（化学工艺专业论文）无皂法亲和高分子乳液微球的分子构筑及表征.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 亲和高分子乳液微球是在高分子乳液微球的表面固定具有特定的亲和配位 关系的分子或基团，如蛋白质、酶、药物分子等生物活性物质，利用这些活性物 质与目标物质间的亲和配位关系，选择性地吸附并最终分离出目标物质的一类功 能高分子微球。亲和高分子乳液微球主要由高分子载体微球和固定于载体上的生 物活性物质组成。亲和高分子乳液微球不仅具有高效、稳定、功能多样等高分子 微球的通有特征【1 1 ，而且具有机械性能强、非特异性吸附少，反应灵敏、生物相 容性能良好、可循环使用、对环境污染小等特有的优点，因此，在诸如药物快速 评价、免疫抗体识别和d n a 诊断等领域有很高的应用价值。 本研究选择苯乙烯s t 和甲基丙烯酸环氧丙酯g m a 为单体，以两性偶氮类 化合物v 5 0 为引发剂，运用功能单体多段加料的无皂乳液聚合法制备了亲和高 分子乳液基球p s g ；并采用双氨基封端的聚乙二醇作为空间臂分子，进行表面修 饰反应，以降低其空间位阻效应和壁面效应；最后进行了高分子乳液微球对牛血 蛋白b s a 的吸附反应的特性研究。论文重点研究了无皂法亲和高分子乳液基球 的制备工艺及表征方法，微球的表面修饰和蛋白质吸附反应的影响因素，全文分 为五章，主要内容如下。 第1 章，文献综述。概述了亲和高分子乳液微球的定义、特点、国内外研究 进展情况及应用前景，重点比较了亲和高分子乳液基球的不同制备途径，介绍了 功能微球表面修饰反应的意义和聚乙二醇类空间臂分子的特点及引入方法，并分 析讨论了生物活性物质的固定方法和蛋白质吸附理论。 第2 章，无皂法制备亲和高分子乳液基球。本部分以含有弱电离基团的两性 偶氮类化合物v 5 0 为引发剂，采用功能单体的分段加料法，苯乙烯s t 和甲基丙 烯酸环氧丙酯g m a 无皂共聚，合成了直径大约3 0 0 啪，具有良好粒度单分散性， 且表面有效环氧基浓度大于3 m m o 垤的乳液基球。运用多种分析测试手段，对 无皂乳液微球的稳定性、表观形态、粒径、表面功能基团浓度及分布等特性进行 表征，并重点研究了s t g m a 共聚体系的动力学特性，聚合反应的温度、共聚单 体配比及功能单体浓度、引发剂类型及浓度、加料方式等影响因素。 第3 章，亲和高分子乳液基球的表面修饰。通过p s g 乳液基球的表面修饰 反应，氨基封端的空间臂分子成功嫁接到微球的表面。选择具有良好的生物相容 i 浙江大学硕士学位论文 性的双氨基封端的聚乙二醇作为空间臂分子，进行表面修饰，嫁接率约为6 7 ， 含水率较未修饰的乳液基球提高了近5 0 。通过对嫁接反应时间及温度、空间臂 分子类型及链长等影响因素的分析研究，优化了乳液微球表面修饰反应的条件。 另外，研究发现，空间臂分子的链长直接影响表面修饰反应的嫁接率，且表面功 能基团的浓度和流动性均是影响嫁接反应的重要因素。 第4 章，氨基表面修饰的高分子乳液微球对蛋白质吸附特性的研究。本部分 实验以牛血蛋白b s a 为模型蛋白质，表面修饰的乳液微球作为吸附材料，考察 吸附反应特性，并着重研究了吸附时间及温度、b s a 初始浓度、离子强度等因 素对吸附反应的影响。 第5 章，主要结论。总结各阶段研究内容，得出主要结论，并对该课题的深 入研究进行了展望。 关键词：亲和高分子乳液微球，无皂乳液聚合，表面修饰，双氨基封端聚乙二醇， 蛋白质吸附，b s a 浙 l ：大学硕上学位论文 a b s t r a c t a m l l i t ) rp o l y m e rl a t e xm i c m s p h e r ei sak i n do f 如r l c t i o i l a lp o l y m e ri i l i c r o s p h e r e ， w i l i c hc o u l di m m o b i l i z ec o m p o n e mo fm ec o u p l eo n “ss _ u r l 沁e0 ra t t a c ht 0s ：p e c i f i c s i 钯c e l l s ab i o 炳i l i 哆o f b i o 驴c i f i cc 0 u p l e s ，m e s e 觚c t i o n a lm i c r o s p h e r e s c o u l dc o l l e c tm e i rp a n n e r so i i c 0n l el a t e xl l l i c r o s p h e r e s ，r e a l i z et h es e p a r a l i o no f 也et a 玛e tm o l e c u l e s a m i l i 锣p o l y m e rl a t e x1 1 1 i c r o s p h e r e sa r ec o m p o s e do ft w o p a r t s ， t l l ec a r r i e rl i l i c r o s p h e r e s 射l d 廿1 eb i o i n o l e c u l e si i i