o r p t i o n o na u n a n o p a r t i c l e s ( n p s ) w a ss y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e du s i n gs u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s p e c t r o s c o p yi nc h a p t e rt w o m o l e c u l a rj u n c t i o n s ( m j s ) w e r ef o u n dt o f o r mb e t w e e n n p sw i t hp a t pa st h eb r i d g em o l e c u l ew i t ha ne x t e r n a le n e r g yp r o v i d e db yt h e i n c i d e n tl a s e r t h ef o r m a t i o no fm j sd e p e n d so nt h el a s e ri l l u m i n a t i o nt i m e ，t h e a g g r e g a t i o ns t a t e so fn p sa n dt h es u r f a c ec o v e r a g eo fp a t p f u r t h e r m o r e ，t h em j s f o r m e ds h o w e dr e v e r s i b i l i t yt ob ea f f e c t e db yt h el a s e rp o w e ra n dt h ei l l u m i n a t e dt i m e 2 i nc h a p t e rt h r e e ，au l t r a s e n s i t i v eh i v 1d n ad e t e c t i o na s s a yb a s e do nt h e m u l t i l a y e r m e t a l m o l e c u l e m e t a ln a n o j u n c t i o n s ( n j s ) w a s d e v e l o p e du s m g s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y ( s e r s ) t a k i n ga d v a n t a g eo ft h eh y b r i d i z a t i o n b e t w e e nt w oc o m p l e m e n t a r yd n as t r a n d s ，t h er a m a ns i g n a lo ft h e i rt e r m i n a lt a g m o l e c u l e sw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dw i t ht h ef o r m a t i o no ft h em e t a l - m o l e c u l e m e t a l n j sb e t w e e na un a n o p a r t i c l e s ( n p s ) c a p p e db yt h e m ad e t e c t i o nl i m i tt o w a r d sh i v - 1 d n as e q u e n c eh a sb e e no b t a i n e da sl o wa s10 1 9m ( 10 。