（化学工程专业论文）酶法降解黄原胶制备寡糖工艺初步研究.pdf

i 摘 要 寡糖因其独特的结构而成为重要的生命物质，随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，寡糖的生物学活性和功能不断得到揭示，同时也引起人们越来越多的关注，因此寡糖将会有广阔的应用空间和市场前景。寡糖的制备有化学法、物理法和生物酶法。其中，酶法反应条件温和，选择性较好，是理想的寡糖制备方法。本文以黄原胶为原料，采用生物酶法制备出一种新型寡糖，并对该黄原胶寡糖的生物活性进行了初步研究。主要研究内容如下： 利用实验室分离纯化出的黄原胶降解菌 paenibacillus lautus xd2-8，以黄原胶为底物摇瓶培养，通过测定发酵温度、ph、摇瓶装量、底物浓度、种龄对发酵液的菌体密度和相对酶活力的影响，确定该菌的最佳产酶条件。实验结果表明：发酵产黄原胶降解酶的最佳条件为温度 30，初始 ph 为 7.5（灭菌前） ，摇瓶装量为 80ml，底物浓度为 10g/l，摇床转速为 200r/min，接种的适宜种龄为 3642h，接种量对发酵产酶影响不大。在黄原胶降解菌（paenibacillus lautus）xd2-8 的最佳产酶条件下，发酵培养制备黄原胶降解酶，并对其酶学特性做了初步的研究。结果显示，该酶的最优酶促反应条件为：温度为 35、ph 值为 6.0、底物浓度为 5g/l；葡萄糖对该酶促反应具有抑制作用，且葡萄糖浓度越大抑制作用越强。 然后利用该黄原胶降解酶对黄原胶进行降解，通过测定温度、ph、酶解时间、底物浓度和加酶量对制备黄原胶寡糖生物活性（羟基自由基清除率、超氧自由基清除率和 dpph 自由基清除率）的影响，确定该酶制备黄原胶寡糖的最佳工艺条件。结果显示：具有清除羟基自由基活性的黄原胶寡糖的最适制备温度是 35，ph 值为6.2，酶解时间是 5h，底物浓度为 4g/l，于 80ml 的黄原胶溶液中加入 10ml 粗酶；具有清除超氧自由基活性的黄原胶寡糖的最适制备温度是 33，ph 值为 6.0，酶解时间是 5h，底物浓度为 6g/l，于 80ml 的黄原胶溶液中加入 9ml 粗酶；具有清除dpph 自由基活性的黄原胶寡糖的最适制备温度是 33，ph 值为 6.2，酶解时间是8h，底物浓度为 3g/l，于 80ml 的黄原胶溶液中加入 8ml 粗酶。 最后对上述三种寡糖样品进行了初步提纯，通过高效液相色谱仪初步测定其分ii 子量。结果表明：清除羟基自由基活性最强的黄原胶寡糖的分子量约为 1000；清除超氧阴离子自由基活性最强的黄原胶寡糖的分子量约为 900； 清除 dpph 自由基活性最强的黄原胶寡糖的分子量约为 670。 关键词：关键词：黄原胶寡糖；黄原胶降解酶；酶促反应；制备；生物活性 iii abstract oligosaccharides become a kind of significant life matter due to their unique structures. recent years, with the rapid development of molecular biology and cell biology, their bioactivity properties and functions have gradually being revealed. meanwhile, they are given rise to more attention. so they are used more and more widely. biological enzymatic method has been proved to be an ideal method for preparing xanthan gum oligosaccharides due to its mild reaction conditions and selectivity as compared with chemical method and physical method. a new kind of oligosaccharides was prepared from xanthan gum by biological enzymatic method in this article, and their biological activities were preliminarily studied. the main studies are as follows: the bacteria used in the experiments was purified in our lab and named paenibacillus lautus xd2-8. by studying the impact of fermentation temperature, ph, shaking bottle volume, substrate concentration and seed age on the cell density and relative enzyme activity, the best enzyme production conditions were determined. the optimum conditions of fermentation were 30, initial ph=7.5 (medium before sterilization), 80ml shaking bottle capacity, 10g/l substrate concentration, 200rpm shaking speed, 3642h seed age. the enzyme was prepared from the bacteria xd2-8 (paenibacillus lautus) under optimum conditions, and its enzymological characteristics were preliminarily studied. the results show that the optimum temperature is 35, the optimum ph is 6.0 and the optimum substrate concentration is 5g/l. glucose owns an inhibitory action on the enzymatic reaction, and the action is enhanced with the increase of glucose concentration. afterwards, oligoxanthan was prepared by enzymatic degradation process of the enzyme. and the optimum process was determined through studying the impact of temperature, ph, hydrolysis time, substrate concentration and enzyme amount on bioactivity of oligosaccharides. the obtained results were used to choose the optimum conditions for the preparation of three different categories of oligosaccharides which can iv remove hydroxyl radical, superoxide radical and dpph free radical respectively. it is indicated that the oligosaccharides with highest performance can be synthesized at 35, ph=6.2, 5h hydrolysis time, 4g/l substrate concentration, 10ml enzyme amount for the removing of hydroxyl radical; 33, ph=6.0, 5h hydrolysis time, 6g/l substrate concentration, 9ml enzyme amount for the removing of superoxide radical; 33, ph=6.2, 8h hydrolysis time, 3g/l substrate concentration, 8ml enzyme amount for the removing of dpph free radical. after preliminary purification, the molecular weights of three kinds of oligosaccharides samples were preliminarily measured by liquid chromatography. the results show that the molecular weights of oligosaccharides with highest performance is about 1000 for removing hydroxyl radical, 900 for removing superoxide radical, and 670 for removing dpph free radical. key words: oligoxanthan; xanthan-degrading enzyme; enzymatic action; preparation; biological activities 烟台大学学位论文原创性声明和使用烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明授权说明 原创性声明原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明学位论文使用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 71 版权声明 任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人，未经本论文作者同意，不得将本论文转借他人，亦不得随意复制、抄录、拍照或以任何方式传播。否则，引起有碍作者著作权之问题，将可能承担法律责任。