（预防兽医学专业论文）产紫杉醇菌株原生质体诱变育种及其生物合成调控的研究.pdf

内容摘要 肿瘤和癌症是目前严重威胁人类生命的顽症之一。对于人类 来说，这是仅次于心脑血管疾病的第二大死因。长期以来，世界 各国的许多学者对于各种癌症的防治进行了种种尝试与探索，但 结果都不甚令人满意。目前，紫杉醇己被国内外一致公认为是一 类对多种癌症具有显效乃至特效的抗癌新药。因此，采取各种途 径生产紫杉醇已经成为国内外紫杉醇研究和规模开发的热点。与 其它方法相比，微生物发酵法生产紫杉醇的优势是显而易见的。 本试验采用单因子试验设计方法，对影响紫杉醇产生菌u v 4 0 棚 合成紫杉醇的培养温度、发酵液初始p h 、摇床转数进行了探讨， 确定了最佳培养条件；通过单因子和正交试验设计研究了前体 物、诱导子和抑制剂及其协同对紫杉醇产生菌合成紫杉醇的调控 作用。同时，对紫杉醇菌株u v 。o m 的原生质体制备、再生及紫外 线和亚硝基胍复合诱变育种进行了研究，筛选潮霉素抗性突变 株。另外，通过同工酶技术、r a p d 、a f l p 和i t s 序列分析对出 发菌株n c e u 1 与两高产株u v 4 0 - 1 9 和u l 5 0 6 间的遗传差异进行了 研究。此外，利用s o u t h e r nb l o t t i n g 技术对细胞培养中紫杉二烯 合成酶是否也存在于通过微生物发酵法生产紫杉醇的生物合成 途径中进行了初探。目前，在利用紫杉醇产生菌合成紫杉醇的研 究领域内，尚未见有关本试验研究方面的报道。因此，本试验在 这几方面研究取得的突破性进展，为通过微生物发酵法生产抗癌 药物紫杉醇的生物合成调控和构建高产基因工程菌株提供了强 有力的理论指导；为早日实现利用微生物发酵法生产抗癌药物紫 杉醇的工业化生产、创造巨大经济效益和社会效益展示了美好的 前景。 本试验的主要研究结果如下： 1 、紫杉醇产生菌u v 。1 9 生物合成紫杉醇的最佳发酵培养条 件为：s 7 发酵液初始p h 5 5 ，摇床温度2 5 ，摇床转速1 5 0 r m i n ； 2 、向s 7 发酵培养基添加适当浓度的前体物、代谢旁路抑制 剂和诱导子对微生物发酵法生产紫杉醇的合成代谢进行综合调 控可以大大提高紫杉醇的产量； 3 、采用试验得出的最佳发酵培养条件，以筛选出的优化培养 基作为发酵培养基，菌株u v 。m 发酵液中紫杉醇含量为 4 9 3 7 4 p g l ，是改良s ，7 发酵培养基的1 2 5 倍； 4 、n o d u l i s p o r i u ms y l v i f o r m e 紫杉醇产生菌u v 4 0 1 9 原生质体制 备及再生的最佳条件为：每2 5 0 m g 湿菌丝体加酶液l m l ( o 7 m o l l n a c i 配制由3 溶壁酶+ 3 纤维素酶+ 4 蜗牛酶+ 1 的溶菌酶组 成的复合酶系，p h 5 5 6 o ) 一3 0 振荡酶解5 h 一酶解液用三层 无菌镜头纸过滤- - - * 3 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，收集原生质体；将获得 的原生质体在含n a c l ：k c l ：葡萄糖( 5 ：3 ：2 ，v v v ，终浓度均 为0 7 m o l l ) 的p d a 再生培养基上，采用双层平板培养法再生制 备到的原生质体； 5 、n o d u l i s p o r i u ms y l v i f o r m e 紫杉醇产生菌u v 4 0 1 9 原生质体诱 变的适宜条件为：将原生质体悬液经过0 8 m g m ln t g 、处理 1 5 m i n 后，在电磁搅拌下，用紫外灯( 3 0 w ，距离3 0 c m ) 照射处 理4 0 s ： 6 、在潮霉素含量为9 0 1 x g m l 的抗性平皿中筛选出了一株高产 紫杉醇的原生质体诱变菌株一u n o ”，其产量从出发菌株紫杉醇 的产量( 3 7 6 3 8 4 - 8 4 1 ) p g l 提高至( 4 7 8 1 2 0 - 1 1 3 6 ) i x g l ； 7 、探索出了一种新的、快速而高效的树状多节孢紫杉醇产生 菌基因组d n a 的提取方法； 8 、通过同工酶技术、r a p d 、a f l p 和i t s 序列分析表明， 出发菌株与诱变菌株之间以及两诱变菌株之间都存在明显差异， 为进一步研究与紫杉醇生物合成相关基因及诱变株产量提高的 分子机制奠定了基础； 9 、从东北红豆杉( t a x u sc u s p i d a t a ) 树叶中获得了紫杉二烯 合成酶基因片段克隆，用g e n b a n k ( h t t p w w w n c b i n l m n i h g o v ) 中的b l a s t 程序对此个序列与g e n b a n k 中收录的序列进行了同源 性比较，同源性达到9 8 ； i o 、首次证实了紫杉二烯合成酶基因也存在于紫杉醇产生菌 树状多节孢n o d u l i s p o r i u ms y l v i f o r i n d 这类丝状半知菌中，这 预示紫杉二烯合成酶也存在于通过微生物发酵法生产紫杉醇的 生物合成途径中。 