（生物物理学专业论文）耐辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控研究.pdf

中文摘要 耐辐射球菌不仅对电离辐射具有极端的抗性，而且它对紫外线、过氧化氢、 干燥以及其它物理化学诱变和胁迫因子也具有很高的抗性。迄今为止，我们对 于它的极端抗性的分子机制了解得还很有限。对耐辐射球菌中与极端辐射抗性 相关的蛋白的研究，将有助于我们加深对耐辐射球菌这一极端抗性的理解。本 论文从4 个方面对耐辐射球菌进行了较为系统的研究，获得的结果如下： ( 1 ) 耐辐射球菌r a d a 参与了d n a 损伤修复过程 r a d a 是一个高度保守的蛋白，属于r e c a r a d a r a d 5 l 蛋白超家族。这个 蛋白超家族在细菌，古细菌和真核细胞中均被发现。在吉细菌中，r a d a 蛋白具 有r e c a 类似的功能并在同源重组过程中起关键作用。在大肠杆菌中，r a d a 蛋 白也参与了重组和d n a 损伤修复过程，但远没有在古细菌中的功能那么重要。 用p s i b l a s t 方法，我们发现，与古细菌以及真核细胞中r a d a 蛋白相比，耐 辐射球菌r a d a 蛋白和细菌中的r a d a 的相似性更高。研究发现耐辐射球菌r a d a 基因的突变增加了耐辐射球菌对y 射线和紫外线照射的敏感性，但对过氧化氢氧 化胁迫的抗性没有影响。耐辐射球菌和大肠杆菌r a d a 基因均能完全补偿突变体 对y 射线和紫外线辐照的抗性。进一步的结构域功能分析表明，和y a d a 突变体 的抗性相比，锌指结构域的缺失导致耐辐射球菌对y 射线和紫外线辐照更加敏 感；仅仅缺失l o n 蛋白酶结构域的耐辐射球菌表现为比r a d a 突变体略微更抗y 射线和紫外线辐照处理。这些实验结果表明，耐辐射球菌r a d a 蛋白的确参与 了d n a 损伤修复过程，而且不同的结构域具有不同的功能。 ( 2 ) 耐辐射球菌r e e d 参与了抗氧化过程 r e c b c d 在许多生物体的双链d n a 损伤修复过程中起关键作用。在耐辐射 球菌中，这个蛋白酶复合体是不完整的。它的基因组只编码一个r e e d 蛋白， 而缺少了r e c b 和r e e c 。对耐辐射球菌r e e d 的生化分析表明：它具有5 - 3 方 向的解螺旋酶活性，但是这种活性很低。在本研究中，我们构建了耐辐射球菌 r e e d 的突变体并研究了它可能的生物学功能。研究结果显示：与野生型r 1 相 比，r e e d 基因的突变使得耐辐射球菌对过氧化氢氧化胁迫处理极其敏感而且 略微降低了耐辐射球菌对紫外线辐照的抗性，然而对耐辐射球菌的电离辐射抗 i v 性没有任何影响。补偿实验结果显示，只有完整的耐辐射球菌r e e d 或者耐辐 射球菌r e e d 的解螺旋酶结构域和n 末端结构域共同过量表达才能够完全补偿 r e e d 基因的突变菌株对过氧化氢氧化胁迫的抗性，而大肠杆菌r e e d 、单独的 耐辐射球菌r e e d 的解螺旋酶结构域或耐辐射球菌r e e d 的n 末端结构域都不 能补偿这一表型。进一步的实验结果表明：r e e d 通过调节过氧化氢酶活性和活 性氧自由基清除活性参与了耐辐射球菌的抗氧化过程。 ( 3 ) 耐辐射球菌不具有经典的s o s 反应 l e x a 和r e e a 在大肠杆菌经典的s o s 反应过程中起关键作用。l e x a 作为 一个转录抑制因子控制着包括r e c a 在内的许多基因的d n a 损伤后的诱导表 达。以前的研究表明，耐辐射球菌中单独l e x a l 和l e x a 2 都不参与r e e a 的诱 导表达。在本研究中，我们构建了耐辐射球菌l e x a l 和l e x a 2 基因的双突变。研 究结果显示，与野生型和两个单突变体相比较，l e x a l 和l e x a 2 基因双突变明显 降低了耐辐射球菌的生长速度，而且增加了耐辐射球菌对紫外线辐照和过氧化 氢氧化胁迫的抗性。在正常生长情况下，双突变并没有使耐辐射球菌细胞内 r e c a 本底表达量明显上升，而是和野生型和两个单突变体中的r e c a 蛋白水平 一致。这表明l e x a l 和l e x a 2 一起也不参与对r e e a 蛋白诱导表达的调控。进 一步的d n a 芯片数据显示，l e x a l 和l e x a 2 一起参与了包括细胞分裂、蛋白 合成、抗氧化和转录调控等许多分子机制的调控过程。以上实验结果表明，耐 辐射球菌并不具有经典的s o s 反应，它应该利用一种新的分子机制来调控d n a 损伤诱导蛋白的诱导表达过程。 ( 4 ) 耐辐射球菌p p r l 通过拮抗r e c x 的功能来调控r e e a 和p p r a 的诱导表达 r e e a 在同源重组过程中起重要作用，以便在d n a 受到严重损伤时及时修 复那些d n a 双链断裂；p p r a 则在非同源末端连接过程中起作用。到目前为止， 有关耐辐射球菌r e c a 和p p r a 的诱导表达分子机制还不清楚。以前的研究显示： 在r e c a 的转录调控过程中，p p r l 作为一个正调控因子起作用，而r e e x 则作为 一个负调控因子起作用。在本研究中，我们构建了p p r l r e c x 双突变体，并揭示 了它们之间的调控关系。我们发现p p r l r e c x 双突变可以完全恢复p p r l 突变体对 紫外线和过氧化氢处理的抗性，但不能恢复p p r l 突变体对 r 射线辐照处理的抗 性。进一步的补偿实验结果表明：r e c a 的过表达也能完全补偿p p r l 突变体对 紫外线和过氧化氢处理的抗性，而p p r a 的过表达不能补偿p p r l 突变体的三种 抗性中的任何一种抗性。另外，重组频率和免疫印记分析结果表明：耐辐射球 v 菌r e c x 的突变可以上调r e c a 和p p r a 在正常生长条件下的本底表达水平。