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1 1 前言 1.1 寡糖生物活性的研究进展 寡糖（oligosaccharides） ，也称低聚糖，由 210 个单糖单元经糖苷键结合而成，分子式为 （c6h10o5）n，n=210，根据结合的单糖个数，可分为二糖、三糖直至十糖。构成寡糖的单糖结构单元主要是五碳糖和六碳糖，基本上由六种单糖所组成，即葡萄糖（glucose） 、半乳糖（galactose） 、木糖（xylose） 、果糖（fructose） 、阿拉伯糖（arabinose）和甘露糖（mannose）等。目前，已确认的寡糖有 1000 多种。 近年来，有越来越多的寡糖衍生物被开发为保健品、药物、农药、饲料添加剂等，而且寡糖成分的新功能不断被发现。随着糖生物工程与糖生物学的研究，研究者们不断揭示了寡糖的生物活性以及功能原理，使得寡糖产品在市场上的需求量不断增加，尤其是功能优异的寡糖将具有更广阔的市场。另外，寡糖还有促生长和防病的植物调节作用，有些寡糖还可以做新型的生化肥料、农药等。随着人们对绿色食品的需求量的不断增加，寡糖在农业上将会有越来越广阔的市场前景。 1.1.1 抑菌作用 目前对寡糖抑菌作用研究最多的有壳寡糖、半乳糖苷寡糖和果寡糖等，特别是对壳寡糖的抑菌作用的研究取得了突破性的进展。 夏文水等1研究发现，不同脱乙酰度的壳寡糖对大肠杆菌的抑制作用有所不同，壳寡糖的抑菌率与脱乙酰度的程度密切相关，壳寡糖的脱乙酰度越高氨基含量也就越高，它的抑菌作用也就越大。you-jin jeon，pyo-jam park&se-kwon kim 以 4 种乳酸菌， 5 种革兰氏阳性细菌及 4 种革兰氏阴性细菌为实验菌种对壳寡糖进行了抑菌实验，实验结果表明壳寡糖除乳酸菌外对其它细菌的生长具有不同程度的抑制作用2。christakopoulos，katapodis 等也证明了这一点3。杨声等4研究发现，壳寡糖对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等都有不同程度的抑菌作用。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 2 壳寡糖的相对分子质量较小，因此比较容易透过细菌的细胞膜进入细胞质和细胞核内，从而造成了细菌细胞内部相关酶的泄露，与此同时，透过细胞膜的壳寡糖还可以与 dna 等相互作用，使得 dna 正常的复制与转录被干扰了，壳寡糖就能够发挥其抗微生物的活性5,6。严钦等通过实验验证，壳寡糖的抑菌作用是通过它自身带正电荷的质子化铵同细菌带负电荷的细胞膜作用来达到杀菌的作用。其作用机理是由于细菌细胞膜的功能被干扰，使得细菌体内的细胞质流失，从而细菌细胞的生理代谢功能被扰乱了，壳寡糖就起到了杀菌的功效。 胡健7等研究表明不同分子量的壳寡糖对供试病原菌的抑制能力也不相同， 分子量为 1000 的壳寡糖对水稻白叶枯病菌的三折菌株的抑制作用显著，然而分子量相对较低或者相对较高的壳寡糖的抑菌效果较差。另外，不同含量的壳寡糖对植物病菌的抑制作用也不相同，壳寡糖含量越高，其抑菌效果就越显著。窦勇8等实验结果表明褐藻胶寡糖对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌具有很强的抑制作用，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑制作用较弱，然而对真菌几乎没有抑制作用。 琼胶寡糖 3.11%的浓度时就能有效的抑制细菌生长。褐藻胶寡糖仅需 0.625%的浓度就能够对大肠杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌起到抑制作用，2.5%的浓度就能够对枯草芽孢杆菌起到抑制作用，需要高达 10%的浓度才能够对啤酒酵母起到抑制作用。褐藻胶溶解度小、粘度大等特点，使得它很难扩散进入培养基中，从而使得褐藻胶在抑菌方面的应用受到了限制。 1.1.2 抗病毒活性 近年来，有关寡糖抗病毒活性的研究越来越多，研究发现寡糖对 hiv、hsv 有很强的抗病毒活性，能够起到显著的抑制 hiv、hsv 的作用，而且当有疏水基存在时寡糖的抗病毒活性更显著。有研究表明，壳寡糖有诱导植物抗病毒的活性，而且50g/ml 的壳寡糖抗病毒活性最强。mazumder 等研究发现，琼胶类硫酸半乳低聚糖对 i 型和 ii 型单纯疱疹病毒具有选择性的抗病毒活性。weinberger 等实验结果表明，聚合度在 68 之间的琼胶寡糖能够诱发藻类的生理反应，起到抗病毒活性的作用。yamada 等9,10研究了不同硫酸盐含量的o-乙酰卡拉胶的抗 hiv 活性， 以及不同相对分子质量的 o-乙酰卡拉胶的抗 hiv 活性，研究结果表明，硫酸酯化和降解后的卡拉胶抗 hiv 活性显著增强，同时其抗凝血活性也明显下降。kaname katsuraya 等11采烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 3 用磺酸化方法合成的寡糖抗 hiv 活性非常好，他们详细研究了寡糖的抗 hiv 的构效关系，研究发现单糖数越多并且寡糖的磺酸化程度越高，就有越高的抗 hiv 活性。这些化合物是罗布寡糖的衍生物，而且是由 46 个单糖组成的，其化学式如图 1.1。 图 1.1 罗布寡糖的衍生物 fig.1.1 ramification of loboligosaccharide 1.1.3 抗肿瘤活性 寡糖有着很好的抗肿瘤活性，也是近几年研究的热点。