u n o b i l i z e do nt h es u p p o n a f n n i 够 p o l y m e rl a 钯xl i l i c r o s p h e r e sm l v em ec o m m o na d v 跚l t a g e so f 如n c t i o n a lp o l y r n e r i i l i c r o s p h e r e s ，i e ，s t a b l ed i s p e r s i o n s ，l a r g es p e c i f i cs u r f 犯ea r e 嬲a sw e l l 懿v e r s a t i l e p i 0 l p e r t i i n 缸i d i t i o n ，t 1 1 e s e 跚【m r tl a t e xm i c r o s p h e r e sh a v e v e r a lp a r t i c u l a rf e a t u r e s ， s u c h 嬲w e um e c h 撕c a lp e 0 彻a i l c e ，n o n s p e c i f i ca d s 0 印t i o 玛l l i 幽a c t i v 时，e x c e l l e n t b i o l o g ) rc o m p a t i b i l 岭，e a 锣t 0r e c o v e 巧锄dr e p e t i t i v et 0u s e ，衔e n d l yt 0e n v i r o l l i i l e n t ， e t c s oa m n i 锣p o l y m e rl a t e xm i c r 0 s p h e r e se x b 沁dp o t e n t i a l 印p l i c a t i o nf o r b i o s 印a r a t i o i l ，a n t i b o d yi d e n t i f i c a t i o 玛d n ad i 孵l o s i s 舔w e u 嬲e v a l i i a t i o nt h e e 伍c i e n c yo fm e d i c i n e i nt h i s 咖d y ，p o l y ( s 够r e n e - c o g l y c i d y lm e m a c r y l a t e ) ( p s g ) l a t e xm i c r o s p h e r e w 舔a tf i r s tp r e p a r e db y 把s o a p 一骶ee m u l s i o np o l y m e r i 捌i o nw 池b a t c h 诵 o p e m t i o nm o d ei nm ep r e n c e0 f2 ，2 - a z o b i s ( 2 一a i i l i d i n o p r o p a i l e ) d i h y d r o c l l l o r i d e 部 觚i 1 1 i t i a t o r t 1 1 e n ，戗l es 谢沁eo fm ea _ b o v ei i l i c r o s p h e r e 、) l 粥m o d i f i e db yt l l eg r a r i i l g r e a c t i o nb e 觚e e nt l l e e p o 巧伊o u p so fi t ss u d 沁ea n dm e ：a m i n 0g r o u p so f 锄i n 0 t e r l n i n a t e dp o l y e t h y l e n eg l y c o l n h 2 ( p e g ) n n h 2 】( 5 如受0 ) 、i t l ld i 仃e r e n t c 打b o nc h a i nl e n g 也0 r1 ，6 一d i a i i l i n o h e x a n et 0r e d u c et h e 咖r i cl l i | 讪r 锄c ea n ds i d e i 1 1 t e r a c t i o no fm es u r f a c eo fs 邺r t e dm i c r o s p h e r e s f i n a l l 弘t t l ea d s o r p t i o no fp r o t e i i l o n t ot h es u 【r f a c em o d i f i e dp o l y r n e rl a t e xi i l i c r o s p h e r e sw 嬲s t u d i e d t l l i sp a p e rf 1 0 c u s o nm es t u d yo fm ep r e p a r a t i o n 觚dc h a r a c t e r i s a t i o no f 缅1 1 i t ) rp o l y m e rl a t e xb a s i c l i l i c s p h e r e sb y a p - f k ee