（化学工艺专业论文）橙皮甙在微波条件下的提取及分离纯化.pdf

摘要 黄酮类化合物具有抗氧化、抗自由基和防癌抗癌等多种生理活性，已越来越受 到重视。本文以橙皮为原料，较系统地研究了其中的黄酮物质( 主要为橙皮甙) 的 微波辅助提取方法，分离提纯方法，还研究了橙皮甙的抗氧化和抗自由基作用。主 要研究内容及实验结果如下： 1 、通过单因素实验和正交实验的考察，确定了微波 辅助萃取橙皮总黄酮的各因素影响的主次为：固液比 乙醇浓度 辐射时f n 微波 功率 溶液p h 值；微波辅助萃取橙皮总黄酮的最佳工艺条件为，微波功率3 2 0 w ， 溶剂乙醇浓度2 0 ，固液比为l g ：2 5 m l ，辐射时间6 0 s ，橙皮总黄酮提取率为8 7 o 。2 、对橙皮黄酮分离和精制，采用大孔吸附树脂法对生物类黄酮( 橙皮黄酮) 分 离和精制。根据其吸附和沈脱工艺条件的试验研究，认为：( 1 ) x 5 大孔吸附树脂 由于具有较大的孔径和比表面积对生物类黄酮具有良好的吸附分离性能，可以用于 橙皮中生物类黄酮的富集分离。( 2 ) 生物类黄酮在x 5 大孔吸附树脂的吸附可以用 l a n g m u i r 方程进行较好的描述。( 3 ) x 5 大孔吸附树脂的静态饱和吸附量约为 3 2 6 m g g ，动态吸附容量约为2 3 8 m g g ( 4 ) p h 约为1 0 的6 0 乙醇水溶液为最 佳洗脱溶剂，在流速为1 - 2 b v h ，时沈脱率较高。 关键词：总黄酮微波辅助萃取分离提纯树脂吸附 a b s t r a c t f l a v o n e sa r et h o u g h tt ob em o r ea n dm o r ei m p o r t a n tb e c a u s eo ft h e i r a n t i o x i d a l i v e 。a n t i f r e e - r a d i c a la n dc a n c e r - p i e y e n lc a n c e r - r e s i s t a n ta c t i v i t i e s i n t h i sp a p e r m e t h o do fe x t r a c t i n gf l a v o n e sf r o mo r a n g ep e e li ss t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y , a sw e l la st h e i ra n t i o x i d a t i v ea n da n f i f r e e - r a d i c a la c t i v i t i e st h em a i nc o n t e n t sa n d r e s u l t sa r ed i s p l a y e da sf o l l o w 1t h es t u d i e ss h o w e dt h a t ： b ys i n g l ef a c t o ra n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h ep r i m a r ya n ds e c o n d a r yo r d e ro fe f f e c to ft h ef a c t o r s m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n p r o c e s s f o rt h et o t a li s o f l a v o n e sf r o mo r a n g e p e e l s o l i d - l i q u i dr a t i o a l c o h o lc h r o m a r a d i a t i o nt i m e m i c r o w a v ep o w e r l i q u o r p hi n d i c a t o r