在寡糖的抗肿瘤研究中，在很多情况下寡糖可诱导细胞毒性，通过增强机体的免疫功能来实现抗肿瘤的功效。果寡糖可以降低肠道内致癌因子的含量，而且还可以降低消化道内由于蛋白质和氨基酸降解产生的吲哚、酚等有毒物质。suzuki 等又证明壳六糖对 meth-a 瘤细胞具有显著的抑制作用。目前国内外学者较多的研究了壳寡糖的抗肿瘤作用，1970 年报道了来源于甲壳质的壳寡糖的抗肿瘤活性。muzzarelli12研究发现，肿瘤细胞的表面比正常细胞的表面具有更多的负电荷，壳寡糖自身氨基所带的正电荷，可以与之结合，从而抑制肿瘤细胞的生长，因此，壳寡糖是由于自身所带正电荷的氨基才具有的抗肿瘤活性。wang等13研究发现，乙酰化壳寡糖抑制肿瘤血管生成的效果要比壳寡糖好的多。maeda 等14则研究发现不同相对分子质量的壳寡糖的抗肿瘤活性也不相同，相对分子质量较小的壳寡糖有着很强的抗肿瘤活性。 刘莹等15研究揭示了，壳寡糖能够直接的抑制肿瘤细胞的生长。随着科学的发展，壳寡糖不断的被各种化学所修饰，huang 等16研究发现，硫酸化和季铵化的壳寡糖有明显的抑制人的宫颈癌细胞的作用。综上所述，大部分学者认为，壳寡糖之所以有抗肿瘤作用，都是与其自身的相对分子质量（mr） 、正电性、化学修饰和脱乙酰度有关。因此，研究壳寡糖的抗肿瘤活性就要从以上几方面进行分析。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 4 1999 年， quchi-t17等研究发现 3 个壳寡糖通过六亚甲基空间通道与 5-氟尿嘧啶（5-fu）共轭结合后，其抗肿瘤作用大大增强了，而且远远强于 5-fu；研究发现注射后能够抑制肿瘤的生长，而且不会使小鼠引起急性中毒，也不会使小鼠的体重迅速下降。寡糖本身并无细胞毒性，因此大大降低了寡糖作为抗肿瘤药物潜在的毒副作用。上述寡糖及其衍生物抗肿瘤活性的研究，为其作为抗肿瘤新型药物的开发提供了基础资料。 1.1.4 寡糖的抗感染作用 寡糖作为多糖类降解后的产物，可能是多糖发挥生物学效应的一个活性片段。近年铃木等发现 n-乙酰壳寡六糖具有很高的抗感染活性作用； minami 等人也证实了壳寡糖对伤口的愈合有明显的功效，可以开发为医用品。许多学者已经证实了寡糖在抗感染方面的作用。 suzuki18发现提高了 pec 的杀菌能力以及活性氧的生成，据此认为开发这些寡糖作为幼畜的疫苗试剂，幼畜自身免疫系统尚不发达，因此不能注射普通的疫苗。而寡糖疫苗无抗原性，很适合对幼畜注射。1989 年，suzuki 等19又发现几丁六糖能够激发巨噬细胞释放出 h2o2，来抑制 l.monocytogenes 的生长，直接使用几丁六糖也能起到抑制生长的作用，然而联合应用的话效果就会更好。此外，寡糖对绿浓杆菌也具有抗感染的功效。寡糖可以与免疫活性细胞上的糖受体结合，激发免疫活性细胞释放激素和细胞因子，从而将下游的效应细胞活化，寡糖还可以通过不同途径来达到调节和增强免疫系统的功效。 1.1.5 降血糖 近年来，随着寡糖产品的陆续上市，人们对寡糖生物活性的研究也就越来越关注，有文献报道，寡糖还有降血糖的功效，可以用来制备降血糖的药物，效果很好，而且也不会有副作用。lu等20从魔芋根提取了 3 个相对分子质量不同的寡糖，研究发现相对分子质量为 666 的四糖能够有效的降低血糖，寡糖在 1.5mmol 的低浓度时不仅能显著降低胰岛中的 no+自由基水平，而且还能增加胰岛素的分泌，从而抑制血糖，有效的降低血糖。寡糖不会使血糖升高，因此对于高血糖和糖尿病人来说是很适合食用的。例如，壳寡糖就可以降低血清中的胆固醇，降低人的血脂，增大对烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 5 钙、铁、镁的吸收率。此外，天然的纯寡糖还有预防蛀牙、供能、促进矿物质吸收以及降低血脂等十分重要的功效21。 张汝学22等研究发现地黄寡糖能够显著降低四氧嘧啶（alx）糖尿病大鼠的高血糖水平，还能使肝糖的原含量增加，同时也能使肝葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低。然而对于正常大鼠的血糖，地黄寡糖却不能起作用。但是我们可以用地黄寡糖来预防由肾上腺素及葡萄糖引起的高血糖的症状。地黄寡糖的主要活性成分为水苏糖，有较好的降血糖作用23。 同时进一步研究发现地黄寡糖(ros)具有很好的调整由胸腺切除术（tx）引起的神经内分泌免疫调节（nim）网络失调状态下的糖代谢紊乱的功效24。 1.1.6 增强造血功能活性 众所周知，中药具有纯天然、低副作用等优点，但是中药的成份比较复杂，作用机理也不容易阐明，因此，中药一直难以得到国际的公认。要改变这种现状，从中药中提取出有效成分是研究者首要解决的问题。近年研究表明，中药中的多糖或寡糖类有 效成分 能很好 的促进 造血系 统。地 黄寡糖 （rehmannia glutinosa oligosaccharide，rgos）是从地黄多糖中分离提取出的有效成分。地黄寡糖不仅可以增强正常小鼠的骨髓造血功能，而且还能增强造血功能低下小鼠的造血功能，是补血活气的良药。 武卫红25对从地黄中提取的甘露三糖和水苏糖进行了考察，研究发现两者均有促进造血的功效，并且甘露三糖在促进造血祖细胞增殖分化方面的作用比水苏糖强很多，据此推测甘露三糖和水苏糖可能是通过促进分泌造血生长因子的途径从而促进造血祖细胞的增殖分化，最终达到促进造血的作用。 