i n l l l s i o np o l y m e r i 2 嘶o na n dm ee 彘c tf a c t o r so ft l l e 双l r f k em o d i f i c a t i o na n d p r o t e i i la d s o r p t i o n 7 n 圮f i r s tc h a p t e r ：d 0 c l l i n e n t a t i o nr e v i e w 1 1 l i sp a nm 撕砌yi n 们d u c e d 仕伧 d e f i n i t i o i l ，f e a n 鹏so fa m i l i 哆p o l y i i l e rl a t c xi i l i c r o s p h e r c s ，t l 坨d 0 i n e s t i c 觚d i i i 浙江人学硕士学位论文 i l l t e m a t i o i l a lr e s c a r c hp r o 铲e s s ，p o t e m i a la p p l i c a t i o n ，a n d o n t h ed i f r e r e n t p r e p a 【r a l i o nm e m o d so ft l l ea m i l i t yp o l y m e rla ：t e xm i c r o s p h e r e sw e r ee m p h a t i c a l l y c o m p a r e d ，t h em e a i l i n go ft h e 跚r f k e l o d i f i c a t i o no ft l l ef h n c t i o n a li m c r o s p h e r e s ，1 e c b 锄c t e r i s t i ca n d 黟m i l l gm e t l l o do ft i l ep o l y e t h y l e n eg l y c o l 锄di t sd e r i v a t i v es p a c e r 锄n l o l e c u l e sw e r es u m m a r i z e d f u n l l e 肌o r e ， t h ei m m o b i l i z a t i o no ft l l e b i o m o l c c u l e s 锄dt h ea d s o r p t i o nt h e o r ) ro fp r o t e i n 、r ed i s c u s s e d t 1 舱c o n dc h a p t e r ：p r e p a m t i o no fa 伍n i t ) rp o l y m e rl a t e xi i l i c r o s p h e r e sb y s o 咿矗e c 锄m s i o np 0 1 y 删0 n i n t h i sp a r t ，p o l y ( 啊r e n e c o g l y c i d y lm e t l l a c r y l a t e ) l a t e xi i l i c r o s p h e r ew a sp r e p a r e db ys o a p f k ee m u l s i o np o l y i n e r i z a ：t i o n 诚t l lb a t c h 晰s e o p e r a t i o n m o d ei i ln 坞 p r e s e n c e o f 2 ，2 - 切0 b i s ( 2 a r n j d i n o p r o p a n e ) d i h y d 赋h l o r i d ea s 觚i 1 1 i t i a t o r t i l ed i a m e t e ro fp s gl a t e xi i l i c r o s 】) h e r et h l l sp r o d u c e d w 笛d b c h l t3 0 0 m na 1 1 dl l a daw e um o n o d i s p e r s i t ) ，w i t hp a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o ni r l d e x u 1 0 5 ，m ec o n c e n t r a 【t i o no f 印。碍g r o u p so nt l l es u r f 砬eo f t l l el i l i c r o s p h e r ec o u l d r e a c ht 03 衄。