关键词紫杉醇；紫杉醇产生菌；发酵；培养基优化；原生质 体诱变；遗传差异；s o u t h e r n 杂交 a b s t r a c t n o w a d a y s ，t u m o r sa n dc a n c e r ss e r i o u s l yt h r e a t e nh u m a n sl i f e ， a n dt h e ya r eo n eo ft h ep e r s i s t e n ta i l m e n t s f o rt h eh u m a nb e i n g ，i t i st h es e c o n dm a i nc a u s eo fd e a t ht h a ti sj u s ta f t e rh e a r ta n db r a i n b l o o dv e s s e ld i s e a s e s f o ral o n gt i m e ，s c h o l a r sm a d em a n ya t t e m p t s a n de x p l o r a t i o n st o p r e v e n ta n dc u r e a l lk i n d so fc a n c e r si nt h e w o r l d ，b u tt h e i rr e s u l t sw e r ed i s s a t i s f a c t o r y n o w ，i ti sb e l i e v e dt h a t t h et a x o li san e wk i n do fa n t i c a n c e rd r u g ，a n di ti sv e r ye f f e c t i v e f o rm a n yk i n d so fc a n c e r s t h e r e f o r e ，t h ep r o d u c t i o no ft a x o l b e c o m e sah o t s p o ti nt h ef i e l do fr e s e a r c ha n de x p l o i t a t i o no ft a x o l a r o u n dt h ew o r l d c o m p a r e dw i t ho t h e rm e t h o d so fp r o d u c i n gt a x o l ， t h ea d v a n t a g eo fu s i n gm i c r o b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o nt op r o d u c e t a x o ti sm u c hm o r es u p e r i o r i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ef e r m e n t a t i o no f t a x o l p r o d u c i n gf u n g u su v 4 0 1 9w a si n v e s t i g a t e dt h r o u g hs i n g l e f a c t o rt e s t ，a n dt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o b t a i n e d ：t h ee f f e c t so fp r e c u r s o r s ，e l i c i t o r s ，i n h i b i t o r sa n dt h e i r c o o p e r a t i o no nt h er e g u l a t i o no ft a x o lb i o s y n t h e s i sw e r es t u d i e db y u s i n g b o t hs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l d e s i g ne x p e r i m e n t ， r e s p e c t i v e l y ；a tt h es a m et i m e ，t h eb r e e d i n go fh i g h y i e l ds t r a i no f t a x o lw a sp e r f o r m e db yp r o t o p l a s tm u t a g e n s i so fs t r a i nu v 4 0 1 9u s i n g c o m b i n e dt r e a t m e n to fu va n dn t g ；i na d d t i o n ，g e n e t i cd i f f e r e n c e s b e t w e e nt h em u t a n t su v 4 0 1 9 ，u l s 0 6a n dt h e i rp a r e n ts t r a i nn c e u 一1 w e r ep r i m a r i l yc o m p a r e dt h r o u g