（生物物理学专业论文）类菌紫质蛋白在膜上聚集状态与功能研究.pdf

兰兰查兰! 圭兰兰望苎一 摘要 菌紫质( b a c t e r i o r h o d o p s 简称b r ) 是一种光驱动的质子泵，能将太阳 光能转化为质子的电化学势能。它是嗜盐菌( h s a l i n a r u m ) 紫膜上唯一的蛋白 质组份，以三聚体形式在紫膜上堆积成二维六方晶格。f 这种聚集状态是如何组 织并保持稳定的? 这种三聚体组织方式在功能上又有什么重要性? 这是我们研 究工作关注的焦点7 一。 在紫膜中，菌紫质光循环随着激发光强度的改变，m 中间态的衰减速率发 生相应变化。( 这一特性的原因尚未确定。我们认为这种光依赖现象完全可以用 光协同效应来解释。这种协同效应不仅与菌紫质的三聚体聚集状态有关，也与 茵紫质分子在紫膜上的晶型有序排列有关。紫膜在碱性介质中，加温至5 0 一6 0 时，三聚体仍然存在，但晶格结构已有破坏，此时也不存在协同效应少一 从西藏扎北湖分离到又一株极端喜盐的嗜盐菌( h 印x z 5 1 5 ) 。在此嗜盐菌 里含有一种类b r 蛋白，称之为x z 5 1 5 。与紫膜相对应的，x z 5 1 5 在细胞膜上 形成紫红色的特异性区域，称之为紫红膜。我们发现紫红膜上的茵紫质光循环 也受激发光强度的调制。f 而原子力显微镜图象显示，x z 5 1 5 三聚体在紫红膜上 也形成二维六方晶阵。比较x z 5 1 5 和b r 的c 螺旋至g 螺旋氨基酸序列，我 们可以推断，膜内c l 螺旋问的相互作用对这种蛋白聚集方式有重要意义。 一。， 、，关键词：菌紫质、紫膜、光循环、原子力显微镜、蛋白质间相互作用 复旦大掌硕士掌1 立就? 二 - _ - _ - _ _ _ - _ - - _ _ - _ _ - _ _ _ ，_ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - a b s t r a c t b a c t e r j o r h o d o p s i n ( b r ) i s a l i g h t d r i v e np r o t o np u m pt h a tc o n v e r t s o l a r e n e r g yi n t oap r o t o ne l e c t r o c h e m i c a lp o t e n t i a l i ti st h e s o l ep r o t e i nc o m p o n e n t o ft h ep u r p l em e m b r a n e ( p m ) o fh a l o b a c t e r i u ms a l i n a r u m ，w h i c h i sat w 0 4 d i m e n s i o n a ll a t t i c eo fh e x a g o n a l l yo r g a n i z e db a c t e r i o r h o d p s i nt r i m e r s h o wi s t h i s c o m p l e xa s s e m b l e da n ds t a b l i z e d ? w h a ti st h ef u n t i o n a ls i g n i f i c a n c e o f t h i sm a c r o s c o p i c o r g a n i z a t i o no f t r i m e r s ? i ti st h ef o c u so fo u rr e s e a r c h i tw a so b s e r v e dt h a tt h eb a c t e n o r h o d o p s i np h o t o c y c l er e s p o n d st ot h e i n t e n s i t yo fa c t i n i cl i g h tb ya l t e r i n gt h ed e c a yr a t eo ft h em i n t e r m e d i a t ei nt h e p u r p l em e m b r a n e t h eo r i g i no f t h i sb e h a v i o rh a sn o tb e e ns e t t l e d w e s u g g e s t t h a tt h i sl i g h t d e p e n d e n tp h e n o m e n o nc o u l db ee x p l a i n e dp u r e l yo nt h eb a s i s o fp h o t o c o o p e r a t i v i t y , w h i c hn o to n l yr e l a t e sw i t ht h ea g g r e g a t i o ns t a t eo fb r t r i m e r , b u ta l s ow