2 3m 0 1 ) ，w h i c hs u c c e s s f u l l y r e a l i z e das i m p l es e r sb a s e da s s a ya p p r o a c h i n gs i n g l em o l e c u l a rd e t e c t i o nl e v e l 3 i nc h a p t e rf o u r ，w ed e v e l o p e da ne l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb a s e db i o s e n s o rf o r t h et h r o m b i nd e t e c t i o nu s i n gs u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y ( s e r s ) t h i s m e t h o du t i l i z e dt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nc a p t u r e ( t h r o m b i na p t a m e r ) a n d p r o b e ( c r y s t a lv i o l e t ，c v ) m o l e c u l e s t h es p e c i f i c i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h r o m b i na n d a p t a m e rc o u l dw e a k e nt h e e l e c t r o s t a t i cb a r r i e re f f e c tf r o mt h en e g a t i v ec h a r g e d a p t a m e rs a m st ot h ed i f f u s i o np r o c e s so ft h ep o s i t i v ec h a r g e dc vf r o mt h eb u l k s o l u t i o nt ot h ea un a n o p a r t i c l es u r f a c e t h e r e f o r e ，t h em o r et h eb o u n d e dt h r o m b i n ，t h e m o r et h ec vm o l e c u l e sn e a rt h ea un a n o p a r t i c l es u r f a c ea n dt h es t r o n g e rt h eo b s e r v e d i i i 硕 ：学位论文 r a m a ns i g n a lo fc v ，p r o v i d e dt h er a m a nd e t e c t i o n sw e r es e ta tt h es a m et i m ep o i n t f o re a c hc a s e t h i sp r o c e d u r ep r e s e n t e dah i g hs e l e c t i v i t ya n dal i n e a rd e t e c t i o no f t h r o m b i ni nt h er a n g ef r o m0 1n mt o10n mw i t had e t e c t i o nl i m i to fc a 2 0p m ，a n d r e a l i z e dt h et h r o m b i nd e t e c t i o ni nh u m a nb l o o ds e r u ms o l u t i o nd i r e c t l y k e yw o r d s ：s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ；b i o s e n s o r ；m o l e c u l a rj u n c t i o n s ； p - a m i n o t h i o p h e n o l ；a p t a m e r ；t h r o m b i n ；e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 古匀妫日期：夕年 多月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期： 舻7 年 多月r 日 日期：前年么月j 日 净 ，m n 寸 呓n 呓肾 硕十学位论文 1 1 拉曼散射的原理 第1 章绪论 拉曼效应是分子的一种非弹性散射现象。自发拉曼散射是在频率为的入射光 场作用下所产生的发生频移的散射信号，该频移反映了分子基态的振动频率，因 而能够在分子水平上描述所研究的体系。图1 1 给出一些散射过程示意图。