垤t h e 渤b i l i 饥s l l r l f a c em o r p h o l o 烈p a n i c l es i z e 锄dc o n c e n t r a t i o n 0 fs u r f a c e 如n c t i o n a l 铲o u p so ft l l el a t e xm i c r o s p h e r c sw e r ec h a r a c t e r i z e d t h e k i 鹏t i c so fs o a p - f r e ee m u l s i o np o l y m e r i z a t i o na i l dt l l ee 疗e c t so fp o l y m e r i z a t i o n f 撕o r s ，i e ，p o l y m e r i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，t h e r a t i oo fc o m o n o m e r s锄d 1 e c o n c e i l 仃a t i o no f 缸l c t i o n a l 伊o u p s ，锣p ea n dc o n c e n 仃a t i o no fi i l i t i a t o r 柚dt 1 1 ef c e d o l 煽r a l i o nm o d ew e r ee m p h a t i c a l l ye 戤血i l e d t h et l l i r d c h a p t e r ：s w e m o d i f i c a t i o no ft h c a 伍1 1 i 够叫y m e r l a t e x i i l i c r o s p h e r e s i nt i l i sc h a p t e r ，t h es p a c e ra r mm o l e c u l e s ( i e ，枷n o t e m l i i l a t e d p o l y e t l l y l e n eg l y c 0 1 ) 、e 托s u c c e s s 向l l y 伊a r e do nt h es u r f 酝eo ft l l e 印。巧- c o n t a i n i n g l a 觚m i c r 0 s p h e r e 1 1 1 eg 舭dy i e l d o fn h 2 ( p e g 州h 2o n t 0 恤s u 舭eo f 武c r o s p h e r ew a sa p p r o x i i l l 锄e l y6 7 觚dt h ew a t e rc o n t e n tw 镐i n c r e a s e db y5 0 c o m p a r e d t 0l l r l m o d i f i e d m i c r o s p h e r e a c c o r d i n g t 0t l l e c o m p a r i s o n r e s u l t a m i i l 0 一t c r i i l i n a t c dp o l y e t h y l e n cg l y c o l 时h 2 ( p e g ) n n h 2 】s h o u l db e 锄i d e a ls p a c e r 蚴 n 1 0 k c u l ed u et 0i t se x c e l l e mb i o c o m p a t i b i l i t ) r 砚dp r o p e r 铲a r e dy i e l d t h e 伊a f 锄 y i e l d 、糯蝴l yd 印e n d e n t0 nt h ec h 如l e n g t l lo f t 1 1 es p a c e ra n nm o l e c u l e sa n dt h e o p t i l m l ml e i 培m o ft h es p a c e r 锄m o l e c u l e sw 弱e x i s t e df o ri m m o b i l 泌d b i o m o l e c u l e i na d d i t i o l l ，b o mt h ea i n o 姗t 锄dt 1 1 em o b i l 时o ft h ee p o 巧g r o u p so nn l e v 浙江大学硕士学位论文 m i c r 0 s p h e r es u r f l a c ew e r ck e yf a c t o r st ot l l eg f a r e dy i e l d t h ef 0 呱hc h a l ) t e r ：s t u d y0 nt l l ea d s o r p t i o no fp r o t e i no nt h es u r f a c em o d i f i e d p o l y m e rla _ t e xi i l i c r o s p h e r e sb y 幽莎o u p s i nt 1 1 i ss t i = k i y b o v i n es e 砌 1 1a l b u i i 洫 ( b s a ) 、张s 嬲t t l em o d e lp r o t e i n 锄dm es u r f 犯em o d i f i e dl a t e xn l i c r o s p h e r e sw 雏a s t l l es u p p o nm a t e r i