i t ht h ec r y s t a la r r a n g e m e n to fb r i n p u r p l em e m b r a n ew h e n p u r p l em e m b r a n es u s p e n d s i na l k a l i n em e d i u m ，w i t ht e m p e r a t u r er a i s e dt o5 5 6 0 ，w h e r eb rk e e p st r i m e ra g g r e g a t i o ns t a t e b u tc r y s t a ll a t t i c ei sr u i n e d ，t h e p h o t o c o o p e r a t i v i t yb e t w e e nb r m o l e c u l e sc a nn o tb eo b s e r v e d a n o t h e rs t r a i no fe x t r e m e l yh a l o p h i l i ch a l o b a c t e r i ah a l o b a c t e r i u ms p e c i e s x z 5 1 5f r o mas a l tl a k e 。t i b e t c h i n aw a si s o l a t e d an e wb r l i k ep r o t e i nn a m e d a sx z 5 15w a sf o u di ni t a n dx z 5 15m a k e sac l a r e t - c o l o u r e dp a t c hr a t h e rt h a n p u r p l em e m b r a n e ，w h i c h w ec a l lc l a r e tm e m b r a n e i nt h ec l a r e tm e m b r a n e ，w e a l s od i s c o v e r e dt h a tt h ek i n e t i c so ft h eb a c t e r i o r h o d o p s i n p h o t o c y c l e i s m o d u l a t e db yt h el e v e lo fa c t i n i cl i g h ta n dt h ea f m ( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ) i m a g e s h o w st h a tx z 5 15t r i m e r s a g g r e g a t e t of o r mat w o d i m e n s i o n a l h e x a g o n a l l a t t i c ei nt h ec l a r e tm e m b r a n ea sw e l la sb ri nt h e p u r p l e m e m b r a n e c o m p a r i n gt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e sf r o m h e l i c e sct ogo f h a l o b i u mb ra n dx z 5 1 5 ，w ec a nc o n c l u d et h a th e l i x h e l i xi n t e r a c t i o n sw h i t h i n t h em e m b r a n ec o n t r i b u t es i g n i f i c a n t l yt ot h ef o r m a t i o no ft h ep r o t e i nt r i m e r s k e yw o r d s ：b a c t e r j o r h o d o p s i n ，p u r p l em e m b r a n e ，p h o t o c y c l e ，a f m p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n i i ，：旦大掌硕士掌位饨文 综述 一，菌紫质( b a c t e r i o r h o d o p si n ) 本世纪六十年代，在一种极端喜盐的嗜盐菌h s a l i n a r u m 中，发现了一种 视黄醛蛋白。由于其结构和功能与高级动物视网膜上的视生色素一一视紫红质 极为相似，因而称为细菌视紫红质( b a c t e r i o r h o d i p s i n ，简称茵紫质或b r ) ， 其分子量为2 6 5 k d a ”。作为光驱动质子泵，它被认为是以最简单的形式揭示了 跨膜离子泵的普适机理。 - 5b r 受到光照，视黄醛发生异构化一一由a l l t r a n s 变为1 3 - c i s ，1 5 - a n t i ，并引发一系列热反应，经过k 、l 、m 、n 等一系列中间态， 在约1 0 毫秒内又回复到基态，从而形成一个光循环。在这一过程中，只是视黄 醛和b r 蛋白发生了构象变化，调节了不同基团的p k 值，将一个质子由细胞质 传输到细胞外。通过对b r 的研究，人们希望能在不涉及复杂的化学反应的情 况下，探寻离子泵能量耦合的规律。为此在过去的二十多年里，许多研究组用 各种不同的方法做了大量的工作尤其是最近几年高分辨晶体图谱的进展，使 在不久的将来全面理解其机制成为可能。 在嗜盐茵质膜上，b r 自组织成三聚体，并密堆积为平面六方晶阵，形成特 异的区域，称为紫膜1 2 1 。b r 中光驱动质子做跨膜运动，在紫膜两侧产生电位差 和p h 值梯度。嗜盐菌紫膜独特的光敏特性和稳定性使其在生物膜、生物能力 学、非线性光学材料、全息记录介质、神经网络、化学探测器、耐高温的光电 致变材料、人造视网膜等方面的研究中具有良好的应用前景f 3 j 。 1 b r 的结构 1 3 r 分子含有2 4 8 个氨基酸和一个生色团一视黄醛，其中7 0 的氨基酸 是疏水性的。电子显微镜的两维晶体衍射图确证，b r 由垂直于膜平面的七 个a 螺旋( a g ) ，螺旋间短环和n 末端、c 末端组成( 如f i g1 ) i e ) o 在螺旋 一 苎兰查竺竺竺苎兰查一 _ _ 一一 f i g2 s t e r e o v i e w so ft h es t r u c t u r e a n dh y d r e g e nb o n d i n go f t h e e x t r a c e l l u l a rr e g i o n i nt h eb r ( q u o t e d 仃o mf 10 】) 2 f i g1 r i b b o ns t e r e od i a g r a mo f b a c t e r i o r h o d o p s i n m o l e c u l e t h es e v e nt r a n s m e m b r a n e h e l i c e s s h o w na r er o u g h l y n o r m a lt ot h ep l a n eo ft h e b i l a y e r t h ec y t o p l a s m i cs i d ei s t h et o p ( q u o t e d 仃o m 【6 】) 兰兰查竺! 主兰竺查 一_ _ 一 一 间区域内，一个全反式的视黄醛平行于膜平面，通过一个质子化的s c h i f f s 碱基 连接到l y s 一2 1 6 。它把b r 分隔为胞外侧和胞质侧两个区域，其中各有一个天冬 氨酸一一a s p 一8 5 和a s p 一9 6 ，分别执行质子受体和供体的功能。另外，b r 的胞 外侧区域富含亲帕胜残基，如a s p - 2 1 2 ，a r g 一8 6 、g l u 一2 0 4 和g l u 一1 9 4 ，研究显 示它们在质子传导上扮演重要角色；而其胞质侧区域则缺乏这样一个极性氨基 酸系列。 三维晶体的x 射线衍射谱，在约2a 的分辨率上印证了这些特征8 1 1 。同 时，它揭示在胞外侧区域有许多水分子，它们和那些极性侧链共同构成了三维 的氢键网络( 如f i g2 所示) ”1 ；相对应的，在胞质侧区域，看到的结合水分子 要少得多胞外例的水分子和极性残基一起构成延伸到膜外的氢键链：a s p 一8 5 一 w a t e r 4 0 1 一w a t e r 4 0 6 - a r g 一8 2 - w a t e r 4 0 3 一w a t e r 4 0 4 一g l u 一19 4 一g l u 一2 0 4 一s e r - 1 9 3， a s p 一2 1 2 - w a t e r 4 0 6 一a r g 一8 2 及a s p - 2 1 2 - t y r 一5 7 一w a t e r 4 0 7 - a r g 一8 2 。这些氢键链应 当与光循环中a s p 8 5 质子化和胞外侧活性位点释放的能量耦合有关，并提供了 质子由a s p 8 5 释放到膜外的通道。胞质侧明显与功能有关的水分子有两个： w a t e r5 0 1 以氢键链接a l a 2 1 5 的肽键和t r p - 1 8 2 吲哚基上的n ；w a t e r5 0 2 链 接l y s 一2 1 6 和t h r - 4 6 【9 1 t h r - 4 6 以氢键链接到a s p 一9 6 ，t r p 一1 8 2 的吲哚环以范 德华( v a nd e r w a a l s ) 作用于视黄醛的1 3 一甲基。这样就提供了一种a s p 一9 6 和 视黄醛之间在光循环中长程耦合的可能机制。非光激活状态下，从s c h i f f s 碱基 至胞外侧可以形成一条质子传输通道，而广泛的氢键网络降低了潜在质子受体 a s p 一8 5 和a s p 2 1 2 的质子亲和力，并使s c h i f f s 碱基稳定于质子化状态。