hr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i e d n a ( r a p d ) ，a f l p ，i t ss e q u e n c ea n di s o z y m et e c h n i q u e ； m o r e o v e r ，i tw a sp r i m a r i l yd i s c u s s e dt h a ti ft a x a d i e n es y n t h a s ea l s o e x i s t e di nt h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fm i c r o b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o n m e t h o dt op r o d u c ea n t i d r u gt a x o lb ys o u t h e r nb l o t t i n g i nt h ef i e l d o fu s i n g t a x o l - p r o d u c i n gf u n g i t o p r o d u c et a x o l ，t h er e p o r t c o r r e l a t i v et ot h ee x p e r i m e n th a sn o tb e e nf o u n d y e t t h e r e f o r e ，t h e p r o g r e s s w em a d e p r o v i d e s a s t r o n ga c a d e m i cg u i d a n c ef o r r e g u l a t i o no ft a x o lb i o s y n t h e s i sa n db u i l d i n gh i g h y i e l ds t r a i no f t a x o lb ym i c r o b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o nm e t h o dt op r o d u c ea n t i d r u g t a x o l ；a tt h es a m et i m e ，i ts h o w sag r e a tp r o s p e c tf o rp r o d u c i n gt a x o l i n d u s t r i a l l ya n dc r e a t i n ge n o r m o u se c o n o m i ca n ds o c i a lb e n e f i ti n t h en e a rf u t u r e t h em a i nr e s u l t so ft h ee x p e r i m e n tw e r el i s t e db e l o w 1 、t h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r e ：f e r m e n t a t i o n l i q u i d i n i t i a lp hv a l u e5 5 ，c u l t u r e t e m p e r a t u r e2 5 c ，r o t a t i o n a l s p e e d15 0 r m i n ； 2 、t h es y n t h e s e so ft a x o lw a s s i g n i f i c a n t l yp r o m o t e db ya d d i n g s o n l ep r e c u r s o r s ，e l i c i t o r sa n di n h i b i t o r si n t ot h es 7m e d i u mw i t h a na p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o n ； 3 、t h eo p t i m i z e dm e d i u ma l l o w e dt h ey i e l do ft a x o lt ob e i n c r e a s e df r o m39 6 4 3i - t g lt o4 9 3 7 4 _ t g l ： 4 、t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h ep r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o n o ft h en o d u l i s p o r i u ms y l v i f o r m et a x o lp r o d u c i n gf u n g u su v 4 0 19 w e r e3 l y w a l l z y m e + 4 s n a i l a s e + 1 l y s o z y m e + 3 c e l l u l o s ea t 