a l t h eb e l l 乏i v i o ro fp r o t e i na d s o 巾t i o no n 协n l el a t e x 商c r o s p h e r e s w a si n v e s t i g a t e da i l dt l l ee f r e c tf a c t o r so ft h ea d s o r p t i o nr e a c t i o i l i e ，a d s o r p t i o nt i m e 锄dt e m p e r a t u r e ，i m t i a lc o i l c e m r a t i o no fp r o t e i ns o l u t i o l l ，i o i l i c s t r e n g t l l w e r e 唧h a t i c a l l ys t u d i e d t h ef i 肋c h a p t e r ：c o n c l 戚o i l s i nt l l i sp 吼m er e s e a r c ho fa l ls t e p sw e r e g e n e r a l i z e da n d 也em a i nc o n c l u s i o n s 袱淝a l s oo b t a i n e d k e y w o r d s ：a m l l i 够p o l y m e rl a t e xm i c r o s p h e r e s ，s o 印- 缸ee m u l s i o np o l y m e r i z a t i o n ， s u r 】em o d i f i c a t i o n ，a i l l i n o - t e 册i n a t e dp o l y e t l l y l e n eg l y c o l ，p r o t e i na d s o r p t i o n ，b s a - v - 浙江人学硕上学位论文 1 上j 一 刖舌 亲和高分子乳液微球是一类在高分子乳液微球的表面固定具有特定亲和配 位关系的基团或分子的高分子微球分散体。这类功能高分子微球主要由高分子乳 液载体微球和固定于载体上的具有亲和配位关系的基团或分子组成。 亲和高分子乳液微球具有亲和结合容量高、脱吸处理效率高、固定活化过 程容易、非特异性吸附少和对环境友好且可循环再生使用等优点，因此在生物 化学及医学领域中具有广泛的潜在应用。例如此类功能高分子材料可应用于药 物快速评价、免疫抗体识别和d n a 诊断等领域。国外关于亲和高分子微球的 研究日趋活跃，然而国内相关的研究却较少，但迄今对于亲和高分子乳液微球 的研究仍面临不少难题，因此需要对亲和高分子乳液微球的课题进行深入的探 索。 本研究体系选择疏水性的苯乙烯( s t ) 为主单体，亲水性的甲基丙烯酸环 氧丙酯( g m a ) 为功能单体，以含有弱电离基团的两性偶氮类化合物v 5 0 引发 无皂乳液共聚法制备带有环氧基团的功能高分子乳液基球，并把不同种类和链 长的空间臂分子嫁接于乳液基球上，制得亲和高分子乳液载体微球。研究了 s t - g m a 共聚体系的动力学特性和聚合反应的影响因素，考察遥爪空间臂分子 引入反应中各因素对微球表面修饰嫁接效果的影响规律，筛选空间臂分子的最 佳导入条件和分子尺寸等。最后在亲和乳液载体微球上吸附固定牛血蛋白b s a ， 考察嫁接有遥爪空间臂分子的高分子乳液微球对蛋白质的吸附特性，并着重考 察吸附反应中各因素的影响规律。 浙江人学硕_ 上学位论文 第1 章文献综述 1 1 亲和高分子乳液微球概述 1 1 1 引言 亲和高分子乳液微球是在高分子乳液微球的表面固定具有特定的亲和配位 能力的分子或基团，如蛋白质、酶、药物分子等生物活性物质，利用这些活性物 质与目标物质间的亲和配位关系，选择性地吸附并最终分离出目标物质的一类功 能高分子微球。亲和高分子乳液微球主要由高分子载体微球和固定于载体上的生 物活性物质组成。 亲和高分子乳液微球不仅具有高效、稳定、功能多样等高分子微球的通有特 征【2 】，而且具有机械性能强、对蛋白质非特异性吸附少，反应灵敏、生物相容性 能良好、可循环使用、对环境污染小等特有的优点，因此，在诸如药物快速评价、 免疫抗体识别和d n a 诊断等领域有很高的应用价值。例如，将药物分子固定在亚 纳米级的高分子乳液微球载体上形成药物固定亲和高分子微球，利用后者生物惰 性和高的比表面积等方面的优势，可简便的从生物细胞组织液中以亲和配位方式 吸附分离出药物受体蛋白质，而通过对药物受体蛋白质的分析测定，可推测这种 药物的作用机制和效果。因此，这类功能高分子材料在生化、医药等领域具有广 泛的应用前景。 1 1 2 亲和高分子乳液微球的特点 亲和高分子微球具有以下特点【3 】： ( 1 ) 微球体积小，比表面积大，亲和结合容量高； ( 2 ) 微球表面具有适当的亲水疏水性，既提高生物相容性，又减少了对蛋白 质的非特异性吸附； ( 3 ) 微球的物化性能稳定，甚至在有机介质中也能固定粘结生化分子； ( 4 ) 微球易导入高活性反应基团，不需活化过程就能固定粘结生化分子； ( 5 ) 具有亲和配位关系的分子亲和效率高，且脱冼后可循环再生使用。 