胞质 侧缺少这样的氢键网络，就使a s p 9 6 保持很高的质子亲和力，以至在正常生理 d h 下处于质子化状态；同时也禁止了s c h i f f s 碱基向胞质侧释放质子。 菌紫质在紫膜上成特殊的二维晶格排列：主要由b r 上的b b 链，d d 链 问相互作用，使b r 分子组成三聚体，三聚体又进一步排列成二维六方晶格( 如 f i g3 ) m 。这种晶格排列赋予紫膜蛋白特别稳定的四级结构。虽然这种晶格结 构早在七十年代就已由二维x 射线衍射实验揭示f 2 】，但是其对紫膜蛋白质子泵 功能，以及分子间相互作用有什么影响仍知之甚少。 3 苎苎查竺竺查竺竺苎 _ _ _ - ，- _ _ _ - - ，一一 f i g3 b rt r i m e r si nt h e ( a b ) p l a n et h ev i e wi sa l o n gt h eca x i sf r o mt h ec y t o p l a s m i c t o w a r dt h ee x t r a c e l l u l a rs p a c e t h es c h e m a u cu p p e rr i g h ts e c t o rd e f i n e st h ep o s i t i o n so f t h eh e l i c e sa n dc o n n e c t i n gl o o p s ，d r a w na ss o l i d l i n e so nt h ec y t o p l a s m i cs i d ea n da s d a s h e dl i n e so nt h ee x t r a c e l l u l a rs i d e t h eu p p e rl e f ts e c t o rd e p i c t st h eb a c k b o n eo ft h e h e l i c e si ng r e y l o o p sa ba n dc d ，w h i c hp a r t i c i p a t ee x t e n s i v e l yi nt h ei n t r a t h m e r i n t e r a c t i o n s ，a r eh i g h l i g h t e di nt h el o w e rs e c t o r , w h i c hr e v e a l st h eb a c k b o n ea n ds i d e c h a i nr e s i d u e si ns t i c km o d e l s ( q u o t e df r o m 【7 1 ) 2 光循环 光照下b r 的分子构型会发生一系列的瞬态变化，其最大吸收峰( 5 7 0 n m ) 也相应的发生一系列变化，b r 经历一系列的中间态( j 、k 、l o ) ，最后 又回到原初态，形成一个光循环带有不同最大吸收峰的b r 瞬态物，称为光 化学反应的中间态光循环的粗略过程为：b r h v 一一j 一一k 一一l 一一m ，一一m 2 一一n + _ 一o - b r ”j 。振动光谱显示在l 中间态里，k 态中存在的1 3 - c i s 视黄 醛多烯烃的扭曲现象已经恢复s c h i f f s 碱基的位移干扰了氢键网络，并改变了 4 复旦大掌硕士掌位论文 活性位点的电荷稳定性。有f t i r 证据表明，这种氢键网络的重整一直影响到 a s p 一9 6 ，结果使得s c h i f f s 碱基的p k 值下降而a s p - 8 5 的p k 值上升，从而在 两者间建立起质子化的平衡。有动力学实验可知【1 3 - “】，此时b r 为l 与m ，的 混合状态，而l 态( s c h i f f s 碱基质子化) 占优。紧接着a s p - 8 5 的质子化，b r 向胞外侧释放质子【1 6 ，”。当p h 高于质子释放p k 值( p k = 5 6 ) 时，原先s c h i f f s 碱基和a s p 一8 5 间的质子化平衡也向着s c h i f f s 碱基去质子化的方向移动。这样， b r 就由m 1 态进入m 2 态”邝1 。由于a s p 一8 5 的p k 值很高，无法作为s c h i f f s 碱基质子化的质子供体l 。此时，胞质侧区域的b r 发生大范围的构象变化， 不仅降低了a s p - 9 6 的p k 值，同时建立起质子通道以便s c h i f f s 碱基重新质子 化一一b r 进入n 态 2 1 , 2 2 | 。s c h f f s 碱基的质子化引起视黄醛从1 3 - c i s 向a l l - t r a n s 的重构，也就是由n 至o 的反应；与之相联地a s p 一9 6 的p k 值提升，并从胞 内侧重新获得一个质子。之后，a s p 一8 5 释放一个质子，而原采释放质子的位点 重新质子化，b r 即又回复到初始状态【2 3 2 q 。整个光循环过程及与其相关的质子 在膜上转运过程如f i g4 所示【1 “。 