可以看 出散射是一个双光子过程，如果该过程发生前后光子频率没有改变，则称之为瑞 利散射；如果发生频移，则称之为拉曼散射。该频移的能量可以来自于光子传递 给分子的过程，称为斯托克斯线( s t o k e s ) ；反之，则称为反斯托克斯线 ( a n t i s t o k e s ) 。通常利用强度较高的斯托克斯线进行研究，但是拉曼散射强度只 有瑞利散射强度的1 0 - 31 0 ，如此低的散射信号导致其极低的检测灵敏度，因而其 应用一直不如后来发现的红外光谱。 如果入射光能量和分子第一激发态和基态的能级差很接近或一致时( 如图1 1 所示) ，将发生( 类) 共振拉曼效应，散射强度可增强1 0 6 倍。由于能在合适激发 光下产生共振拉曼效应的分子并不多而限制了共振拉曼的应用范围。 激发态 虚态 一一 办1 1 6 基态 h v h v o h v o 、 h v p o h v 、，卅 办k h v ，v v i 一 斯托克斯拉曼散射瑞利散射反斯托克斯散射近共振拉曼散射 图1 1 不同散射过程示意图。 会属纳米分了结的形成及s e r s 生物传感器的研究 1 2 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 1 2 1s e r s 的发现 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n n 等人首次获得吡啶吸附在粗糙银电极表面的高质量拉曼 谱刚l 】；直到l9 7 7 年，才由v a nd u y n e 等以及c r e i g h t o n 等证实该信号来自于某 种特殊的物理光学效应，称之为表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s c a t t e r i n g ，s e r s ) ，所得光谱为表面增强拉曼光谱( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s p e c t r o s c o p y ，s e r s ) 【2 3 1 。 在丰富的实验和理论研究基础上，研究者们归纳得出s e r s 效应具有的一些 普遍性特点 4 - 6 】： ( 1 ) 可以检测到许多分子的s e r s 信号，他们的增强因子往往不同；可以在 多种金属上观察到s e r s 效应，在金、银、铜贵金属表面可以获得1 0 6 增强。 ( 2 ) 产生s e r s 效应的前提条件是表面进行粗糙化处理，不同表面处理方法 获得的表面活性不同。 ( 3 ) s e r s 具有极高的表面灵敏度，吸附在金属表面的第一层分子萌r 获得最 大的增强，在离开金属表面数十埃乃至十纳米的距离内都有长程增强作用。 ( 4 ) s e r s 谱峰的相对强度以及频率和分子本体的常规拉曼光谱相比有较大 差异。 ( 5 ) s e r s 在常规粗糙化的金属表面上是完全退偏振的；在单个的纳米粒子 或纳米管、线的表面，s e r s 谱峰则可能是偏振的。 ( 6 ) 在具有s e r s 效应的粗糙表面欠电位沉积极少量非s e r s 活性金属p b 、 t l 等会导致s e r s 效应的减弱和淬灭，s e r s 活性位也会随外界条件的改变而不可 逆消失。 1 2 2s e r s 的机理 虽然人们对s e r s 现象有比较清晰的认识，但是对于其增强机理仍未有统一的 结论。普遍认为存在电磁场增强和化学增强两种机理【5 。8 】。 电磁场( e m ) 增强是一种物理模型，来自电磁场的增强因子约为lo h 引。具有 一定表面粗糙度的类自由电子金属基底的存在，使得入射激光在表面产生的电磁 场较大地增强，由于拉曼散射强度与分子所处光电场强度的平方呈正比，因而极 大地增加了吸附在表面的分子产生拉曼散射的几率，从而提高了所检测到的表面 拉曼强度。该种模型无法解释一些问题，如不同的吸附分子在同一s e r s 活性基底 上出现不同的增强效应；s e r s 谱峰的相对强度与常规拉曼光谱相比发生了明显的 变化；只有当吸附分子以化学成键或形成表面络合物的方式吸附于金属表面才可 能表现出非常高的增强因子；分子吸附在某些特殊的活性位上才产生s e r s 信号， 一些实验表明在基底上只存在少量的表面活性位；电化学体系中，吸附分子的 硕 ：学位论文 s e r s 强度往往是所加电极电位的函数。以上现象表明除了电磁场增强作用外，可 能还存在其他的增强效应。 科学家们提出许多模型用以解释以上现象，主要是化学增强机理，该机理主 要研究吸附物种和金属表面作用以及成键效应。