3 0 c b a t h ，p h 5 5 6 0w i t he n z y m o l y s i st i m ea t5h o u r s ，t h e nt h e p r o t o p l a s t sw e f ec o l l e c t e da n dc u l t u r e do nt h ep d ar e g e n e r a t i o n m e d i u mc o m p o s e do fn a c i ：k c i ：g l u c o s e ( 5 ：3 ：2 ，v ? v 沁tf i n a l c o n c e n t r a t i o no 7 m o l l ) b yb i l a y e r p l a t ec u l t u r e ； 5 、t h es u i t a b l ec o n d i t i o n sf o rt h e m u t a g e n e s i so ft h e n o d u l i s p o r i u ms y l v b r m et a x o lp r o d u c i n gf u n g u su v 4 0 19w a sa s f o l l o w s ：t h ep r o t o p t a s ts u s p e n s i o nw a st r e a t e dw i t h0 8 m g m ln t g f o r15 m i n ；t h e ni r r a d i a t e db yu v ( 3 0 w , 3 0 c m a w a y ) f o r4 0 su n d e r m a g n e t i cs t i r r i n g ； 6 、t h em u t a g e n e s i ss t r a i n ，u n 0 5 6 ，w h i c h w a ss t a b l e h e r e d i t a r i l yw i t ht a x o lo u t p u ta t ( 4 7 8 1 2 士11 36 ) l ，t g l ，w a ss c r e e n e d f r o mr e s i s t a n c ep l a t ec o n t a i n i n g9 0 m g m ln t g ； 7 、an e w ， q u i c ka n de f f e c t i v e m e t h o dw a se x p l o r e df o r e x t r a c t i n gg e n o m e d n ao fn o d u l i s p o r i u ms y l v i f o r m e t a x 0 1 p r o d u c i n gf u n g u si nt h es t u d y ； 8 、t h eg e n e t i cd i f f e r e n c e sw e r ev e r yo b v i o u s l yb e t w e e nt h e p a r e n ts t r a i na n d i t sm u t a n t sa n db e t w e e nt h et w om u t a n t s w h i c h l a i df 0 帖n d a t i o no fm o l e c u l a rm e c h a n i s mf o rt h e s t u d yo fg e n e s r e l a t e dt ot h et a x o lb i o s y n t h e s i sa n dm u t a n t sf o rr a i s i n gt h et a x o l y i e l d ； 9 、t h eg e n ef r a g m e n to ft a x a d i e n es y n t h a s ew a sc l o n e df r o m t a x u sc u s p i d a t e t h es e q u e n c ew a sa n a l y z e db yb l a s tp r o g r a mo n n c b ig e n e b a n k d a t a b a s e ，a n d i tw a sc o m p a r e dw i t h t h e h o m 0 1 0 9 0 u ss e q u e n c e sc o l l e c t e df r o m g e n e b a n k t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h es e q u e n c et h a tw a sc l o n e di n t h ee x p e r i m e n th a dh i g h l y h o m o l o g o u sw i t hs e q u e n c e s ( 9 8 ) c o l l e c t e d f r o mg e n e b a n k ； 10 、i tw a sv e r i f i e dt h