f i g 4 o v e r a l lv i e wo fb a c t er i o r h o d o p s j n ， s h o w nw i t ht h er e t i n a la n dr e s i d u e sd i r e c t l y i m p l i c a t e d i n p r o t o nt r a n s p o r tt o p ， c y t o p l a s m i cs i d e a r r o w si n d i c a t ep r o t o n t r a n s f e rs t e p sd u d n gt h ep h o t o c h e m i c a l c y c l e n u m b e r sr e f e rt ot h es e q u e n t i a lo r d e r ： ( 1 ) d e p r o t o n a t i o n o ft h es c h i f f b a s e ， p r o t o n a t i o no fa s p 8 5 ；( 2 ) p r o t o nr e l e a s et o t h ee x t r a c e l l u l a rs u r f a c e ；( 3 ) r e p r o t o n a t i o no f t h es c h i f fb a s e d e p r o t o n a t i o no fa s p 9 6 ；( 4 ) r e p r o t o n a t i o no fa s p 9 6f r o mt h ec y t o p l a s m i c s u r f a c e ；a n d ( 5 ) d e p r o t o n a t i o no fa s p 8 5 ， r e p r o t o n a t i o no ft h ep r o t o nr e l e a s es i t e i ”i 5 复旦大掌硕士学位论文 3 中间态的结构变化 用低温学的方法可以获得稳定的光反应中间态。其中，k 中间态在2 1a 分辨率的x 射线衍射实验表明，a s p 一8 5 向s c h i f f s 碱基方向运动，w a t e r4 0 2 也 发生移动，而视黄醛只沿着烯烃链有扰动2 ”。正如人们预期的一样，光循环早 期的结构变化发生在视黄醛附近。紧接下来的l 中间态，对理解s c h i f f s 碱基质 子的运动方向和a s p 一8 5 的质子化方式有重要意义。遗憾的是目前还没有其结构 变化的数据。 对于m 中间态，通过把d 9 6 n ( a s p 由a s n 取代) 突变体速冻至1 0 0 k 以 捕获稳定的光反应中间态，可得到分辨率2a 的结构图象【1 0 】。电子密度图显示， m 态的视黄醛为明显的1 3 - c i s ，这样造成视黄醛去质子化的n 原子中的电子对 远离a s p 一8 5 而靠向包含v a l - 4 9 和l e u 一9 3 在内的疏水性区域；进一步地，c ，。 一c 。双键的异构化引起多烯烃链的歪曲，使1 3 一甲基区最大程度地朝向胞质侧 移动；相应地，胞外侧的t r p 一8 6 和胞质侧的t r p - 1 8 2 的侧链分别向两侧移开， 而l e u 9 3 的侧链发生扭曲以适应这种变化。s c h i f f s 碱基也发生明显的变化。 与s c h i f f s 碱基去质子化相关联地，w a t e r4 0 2 在此区域消失；w a t e r4 0 1 转而 以氢键链接a s p 一8 5 和a s p 2 1 2 ；原来链按w a t e r4 0 1 和a r g 一8 2 的w a t e r4 0 6 也缺失了。质子化的a s p 一8 5 远离s c h i f f s 碱基，并不再与t h r - 8 9 形成氢键：另 一方面，a s p 一2 1 2 仍然处于阴离子状态，保持与t y r - 1 8 5 弄口t y 卜5 7 的氢键链接， 并与t r p 8 6 吲哆环上的n 形成新的氢键。m 中间态与a s p - 8 5 质子化和胞外释 放质子的过程相联的结构变化也同样显著：a r g - 8 2 的侧链向胞外方向移动，可 能是由于胍基与w a t e r4 0 6 和w a t e r4 0 7 原有的三个氢键断裂的缘故。这样， a r g 一8 2 带正电侧链的往返运动就提供了a s p 一8 5 与质子释放位点耦合的方式2 “。 如果这种耦合方式成立，那么质子就将由g l u 1 9 4 和g l u - 2 0 4 邻近的区域释放， 那里形成的负电位则将由a r g - 8 2 的正电荷平衡。而这两个谷氨酸的区域在m 态发生结构重整：w a t e r4 0 3 不见了，w a t e r4 0 4 和w a t e r4 0 5 也移动了位置； g l u 2 0 4 和g l u 一1 9 4 的侧链旋转到了氢键距离之外，它们现在由w a t e r4 0 4 连 接；g l u 1 9 4 与t y 卜8 3 形成了新的氢键。