化学增强有两部分贡献：增强因 子分别为10 1 和10 3 的静态化学增强和共振增强【引。静态化学增强来自于分子靠近金 属表面后电子性质的改变；共振增强则来自于分子中的激发或分子和金属问电荷 传递激发。其中最受关注的是金属吸附原子和吸附分子间电荷传递增强，即吸附 原子电荷传递络合物模型。 迄今，人们一般认为，电荷传递包括电荷从金属转移到吸附分子或从吸附分 子转移到金属表面这两种方式。以前者为例，主要包括以下四个过程： ( 1 ) 处在金属费米能级附近的电子吸收激发光子而被激发到比费米能级更高 的轨道上，在费米能级以下轨道产生空穴，因此在金属一侧形成了电子空穴对； ( 2 ) 吸收了光子能量的电子转移到吸附分子的l u m o 能级( 分子离子态的基 态) ，此过程的完成需要吸附分子和金属表面之间存在化学作用并与吸附原子或原 子簇等活性中心形成表面化合物； ( 3 ) 电子再次跃迁回到金属，此过程中分子的某些振动能级发生变化，吸附 分子处于某一振动激发态； ( 4 ) 返回的电子与金属内部的空穴复合并辐射出一个拉曼光子1 9 】。 在这四个过程中起决定作用的是第一和第二两个过程，它关系到激发光的光子能 量能否与电子跃迁所需能量匹配，两者接近或相等才可能发生( 类) 共振现象， 因此可通过改变激发光波长或电极电位以实现电荷转移。 1 2 3s e r s 在生物分析中的应用 由于s e r s 能直接提供表面吸附物种及其与金属表面作用的详细信息，因而为 鉴定表面吸附层组成以及吸附物种通过何种( 物理或化学) 方式和表面作用及吸 附取向提供直接有力的数据【1 0 。2 1 。如可以获得卤素或氢吸附在铂电极后的成键振 动信息，也可以得到多原子分子或离子与表面键合的振动光谱，由此推断该分子 或离子以何种原子吸附于金属表面。通过对表面分子的s e r s 研究还可以得到分子 吸附位的一些信息。选择某些对表面结构敏感的分子作为探针，根据其特征谱峰 频率和峰形的变化可以推断它们相应的吸附位置；也可利用这类对表面十分敏感 的探针分子来研究它们和不同表面的作用。 s e r s 所提供的表面物种丰富的振动光谱信息使得拉曼光谱，尤其是表面增强 拉曼光谱得以飞速发展并在各个科学领域如材料、催化、电化学、腐蚀及防腐、 分析化学、传感器、生化、医学等方面，都得到了广泛的应用。最近，英国皇家 化学会c h e m i c a ls o c i e t yr e v i e w s 杂志发表了一期专刊，由多位专家从不同角度详 细探讨了s e r s 在化学和生物分析方面的理论基础及相关应用l l 引。 垒属纳米分子结的形成及s e r s 生物传癌器的研究 在众多光学生物检测技术中，表面增强拉曼光谱( s e r s ) 能够吸引研究者们 的广泛注意在于：其窄谱带的特征拉曼光谱为分析物提供了丰富的结构信息，并 且可避免复杂体系中多物种问的相互干扰【1 4 1 ：相对于荧光，任何波长光源激发下， 拉曼不会发生光漂白以及自淬灭等现象【1 4 1 ；s e r s 的检测灵敏度可达单分子水平 i ”“”，几乎可以与荧光技术相媲美。 近二十年来表面增强拉曼光谱( s e r s ) 由于提供了巨大的化学结构信息和 高达单分子水平的高灵敏度，被广泛用于从小的生物活性分子、d n a 、到蛋白质 和细胞的生物分析。s e r s 能够用于这些生物分析的关键是：怎样制备具有高s e r s 活性的稳定的拉曼标记基底。有高s e r s 活性的a g 和a u 纳米粒子和大拉曼横截面的 分子分别被用作为基底和标电物，这吸引了大量研究人员，尤其有可能用于d n a ( 基因) 检测和免疫分析。通常情况f ，拉曼标记物和捕获探针可能吸附在纳米 粒子表面【18 。2 0 l ，或是先成共轭再吸附在纳米粒子表面1 1 9 。2 2 】。然而，前一种需要非 常谨慎和大量地试验，去控制捕获探针和拉曼标记物的比率；后一种要求高的有 机合成技术。纳术粒子核壳结构的引进，尤其是硅包裹的a r ( a u ) n p s t 2 3 2 4 i ( 图 12 ) ，大大地增加了扎曼标记物和捕获探针的数量口 拍j 。 阿等厣 f 一 _ i 幕 图】2 核壳纳米颗粒的结构及硅包裹a u n r , s 的g 成过程示意图叫。