以 上结果说明，耐辐射球菌p p r i 通过拮抗r e c x 的负调控作用来调控r e e a 和p p r a 的诱导表达。 关键词：耐辐射球菌，突变，功能，调控 v i a b s t r a c t t h e e x t r e m e l y r a d i o - r e s i s t a n tb a c t e r i u m , d e i n o c o c c u sr c i d o d 谢e l m i s c h a r a c t e r i z e db yi t su n u s u a lc a p a b i l i t yt ot o l e r a t en u m e r o u sd n ad a m a g i n ga g e n t s ， i n c l u d i n gi o n i z i n gr a d i a t i o n ，u l t r a v i o l e t , h y d r o g e np e r o x i d e ，d e s i c c a t i o na n do t h e r p h y s i c a la n dc h e m i c a ld n a d a m a g i n ga g e n t s h o w e v e r , l i t t l ei sk n o w na b o u tt h e m o l e c u l a rm e c h a n i s m sr e s p o n s i b l ef o rt h ee x t r a o r d i n a r yr e s i s t a n c ei nt h i so r g a n i s m i nt h i ss t u d y , t h ef u n c t i o n sa n d r e g u l a t i o no ft h e s ep r o t e i n si n v o l v e di nd n ad a m a g e r e p a i rw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sa sb e l o w ： 1r a d at a k e sp a r ti nt h ed n a d a m a g er e p a i rp r o c e s si na r a d l o d u r a n s r a d ai sh i g h l yc o n s e r v e di nb a c t e r i aa n db e l o n g st ot h er e c a r a d a r a d 5 1 p r o t e i ns u p e r f a m i l yf o u n di nb a c t e r i a , a r c h a e aa n de u k a r y o t a i na r c h a e a ，i tp l a y sa c r i t i c a lr o l ei nh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o np r o c e s sd u et oi t sr e c a - l i k ef u n c t i o n i n e s c h e r i c h i ac o l i ，i tt a k e sp a r ti nc o n j u g a t i o n a lr e c o m b i n a t i o na n dd n a r e p a i rb u ti s n o ta si m p o r t a n ta st h a t i na r c h a e 乱u s i n gp s i b l a s ts e a r c h e s w ef o u n dt h a tn r n d i o d t l r d n sr a d ah a sah i g h e rs i m i l a r i t yt ot h a ti nb a c t e r i at h a nt h a ti na r c l l a e aa n d e u k a r y o 饥d i s r u p t i o no fr a d ag e n ei ndr a d i o d u r a n sr e s u l t e di n am o d e s t l y d e c r e a s e dr e s i s t a n c et og a m m ar a d i a t i o na n du l t r a v i o l e t ，b u th a dn oe f f e c to nt h e r e s i s t a n c et oh y d r o g e np e r o x i d e c o m p l e m e n t a t i o no f t h er a d , 4d i s r u p t a n tb yb o t he c o l ir a d aa n ddr a d i o d u r a n sr a d ac o u l df u l l yr e s t o r ei t sr e s i s t a n c et og a m m a r a d i a t i o na n du l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o n f u r t h e rd o m a i nf u n c t i o na n a l y s e so fd r a d i o d u r a n sr a d as h o w e dt h a tt h ea b s e n c eo ft h ez i n cf i n g e rd o m a i nr e s u l t e di na s