t h ef u r t h e s tt e c h n i c sq u a l i f i c a t i o n ：m i c r o w a v ep o w e r3 2 0 w ，a l c o h o l c h r o m a2 0p e rce n t ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 ：2 5 ，r a d i a t i o nt i m e6 0s ，q u o t i e t yo ft o t a l i s o f l a v o n e s8 7 0p e r c e n t 2 t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nf o rf l a v o n ef r o mo r a n g e p e e lh a sat e c h n i c so fa b s o r p t i o na n dw a s he s c a p e ： ( 1 ) x - 5r e s i na d s o r p t i o nh a s h i g h b l o o d e da d s o r p t i o n ( 2 ) t h ea d s o r p t i o nb ed e s c r i b e db yl a n g i u i r ( 3 ) x - 5 s t i t i cs t a t ea d s o r p t i o n3 2 6 m g g ，d y n a m i ca d s o r p t i o n2 3 8 m g g ( 4 ) af u r t h e s t i m p r e g n a n ti sa l c o h o l6 0p e r c e n tw i t hp hi n d i c a t o r10w h i c hh a st h ef u r t h e s tb y v e l o c i t yo f f l o wt h a ti s 1 - 2 b v h k e yw o r d s ：t o t a li s o f l a v o n e s m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ( m a e ) s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n r e s i na d s o r p t i o n h 资州人学硕+ 卜论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究曾做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：e 7 期：2 q q2 生! 幺 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 槲：格钠叛黻帆一 前言 黄酮类化合物的强抗氧化活性已被越来越多的实验所证实，可作为食品抗氧化 剂使用。现在合成的食品抗氧化剂如b h t , b h a 的安全性己越来越受到质疑，而天 然黄酮类化合物毒副作用小，且某些黄酮类物质的抗氧化性可与b h t 相媲美，其作 为食品抗氧化剂的发展很有潜力。黄酮类化合物还具有各种药理和保健作用，但在 人体不能合成，而且在体内代谢很快，因此需要寻找更多的黄酮类化合物的来源以 满足人体摄取水平达到有益的摄取量。 橙皮是含有黄酮类化合物的极其广泛易得且廉价的资源，其中黄酮含量较高。 如果对每年数以千万吨计的橙皮资源加以利用，其效益是不言而喻的。我国柑橙资 源丰富柑桔；碰柑；南丰蜜桔；砂糖桔；脐橙；冰糖橙；红江橙；甜橙；夏橙；青 皮甜橙；芦柑；品种全且产量大。湖南麻阳苗族自治县有“中国冰糖橙之乡”的誉称。 目前，全县柑桔栽种面积达1 8 万亩，2 0 0 6 年总产量2 6 万吨，实现产值2 7 亿元。 