a tt a x a d i e n es y n t h a s ea l s oe x i s t e di n t h e b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fu s i n gm i c r o b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o n m e t h o d t op r o d u c ea n t i d r u gt a x o lf o rt h ef i r s tt i m e k e v w o r d s ：t a x o l ，t a x o lp r o d u c i n gf u n g i ，f e r m e n t a t i o n m e d i u m o 口t i m i z a t i o n ，p r o t o p l a s tm u t a g e n s i s ， g e n e t i c d i f f e r e n c e ， s o u t h e r n b l o t t i n g 1 引言 1 1 课题研究背景、立题依据及研究意义 据w h o 统计，1 9 9 6 年以来，全球每年新增癌症患者达1 0 0 0 万人以上，死亡达7 0 0 多万人，到2 0 0 0 年癌症死亡患者增至8 0 0 万人。我国的癌症发病率也同样十分惊人，据国家卫生部统计， 九十年代我国癌症发病率已上升到o 1 2 7 。预计在2 1 世纪，癌 症将成为人类的“第一杀手”。众所周知，长期以来医学界对这种 疾病治疗尚缺少良策，在其治疗上取得的进展极小。 紫杉醇一种疗效显著的抗癌药物，它是一类具有三环五甲基 十五碳烯骨架的二萜紫杉烷的典型代表。多年来，科学家们围绕 红豆杉的化学合成、红豆杉细胞和组织培养、植物内生真菌发酵 和紫杉醇生物合成途径( 包括生物合成基因) 等方面进行了积极 探索并在某些方面取得了可喜的进展，但这些成果目前仍停留在 实验室阶段。迄今尚未见用其他方法工业化生产紫杉醇的报道， 原因主要是：天然红豆杉资源是有限的，直接砍伐濒危的红豆杉 植物提取紫杉醇只能满足短期的需求，同时造成对人类生态环境 的破坏，所以这一途径已不可能；人工栽培法虽可部分缓解紫杉 醇资源的匮乏，但如果不从根本上解决红豆杉生长缓慢且紫杉醇 的含量极低的问题，能否解决紫杉醇资源的供需矛盾还是个问 题；全合成紫杉醇步骤复杂、收率低、费用高，只有理论意义， 尚无开发价值；红豆杉细胞培养方法虽具有不受季节、场地等限 制，可连续无限生产，产品后处理简单等优势，但目前产量仍然 不高并且产量不稳定是细胞培养面临的巨大难题，离商业化生产 还有一定距离。 植物内生真菌发酵生产紫杉醇具有其他方法不可比拟的优 势，但目前菌株合成紫杉醇的水平还难以达到工厂化生产的要 求，因此，高产菌株的选育成为当前的首要的任务。目前工业菌 株的选育已由传统的诱变选育向利用基因工程、代谢工程手段定 向设计、改造菌株，菌株选育速度显著加快。但是，后者的成功 实施是建立在对产物的生物合成途径的清晰了解的基础之上的。 迄今有关微生物合成紫杉醇的代谢途径仍是空白，微生物合成紫 杉醇的途径不明已极大的制约了高产菌种构建以及代谢调控等 方面的研究。因此，阐明微生物合成紫杉醇的途径，是目前最急 需解决的问题，不仅具有重大的实践价值，其理论意义无疑也是 十分巨大的。 本项目研究将为开辟植物内生真菌发酵法生产抗癌药物紫 杉醇的代谢途径提供可靠的支持；同时，将为阐明微生物合成紫 杉醇的途径、通过基因工程手段构建紫杉醇高产工程菌株奠定坚 实的理论基础。 1 2 文献综述 1 2 1 紫杉醇概述 紫杉醇( t a x 0 1 ) 是6 0 年代美国肿瘤研究所( n a t i o n a lc a n c e r i n s t i t u t e ) 用生物活性测试跟踪大量筛选抗癌活性成分的成就，对 3 5 0 0 0 种植物的几万个化合物筛选结果，紫杉醇最有希望。虽然 w a n i 等在1 9 7 1 年就公布了从短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 树 皮中分离紫杉醇，并发现其对p 3 8 8 和p 1 5 3 4 白血病有很高活性， 抑制w 2 5 6 肉瘤活性也很好。也许因其含量很低，分离纯化困难， 而且结构十分复杂较难合成，最初他们并没有申请专利，也未引 起人们过多的注意。直到7 0 年代后期h o r w i t z 等发现紫杉醇与所 有其它抗癌药物的作用机制不同，紫杉醇是通过抑制肿瘤细胞的 微管解聚作用，使纺锤体和纺锤丝难以形成，使细胞增殖周期限 制在g ：晚期和m 期，从而抑制细胞的有丝分裂，最终导致肿瘤 细胞的凋亡。这一独特的作用机制引起了人们的极大兴趣，经过 3 0 多年的药理、毒理、药效和近十五年的临床实践，该药的治疗 范围已拓宽到晚期乳腺癌、非小叶性肺癌、头颈部癌、软组织肉 瘤、消化道癌等多种重症癌症病人的治疗。近几年的研究还表明， 它在艾滋病，多发性硬化症等顽症的治疗方面显示潜力，被公认 为是最有发展前途的抗癌新药。