l i g h t l ym o r es e n s i t i v ep h e n o t y p et og a m m aa n du vr a d i a t i o nt h a nt h a to ft h er a d a m u t a n t ，w h i l et h ea b s e n c eo ft h el o np r o t e a s ed o m a i ne x h i b i t e das l i g h t l yi n c r e a s e d r e s i s t a n c et og a m m aa n du vr a d i a t i o n t h e s ed a t as u g g e s tt h a td r 幽o d l 盯堪r a d a d o e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed n ad a m a g er e p a i rp r o c e s s e sa n di t st h r e e d i f f e r e n td o m a i n sh a v ed i f f e r e n tf u n c f i o i l s 2ar a d i o d u r a n sr e e dh a san e wr o l ei na n t i o x i d a n tp r o c e s s r e c b c dh o l o e n y m ep l a y sac r i t i c a lr o l ei nd o u b l e s t r a n d e dd n ab r e a k si nm a n y v i i o r g a n i s m s i nd r a d i o d u r a n s t h i sc o m p l e xi sn o ti n t a c tb e c a u s eo ft h ea b s e n c eo f r e c ba n dr e c c ，b u tar e e d - l i k ep r o t e i nd o e si n d e e de x i s t b i o c h e m i c a la n a l y s i sh a s b e e ns h o w nt h a ti ti sa5 - 3 h e l i c a s ea n dh a sal o wp r o c e s s i v i t y i nt h i sw o r k ，w e c o n s t r u c t e dd r a d i o d u r a n sr e e dd i s r u p t a n t sa n di n v e s t i g a t e dt h e i rp o s s i b l e b i o l o g i e a lf u n c t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a td i s r u p t i o no ft h er e e dg e n eo fd r a d i o d u r a n sr e s u l t e di nr e m a r k a b l yi n c r e a s e ds e n s i t i v i t yt oh y d r o g e np e r o x i d ea n d s l i g h t l yd e c r e a s e dr e s i s t a n c et ou l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，b u th a dn oa p p a r e n te f f e e to n t h er e s i s t a n c et og a m m ar a d i a t i o nc o m p a r e dt ot h ew i l dt y p e f u r t h e r m o r e c o m p l e m e n t a t i o ne x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tec o l ir e c d h e l i c a s ed o m a i no r n t e r m i n a ld o m a i no fd r a d i o d u r a n sr e c dc o u l d n ti n d i v i d u a l l yr e s t o r et h e r e s i s t a n tp h e n o t y p et oh y d r o g e np e r o x i d eo ft h ed r a d i o d u r a n sr e e dd i s r u p t a n t w h e r e a st h ec o m p l e t ed r a d i o d u r a n sr e e dp r o t e i na n dc o e x p r e s s i o no ft h e h e l i c a s ed o m a i na n dt h en - t e r m i n a ld o m a i no fdr a d i o d u r a n sr e c dc o u l d , i n d i c a t i n gt h a tt h ei n t e g r i t yo fdr a d i o d u r a n sr e c di sr e q u i r e df o rt h i sf u n c t i o n f u r t h e rs t u d i e ss h o w e dt h a td - r a d i o