建设以麻阳冰糖橙为主的柑桔特色水果产业化，实施以冰糖橙为主的水果示范基地 建设、冷藏保鲜、加工、批发贸易等产业化开发项目。新建采用冰糖橙鲜果处理生 产线4 条，年处理冰糖橙8 万吨；柑桔浓缩汁生产线一条，年产浓缩汁4 万吨；皮 渣饲料生产线一条，年产皮渣饲料原料1 2 万吨，但皮渣只用作饲料原料是极大的 资源浪费。橙皮中的黄酮类物质主要是橙皮甙，是橙皮素的二氢黄酮、二氢黄醇， 橙皮甙与芦丁具有相似的药理作用，是治疗心血管病药物的重要原料，它还是合成 ， 高甜度，低热量新型甜味剂二氢查耳酮( 适合糖尿病人和肥胖者食用) 的主要原料。 加强橙皮中有用物质提取的研究具有积极意义。但在国内橙皮的研究开发利用 上，落后于世界水平，较长时间停留在农业垃圾或饲用的水平上，造成了国有资源 的浪费。所以，现阶段致力于这一领域的研究和开发，有着极其重要的现实意义。 本文采用贵州册亨县冰糖橙皮渣为原料进行橙皮黄酮提取精制。 目前，提取橙皮活性成分的工艺有许多种，主要有有机溶剂浸提，水煮，超临 界c 0 2 流体萃取等，考虑到提取物的收率、成本及操作性，这些方法都不是很理想， 开发出一条经济适用的工艺路线成为当务之急。近年来，科研人员对微波的原理和 作用进行了深入的研究，发现微波对植物细胞的破碎有很大的作用，能对萃取体系 中的不同组分进行选择性加热，萃取热效率高，大大缩短萃取时问，提高了萃取效 率。微波提取技术改变了传统提取中加热一渗透进入基体一溶解或夹带渗透出的模 式，解决了传统提取中萃取选择性差的问题。因此本论文提出利用微波效应来提取 橙皮中的活性成分。本论文试验以乙醇为溶剂，对微波功率，微波作用时问，溶剂 用量，浸提时间等因素对提取的影响做了一些研究，获得较好的效果，其省时，省 溶剂，提取率高等优点被初步验证。开辟了一条提取橙皮活性成分的新途径。 2 贵州大学硕十论文 第一章文献综述 1 1 黄酮化合物的研究进展 黄酮类化合物的生理作用是多种多样的，例如含有槲皮素( q u e r c e t i n ) 、金丝桃 苷、牡荆素、表儿茶素( e c ) 和矢车菊素等的浸膏具有扩张血管和降低高血压作用。 芦丁( r u t i n ) 、槲皮苷、槲皮素能增强心脏收缩减少心脏搏动数。杜鹃索、紫花杜鹃 素等有止咳祛痰作用。黄芩营、木犀草素等有抗菌消炎作用。芦丁、橙皮苷、儿茶 酸类、花色素类具有抗毛细血管脆性和异常透过性作用。牡荆素汉黄芩素等具有抑 制肿瘤细胞作用。水飞蓟素有保肝作用。蔷薇苷a 有泻下作用。异甘草素、大豆素 有解痉作用。染料木素、刺芒柄花素有卵胞激素作用。 1 1 1 黄酮类化合物的生物活性 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 的名称来自黄酮( f l a v o n e ) ，是植物次生代谢产 物( s e e o n d a r y p l n a t m e t a b o l i t e ) 这是因为这类物质大都呈黄色( f l a v u s ) 和具有4 位碳基之故。黄酮类化合物广泛分布于植物界，大部分以甙的形式存在，一部分以 游离形式存在，种类较多，自1 8 1 4 年发现第一个黄酮类化合物至1 9 8 3 年己分离出 约2 3 0 0 种( 包括甙和甙元) 化合物( 肖崇厚，2 0 0 6 ) 。 黄酮类化合物足由c 6 c 3 c 6 构成的一类化合物，大部分具有如图1 1 。 - 的基本结构： 图1 1 黄酮类化合物基本结构图 黄酮类化合物广泛存在于药用植物、水果和蔬菜中，以游离态或与糖结合为甙 的形式存在，不仅数量繁多，而且结构类型复杂多样。是广泛存在于自然界的一大 类化合物。据统计目前发现有6 0 0 0 余种( 邬建敏，贾之慎等，1 9 9 8 ) ，为天然酚类 贵州大学硕： ：论文 化合物之首。由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。此类化合物在 植物的组织内大部分与糖结合成甙存在，少部分以甙元形式存在黄酮类化合物具有 多种生物活性，如抗氧化，抗癌、防癌以及治疗心脑血管和高血脂等疾病的作用 ( g r e e w a yg m ，k o m e t an ，1 9 9 4 ) ，因此，对黄酮类化合物的研究与利用颇受人们重 视。