在m 中间态胞外侧区，残基侧链和水 6 复旦大掌硕士掌位论文 分子间的氢键变化如简图f i g5 所示。 a p r o t o n a t e ds c h i f fb a s e b u n p r o t o n a t e ds c h i f fb a s e a l 卜t r a n sr e t i n a l1 3 - c i sr e t i n a l f i g5s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fh y d r o g e nb o n d sb e t w e e ns i d e c h a i ng r o u p sa n db o u n d w a t e ri nt h ee x t r a c e l l u l a rr e g i o ni nt h eb rs t a t e ( a ) a n dt h ems t a t e ( b ) w a t e rm o l e c u l e s ， p r o t o n s ，a n dh y d r o g e nb o n d si nt h eb rs t a t et h a tu n d e r g oc h a n g ea r es h o w ni ng r a y w a t e rm o l e c u l e s h y d r o g e nb o n d s a n dr e s i d u es i d ec h a i n si nt h ems t a t et h a ta r ed i f f e r e n t o rm o v e df r o mt h eb rs t a t ea r ea l s og r a y g l u l9 4a n dg l u 2 0 4a r eb o t hs h o w na sa n i o n i c i nm a l t h o u g ht i m e - r e s o l v e df t i rs p e c t r ad on o tc o n t a i nt h ee x p e c t e dn e g a t i v ec = o s t r e t c hb a n d ( q u o t e df r o m 【10 】) 相对应地，在m 中间态( 至少在d 9 6 n 的m 态) 中没有产生氢键链以承 担胞质侧至s c h i f f s 碱基之间的质子通道功能的证据；除了观察到残基l e u 一9 3 和p h e - 2 1 9 的侧链从原来阻塞通道的位置转开，提供了建立质子通道的一种可 能性据此可推测，胞质侧质子的传递或是由m 态至n 态转变过程中才产生的 水分子链完成；或是由瞬时插入的水分子在供体与受体间介导如果这一推测 成立，则在n 中间态里应当能观测到这些水分子，而m 态中f 螺旋和g 螺旋 在胞质侧发生的外向弯曲也支持此种假设1 2 ” 7 苎兰查竺竺主竺竺兰苎 一一 一 _ _ _ _ _ _ _ - 一一 激发光强对光循环的影响 用一个短暂的光脉冲照射紫膜，b r 就进入光循环。s l i f k i n 和c a p l a n 在七 十年代中期，提出m 中间态可以根据寿命的不同分为两类：快组份m f 和慢组 份m 。【2 8 2 9 。随后o h n o 等发现，m f 和慢组份m 。的比例受激发光强的调制，产 生不同的动力学谱线 2 9 , 3 0 】。在较低的激发光强下，m 。组份占优；随着光强的增 加，m ，的比例下降至小于0 5 。近来的研究显示，m ，衰减进入o 态，m 。直接回 到b r 基态。对于这个实验现象有两种解释：s h r a g e r 等人认为这是由于b r 分子的非均一性( h e t e r o g e n e i t y ) ，即m f 和m 。均是由处于不同基态的b r 分 子产生p 2 1 ：t o k a j i 等人则认为是与b r 三聚体内存在分子间的协同作用 ( c o o p e r a t i v i t y ) 有关，即在强光作用时，三聚体内由于一个以上的b r 分子进 入光循环，从而引起相互作用，产生m 。 3 0 , 3 3 | 这两种观点孰是孰非，目前尚无 定论。而激发光强依赖性的机理解释，可以看作对不同质子泵光循环模型真实 性的检验标准。我们的工作将对此进行探讨。 二，类菌紫质与比较生物学 继b r 之后，发现了是第二个具有光能转换器的嗜盐菌膜蛋白， h a l o r h o d o p s i n ( h r ) 。h r 的研究解释了一些由b r 还没有阐明的嗜盐菌膜 生物和膜动力学结果。在纯化h r 的的过程中发现了第三种茵紫质一一s e n s o r y r h o d o p s i n ( s r ) ，然后p h o b o r h o d o p s i ( p r ) 也被发现。