f a ) 尺寸为5 5 6 5n r n g a u n p s ( 能在6 3 2 6 4 7n m 激发下产生强的拉曼增强作用) ；( b ) 吸附了拉曼活性分子的a u n p s ： ( c ) 拉曼活性分子与偶联剂( 3 - 巯丙基三甲氧基硅烷，m p t s ) 包裹的a un p s * 和( d ) 经硅酸钠 处理4 2h 后，沉淀于硅的乙醇溶液中的硅包裹a un p s ，其核壳结构内嵌入了拉曼检测的活性 分子。 ；。一；。 顾学位论空 1231s e r s 在生物小分于检测中的应用 在生物小分子的s e r s 检测上，一般是向小分了中加入拉曼活性基底溶液，利 用其本身所具有拉曼活性来实现检测。例如，k n e i p p 等2 1 将多巴胺和去甲肾上腺 素与银溶胶混合，利用待测物的拉曼活性和银纳米粒子的增强作用，得到拉曼信 号增强，从而到达区分两种物质的目的。 然而，有些生物小分子不能直接吸附在基底表面，这就需要发展出新方法束 检测。s h a f e r p e l t i e r 等2 “”1 借鉴h p l c 中固定相的方法( 圈13 ) ，他们将s e r s 活 性基底上修饰上一层自组装膜( s a m ) ，用作吸附相，加快葡萄糖分子在膜中的 渗透速率，使其富集在银电极表面的电磁增强场中，然后利用s e r s 实现葡萄糖的 实时快速检测。 图13 一种葡萄糖传盛器的示意囱“。在粗糙银电极表面修饰一层正癸硫醇的自组装膜 ( s a m ) ，用于“滞茸”葡萄糖分子再通过s e r s 检测检测样品中葡萄糖的含量。 12 _ 32s e r s 在d n a 检测中的应用 s e r s 在d n a 检测中的应用非常灵活，通常分为非标记型和标记型两种。 标记型d n a 的s e r s 检测一般通过分析修饰在d n a 上的拉曼染料或s e r s 活性 标记物来检测目标d n a 。s e r s 活性的d n a 探针设计如图14 所示要获得有效的 s e r s 信号必须具有两个基本条件：生色团能在该激发频率下共振：标记的d n a 片 段能吸附于粗糙的金属表面。 兰墨竺兰2 三釜2 坐坚兰：! ：兰兰苎曼兰兰竺窑 ffff d 姒 连接都分染料表厦捕获基团 图1 4s e r s 活性的d n a 探针成分示意图。一般包括四个部分其中染料分子和表面捕获基团 可以是回种物质并不一定是要分开。 在标 己型d n a 的s e r s 检测上，c a o 等 2 1 , 3 2 - 3 4 i 直接在纳米金颗粒上固定标记 有s e r s 活性分子的d n a 捕获探针，通过与目标链杂交，将探针同定到基底表面， 并通过银染使s e r s 信号增强来定量检测d n a 的浓度，其检测限达到2 0 f m o l ( 如 图l5 所示) 。w a b u y e l e 等p ”将具有发夹结构的标 己了s e r s 活性分子的d n a 固 定在纳米银基底表面，当日标d n a 引入时其中的环状部分由于杂交而发生构象 变化，使得s e r s 活性物质远离基底表面，s e r s 信号减弱( 如图1 6 ) 。 垒鲤 h y d r o q u l n o n e 遂 固15 基于三组分夹心结构的标记型d n a 检测方法【2 1 s e r s 搿m w裟崭麓a矗 、 n=二盯h目 拶一 颇十学位论文 k 一 冒l6 基于构型变化的标记型d n a 检测方法”。 在非标记s e r s 活性分子检测d n a 方面，b r a u n 等 3 6 , 3 7 i 将标 己银纳米粒子的目 标d n a 通过捕获探针固定银表面，再利用银基底表面的s e r s 信号分子来检测d n a 分子。同期用中性的p n a 作为捕获探针与目标d n a 杂交后使表面带上负电荷 再通过静电作用吸附s e r s 活性分子和纳米银，发展r 另一种检测d n a 的方法，如 图17 。还有一种非标记型的检测主要是基于s e r s 对d n a 片断的本身拉曼光谱进行 分析。如b a r h o u m i 等p “通过将双链d n a 或退火的单链d n a 吸附到纳米壳的s e r s 活性基底上，直接获得了d n a 的s e r s 光谱，从而实现了对d n a 的直接检测，他们 发现不同d n a 的光谱类似，目丰要是腺嘌呤的光谱。 cc菱 图17 一种基于静电作用的非标记型的d n a 检测方法”“。 l23 3s e r s 在免疫检测中的应用 _ e | j 于免疫检测，一般是构建各种不同的s e r s 标记物探针，结合特异的免疫反 应的经典方法，形成夹心结构，达到分析检测的目的，其典型的检测步骤如图18 所 示。