1.1.7 其他生物活性 多羟糖酸组分是从甘草（glycyrrhiza uralensis）根的果胶多糖类中提取出的中性低聚糖，具有抗补体和促有丝分裂活性26。崔承彬等研究发现，巴戟天提取物有明显的抗抑郁活性27。纯寡糖(如果聚糖、乳果糖、异麦芽糖、大豆低聚糖等)可作为一种促双歧杆菌生长因子（bifidus factor，bf）28。minami 等人研究发现壳寡糖对伤口的愈合有显著的作用，除此之外，还发现几丁寡糖、壳寡糖还在植物生长、分化烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 6 及生物体抗御方面具有信号传导活性29。聚阴离子寡糖有着良好的抗凝活性，有些寡糖还具有保护胃肠道30、抗休克、抗过敏、保护肝脏及抗过氧化等作用。 1.2 黄原胶概况 20 世纪 50 年代，黄原胶由美国农业部地区实验室的科学家，在筛选能产生具有商业价值水溶性胶的微生物的过程中所发现的。1960 年，进行了黄原胶的第一次工业化生产；1964 年，黄原胶产品第一次实现了商业化。毒理学和安全性研究表明，当以黄原胶喂养白鼠和狗时，无论是长期还是短期的喂养，黄原胶都不会对动物产生毒性，不会抑制其生长，不会改变生物体的体重、血液量，也不会引起肿瘤。1969年，美国 fda 批准可将黄原胶用于食品；1974 年，fao（粮食农业组织）/oms 也作出了同样的许可；1978 年 3 月，黄原胶在法国获得批准；1982 年，其在欧洲也获得许可（在 e415 下） 。欧洲食品管理条例对 e415 的官方定义为：黄原胶是由野油菜黄单孢菌（xanthomonas campestris）天然菌株经纯种培养发酵后所得到的一类高分子多糖胶，用乙醇或异丙醇进行分离纯化，并最终进行干燥和碾磨。其主要的己糖单位为 d-葡萄糖和 d-甘露糖，除此之外，还有 d-葡萄糖醛酸和丙酮酸。它可制备成钠盐、 钾盐、 或者钙盐， 这些盐溶液是中性的， 允许摄入量 （acceptable daily intake，adi）并没有规定，也就是说，并没有对每日允许摄入量有什么限制；黄原胶在运用中使用适当的量， 适量使用。 今天， 黄原胶已由几家公司如 monsanto/kelco、rhodia、jungbunzlauer、archer daniels midland 和 skw biosystem等进行商业化生产。在过去的几年中，中国也有公司生产黄原胶。2001 年其全世界的总产量为 35000t。 1.2.1 黄原胶的结构 黄原胶（xanthan gum）又称为汉生胶。黄原胶是一种由重复单位组成的高分子多糖（图 1.2） 。黄原胶是由 -1，4-键连接形成的葡聚糖纤维素主链骨架，间隔的葡萄糖基上接有甘露糖葡萄糖甘露糖的支链，其中，与主链相接的甘露糖往往是被乙酰基修饰过的，而侧链末端的甘露糖通常是由于与丙酮酸发生缩醛反应而被修饰的，夹在两个甘露糖中间的葡萄糖往往被氧化成葡萄糖醛酸。末端甘露糖部分可以在 4 位和 6 位连接丙酮酰残基。侧链上连接的乙酰基和丙酮酰残基的量的变化是烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 7 由从哪一类野油菜黄单胞菌中分离得到的黄原胶而决定的，丙酮酸的含量的变化还与发酵条件有重要的关系。通常，丙酮酰基的取代程度在 30%40%之间，而乙酰基的取代程度要高的多，高达 60%70%。 图 1.2 黄原胶分子结构图 fig.1.2 structure of xanthan gum 黄原胶的二级结构是其分子结构中侧链和主链通过氢键连结形成的侧链绕主链骨架反向缠绕的双螺旋结构。有序构象的天然黄原胶是以对称的五折右手螺旋形式存在的，螺距为 4.7mm，直径为 1.9mm31。黄原胶的三级结构在水溶液中以液晶形式存在，依靠双螺旋结构之间微弱的共价键作用力结合而形成网状立体结构32。 1.2.2 黄原胶的理化性质 黄原胶为乳白、淡黄至浅褐色颗粒或粉末状体，无味、无臭、适用安全性强，易溶于水，水溶液呈中性，而且是半透明体。在水溶液中呈多聚阴离子且构象是多样的，具有独特的理化性质。 黄原胶在较大的温度范围（-18130）仍能保持特有的功能，具有良好的温度稳定性； 黄原胶粘度在 ph 值 112 范围内能保持原有特性， 具有良好的酸碱稳定性，从而拓宽了它的应用范围；黄原胶与高浓度盐类等共存时，仍保持稳定的增稠体系，具有良好的盐稳定性；蛋白酶等多种酶类都很难将黄原胶分解，它具有良好的酶稳定性。以上都是黄原胶的稳定性，除此之外，黄原胶还具有增稠性、假塑流变性、与增稠剂的协效性、悬浮性和乳化性、微波稳定性等等。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 8 1.2.3 黄原胶的应用 黄原胶是性能最优越的生物胶，这一点在国际上公认的。黄原胶的应用范围广泛，大量应用在食品、果汁、饮料、饲料、化妆、医药、陶瓷、消防、石油等行业33，其市场增长潜力超过其它所有的亲水性胶。目前，世界黄原胶产量约 5 万 t/a，而且每年的产量还以 8%的速度递增34。据统计，美国每年生产的黄原胶，其中 30%用于食品工业，70%用于其他工业35。与国外相比，我国应加强对黄原胶在各个行业中应用以及黄原胶性质的研究。 如表 1.136列出了黄原胶在各行业的应用、 用量及作用。 