1 9 9 2 年布迈施贵宝公司从太平洋 紫杉树皮中提取所得的天然紫杉醇被美国食品药品监督管理局 ( f d a ) 首次批准用于其它化疗药难治的转移性卵巢癌，后又批 准其用于铂类药物化疗无效的晚期转移性乳腺癌，其英文名为 p a c l i t a x e l ，商品名为t a x o l 、泰素，分子式为c 4 7 h 5 l n o l 4 ，分子 量为8 5 3 9 2 ，紫杉醇的结构式见图1 - 1 ( 包括平面和三维结构) ， 为三环二萜类化合物。抗癌新秀紫杉醇自投放市场后，其市场销 售额每年以两位数增长并高居抗肿瘤药之首，1 9 9 6 年紫杉醇的全 球销售额已达8 亿美元( 其中美国本土为5 亿美元) 。1 9 9 8 已超 过1 2 亿美元年。2 0 0 2 年紫杉醇类药品的全球销售售额合计已达 2 3 亿美元，约占当年世界抗肿瘤药市场( 1 6 5 亿美元) 的1 5 。 目前已有5 0 多个国家已批准销售合成紫杉醇。据美国国家癌症研 究所( n c i ) 预测，在今后1 0 n 1 5 年内紫杉醇将成为抗癌首选药 物之一。 图1 - 1 紫杉醇的结构 f i g l - 1t h es t r u c t u r eo f t a x o l 1 2 2 生物技术生产紫杉醇的研究现状 紫杉醇( t a x 0 1 ) 是一种植物源性抗癌新药。由于其独特的作 用机理及对各种癌症和其它疾病的特殊疗效，自问世以来一直受 到各领域研究者的重视。但由于紫杉醇在植物中的含量极低，即 使含量相对较高的树皮，紫杉醇的含量也仅为干重的o 0 0 5 o 0 1 。据估算，目前全球仅美国每年2 5 0k g 紫杉醇需求量，按 现在的提取纯化技术，需要2 5 0 0 0 吨干树皮，这意味着要砍伐1 0 0 万棵6 0 年以上红豆杉大树。随着紫杉醇应用范围的扩大，其需 求量将逐年增加，预计到2 0 3 0 年，全球对紫杉醇的需求量将达 到7 0 0k g ，紫杉醇将成为最昂贵的药物之一。然而红豆杉树生长 速度极为缓慢，直径2 0 c m 的树需生长1 0 0 年。因此，伐树生产 紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布，也远远不 能满足人们对紫杉醇日益增长的需要( 全世晃紫杉醇的需求量约 为3 0 0 0k g 年，而产量只有到5 0 0k g 年) 。 在紫杉醇独特抗癌作用和资源匮乏的双重压力下，紫杉醇药 品价格极为昂贵，1 9 9 5 年紫杉醇原料药的市场价格为5 0 0 6 0 0 万元人民币公斤，最高到达8 0 0 1 1 0 0 万人民币。在高昂价格的 吸引下，中国、阿根廷、墨西哥、印度、韩国等国家都加入到紫 杉醇出口国行列。由于紫杉醇产量增加，出口竞争日趋激烈，2 0 0 3 年国际市场上紫杉醇平均价格只有2 2 万美元左右( 我国2 0 0 3 年 秋季广交会上9 9 5 纯度1 3 服粉剂紫杉醇只卖1 9 万美元k g ) 。尽 管目前国际市场上紫杉醇价跌，但它仍是一种富有朝气的天然抗 癌药。因为迄今为止还没有一种天然抗癌药的临床效果能超越紫 杉醇。在可以预见的将来，紫杉醇的销售量与销售额仍将上升， 市场价格将继续下降。 由于直接从天然红豆杉中提取紫杉醇，特别是从树皮中提取 紫杉醇导致原本稀少的天然红豆杉资源濒临灭绝，被列入国家保 护范围，严禁砍伐，因此如何在保护天然红豆杉资源的同时，满 足日益增加的紫杉醇需求，解决紫杉醇的药源问题，成为一个十 分活跃的研究领域。多年来，通过生物技术合成紫杉醇，寻找替 代野生材料提取紫杉醇的资源已成为国内外紫杉醇研究和规模 开发的热点。为此，许多学者开始研究种种新途径。目前，国内 外探索的主要途径有：红豆杉细胞培养、化学全合成或半合成、 遗传转化、产紫杉醇植物内生真菌的发酵培养和遗传改性等。尖 锐的供需矛盾在医学、化学和生物学领域中引起了一场非同寻常 的广泛研究，以增加这种抗癌化合物的来源，这也是本课题研究 的目标。以下综述有关通过生物技术合成紫杉醇的研究现状。 1 2 ，2 1 化学全合成和半合成 1 2 2 1 1 化学全合成 化学全合成方法是解决紫杉醇来源的理想途径。同时，合成 紫杉醇这复杂的天然分子是有机合成化学家所耍临的巨大挑 战。紫杉醇的全合成引起了全世界许多有机化学家的兴趣。据统 计，到1 9 9 3 年，全世界就有5 0 多个研究小组从事于紫杉醇的全 合成工作( w e n d e r 等，1 9 9 5 ) 。经过2 0 多年的努力，于1 9 9 4 年 由美国的h o l t o n 研究组完成了紫杉醇的全合成。随后， d a n i s h e f s k y 研究组( 1 9 9 6 ) 、w e n d e r 研究组( 1 9 9 7 ) 等也完成了 这一工作。 紫杉醇的化学全合成虽然有多个研究组取得成功，但多数合 成路线过长，需经过几十步复杂的化学反应过程，且合成要求条 件高及成本过高，目前尚无法实现商业化生产。 1 2 2 1 2 紫杉醇的半合成 化学半合成则是以红豆杉中含量相对丰富的1 0 d a b 为原 料，通过化学修饰来生产紫杉醇。红豆杉中1 0 - d a b 的含量约等 于紫杉醇的3 倍左右，并且在枝叶中含量相对较高，因此采集红 豆杉枝叶提取1 0 d a b ，然后通过化学半合成方法生产紫杉醇是 目前最有效的紫杉醇供应途径，但该方法难以摆脱对红豆杉的原 料依赖。 