首先在基底表面固定抗原，再将该基底浸入到抗体和不同种拉曼染料共同修 饰的纳米金溶胶中形成央心结构，进而通过表面s e r s 信号检测待测物，通过不同 的染料标记即可检测出不同的目标物。在免疫探针的设计上，p o r t c r 等 3 ，2 0 ，2 2 ，3 9 1 开 展了大量工作，研究出一系列s e r s 探针，有效的提高了s e r s 检测的灵敏度。 酝越= |一皱 t f_ c a p t u r es u b s t r a t ep r e p a r a t i o n a us u b s t r a t ez 璺璺鳖7 巡 l i n k e rm o l e c u l e c a d t u r e a n u b o d y e x t r i n s i cr a m a nl a b e l ( e r l ) p r e p a r a t i o n r e p o r t e ra n u b o d y 墓泌，- 巡 a n t l g e = = ( a 呲t e ) ，：二篡望。 “”；溅 图l8 基于s e r s 技术的免疫分析平台1 3 9 1 ：( i ) 在镀金基底表面上先后修饰连接分子和捕获抗体 分子，制得能捕获目标物的基底；( 2 ) 在a u n p s 表面修饰拉曼活性分子和检测抗体分子，制得 拉曼标记物( e r l ) ；( 3 ) 将基底浸 到抗体( 目标分析物) 祁e r l ，形成夹心结构，再通过s e r s 检测目标物。 利用s e r s 探针与核酸适配体的特异性作用也用于免疫榆测。例如，w a n g 等【4 0 1 将凝血酶核酸适体固定在会基底上，利用凝血酶核酸适体与凝血酶的结合作用， 将标记s e r s 活性物质的另一个适体固定到摹底表面，再通过银染进一步放大s e r s 信号，实现凝血酶灵敏检测，其检测限达到了o ，5n m 。 s e r s 在免疫检测的应用还有一种比较重要的方法，就是利用酶联免疫反应直 接检测。这是由于酶联免疫反应产生的分子具有s e r s 活性，只要再# - 自f l s e r s 活性 基底即可实现目标物的检测。例如，d o u 等i 将过氧化物酶通过免疫反应固定在 基底表面，再将基底浸入古有邻苹二胺的的溶液中催化产生偶氨苯胺，加入银溶 胶后可以将偶氮苯胺吸附的表面并可以产生很强s e r s 信号，这样待测物的浓度就 与s e r s 信号的强度在定范围内成正比。 l234s e r s 在细胞( 细菌、组织) 检测中的应用 s e r s 在细胞( 细菌、组织) 检测中同样有比较广泛的应用。通常的检测方法 是直接将金属纳米颗粒置入细胞内部或者细胞外壁附近来研究其各种性质1 4 2 , 4 s i ， 或者将具有超强灵敏度和高选择性的s e r s 标记物置入到细胞内来进行分析【2 5 州l 。 a u 。焉。紧鬻 t 。 、。， ? 渗j x ， + 霄 h s p e ( j c o n h s c f v 一 弋p ，白港” * b 、 图1 + 9a ) 琉基化p e g 包埋的纳米金s e r s 探针的合成示意豳；b ) 抗体标记的p e g 化纳米金s e r s 探针用干癌细胞检测。其中，p e g i 蛐a un p s 襄面修饰了s c f ”抗体，能够识别肿癯的生 物标记物e g f r 。e g f r 抗体片段与p e g t e 功能化的一端共价结合。 翼o 会属纳米分子结的形成及s e r s 生物传感器的研究 1 3 本研究论文的构想 由于金属分子金属结的研究对s e r s 技术的单分子检测密切相关，因此我们 以研究分子与纳米粒子间的相互作用为出发点，利用s e r s 技术研究双功能分子在 纳米粒子表面的吸附行为。同时，在对s e r s 技术的深入理解的基础上，我们尝试 构建具有便捷、高灵敏、高选择性的新颖生物传感平台。本文主要开展以下三个 方面的研究工作。 1 3 1 激光诱导a un p s 间p a t p 分子结的形成 基于文献报道的p a t p 分子在不同金属表面或界面上吸附行为的研究，借助于 金纳米粒子自组装形成的s e r s 活性基底，系统研究双功能分子p a t p ( 4 氨基苯 硫酚) 在纳米结区域吸附取向变化。通过考察不同激光功率，照射时间以及基底 形貌下s e r s 谱图的变化，深入分析激光诱导分子结的形成及其机制。 