d u r a n sr e e dt o o kp a r ti na n t i o x i d a n tp r o c e s sb y s t i m u l a t i n ge a t a l a s ea c t i v i t ya n dr e a e t i v eo x y g e ns p e c i e ss c a v e n g i n ga c t i v i t yi nd r a d i o d u r a n s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a td r a d i o d u r a n sr e e dh a san e wr o l ei nt h e a n t i o x i d a n tp a t h w a y 3d r a d i o d u r a n sd o e s n th a v eac l a s s i c a ls o sr e s p o n s e l e x aa n dr e c a p l a yac r u c i a lr o l ei ns o sr e s p o n s ei ne c o l i i nc l a s s i c a ls o s r e s p o n s e ，l e x af u n c t i o n sa sar e p r e s s o rt or e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fm a n yg e n e s i n c l u d i n gr e c aa f t e rd n ad a m a g eo c c u r s p r e v i o u ss t u d i e ss h o w e dt h a tb o t hl e x a l a n dl e x a 2a r en o ti n v o l v e di nr e c ai n d u c t i o ni ndr a d i o d u r a n s i nt h i ss t u d y , w e c o n s t r u c t e dad o u b l em u t a n to fl e x a la n dl e x a 2 r e s u l t ss h o w e dt h a tm u t a t i o no f l e x a la n dl e x a 2r e s u l t e di na na p p a r e n td e c r e a s ei ng r o w t hr a t ea n da ni n c r e a s e d r e s i s t a n c et ou l t r a v i o l e ta n dh y d r o g e np e r o x i d ec o m p a r e dw i t hw i l dt y p er 1a n dt w o s i n g l em u t a n t s h o w e v e r , t h i sd o u b l em u t a n td i dn o te x h i b i ta n yr e m a r k a b l y i n c r e a s e dc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no fr e c au n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，j u s tl i k ew i l d t y p er 1a n dt w os i n g l em u t a n t s ，s u g g e s t i n gt h a tn e i t h e rl e x a ln o rl e x a 2i s i n v o l v e di nt h ei n d u c e de x p r e s s i o no fr e c a f u r t h e rt r a n s c r i p t i o n a la s s a ys h o w e d t h a tl e x a la n dl e x a 2t o g e t h e rp a r t i c i p a t e di nm a n yr e g u l a t o r yp a t h w a y si n v o l v e d v i i i i n c e l ld i v i s i o n , p r o t e i ns y n t h e s i s ，a n t i o x i d a n tp r o c e s s ，t r a a s e r i p t i o nr e g u l a t i o na n d o t h e rm e c h a n i s m s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e r es h o u l db ean e wm e c h a n i s mb y w h i c ht h e s ed a m a g e i n d u c e dp r o t e i n sa l er e g u l a t e di nd r a d i o d u r a n s 4p p r lr e g u l a t e st h ei n d u c e de x p r e s s i o no fr e c aa n dp p r av i aa n t a g o n i z i n g r e c x r e e ap l a y sac e n t r a lr o l ei n h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nr