在h a l o b a c t e r i u n s a l i n a r u m 的单细胞上发现同时存在四种不同的菌紫质b r 、h r 、s r 和p r 引 起了研究者对发现新的菌紫质的兴趣脚】m u k o h a t a 、o t o m o 等人又在澳大利亚 和墨西哥分离出几种新的嗜盐茵菌株，其所含的视黄醛蛋白被命名为古紫质： a r c h a e r h o d o p s i n 1 ( a r 1 ) 、a r c h a e r h o d o p s j n 2 ( a r 2 ) 辟6 - 3 孔。 b r 分子的氨基酸序列由k h o r a n ae t a l ，1 9 7 9 ；o v c h i n n i k o v e t aj ，1 9 7 9 ； d u n ne ta l ，1 9 8 1 等，通过对其蛋白中氨基酸序列的测定和该蛋白基因核酸序 列的测定已经阐明【”4 “。对于光驱动质子泵机理的研究主要采用定点突变的方 8 法确定了几个如a s p 一8 5 ，a s p 9 6 等关键的氨基酸残基f 4 1 j 。但是由于涉及质子 泵和影响b r 分子三聚体结构的可能氨基酸较多，并非用单一的点突变研究所 能解决，需要有一系列的氨基酸变化。随着新的具有质子泵功能的类b r 蛋白 不断被发现，一个可行的方法是对b r 和其他类b r 分子的氨基酸序列进行比 较，可能有助于了解影响质子泵功能的关键的氨基酸残基，以及在形成嗜盐菌 紫膜上蛋白的晶格结构过程中关键的氨基酸残基h “。 比较具有类似功能的b r 和类b r 分子的一级结构发现保守的氨基酸残基。 这些在大自然长期进化中依然保守的氨基酸可能对于如下功能是关键的： a ：视紫质分子的七螺旋结构的保持； b ：质子泵功能的保持； c ：离子选择功能的保持。 同时也有助于我们了解视紫质分子的进化过程和他们的相互联系。 比较具有不同功能的视紫质分子一级结构发生变化的氨基酸残基和由此引 起的高级结构的变化，有助于了解在比如光适应和暗适应、p h 依赖的吸收光谱、 离子泵活性、光循环模型、光循环中间体的类型、持续时间及随p h 和温度变 化性质等方面变化的原因。通过对不同功能的视紫质分子的比较，我们可以进 一步了解这些氨基酸残基对结构和功能的贡献及b r 的离子选择机制，从而有 助于构建人工光能转换器和传感器。 从比较生物学的角度，m u k o h a t a 等对包括已知的8 种嗜盐菌质子泵，5 种 氯离子泵和两种传感器的1 5 个序列进行了比较研究p ”。对氨基酸序列进行同源 性比较后，可以看出在质子泵中序列同源性除了a r 1 和a r - 2 间大于8 0 o # 1 ， 其余都小与6 0 0 ，因此a r 构成独立于其他类b r 茵紫质的子种类( 如f i g6 ) 。 a r 有与b r 不同的氨基酸序列，而又有相似的质子泵功能。对其研究可能揭示 视黄醛蛋白在调节最大吸收峰和质子泵效率等方面的动力学机制。l u k a s h e v 等 发现a r 与b r 两个显著的差异f 4 4 ： ( 1 ) 在a r 的吸收光谱中没有象在b r 中出现的碱性红移。b r 中的碱性 红移被认为由酪氨酸去质子化在色素光谱上的表现p 5 1 ；而a r 中同样检测到酪 氨酸去质子化，却没有发生碱性红移。说明嗜盐茵色素碱性红移并非酪氨酸去 9 复旦大掌硕士掌位论文 质子化的必然结果。 ( 2 ) 在a r 一1 质子泵的质子跨膜输运过程中，质子吸收和释放顺序与b r 相反，表现为受光脉冲照射后介质首先碱化而后酸化。 对其原因有三种猜测： a ) a r 1 胞外侧的增加的负电荷阻止了质子的释放；b ) k 1 2 9 h ( l y s 由h i s 取代) 位点突变抑制或延迟了质子释放过程；c ) 胞外侧质子释放基团p k 。值的改变。 a r 在细胞膜上形成紫红色的特异区域，称之为紫红膜。研究紫膜和紫红膜 在结构和功能上的差异是嗜盐菌比较生物学中的重要课题，其中包括了研究在 紫红膜上a r 蛋白分子的排列规律。虽然，o t o m o 等用电镜观察空气干燥的紫 红膜碎片，发现1 2 0 。角的裂纹，可推测其也具有类似紫膜的二维晶阵。但这 一论点尚需用实验进一步验证p “。 p r o t o np u l p s毒n i 佃p l n i p s t f i g6 t h er e l a t e d n e s so fb a c t e r i a lr h o d o p s i n s ( q u o t e df r o m 【4 3 j ) 三，x z 5 1 5 嗜盐菌及其类菌紫质 复旦大学微生物系在我国西藏扎北湖分离到一株新的嗜盐菌菌株，命名为 x z 5 1 5 ( h ，s p x z 5 1 5 ) h ”。经证实，这种嗜盐菌细胞含有视黄醛类蛋白，并在 照光时能使介质酸化，说明此蛋白具有与b r 类似的视黄醛类蛋白。在x z 5 1 5 菌株中按照嗜盐茵h s a i n a r u m 菌株中分离紫膜的常规方法分离得到一种膜组 1 0 分，它与紫膜比带有明显红色，称为紫红膜( c l a r e tm e m b r a n e ) 。