1 3 2s e r s 用于h i v - ld n a 检测 利用距离决定电磁场( e m ) 增强作用的指数减弱，即拉曼标记物离纳米粒子 表面越近，r a m a n 信号越强的原理，发展一种新型超灵敏d n a 检测平台。本文中， 以h i v - 1d n a 为模型体系来探索这种方法的可行性。利用完全互补的两条d n a 链间的杂交作用力，在a un p s 间形成纳米分子结，使得s e r s 信号显著增强，实 现d n a 的超灵敏检测。 1 3 3s e r s 用于凝血酶的检测 以凝血酶为模型，借助于凝血酶与其核酸适体的特异性作用，以及探针分子 和核酸适体间的静电相互作用，发展一种基于静电相互作用的s e r s 传感器，并 对s e r s 活性基底特性、传感体系选择性和目标蛋白的定量测定等进行考察。 硕 ：学位论文 第2 章激光诱导a un p s 间p a t p 分子结的形成 2 1 前言 众所周知，分子在纳米结中的结构及键合性质对纳电子器件的功能和性能至 关重要4 6 舶】，因此，研究者们利用多种技术对其进行了深入研究【4 9 剐】。其中，振 动光谱尤其是红外5 1 , 5 2 1 和拉曼光谱【5 3 巧5 】是获得位于纳米结中的桥分子结构信息的 有力工具。特别是表面增强拉曼光谱( s e r s ) 的发现，有力拓宽了拉曼光谱的应 用领域并显著提高了其检测能力。经过三十多年的发展，s e r s 已经成为一种高灵 敏的表面检测技术，为研究多种分子( 无机小分子和生物大分子) 在币族和过渡 金属表面的界面行为提供了丰富的结构信息【4 , 7 , 9 , 5 6 - 6 0 。 目前普遍认为电磁场增强( e m ) 和化学增强( c t ) 这两种增强机制对s e r s 增强机理都有贡献。化学增强主要来源于金属和吸附物种间的电简传递过程，该 增强机制对s e r s 的贡献一般不超过1 0 2 5 6 , 5 8 , 6 0 】。电磁场增强则为币族金属表面观察 到吸附物种s e r s 信号的主要来源，该机制的增强因子可达1 0 6 。研究者们发现，由 于纳米粒子间局域电磁场的耦合效应( l s p ) ，在两个聚集的纳米粒子( n p s ) 间 将形成s e r s 增强的热点区域，在该区域的s e r s 增强因子甚至达到1 0 1 4 。如此巨大 的增强效应一直被认为是s e r s 进行单分子检测的必备条件【5 7 , 5 9 】。s e r s 的单分子检 测能力引发了一系列利用s e r s 进行与分子器件密切相关的金属分子金属结的研 究。 4 氨基苯硫酚( p a t p ) 因具有简单的分子结构，强吸附于币族金属表面( s - m 键) 以及强s e r s 信号等优点，已经成为一种广泛应用的s e r s 探针分子【6 卜 】。s e r s 谱图的电极电位和p h 依赖性表明汀p 分子近乎垂直吸附于金和银表面，并且在不 同p h 值下检测至l j p a t p 的苯式和醌式两种结构 6 1 , 6 2 】。同时，研究者们观察到s e r s 最强峰值出现的电极电位随着激发波长频率蓝移而正移，该现象清晰地表明存在 着由银到p a t p 分子的电荷传递过程【6 2 1 。因此，p a t p 常作为一种模型分子用于研究 几何和电子效应对e m 和c t 增强两种机制的影响 6 2 , 6 3 】。需要特别注意的是，由于处 于对角位置的巯基和氨基两种官能团都可以和金属作用而提供两种不同的键合位 点，因此p a t p 可作为一种理想的双官能团分子以研究光滑金或银表面和金或银 n p s 间( 或n p s 相互间) 的局域表面等离子体耦合效应【6 4 。6 7 】。研究结果表明：该三 明治结构将引发强局域电磁场增强效应，导致处于金属层内部的p a t p 分子拉曼信 号明显强于其仅通过巯基作用于单一表面的情况；同时，相对于a l 振动模式，b 2 振动模式的拉曼信号在该三明治结构中获得了额外的10 2 的增强，研究者们将此归 金属纳米分子结的形成及s e r s 生物传感器的研究 结于金属分子金属结结构中的电荷传递效应所产生的化学增强【“石6 1 。 基于上述p a t p 分子在不同金属表面或界面上吸附行为的研究，我们利用s e r s 技术系统研究了p a t p 在金纳米粒子表面的吸附行为。研究结果表明：在a un p s 表 面，相对于a l 振动模式，b 2 振动模式的拉曼强度都随激光功率的增加而显著提高。 通过考察激光照射时间，基底的表面形貌以及p a t p 在n p s 表面的覆盖度等因素的 影响，我们推测这样一种激光诱导的相对拉曼强度的变化不是源于激光热效应 6 8 - 6 9 】，而是光诱导r 盯p 分子在n p s 间形成分子结的结果。