e p a i rt om e n d d o u b l e s t r a n dd n ab r e a k sw h e nd n ai sh i g h l yd a m a g e da n dp p r ai si n v o l v e di n t h en o n h o m o l o g o u se n d - j o i n i n gr e p a i rp a t h w a y t od a t e ，l i t t l ei sk n o w na b o u tt h e b i o c h e m i c a lm e c h a n i s mc o n t r o l l i n gt h ee x p r e s s i o no fd r a d i o d u r a n sr e e aa n d p d r a o u rp r e v i o u sw o r ks h o w e dt h a tp p r ii sap o s i t i v ef a c t o ra n dr e c xi sa n e g a t i v ef a c t o ri nt h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fdr a d i o d u r a n sr e e a h e r e w e f o u n dt h a tt h ed o u b l em u t a t i o no fnr a d i o d u r a n sp p r la n dr e c xc o u l dr e s t o r et h e r e s i s t a n c eo ft h ep p r lm u t a n tt ou l t r a v i o l e ta n dh y d r o g e np e r o x i d eb u tn o tt og a m m a r a d i a t i o n f u r t h e r m o r e c o m p l e m e n t a t i o no ft h ep p r lm u t a n tb yd r a d i o d u r a n s r e c aa l s oc o u l df u l l yr e c o v e l t h er e s i s t a n c eo ft h ep p r lm u t a n tt ou l t r a v i o l e ta n d h y d r o g e np e r o x i d e h o w e v e r , d r a d i o d u r a n sp p r ac o u l d n tc o m p e n s a t ea l lt h r e e k i n d so fr e s i s t a n c e so ft h ep p r lm u t a n t i na d d i t i o n , r e c o m b i n a t i o nr a t ea n a l y s i sa n d w e s t e r nb l o t t i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tm u t a t i o no fdr a d i o d u r a n sr e c xc o u l d u p - r e g u l a t et h eb a s a le x p r e s s i o nl e v e l so fd r a d i o d u r a n sr e c aa n dp p r au n d e r n o r m a lc o n d i t i o n s t a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tp p r jr e g u l a t e st h e i n d u c e de x p r e s s i o no fr e c aa n dp p r av i aa n t a g o n i z i n gr e c xf u n c t i o ni n t h i s b a c t e r i u m k e yw o r d s ：d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ，m u t a n t , f u n c t i o n ，r e g u l a t i o n 本文所用的缩略词 缩写 a m p a t p c a t c m d r 。一缔一 a m p i c i l i n d s b s e s d s a g y k a n 0 d p c r s o d 皇窭冬一一一 氨苄青霉素 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e c a t a l a s e c h l o r a m p h e n i c o l d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s d o u b l e s t r a n d e db r e a k s e x t e n d e ds y n t h e s i s - d e p e n d e n ts t r a n da n n e a l i n g g r a y k a n a m y c i n o p t i c a ld e n s i t y p l o y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 腺苷酸三磷酸 过氧化氢酶 氯霉素 耐辐射球菌 双链断裂 延伸合成依赖的链退 火 戈瑞 卡那霉素 光密度 聚合酶链式反应 超氧化物歧化酶 