x z 5 1 5 紫红膜 在光化学反应中具有光循环m 中间体，说明含有类b r 蛋白膜蛋白的s d s 电泳表明，在x z 5 1 5 菌株的紫红膜中，也如同在h s a l i n a r u m 的紫膜中一样， 仅存在一种蛋白质，而且其分子量也与紫膜中的蛋白质b r 非常接近，约2 6 k d 。 检测紫膜和紫红膜溶液受光脉冲照射后介质的p h 变化，紫膜溶液先酸化后碱 化；紫红膜与紫膜相反，说明x z 5 15 在质子跨膜输运过程中，质子吸收和释放 顺序与b r 相反( 如图f i g 7 显示) 4 8 1 。 凸 o q t i m e ( m s ) f i g7 p h o t o - f l a s hi n d u c e da b s o r p u o nc h a n g eo fp h s e n s i t i v ed y e ， p y r a n i n e ，b yp r o t o np u m p i n gi np u r p l em e m b r a n e i nw a t e r ( a ) a n d c l a r e tm e m b r a n eo fx z 5 1 5i n0 2mn a 2 s 0 4 ( b ) t h ed o w n w a r dc u r v e i m p l i e sa c i d i f i c a t i o no ft h em e d i u m ( q u o t e df r o m 【4 8 】) 用p c r 方法扩增x z 5 1 5 基因片段，测序得到9 1 位以后的氨基酸序列，结 果如下f 4 s ： 。苎苎查竺竺圭兰竺兰查 一 c c g ，c t g c t g ，t t g c t c g a cc t cg c cc t g c t gg c ga a gg t tg a cc g c4 5 plll ldlal lakv dr g t c a g c a t c g g g a c g c t c a t c g g c g t c g a c g c g c t g a t g a t c g t c 9 0 vslgtl igv dalm iv a c c g g tc t ca t cg g cg c gc t ct c g a a ga c g c c gc t cg c g c g gt a c1 3 5 tgl igalsk tplary a c c t g t g g g c t g t t c a g c a c g a t c g c g t t c c t g t t c g t g c t g t a c 1 8 0 tcglfs t iaflfvly t a cc t cc t ga c ga g t c t gc g ca g cg c cg c cg c gc a gc g c t c cg a a2 2 5 ylltslr saaaqr se g a g g t c c a g a g t a c c 丌c a a c a c g c t g a c c g c a c t g g t c g t c c t c2 7 0 evqstf ntltal vvl t g g a c g g c g t a c c c g a t c c t g t g g a t t g t c g g g a c c g a g g g c g c c 3 1 5 wtayp ilw ivgtega g g cg t cg t tg g tc t gg g c g t cg a ga c cc t gg c gt t ca t gg t c c t c 3 6 0 gvv g lgvetlafm vl g a c g t g a c c g c g a g 垡i q g g 昼亟立 dvtakvg fg 1 2 3 8 7 苎兰查兰竺主兰兰篓苎 其中，带下划线的基因序列为p c r 的引物。将此氨基酸序列与b r 、a r 1 和 a r 一2 的相应序列进行同源性比较，结果表明x z 5 1 5 在进化上属于古菌紫质一 类，和a r 一2 是一个子类。 研究x z 5 1 5 不仅可以帮助深入理解视黄醛蛋白质子泵功能的机制，也是对 古紫质性质的补充。它的质子泵功能与b r 有什么差异? 它是否形成三聚体结 构? 三聚体在膜上是否组成二维晶阵? 我们的工作将围绕x z 5 1 5 ，着重回答上 述问题 1 3 兰兰查竺! 主兰兰兰查 - _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ 一一 材料与方法 紫膜与紫红膜的制备 1 嗜盐茵菌株： h a 0 6 a c f e 砌ms a l i n a r u mr i m l 菌株：提供标准b r 蛋白 h s p x z 5 1 5 菌株：产自中国西藏地区，由复旦大学微生物系提供。 2 嗜盐菌培养： r 1 m 1 和x z 5 1 5 根据o e s t e r b e l t 报导的方法培养【5 0 j 。液体培养基由基盐介 质( b s ) 加上蛋白胨组成。基盐介质是为保持细菌正常生长所要求的离子纽份 和高渗浓度的介质，