表 1.1 黄原胶的应用 tab.1.1 application on xanthan gum 用途 用量（%） 作用 液体饮料 0.1-0.3 增稠、混悬、提高感官质量 固体饮料 0.1-0.3 更易成型、增强口感 肉制品 0.1-0.2 嫩化、持水、增强稳定性 冷冻食品 0.1-0.2 增稠及增加细腻度、稳定食品结构 调味品 0.1-0.3 乳化、增稠、稳定 馅类食品 0.5-1.5 便于成型、增强口感 面制品 0.03-0.08 增强韧性、持水、延长保质期 化妆品 0.3-1.2 提高附着润滑能力，增稠、定形 牙膏 0.4-0.6 提高附刷、跟刷力、增加分散、爽口感 饲料 0.5-2.0 粘合剂 钻井液 0.1-0.4 抗盐、抗高温、假塑性 采油 依油层定 驱油、提高采油率 印染 0.4-0.6 载色，使颜料分散、增加着色、增色力度 陶瓷 0.3-1.0 悬浮剂、润滑增色、控制干燥 农药 0.1-0.5 乳化剂、粘着剂、悬浮剂、稳定剂 炸药 0.5-2.0 形成浆状防水 水溶涂料 0.2-0.3 增加水溶性 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 9 1.3 黄原胶降解的意义 1.3.1 探讨黄原胶构效关系的信息 我们目前研究最为透彻的，商业化应用程度最高的多糖是黄原胶。由野油菜黄单胞菌的突变菌株分泌的由重复的四糖单位（侧链由二糖构成，图 1.3a）和三糖单位（侧链为单糖，图 1.3b）组成的黄原胶，研究发现四糖单位组成的聚糖（图 1.3a）一般不会增大溶液的粘度37，而由三糖单位（图 1.3b）组成的聚糖却能很大程度的增加溶液的粘度，很适合做增粘剂38。因此，我们可以通过改变黄原胶降解的各种因素从而达到控制黄原胶降解的目的，得到我们所需要的降解物。而且通过改变黄原胶降解的各种因素还可以将黄原胶侧链上的单糖逐个剥离，控制黄原胶的降解程度，并逐一研究其性质，可以得到有关功能的关键位点的信息。 a b 图 1.3 突变株所产黄原胶 fig.1.3 modified xanthan 1.3.2 制备具有特殊生物活性的寡糖产品 目前，市场上已经有很多种寡糖产品。近年来，黄原胶寡糖是研究的热点，因此它是否具有生物活性激起了人们强烈的兴趣。目前已有黄原胶寡糖具有抗氧化活性、抑制 h2o2诱导的小鼠红细胞溶血、有较强的植物诱抗活性等的报道39。何晓燕等的研究发现，黄原胶寡糖可抑制黄单胞杆菌的生长，据此认为黄原胶寡糖具有潜在的防治油菜茎腐病能力40。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 10 1.3.3 制备具有新的理化特性的黄原胶 黄原胶的流变学、溶解度、分散度等方面的性质会随着黄原胶分子量以及侧链长度和侧链取代基的变化而改变41。我们可以利用黄原胶的这个性质，来生产制备具有新的理化特性的黄原胶，例如，在石油钻探工业中，我们可以用抗高温氧化的黄原胶。我们还可以使用突变株生产具有新的理化特性的黄原胶，但产率较低42。 1.3.4 提高黄原胶的工业应用效果 黄原胶最主要的特征就是高粘度和高稳定性，其作用有利有弊。它在增大黄原胶应用范围的同时，也带来了一些问题。众所周知，在钻井液中，黄原胶可起到增粘、改善流变性能等作用。黄原胶溶液还有剪切稀化的流动特性应用在牙膏中使之容易挤出，酸奶的增稠也是应用黄原胶的增粘性。然而在采油业中，由于使用了黄原胶，虽然使得石油容易采出，但是同时也带来了一些弊端，使得采出液的粘度变大，原油的密度也有所增加，原油的乳化状态变得复杂，使得污水处理的难度加大了，同时也增大了原油的运输难度和纯化的成本。通过对黄原胶降解的研究，我们可以掌握黄原胶的理化特性变化的规律，从而避免因使用黄原胶而带来的弊端，提高黄原胶的工业应用效果。因此，只有将黄原胶降解，才能灵活自如的应用黄原胶，充分利用黄原胶的优势，在避免由于黄原胶的加入而带来的各种弊端方面具有重要意义。 1.4 本文的研究目的及内容 1.4.1 本文的研究目的 随着科技的发展，市场上涌现出越来越多的寡糖产品。黄原胶降解产生的寡糖在生物活性方面的功效，吸引着人们不断地去探索。目前，已经有报道黄原胶寡糖具有抗氧化活性、植物诱抗活性等。多糖降解制备寡糖的方法有化学法、物理法、生物酶法。其中，生物酶法条件温和，易于得到寡糖，是研究者首选的方法。本实验室从环境中分离筛选出黄原胶降解菌 paenibacillus lautus xd2-843，利用该菌制备出黄原胶降解酶，并利用该黄原胶降解酶来降解黄原胶，制备黄原胶寡糖。通过改烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 11 变温度、ph、酶解时间、加酶量、黄原胶底物浓度等因素对制备黄原胶寡糖生物活性的影响，确定制备具有生物活性的黄原胶寡糖的最佳工艺条件。并对制备的黄原胶寡糖初步提纯，然后通过高效液相色谱仪初步测定出具有生物活性的黄原胶寡糖的分子量，从分子量上来定义该黄原胶寡糖。 1.4.2 本文的研究内容 本文主要是利用实验室从周围环境中分离出的黄原胶降解菌 paenibacillus lautus xd2-8， 以黄原胶为底物摇瓶培养， 制备出黄原胶降解酶。 寡糖是近几年研究的热点，尤其是利用酶法降解多糖来制备寡糖具有重要的意义。利用黄原胶降解酶来降解黄原胶，制备具有生物活性的黄原胶寡糖，并对黄原胶寡糖的制备工艺进行了初步研究。本文的研究内容主要是以下三个方面： （1）通过测定发酵温度、底物浓度、ph、摇瓶装量等因素对发酵液的菌体密度和相对酶活力的影响，确定该菌的最佳产酶条件，从而有利于制备黄原胶降解酶。 （2）在该菌的最佳产酶条件下，发酵培养，采用硫酸铵盐析的方法制备黄原胶降解酶，并对该酶的酶学性质作了初步研究，为进一步制备黄原胶寡糖提供了依据。 （3）利用该黄原胶降解酶来降解黄原胶，并初步研究了制备具有生物活性的黄原胶寡糖的工艺条件，确定该酶制备具有清除羟基自由基活性、清除超氧阴离子自由基活性以及清除 dpph 自由基活性的黄原胶寡糖的最佳工艺条件。然后对制备的具有生物活性的黄原胶寡糖初步提纯，进行高效液相分析，初步测定黄原胶寡糖的分子量。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 12 2 黄原胶降解菌 xd2-8 的发酵和产酶条件优化 本课题组以黄原胶水溶液为介质在生物反应器中研究不同的搅拌桨对传质影响的过程中发现，放置在环境中的黄原胶水溶液在经过一段时间后粘度大幅度降低，据此我们可以认为周围空气中存在可以降解黄原胶的菌株，因此，从该降解了的黄原胶水溶液中筛选分离出了一株能够迅速降解黄原胶的菌株，并对该菌株的形态、生理生化特性进行了系统的研究及 16s rrna 序列分析， 初步鉴定该菌属于类芽孢杆菌属（paenibacillus） ，灿烂类芽孢杆菌种（paenibacillus lautus） ，并将其命名为paenibacillus lautus xd2-843。 本实验是利用黄原胶降解菌 paenibacillus lautus xd2-8 对黄原胶的降解，发酵液在粘度降低的同时伴随着还原糖生成量的增加，而且发酵液中的菌体密度也逐渐增加。通过测定温度、底物浓度、ph、摇瓶装量等因素对发酵液的菌体密度和相对酶活力的影响，确定该菌产酶的最佳条件。 2.1 实验材料 2.1.1 菌种 黄原胶降解菌 paenibacillus lautus xd2-8：由烟台大学生物工程实验室分离并保存。 2.1.2 培养基 斜面培养基（g/l） ：黄原胶：5.0，牛肉膏：1.0，蛋白胨：1.0，酵母浸粉：1.0，nacl：5.0，葡萄糖：5.0，琼脂：1520，初始 ph 值 7.5。121灭菌 30min。 液体摇瓶产酶培养基（g/l） ：黄原胶：10.0，牛肉膏：1.0，蛋白胨：1.0，酵母浸粉：1.0，nacl：5.0，葡萄糖：1.0，初始 ph 值 7.5。121灭菌 30min。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 13 2.1.3 主要仪器设备 生化培养箱 lrh-250 型 上海一恒科学仪器有限公司 全温度恒温培养振荡器 zhwy-2102 型 上海智城分析仪器制造有限公司 紫外可见分光光度计 752 型 上海菁华科技仪器有限公司 高速冷冻离心机 20pr-52d 型 hitachi koki co, ltd. 2.2 分析方法 dns 法测定还原糖含量44，3，5二硝基水杨酸（3，5dinitrosalicylic acid） ，简称 dns。在碱性条件下，还原糖与 3，5二硝基水杨酸共热，3，5二硝基水杨酸被还原为 3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质） ，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。 2.2.1 dns 试剂的配制 （1）准确称取 3，5二硝基水杨酸（c7h4n2o7）6.3g，氢氧化钠 21.0g充分溶解于 500ml 蒸馏水中（水先煮沸 10 分钟后冷却） （2）加入酒石酸钾钠（c4h4o6kna 4h2o）182.0g，苯酚（在 50水中融化）5.0ml，偏重亚硫酸钠（nas2o5）5.0g，搅拌至全溶，定容至 1000ml。 （3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置 10 天后便可使用。平时盛一小瓶放在外面使用，其它储于冰箱中。此溶液每月配制一次。 2.2.2 葡萄糖标准溶液的配制 配制 1mg/ml 的葡萄糖标准液，准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 105干燥恒重的标准葡萄糖） ，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至 100ml 刻度，摇匀，置冰箱中保存备用。 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 14 2.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制 按照表 2.1 所示在 6 个试管中分别加入葡萄糖标准溶液、蒸馏水、dns 试剂。然后将各管摇匀，在沸水浴中加热 5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再各加入 9ml 蒸馏水，摇匀。在 540nm 波长下，用 0 号管调零，分别读取15 号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线如图 2.1 所示。 