现在，紫杉醇半合成的前体已不限于b a c c a t i ni l l 和1 0 - d a b ， r a o 等( 1 9 9 5 ) 用l o 去乙酰紫杉醇作为前体半合成了紫杉醇。 b a c c a t i ni i i 和1 0 d a b 在红豆杉属植物中含量远远高于紫杉醇， 在短叶红豆杉中，b a c c a t i ni i i 的含量可达o 2 ，1 0 d a b 在欧洲 红豆杉中的含量为0 1 ，这为紫杉醇的半合成提供了相对较为丰 富的前体。 1 2 2 2 红豆杉细胞培养 植物细胞和组织培养生产紫杉醇已成为目前紫杉醇药源开 发的研究热点之一。相对于半合成法，该方法可以完全摆脱对红 豆杉的依赖，摆脱了气候等因素的影响，可以实现紫杉醇的长期 稳定生产；该方法更容易进行工业化大生产，可以方便的调节产 量适应市场需求的变化。更值得关注的是，细胞培养体系可以方 便地控制细胞的微环境，通过向培养体系中添加前体物、代谢旁 路抑制剂和诱导子，可显著促进细胞内紫杉醇的合成。植物细胞 培养方法，尤其是与代谢调控和基因工程方面的研究成果相结 合，将是最具有潜力的紫杉醇药源供应途径。美国p h y t o n c a t a l y t i c 和韩国s a r m y a n g 公司等均致力于利用红豆杉细胞培养商业化生 产紫杉醇的研究，并取得了重要进展。虽然在韩国已经实现工业 化生产，但由于红豆杉细胞中紫杉醇含量非常低，造成生产成本 过高，目前还难以成为主流的供应途径。 虽然红豆杉细胞培养生产紫杉醇取得了很大的进展，有的已 达到中试规模，但植物细胞遗传与生理的不稳定性、细胞间的不 一致性使得在培养过程中高产细胞系不能实现高产率，而且易发 生遗传变异产生其他代谢产物；另外，植物细胞培养技术较复杂， 对反应器及培养基的成分要求较高，价格昂贵等阻碍了通过红豆 杉细胞培养工业化生产紫杉醇的实现。 1 2 2 3 红豆杉的器官培养 1 ) 胚胎培养 1 9 7 0 年，l e p a g e d e g i v r y 首先报道了t b a c c a t a 胚胎培养的 研究工作。近2 0 年来，学者们等对多种红豆杉胚胎培养进行了 研究( f l o r e s 等，1 9 9 1 ，1 9 9 3 ；h u 等，1 9 9 2 ；c h e e ，1 9 9 5 ；) 。目 前，物种离体培养胚胎的萌发率已达到1 0 0 ( z h i r i ，1 9 9 4 ) 。在 短时间内，利用红豆杉胚胎培养可以获得一定数量的小苗，并有 望从中选择出紫杉醇含量高的个体。目前利用胚胎培养还不能进 行红豆杉的大量、快速繁殖，但是利用胚胎培养所获得的优良个 体作为育种和细胞、组织培养的超始材料仍有一定意义。 2 ) 毛状根培养 e r m a n n o 等( 1 9 9 4 ) 利用根癌农杆菌1 5 8 3 4 侵染东北红豆杉 的叶片获得了毛状根并从中提取到了紫杉醇。r i c h a r d 等( 1 9 9 3 ) 在其专利中报道，发根农杆菌转化短叶红豆杉形成毛状根并产生 紫杉醇。另有专利报道，利用发根农杆菌a 4 、1 5 8 3 4 等菌株能转 化中国红豆杉、短叶红豆杉的愈伤组织形成毛状根并产生紫杉 醇，经紫杉醇单克隆抗体酶联免疫反应检测，毛状根中紫杉醇含 量比用组织和细胞培养方法最多提高了5 0 倍( h a m a d a 等，1 9 9 5 ) 。 黄遵锡等( 1 9 9 7 ) 用发根农杆菌a 4 感染短叶红豆杉芽外植体， 诱导出毛状根，其生长速度是同等条件下短叶红豆杉愈伤组织的 2 9 倍，经紫杉醇单克隆抗体酶联免疫反应检测，毛状根中含有 紫杉醇，其含量为短叶红豆杉愈伤组织的1 3 8 0 倍。这些研究 展示了毛状根培养生产将是解决紫杉醇药源的又一新途径。今 后，如果毛状根在大型生物反应器中大规模培养技术取得突破， 那么利用红豆杉毛状根大规模培养生产紫杉醇将呈现出十分诱 人的前景。 3 ) 冠缨组织培养 h a n 等( 1 9 9 4 ) 用b 0 5 4 2 菌对短叶红豆杉和欧洲红豆杉的外 植体进行了遗传转化，得到了冠缨组织，转化率分别为8 6 和 2 8 3 。盛长忠等( 1 9 9 9 ) 以土壤农杆菌c 5 8 转化东北红豆杉的 愈伤组织，获得了冠缨组织，转化率最高可达1 5 0 。获得的冠 缨组织生长速度显著快于愈伤组织，培养4 0 d 的冠缨组织经h p l c 测定，可产紫杉醇，含量为0 0 0 1 3 。虽然低于同期愈伤组织中 紫杉醇的含量，但在实验中发现冠缨组织对外源诱导子和前体物 质比愈伤组织敏感得多，因而向培养基中添加这些物质可以大幅 度增加紫杉醇的产量。 冠缨组织培养具有培养基成分简单，成本低、免除了外源激 素对组织的伤害和对植物细胞次级代谢的影响及对培养条件的 改变比较敏感等特点，有望成为大量生产紫杉醇的新方法。 1 2 2 4 基因工程 已有证据表明，紫杉二烯合成酶是紫杉醇生物合成的限速 酶。但由于紫杉二烯合成酶活力很低，性质惰性。因此，确定此 合成酶基因序列后，可以采用基因工程方法提高该酶活性；可以 通过对基因的启动子进行置换，构建强有力的组成型启动子，使 限速酶在转基因细胞中高效表达；也可以采用激活剂激活该酶的 基因转录，提高基因的拷贝数；还可以采用基因突变的方法，改 变该酶的关键基因，从而提高该酶基因的表达。