其在食品、医药、保健领域的应用具有广阔的前景( 姚新生等，1 9 9 7 ) 。 黄酮类化合物的强抗氧化活性已被越来越多的实验所证实，可作为食品抗氧化 剂使用。现在合成的食品抗氧化剂如b h t 、b h a 的安全性己越来越受到质疑，而 天然黄酮类化合物毒副作用小，且某些黄酮类物质的抗氧化性可与b h t 相媲美，其 作为食品抗氧化剂的发展很有潜力。黄酮类化合物还具有各种药理和保健作用，但 在人体不能合成，而且在体内代谢很快，因此需要寻找更多的黄酮类化合物的来源 以满足人体摄取水平达到有益的摄取量。 橙皮是含有黄酮类化合物的极其广泛易得且廉价的资源，其中黄酮含量较高。 如果对每年数以千万吨计的橙皮资源加以利用，其效益是不言而喻的。橙皮中的黄 酮类物质主要是橙皮甙( j b 哈本等，2 0 0 4 ) ，结构式为：图1 2 二氢黄酮( f l a v a n o n e ) 0 瞻 o h 二氢黄酮醇( f l a v m o n 0 1 ) 橙皮甙立体结构图 图1 - 2 橙皮甙的主要结构 橙皮甙与芦丁具有相似的药理作用，是治疗心血管病药物的重要原料，它还足 合成高甜度，低热量新型甜味剂二氢查耳酮( 适合糖尿病人和肥胖者食用) 的主要 4 贵州大学硕 ：论文 原料。柑桔类果皮含有较多的橙皮甙，己成为提取生产橙皮甙的原料。橙皮甙据其 结构式属于二氢黄酮类，极性较大，可用甲醇、乙醇、及8 0 丙酮等有机溶剂提取 ( p a r ajr ，j o c e l y n ，2 0 0 5 ) ，由于橙皮甙含有酚羟基，因此也可用碱水提取。本课题 以橙皮为原料，研究了橙皮中橙皮甙的提取工艺及分离纯化，为橙皮的开发利用提 供实践依据。 1 1 2 黄酮类化合物的结构特征与研究 黄酮类化合物的主要结构类型( r o b a r d sk ，2 0 0 6 ；姚新生等，1 9 9 7 ) ：黄酮类化 合物泛指两个苯环( a 环与b 环) 通过中央三碳链相互联结而成的一系列c 6 一c 3 c 6 化合物，主要指以2 苯基色原酮为母核的化合物，其基本结构为： 7 e 2 苯基色原酮( c 6 c 3 c 6 结构) 图1 3 黄酮类化合物结构图 根据中央三碳链的氧化程度、b 环联接位置( 2 或3 位) 以及三碳链是否构成 环状等特点，可将重要的天然黄酮类化合物分类如表1 1 所示。 ， 天然黄酮类多为上述基本母体的衍生物，常见取代基有羟基、甲氧基、甲二氧 基( o h 2 o ) 以及异戊烯基等。羟基和甲氧基出现最多的位置是c 一5 ，7 ，3 ，4 ； 异戊烯基出现最多的位置是c 6 ，7 。黄酮类化合物多以甙类形式存在。并且由于糖 的种类、数量、联接位置及联接方式不同，可以组成各种各样的黄酮甙类。组成黄 酮甙类的糖类主要有d 葡萄糖，d 一半乳糖l 鼠李糖l 阿拉伯糖d 木糖、d 葡萄糖 醛酸等，或由这些糖组成的双糖或三糖，糖的联接位置与甙元的结构类型有关，如 单糖链氧甙的连接位置经常是3 ，7 ，3 ，4 位：二糖链氧甙的连接位置常见的是3 ， 7 ，3 4 或7 ，4 位。花色素甙糖多连在3 位或形成3 ，5 二葡萄糖甙。在碳甙中，糖 多连接c 6 或c 8 位上( p i e r r em o u l y , e m i l em g a y d o u ，2 0 0 5 ) 贵州大学颂一 ：论文 黄酮 黄酮醇 二氢黄酮 二氢黄酮醇 花色素 黄烷3 ，4 二醇 双苯吡酮 黄烷3 醇 异黄酮 二氢异黄酮 查而酮 二氢查而酮 橙酮 高异黄酮 黄酮类化合物的生物合成途径如s c h e m ei 所示( 阿布拉江克依木，2 0 0 5 ) 天然 黄酮类成分是以1 5 个碳 八( c 6 ) 一c ( c 3 ) 一b ( c 6 ) 】为母核的黄酮甙元及甙类衍生 物，主要是指基本母核为二苯基色原酮类化合物且多以糖甙形式存在。