表 2.1 dns 试剂法测定还原糖含量 tab.2.1 determination of reducing sugar content by dns reagent 管号 葡萄糖标准 溶液（ml） 蒸馏水 （ml） dns（ml） 葡萄糖含量（mg/ml） 0 0 1.0 2 0 1 0.2 0.8 2 0.2 2 0.4 0.6 2 0.4 3 0.6 0.4 2 0.6 4 0.8 0.2 2 0.8 5 1.0 0.0 2 1.0 y = 0.9881x + 0.0322r2 = 0.993800.20.40.60.811.200.20.40.60.811.2葡萄糖含量（mg/ml）540nm吸光度 图 2.1 葡萄糖标准曲线 fig.2.1 the standard curve of glucose 烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 15 2.2.4 黄原胶降解酶酶活力测定方法的建立 在一定条件下，酶所催化的反应速度称酶活力，即一定时间内底物分解的量或产物生成的量，用单位数表示。黄原胶具有突出的高粘性和水溶性，1%的黄原胶水溶液粘度相当于相同浓度明胶溶液粘度的 100 倍。随着黄原胶降解酶对黄原胶的降解，在黄原胶溶液粘度不断下降的同时伴随着还原糖生成量的不断增加，因此，可以用粘度的下降或者还原糖的生成量来表示酶活力的大小。然而，黄原胶具有独特的假塑性流变学特征，这就要求有精度很高的粘度计才能准确测定黄原胶溶液的粘度，而且需要相当大的样品的量。因此，采用降解液中还原糖的生成量来表示酶活力的大小。 500l酶液 + 500l酶液 500lxanthan gum溶液（5g/l） 沸水浴 5min 35水浴反应 30min 500l xanthan gum溶液（5g/l） 沸水浴 5min（反应组） 35水浴反应 30min（空白） 9000rpm下离心 20min后取上清液 加入 2mldns 溶液沸水浴加热 5min 冷却后加入 9ml蒸馏水 以蒸馏水为对照，分别测定两组的 od540 图 2.2 黄原胶酶活力的测定方法 fig.2.2 inspecting method of xanthan enzyme activity 将活化后的黄原胶降解菌xd2-8按1%接种量接种至100ml(5g/l)黄原胶液体摇烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 16 瓶产酶培养基中培养。摇床转速为 200r/min，3d（此时粘度已经大幅度降低）后将发酵液在 9,000r/min，4条件下离心 20min，除去菌体，得到的上清液作为黄原胶降解酶的酶液。按图 2.2 方法检测其活力，在分光光度计 540nm 处测定吸光度，根据已知的吸光度和葡萄糖标准曲线， 就可以将两组od540差值折算成还原糖生成量，再根据酶活力单位的定义，计算出黄原胶酶活力。 酶活力单位定义：在 ph6.0，35，底物浓度为 5g/l 条件下，酶解反应 30min，每分钟水解黄原胶溶液产生 1mol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（u） 。 2.3 实验方法 2.3.1 黄原胶降解菌 xd2-8 的培养及发酵参数的确定 先将黄原胶降解菌 xd2-8 转接到斜面培养基上，在培养箱中 30培养 23 天。然后将活化后的黄原胶降解菌 xd2-8 接种至装有 100ml 黄原胶液体产酶培养基的300ml 三角瓶中，接种量为 1%，将接好种的三角瓶放到旋转式摇床上培养，培养温度为 30，摇床转速为 200r/min。在培养过程中每间隔 6h取样，分别测定发酵液的od620、上清液中的还原糖含量（dns 法）及粘度。 2.3.2 发酵条件的优化 微生物产酶是个复杂的生理生化过程，菌体的生长和新陈代谢与培养条件有着直接的关系，培养条件改变了，菌体生长的和代谢的速度也会随之改变，从而影响菌体的产酶量。为了提高生物酶法水解黄原胶多糖的能力，对菌株 xd2-8 的发酵条件及产酶条件进行了研究，从而提高菌株 xd2-8 的产酶量。因此，对菌株 xd2-8 的发酵产酶条件进行优化是提高产酶量的前提。 2.3.2.1 温度对发酵产黄原胶降解酶的影响 按照 2.1.2 所述配制黄原胶液体摇瓶产酶培养基，在容量为 300ml 的三角瓶中装入 100ml 黄原胶液体摇瓶产酶培养基，即：摇瓶装量为 100ml，黄原胶浓度为10g/l，灭菌前初始 ph 为 7.5，121灭菌 30min 后，在无菌室接菌，接种量为 1%。接种后将摇瓶放到温度分别为 25、 30、 35的摇床上培养， 摇床转速为 200r/min。烟烟 台台 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 17 每隔 1 天测定黄原胶发酵液的酶活力，绘制出温度对发酵产黄原胶降解酶的影响曲线，从而确定最佳发酵温度。 2.3.2.2 温度对菌体生长的影响 按照 2.1.2 所述配制黄原胶液体摇瓶产酶培养基，在容量为 300ml 的三角瓶中装入 100ml 黄原胶液体摇瓶产酶培养基，即：摇瓶装量为 100ml，黄原胶浓度为10g/l，灭菌前初始 ph 为 7.5，121灭菌 30min 后，在无菌室接菌，接种量为 1%。接种后将摇瓶放到温度分别为 25、 30、 35的摇床上培养， 摇床转速为 200r/min的。每隔 1 天在紫外可见分光光度计 620nm 下测定发酵液的菌体密度，绘制出温度对菌体生长的影响曲线，从而确定最佳细菌生长温度。 2.3.2.3 底物浓度对发酵产黄原胶降解酶的影响 分别配制底物浓度为 5g/l、 10g/l、 15g/l 的黄原胶液体培养基， 在容量为 300ml的三角瓶