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂和仪器 氯金酸，柠檬酸钠，盐酸羟胺均购置上海国药化学试剂有限公司。4 巯基苯酚 ( p a t p ) 从a l d r i c h 购买。所有水溶液都使用电阻大于1 8 2q m 的超纯水配制。 拉曼光谱的采集在共焦显微拉曼仪( r a m l a b 0 1 0 ，j o b i ny v o n ，f r a n c e ) 上进 行。实验中，采用工作距离为8m m 的5 0 倍长焦镜头，该镜头所照射样品面积为 2g m x 2g m 见方。拉曼仪器狭缝宽度为1 0 0g m ，针孔大小则为1 0 0 0g m 。利用 j e m 1 0 0 c x i i 透射电镜和j s m 6 7 0 0 f s e m 扫描电镜( j e o l ，l t d ，j a p a n ) 获得各 种金和银n p s 的粒径分布和形貌。 2 2 2a un p s 的合成 我们根据b r u s t s c h i f f r i n 合成法【7 0 】制备粒径在2 5n m 左右的a un p s 。简言之， 将2m l 新鲜配制的1 0m m o ln a b h 4 水溶液快速加入到溶有1m m o lh a u c l 4 和1 m m o l4 巯基苯酚( p a t p ) 的5 0m l 甲醇溶液中，冰浴条件下搅拌3 小时；将得到 的黑色溶液真空抽干，然后分别用水和乙醚洗涤黑色残留物，以除去还原剂产物 和过量的p a t p ，所得到的黑色粉末即为p a t p 保护的a un p s 。透射电镜( t e m ) 结果表明该a un p s 的尺寸分布较宽，在2n m 到5n m 之间。 粒径在1 5n m 左右的a un p s 的制备则根据经典f r e n s 法【7 1 】：将3 7m l1 h a u c l 4 水溶液加入到9 0m l 水中加热至沸，然后迅速加入9m ll 柠檬酸钠水溶 液，并持续沸腾1 5 分钟，溶液颜色迅速由浅黄色至无色、黑色，最后得到酒红色 胶体溶液。该尺寸的n p s 将作为种子合成如下几种尺寸的a un p s 7 扪。 2 6n m 大小a un p s 的合成步骤如下：剧烈搅拌下，o 8m l1 h a u c l 4 水溶液 逐滴加入到含有2 0m l a u 种子溶液，2 4m l2 5m mn h 2 0 h 溶液以及5 6m l 水的溶 液中。维持搅拌1 0 分钟后即可得到粒径分布为2 6 + _ 4n m 的a un p s 。 类似地，0 9m l1 h a u c l 4 水溶液，10m l2 6n ma un p s 溶胶，9m l2 5m m n h 2 0 h 溶液和8 0m l 水混合搅拌将得到粒径在5 6 + _ 4n m 的a un p s ；0 6m l1 h a u c l 4 水溶液，4 0m l5 6n m a un p s 溶胶，2 2m l2 5m mn h 2 0 h 溶液和5 7 8m l 顶学位论文 水混合搅拌则得到粒径分布为7 0 士4n m 的a u n p s 。 图2 1a 和b 分别给出所制各的粒径为7 0 4n m 的a u n p s 大范围和小范围的 扫描电镜( s e m ) 图。可以明显观察到，经过上述三步种子法合成得到的a u n p s 大多数呈球形且尺寸分布均匀。在单晶s i 表面，a u n p s 倾向于形成亚单层聚集体， 在某些位点偶尔出现多层聚集体。虽然，相比于其他经典的表面自组装方法f 6 “， 这里所得到的n p s 自组装层并不是很均匀，然而这些聚集体中紧密靠拢的n p s 可 能更有效诱发粒子间局域表面等离子体耦合而产生更强的s e r s 信号，特别是对 于处在n p s 间的分子而言。对于其他粒径的a u n p s ，我们观察到了类似的表面形 貌，这里不再赘述。 b ) 图2 1a ) 和b ) 分别是粒径为7 0 4n m 的a u n p s 在大范围和小范围的s e m 图。 根据s e m 成像图，我们通过测量至少3 0 0 个n p s 的尺寸绘制统计分布圈， 获得了上述四种a u n p s 各自的粒径分布，如图2 2 所示。可以明显观察到它们的 粒径分布都比较窄，这一特点使得我们可以更好地分析s e r s 谱图的n p s 尺寸