这样可以从根本 上解决紫杉二烯合成酶活力低的难题，大幅度提高紫杉烷骨架的 合成量，进而打破紫杉醇骨架合成反应的瓶颈步骤。由此可见， 通过基因工程提高细胞中紫杉醇的产量是一条十分诱人的途径， 但是由于紫杉醇生物合成的具体步骤还不完全清楚，加上紫杉醇 合成可能需要多个基因参与等原因，有关基因工程的研究还仅处 于初始的探索阶段，有许多工作尚未真正开始研究。 1 2 。2 5 微生物发酵法生产紫杉醇 1 2 ，2 5 1 产紫杉醇的内生真菌的分离研究现状 1 9 9 3 年，美国蒙塔那( m o n t a n a ) 州立大学化学家s t i e r l e 和 植物病理学家s t r o b e l 在蒙塔那西北部国家冰川公园的短叶红豆 杉中分离到一株内生真菌t a x o m y c e sa n d r e a n a e ，利用质谱、免疫 化学、色谱和放射性化学标记等方法证实此种内生真菌能产生紫 杉醇。尽管此菌产紫杉醇的量很低，3 周培养物中紫杉醇的含量 只有2 4 5 0 n g l ，但这一发现开创了利用微生物生产紫杉醇的新 途径。此后，国内外学者陆续从多种红豆杉属植物中分离到可产 紫杉醇的内生真菌。1 9 9 6 年，s t r o b e l 等又在喜马拉雅山海拔 1 5 0 0 3 0 0 0 m 的丘陵地带的西藏红豆杉( zw a l l a c h i a n a ) 的小枝 中分离出可产紫杉醇的内生真菌，该菌被鉴定为小孢盘多毛孢 ( p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a ) 。目前，这方面的研究工作取得了相 当进展，除了短叶红豆杉、西藏红豆杉外，云南红豆杉、南方红 豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉等红豆杉属植物内生真菌产紫杉 醇的研究均有报道。另外，在一些非红豆杉属植物中也分离到了 产紫杉醇的内生真菌。s t r o b e l 等( 1 9 9 7 ) 从一种松树( w o l l e m i a n o b i l i s ) 分离到产紫杉醇内生真菌p e s t a l o t i o p s i sg u e p i n i 。l i 等 ( 1 9 9 8 ) 从秃柏( t a x o d i u md i s t i c h u m ) 的树皮、韧皮部和木质部 都分离到产紫杉醇的内生真菌p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a ，其中有 些菌株能够产生紫杉醇，产量为1 4 1 4 8 7 n g l 。此外，s t r o b e | 等( 1 9 9 6 a ；1 9 9 6 b ；1 9 9 9 ) ，k i m 等( 1 9 9 9 ) 分别在多种红豆杉树、 秃柏树等分离到多种可产紫杉醇的内生真菌，已经鉴定清楚的有 1 0 个属，证实了其物种的多样性，其产量水平多为8 8 9 5 n g l 之间，最高的为s t r o b e l ( 1 9 9 6 b ) 报道的p m i c r o s p o r a ，其紫杉醇 产量为6 0 7 0 1 a g l 。 我国学者在分离产紫杉醇内生真菌的研究中也取得了可喜 的进展。1 9 9 4 年，邱德有等从云南红豆杉( zy u n n a n e n s i s ) 的树 皮中分离出8 0 多株真菌，其中一株可产紫杉醇。张理珉等( 1 9 9 8 ) 从云南红豆杉树皮分离出可产紫杉醇的内生真菌；马天有等 ( 1 9 9 9 ) 从中国红豆杉( zc h i n e n s i s ) 树皮中分离得到一株内生 真菌，能产紫杉醇，产量为1 4 2 0 9 9 l 。王伟等( 1 9 9 9 ) 从南方 红豆杉的主干和侧枝树皮及皮下部分分离得到9 l 株菌，其中6 株能分泌紫杉烷类化合物。王建锋等( 1 9 9 9 ) 也从南方红豆杉皮 层中分离到一株瘤座孢菌，发酵产物分析表明可产紫杉醇，产量 为1 8 5 4 t t g l 。1 9 9 3 年，周东坡等从东北红豆杉( zc u s p i d a t a ) 的枝条与树皮中分离3 株可产紫杉醇的内生真菌，后来又分离到 l 株，其中2 株菌被鉴定为树状多节孢( n o d u l i s p o r i u ms y l v i f o r m e ) ， 为我国的新记录属、新记录种( 周东坡等，2 0 0 l a ，2 0 0 1 b ) ，发酵 液中紫杉醇的产量可达5 1 0 6 1 2 5 7 0 i _ t g l 。此菌株后经一系列的 诱变育种和选育，获得了一株高产工程菌株，此高产工程菌株的 紫杉醇产量有了大幅度的提高，达到了4 4 8 5 2 i t g l ，这标志着向 通过微生物发酵工业化生产抗癌药物紫杉醇迈进了一大步。 以上这些事实说明，产紫杉醇的内生真菌不仅能在红豆杉属 植物中找到，同时，也能在其它非红豆杉属植物中找到，从而 进一步拓宽了产紫杉醇内生真菌的研究范围。 1 2 2 5 2 微生物发酵法生产紫杉醇的优势 与其它方法相比，微生物发酵法生产紫杉醇具有如下优点： 1 ) 生产的可重复性，在工业上可用发酵罐大规模进行生产， 微生物的生长速率较高，易于缩短生产周期： 2 ) 微生物的发酵生