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸望盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：周庆签字日期：2 0 0 7 年5 月2 8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：周庆 导师签名：华跃进、徐步进、唐孝威 签字日期：2 0 0 7 年5 月2 8 日签字日期：2 0 0 7 年5 月2 8 日 浙江大学博士学位论文：耐辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控 第一章耐辐射球菌的研究综述 耐辐射球菌是一种红色的、不运动的、革兰氏染色呈阳性反应的四联体球 菌( 图1 1 ) ，由a n d e r s o n 等人于1 9 5 6 年从y 射线灭菌过的肉类罐头中首次发 现川。它是一种好氧菌，直径约为1 2 微米。由于其具有超强的辐射抗性而闻 名于世。起初，它被命名为m i c r o c o c c u sr a d i o d u r a n s ，因为它在形态上与 m i c r o c o c c u s 属的成员很相似。经过3 0 多年的研究，科学家们又把它重新归类 为一个新属d e i n o c o c c a c e a e 属，这个属中的细菌都具有非常强的t 射线辐射 抗性，而且比较容易培养也不具有致病性f 2 8 】。后来发现，耐辐射球菌不仅对 t 射线有很强的抗性，它对紫外线，过氧化氢、干燥和其它能够导致d n a 损伤 的物理化学因子也具有很强的抗性【9 1 3 】。在超过1 5 0 0 0c , y 的t 射线急性辐射 的情况下，耐辐射球菌不会死亡，也不会产生突变【1 4 】；而且它还能够在6 0g y ， 小时的慢性辐照下正常生长，而不会影响它的生长速率也不影响外源基因的表 达【9 ，1 5 ，1 6 】。与此相比，大肠杆菌在6 0e y , j , 时的慢性剂量照射下就不能生长 并被杀死，所以仅仅1 0 0 0 - 2 0 0 0g y 的急性照射就可以达到灭菌效果 9 】。与大肠 杆菌类似，枯草芽孢杆菌在6 0g y 小时的慢性剂量照射下也不能生长，当用 2 0 0 0 1 0 0 0 0g y 的剂量急性照射后，枯草芽孢杆菌的生存率下降大约5 倍 1 7 1 。 图1 1 耐辐射球菌外形的电镜图( 2 l 浙江大学博士学位论文：耐辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控 零 = 击 之 2 ： ( ，) ) , - r a yd o s e ( g y ) c u r r e n tb b b g y 图1 2 耐辐射球菌与大肠杆菌辐射抗性比较【9 】 d ”代表存活率为3 7 时的辐射剂量。 f i g 1 2s u r v i v a lo f d r a d i o d l 口d ma n de c o l if o l l o w i n ge x p o s u r et og a m m ar a d i a t i o n t h ed 3 7l e v e li st h a ta tw h i c ht w ot h i r d so fap o p u l a t i o na l ek i l l e da n di si n d i c a t e db yt h eg r e y d o t t e d1 i n e 表1 1 列出了6 个属的细菌，它们都具有电离辐射抗性。在这其中， d e i n o c o c c a c e a e 属是最有名的抗辐射家族，而且已经被研究了5 0 多年。对于表 中的其它细菌，我们除了知道它们抗辐射以外，其它方面我们知道的很少。 r u b r o b a c t e rx y l a n o p h i l u s 和k i n e o c o c c u sr a d i o t o l e r a n s 的基因组序列的草图已经 绘出，还没有对这些序列进行详细的分析。 2 浙江大学博士学位论文：耐辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控 表1 1 具有电离辐射抗性的菌种 d 1 0 表示存活率为1 0 时的辐射剂量。 所有与原核生物相关的表型中，对电离辐射的抗性是最难用自然选择来解 释的问题之一。因为地球上没有超过4 0 0m g y 年的辐射环境，这些生物不可能 自身发展出对高剂量辐射的保护机制【1 8 】。研究发现，t 射线辐照造成的损伤与 其它胁迫造成的损伤有一些相似的特征，而且这些具有辐射抗性的生物已经适 应了其它的环境胁迫。比如，干燥能够使耐辐射球菌和蓝细菌属 c h r o o c o c c i d i o p s 括的基因组产生许多d n a 双链断裂，而且这两种生物都能够耐 受干燥，也对电离辐射有很强的抗性 1 9 】。这表明这些生物的辐射抗性可能是 由于它们耐受干燥的分子机制发挥作用的结果。 在这些对电离辐射有抗性的物种中，他们之间并没有一个很清晰的进化模 式。在不同的原核生物进化树中，具有电离辐射抗性的物种呈现离散分布( 图 1 3 ) 。有两种可能来解释这种现象：一种可能是辐射抗性可能是它们祖先中已 经存在的一种d n a 修复系统的遗迹，这种辐射抗性在需要这种表型的生物中 保留了下来。这种解释假定祖先所具有的应对d n a 损伤的能力已经在大部分 的进化分支中丢失了，而且这种辐射抗性的分子机制在这些具有电离辐射抗性 的物种中是非常相似的。第二种解释认为，既然电离辐射抗性是一种稀有事件， 这种表型可能是来自于不同物种之间的基因的水平转移或者趋同进化。比如， 尽管鸟类和蝙蝠有不同的进化起源，但是他们都进化出了翅膀。不同的原核细 胞可能通过不同的方式适应了相似的选择压力，也必然有许多不同的辐射抗性 分子机制。