2 浙江人学硕上学位论文 1 1 3 亲和高分子乳液微球的研究进展 近年，国外关于亲和高分子乳胶微球材料的研究日趋活跃吲。m a r g e l 【5 】采用 微胶囊化技术制成具有醛基的高分子微球，并通过表面反应固定含胺基的蛋白质 等生化活性物质，以实现亲和分离目的。k 跚，a g u c h i 【6 】报道了用无皂乳液聚合方 法制备含环氧基团的核壳结构的乳胶微球，并固定d n a 分子片断制成亲和乳胶微 球，用于纯化转基因蛋白。采用无皂乳液聚合方法合成的水分散型乳液微球表面 清洁度相对较高，适合于生化领域应用，但常规无皂乳液聚合对颗粒粒径大小和 分布均匀性的控制较难。无皂乳液聚合体系中乳胶颗粒的形成和成长与颗粒表面 上引发及残留片段分子的特性密切相关，由两性水性引发剂引发的无皂乳液聚合 合成的乳胶颗粒因两性引发剂残留基团存在，在不同p h 值下会呈现不同的离子 特性，且随着体系的离子强度增强而降低电离程度，运用这一无皂乳液聚合体系 的特性，可以较好的控制乳胶颗粒的成长，从而调控最终乳胶颗粒的大小及分布。 p i c h o t 【7 l 研制了含有阳离子功能基团的乳胶微球，主要应用于辨识分离特定结构 的蛋白质。u g e l s t a d 等人f 8 】以聚苯乙烯为载体、采用表面涂覆方式制成用于生化 分离的磁性微球，分离速度虽快，但亲和时活性物质容易脱落。k o n d o 【9 】报道了 一种用作抗体分子的辨识和纯化分离的热敏性乳胶微球分散体，其亲和效果主要 依赖于体系温度的变化。由于亲和高分子乳液微球表面的固态性状容易对被固定 或被吸附的生化分子产生不良影响，如导致生化分子活性丧失或形态变异等，所 以在固定亲和配位分子前宜先在微球表面上嫁接空间分子以消除固体表面效应。 k 1 w a g u c t l i 【6 】采用了环氧基封端的短链低分子化合物为遥爪空间分子，发现表面 遥爪空间分子的存在可明显改善亲和微球的亲和效率。由于他们使用了生物相容 性较差的烷烃类化合物作为遥爪空间分子，虽然一定程度上消除基球固体壁面的 影响，但增加了对蛋白质的非特异性吸附程度。 国内相关的研究报道鲜少。余艺华和何丙林等人【1 0 】制备了以壳聚糖为包裹 基体材料体的磁性微球，并研究微球对蛋白质的吸附特性，但没有进一步嫁接生 化活性分子制成亲和磁性微球。 纵观国内外的研究现状，不难发现在目前亲和高分子乳胶微球材料的研究中 仍然存在不少问题。例如，乳胶微球对p h 稳定性欠佳，导致在高p h 值下固定 生化分子时容易引发微球凝聚失稳，最终影响亲和效率；微球固体表面与被固定 3 浙江大学硕士学位论文 生化物质之间间隔太短，固体表面容易诱致结合分子与被结合的亲和障碍或导致 被结合分子的生化失活，影响亲和配位效果；乳胶微球表面上被固定的反应性基 团浓度较低，造成嫁接固定生化分子的能力偏低；乳液微球粒度太小，自身纯化 和脱冼时对分离设备要求高，且操作周期偏长等等。另外，作为遥爪空间分子的 种类少且其生物相容性较差；嫁接于亲和乳液微球上的遥爪空间分子对被固定生 化活性分子的影响及后者对于其亲和配位分子的作用机制等。因此亲和高分子乳 胶微球的问题仍需进一步的深入研究。 1 1 4 亲和高分子乳液微球的应用 亲和高分子乳液微球具有比表面积大、单分散性好、生物相容性好、亲和结 合容量高，易于分离和提纯、脱吸处理效率高，对蛋白质和酶等生物活性物质非 特异性吸附少和对环境友好且可循环再生使用等优点，因此在生物化学及医学领 域中具有广泛的潜在应用1 2 1 。 利用生物活性物质与目标物质间的亲和配位关系，亲和高分子微球才能吸附 并最终分离出目标物质。存在亲和配位特性的对应生物体较多，例如： d n a - r n a ，结合蛋白质一被结合蛋白质，药物分子一受体蛋白质，抗原一抗体， 配体一受体，外源凝集素一糖等【l l 】。利用这些特定的对应的亲和配位性，亲和 高分子乳液微球可实现多种应用，如图1 1 所示。 g 二 抗体一抗原 d n a d i a 受体蛋白质 d n a d n a 、r n a 配体一受体 糖类一凝集素 图1 1 几种可用的亲和微球 f i g1 1s e v e r a jl ( i n d so fa v a i l a b l e 硪i n 时m i c r o s p h e r 瞄 - 4 浙江大学硕上学位论文 1 1 。4 1 生化识别分离 亲和分离是目前生物物质分离领域中比较常用的一种分离方法。以具有高比 表面积的高分子微球作为载体，并在其表面的功能基团上固定对特定配位分子具 有亲和配位的生物活性物质，这种制得的亲和高分子微球功能材料可以有效地用 于生化分子的识别分离及提纯。 亲和高分子微球对生化分子的吸附具有高选择性，因此可以高效准确的实现 对目标分子的吸附和分离。例如：带硼酸的亲和胶乳可从一系列糖类中选择对其 具有亲和力的顺式二醇醣类进行特定吸附。b g e b b e i l ，z h a n gt h 【1 2 】将c i b a c r o n b l u e ( c b ) 固定于内核疏水外壳亲水的乳胶微球上，因c b 对牛血清白蛋白( b s a ) 存在着较强的亲和力，故利用这种微球可以从b s a 与i g g 等的混合物中成功地吸 附出钝性的b s a 。 