第二种解释看起来更有可能，少量的独立进化事件产生了一大批已 3 浙江大学博士学位论文：耐辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控 知的具有辐射抗性的物种。 船雠m ， 功m * 一一一 m 一；v 一 c 嗡o a c o 曲d 搭s g m 锚 _ a 睁捌曲。c ：。r 瑁d 口# 蝣哥嚣 ，、，一捌 、a 拥托加c 印a 箱 、越日出“，0 2 c n 埘舟d “口崩掷 只缸”b b 蚱f 爵c 2 p z 斑蓐 却慨日“副m m 日 & 印h i k “0 5 鱼j 瞄撕如盘册：d u 帆川? 图1 3 基于1 6 s r r n a 的细菌进化树 f i g 1 3a1 6 s - r r n a - g e n e - s l u e n c e b a s e dp h y l o g e n yo ft h em a i nl i n e a g e so ft h ed o m a i n b a c t e r i a t h es c a l eb a rr e p r e s e n t s1 0i n f e r r e dn u c l e o t i d es u b s t i t u t i o n sp e r1 0 0n u c l e o t i d e s 辐射抗性并不仅仅存在与细菌之中，几种高度嗜热的古细菌也具有极端的 辐射抗性2 0 2 3 ，它们中的一些物种( 例如，t h e r m o c o c c u sg a m m a t o l e r a n s ) 的 辐射抗性可以和耐辐射球菌相媲美【2 2 】。耐辐射球菌r 1 菌株( d e i n o c o c c u s r a c ，f o d u r a n sr 1 ) 被发现后不久，耐辐射球菌的另一个菌株( d e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n ss a r k ) 作为一种医院里的空气污染物也被发现。到目前为止， d e i n o c o c c a c e a e 家族包括1 1 个物种：d r a d i o d u r a n s ， d p r o t e o l y t i c u s ，n r a d i o p u g n a n s ，d g r a n d i s ，d r a d i o p i l u s d g e o t h e r m a l i s t d m u r r a y i t d i n d i c u s ， d f r i g e n s ， d s a x i c o l a 和nm a r m o r i s 2 4 - 2 6 1 。这个属的细菌不产生 孢子，也不运动。它们大部分的最适生长温度在3 0 3 7 c 之间。细胞传代时间在 1 5 3 个小时不等。然而，dg e o t h e r m a l i s 和d m u r r a y 是嗜热菌，它们的最适 生长温度是4 5 5 5 c 之间。除了d g r a n d i s 的形态呈棒状以外，其它物种的形态 都是球形的，并且在液体培养基中以单体、二聚体或者四聚体的形式存在。他 们共同组成一个细菌的进化分支，与嗜热菌属在进化上最为接近。基于1 6 s r r n a 序列分析结果，推测d e i n o c o c c u s 属和t h e r m u s 属同属一个门( 图1 3 ) 。 4 浙江大学博士学位论文：耐辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控 目前，对这个属的细菌的自然分布情况没有做系统性的研究。除了以上提到的 地点，发现地点还有：英格兰湖周围的潮湿土壤、南极风化的岩石、辐照过的 医疗器械和空气净化系统。 在这个属中，只有d r a d i o d u r a n s 和ng e o t h e r m a l i s 能够进行遗传转化。到 目前为止，耐辐射球菌( d r a d i o d u r a n sr 1 ) 比其它抗辐射的球菌受到了科学家 们更多的关注。耐辐射球菌( a t c cb a a 8 1 6 ) 的基因组在1 9 9 9 年被成功测序 【2 7 2 9 】。耐辐射球菌的基因组的大小为3 2 8m b ，g c 含量为6 6 6 。在耐辐射 球菌基因组的2 9 5 个位点，发现有9 种类型的短核苷酸重复，短核苷酸重复的 大小从6 0b p 到2 1 5b p 不等，他们随机地分布在基因组内。耐辐射球菌的基因 组由一个2 6 4m b 的染色体i ，一个o 4 1m b 的染色体i i ，一个o 1 8m b 的大质 粒和一个0 0 4 5m b 的小质粒组成。共编码3 1 8 7 个预测基因( 见表1 2 ) 。在细 胞生长的不同时期，每个耐辐射球菌细胞中有4 - 9 个基因组拷贝 3 0 ，3 1 1 。 表1 2 耐辐射球菌基因组中的编码基因 m o l e c u l ew i t had a t a b a s em a t c h 1 1d n a 损伤抗性 在耐辐射球菌属中，耐辐射球菌被广泛研究。与其它的抗辐射物种不同， 耐辐射球菌可以进行遗传操作，因为它能够转化高分子量的染色体d n a 和质 粒d n a 3 2 3 4 】。这种自然转化能力使人们可以对这个生物进行一系列遗传操 作，使它成为科学家研究的热门材料【9 ，1 6 ，3 5 - 4 6 。这种转化能力和d n a 损 5 星 击i c 坶磊 蚕蓉 浙江大学博士学位论文：酎辐射球菌极端辐射抗性相关蛋白的功能与调控 伤抗性没有内在联系1 4 7 1 ，因为其它耐辐射的物种与耐辐射球菌一样耐辐射却 不能转化任何形式的d n a ( dg e o t h e r m a l i s 是个例外，它已经可以成功转化质 粒【4 8 】) 。在指数生长期，5 0 0 0g y 的辐照剂量下，耐辐射球菌不会死亡；直