a a 函【1 3 】和j t k a d o m g a 【1 4 j 对表面固定化d n a 的微球吸附分离法进行了 深入研究，并与带d n a 的琼脂糖凝胶做成柱体的亲和性柱式色谱分析法做了对 比。实验结果显示，由于高分子微球具有高比表面积方面的优势，在纯化转录因 子的效率和加工性方面，固定d n a 的胶乳微球大大优于吸附d n a 的琼脂糖凝胶 柱体，并且这种亲和胶乳微球的纯化酸性蛋白质的效果也明显优于凝胶柱体。 m u 1 1 1 e n 【1 5 】利用维生素一抗生素亲和配位将d n a 的固定链末端固定在高分子微 球上。y i n o m a 切。t w a d a 等人【1 6 】用苯乙烯( s t ) 和甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 共聚制得亲和乳胶微球，并应用于吸附d n a 和纯化转录因子。 1 1 4 2 药物快速评价 新药的研制通常要经过药物分子的设计和筛选、天然或化学合成和临床评 价试验等相当复杂的过程，尤其是药物的评价试验包括前期的动物试验和后期 的人体临床试验，具有相当的长期性和冒险性。因此，如何高效且安全地辨识( 或 分离、纯化) 药物受体蛋白质，是缩短新药开发周期，提高新药开发效率的关键。 生化分子的本质特征之一就是分子之间通常存在亲和配位关系，例如 d n a - r n 人结合蛋白质被结合蛋白质，药物分子受体蛋白质等。早期研究者已 认识到可利用生化结合( 1 i g a n 结合( b i n d i n g ) 分子之间的这种特性来辨识、分 5 浙江人学硕士学位论文 离或纯化活性物质如蛋白质等【1 7 】。9 0 年代起，研究发现若以微小乳胶微球作为 基体，在其表面上嫁接构筑对生化活性分子具有亲和配位的功能基团或分子，能 够制成对特定配位分子具有高效辨识、痕量分离乃至d n a 诊断目标的亲和乳胶 微球功能材料【嘲。亲和高分子微球具有亲和结合容量高、非特异性吸附少、物 化性能稳定以及可循环再生使用等优点，因此，将其应用于药物评价领域将成为 今后研究的重点。 图1 2 亲和高分子乳液微球用于药物快速评价 f i g1 2i m m o b i l i 孺d r u gw 淌s p a c e rm o l e c u l e 觚di t s 印p l i c a t i o nf o rd m g e v a l u a t i o n 1 1 4 3 重金属识别分离 通过在高分子微球上嫁接对重金属具有识别功能和亲和配位性的功能基团， 能将重金属从废水中辨别并吸附于其上，经释放和纯化而得到分离并回收。 p d 哪【1 9 】以p m m a 为基球，p e i 为吸附功能基团，在p h 值为3 0 7 0 环境中，对 c d ( i i ) 、c u ( i i ) 和p b ( i i ) 的分离效果进行比较，发现在p h = 5 5 时，3 6 i m o 垤的c u ( i i ) ， 4 6 p m o 垤的c d ( i i ) 和4 2 p r n 0 垤的p b ( i i ) 都能辨别和分离出来。在废水综合处理中， 此法有极高的灵敏性，较普通方法效果更佳，因此，可以利用亲和高分子微球对 重金属进行识别和分离。 1 1 4 4d n a 诊断 在很多癌症初期常帮随着基因突变的发生，如何检测出突变的异常基因对于 6 浙江大学硕士学位论文 癌症的早期发现起着至关重要的作用。将d n a 分子固定于亲和高分子微球上可 以实现对d n a 的诊断。带单链d n a 的亲和高分子微球能捕捉与之相对应的e i n a 或l 斟a 。m t s u l l e z u k a 【2 川将t y m i n e 2 0 m e r 固定在胶乳微球上，并成功地从r n a 混 合物体系中提纯出m i 玳a 。f h i r o s e ，m n a b u c h i 等人1 2 1 】已设计出一种固定活 性和非活性d n a 的可靠方法，携带活性d n a 的微球能成功地纯化对应的非活性 黜妊。另外，带有与d n a 突变体互补的d n a 的亲和高分子微球可以检测出突变 的d n a 。 1 1 4 5 免疫载体 亲和高分子微球已被用作免疫载体应用于生物的免疫力测试，并且己在临床 化学分析上展示出了强大的生命力，得到广泛应用。生物的免疫体系在受到抗原 侵入时，会产生的对应的抗体，保护生物体抗原免于侵略者的侵害。其关键在于 抗原和抗体能高效率和高选择性地形成抗原一抗体络合物。随着抗原一抗体络合 作用的进行，载体的表观大小也会随之改变，通过测量大小变化的程度进而可以 得出络合反应的进行程度。免疫胶乳诊断试剂正是基于这一原理，将抗体或抗原 通过物理吸附或化学键合的方式固载于胶乳微球载体表面制成的。通过胶乳凝聚 测试法，能够检测出体系中对应的抗原或抗体浓度。免疫胶乳凝集法能简便、快 速、灵敏的进行免疫测定阎。 1 2 无皂法亲和高分子乳液基球的制备 1 2 1 引言 高分子微球通常作为一种功能高分子材料应用于生化医药等领域，因此其基 球要满足比表面积，粒径大小，功能基团浓度和分布，机械性能、稳定性等方面 的要求，且功能基团还要具有较高的活性，生物相容性好，能够较易的固定嫁接 生物活性物质。因此高分子基球常选用苯乙烯、乙烯基吡啶、丙烯酸、丙烯醛、 丙烯酸酯、丙烯酰胺及它们的衍生物为主单体，与含有不同官能团的功能单体共 聚制备。主要的聚合方法有悬浮聚合、沉淀聚合、分散聚合、乳液聚合等，表 1 1 总结了文献报道的各种合成途径。 7 浙江人学硕士学位论文 表1 1 多元共聚法制备亲和高分予微球载体 t a b1 1p r e p a r a t i o no fa 币n i t yp o l y m e rm i c r o s p h e r e sb yc o p o l y m e r i z a t i o n 由表1 1 可见，已经实现由多种主单体和功能单体在不同的引发体系下通过 各种聚合方法来制备亲和高分子微球，并成功制得表面含有羟基、羧基、氨基、 醛基、环氧基等各种功能基团的高分子基球。 制备功能高分子微球的常用方法是非均相体系中的共聚，这种共聚主要是采 用无皂乳液聚合及分散聚合。由于无皂乳液聚合制备的微球比表面积大，粒径分 布均匀，表面洁净，并且表面的一些性质如亲水性、功能基团的数目和分布在一 定程度上可以控制，因此在生物医学领域的应用越来越广泛。 1 2 2 无皂乳液聚合 无皂乳液聚合( s o a p 舶ee m u l s i o np o l y m 耐z a t i o n ) 是指在反应过程中完全不 加乳化剂或仅加入微量乳化剂( 其浓度小于临界胶束浓度c m c ) 的乳液聚合过 程，又称无乳化剂乳液聚合。无皂乳液聚合体系主要由水、单体和引发剂三种组 分构成。与传统的乳液聚合相比，无皂乳液聚合消除了产物中含有乳化剂，且难 以完全清除而影响最终产物的使用性能这一致命弱点。同时，由于无皂胶粒呈规 则球状、粒径分布均匀、表面功能基团的浓度和分布均可得到控制且产物洁净， 8 - 浙 i ：大学硕士学位论文 因此无皂胶粒用作固定生物活性物质的载体基球有无可比拟的优势。 1 2 2 1 无皂乳液聚合的特点 无皂乳液聚合与传统乳液聚合相比具有以下特点【3 2 1 ： 1 ) 聚合过程中未使用乳化剂，既降低了产品的原料成本，又避免了去除乳 化剂的后处理复杂程序； 2 ) 制得的乳胶粒表面洁净，避免了应用过程中由于乳化剂的存在对聚合物 产品电性能、光学性质、表面性质、耐水性及成膜性等的不良影响； 3 ) 制得的乳胶微粒的粒径单分散性好。粒径分布系数u ( u n i f o m i t ) ，) 值接近 于l ，其中u = d w d n 。( d 。为微粒的数均粒径，d w 为重均粒径) ； 4 ) 微球尺寸较常规乳液聚合的大，还可得到具有一定表面化学性质的功能 性颗粒。 另外，无皂乳液聚合反应完毕后，体系中由于存在未反应的单体、残留的引 发剂、电解质等物质，因此要利用透析、离子交换及高速离心等手段对产品进行 纯化。 1 2 2 2 无皂乳液聚合方法 在无皂乳液聚合体系中没有乳化剂存在的条件下，胶粒主要通过结合在聚合 物链或其端基上的离子基团、亲水基团等而得以稳定的。主要聚合方法如下： a 引入可离子化的引发剂 在无皂乳液聚合过程中，引入可离子化的引发剂，使之在分解后，生成离子 型自由基。这样在引发聚合反应后，离子型引发剂碎片则作为聚合物链的端基最 终分布在乳胶粒表面，起类似于乳化剂的稳定作用。用这种方法，可以采用不同 的引发剂，从而赋予乳胶粒表面不同的功能基团，制备不同性质的高分子微球。 常用的阴离子型引发剂有过硫酸盐型和偶氮烷基羧酸盐型，阳离子型引发剂主要 有偶氮烷基氯化胺盐型【3 3 1 。采用这种方法得到的高分子微球表面电荷密度低， 乳液稳定性差，并且通常只能得到固含量为1 0 左右的乳液。 9 浙江大学硕上学位论文 b 引入亲水性共聚单体 在无皂乳液聚合体系中加入亲水性共聚单体有两个作用：第一，引入亲水性 单体增加了水相中的单体浓度，可提高反应速率；第二，亲水性共聚单体参加共 聚，由于亲水性而倾向于排列在聚合物乳胶粒水相界面上，或以离子形式形成水 化层，起到类似乳化剂稳定乳胶粒的作用。亲水性共聚单体主要有如下几类。 幻羧酸类单体 羧基单体参与无皂乳液聚合使聚合加速、稳定性增加，其作用与羧基单体的 特性有关。这类单体主要有丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、马来酸酐、富马酸等。 单体的种类、用量、中和度等对反应有很大影响。一般来说，水溶性共聚单体越 易溶于油相，在聚合反应中越易扩散到乳胶粒内，从而有效地起到稳定作用，但 它们在乳胶粒表面的分配比越小。此外，羧酸类单体的中和度不同，会导致羧酸 单体在油水中的分配比不同，进而影响羧基在乳胶粒表面的含量、乳胶粒数目 及稳定性【3 4 1 。 b ) 酰胺类单体 这类单体由于亲水性好，参与共聚合反应后，分布在乳胶粒表面，可以在乳 胶粒表面形成水化层，从而起到稳定作用。这类单体包括丙烯酰胺及其衍生物如 n 一羟甲基丙烯酰胺、n ，n 一二甲基丙烯酰胺及甲基丙烯酰胺等。在高过硫酸铵 s ) 浓度下，苯乙烯( s t ) 和丁二烯( b d ) 与丙烯酰胺( 删和羟甲基丙烯酰胺 ( h m a a m ) 的无皂乳液聚合下，用两阶段聚合法得到了5 0 的稳定乳液，并且乳 液的单分散性较好f 3 5 】。 c ) 羟基、环氧基类单体 普通聚合物乳液通常