如图1 4 ( f i g u r e1 4 ) 所示，根据中央三碳链的不饱和程度、b 环连接位置( 2 或3 位) 、以 及三碳链合环的不同，可将天然黄酮类化合物分为：黄酮( f l a v o n e ) 及黄酮醇 ( f l a v o n 0 1 ) 类、二氢黄酮( d i h y d r o f l a v o n e ) 及二氢黄酮醇( f l a v o n o n 0 1 ) 类、黄烷 酮( f l a v o n o n e ) 及黄烷醇( f l a v a n 0 1 ) 、异黄酮( i s o f l a v o n e ) 类及二氢异黄酮 ( d i h y d r o i s o f l a v o n e ) 类、双黄酮( b i f l v o n e ) 类以及其他如查尔酮( c h a l c o n e ) 、花 色素( a n t h o c y a n i d i n ) 等。 6 叩啪妒。妒。 叩嘴叩嘴带叩 贵州大学硕十论文 配 瞄 f l a v o n e s f l a v o n o l s 莨 蝎 f l a v a n o r , a 3 sf l a v a n o n o i s i s o f l a v o n e s 妒嬲妒 o c h a l c o n e c a t e c h i n a n b e ：y a n i d i n f i g u r e1 - 4 g e n e r a ls t r u c t u r eo ff l a v o n o i d s 图1 4 黄酮的糖甙形式 黄酮甙类化合物根据糖链和甙元连接方式的不同分为黄酮糖甙和黄酮。一糖甙。 黄酮甙元上羟基氧原子与糖链上c 1 以c ( 甙元) 0 ( 甙元) c ( 糖) 甙键接连生 成容易分解的黄酮o 糖甙。原则上，甙元上的任何一个羟基都会被糖基化， ， 但是糖基化顺序有差异。黄酮。一糖甙的7 位羟基、黄酮醇o 糖甙的3 位和- 7 位羟基、花青素的3 位和5 位羟基是最易发生糖基化成甙的位置。因为c 一5 位羟基 与c 4 位羰基产生氢键作用，5 o 糖甙较少见。含有多糖的黄酮o 一糖甙类化合物， 糖链部分以1 2 连接和l _ 6 连接为主。黄酮c 一糖甙是指糖直接与黄酮甙元碳原子 以c c 键连接成甙，其中，黄酮6 c 糖甙、黄酮6 c 糖甙和黄酮6 ，8 双c 一糖甙等 类型比较常见，目前尚未发现其它位置被糖基化的c 糖甙类化合物。组成黄酮甙的 糖类主要有p d 一葡萄糖、p d 一半乳糖、一l - 鼠李糖、伐一l 阿拉伯糖和木糖等，其中p d 一 葡萄糖最常见。主要的糖基化位置和最常见的单糖类如f i g u r e1 5 所示。 7 圮 贵州大学硕 ：论文 巍 i l m - - 狂郇：h ：鞭苹：m 喀： ( 1 )( 2 )( 3 )( 4 ) 1 b d g l u c o s e ( 葡萄糖) 2 1 3 - d g a l a c t o s e ( 半乳搪) 3 l - a - r h a m n o s e ( 鼠李搪) 4a - l a r a b i n o s e ( 阿拉伯糖) f i g u r e1 - 5 p o s s i b l eg l y c o s y l a t i o np o s i t i o na n dt h es t r u c t u r eo fg l y e o s y lm o i e t i e s l i n k e dt oa g l y c o n ei nm o s tc a s e 图1 5 单糖类黄酮 黄酮类化合物结构中含有较多的酚羟基，具有较强的抗氧化作用，因此在抗氧 化作用及其药物研究领域中黄酮类化合物依然倍受关注。另外，黄酮类化合物抗癌、 抗肿瘤作用与其抗自由基作用有很大的关系，而其抗自由基作用强弱受其结构影n 向， 如c 2 c 3 双键、酚羟基数目及其位置、甲氧基取代以及b 环取代基等均会影响此类 化合物的抗癌效果。研究表明黄酮分子中心的a ，p 不饱和吡哺酮足具有多种生物活 性的关键，7 位羟基糖甙化和c 2 ，c 3 位双键被氢化，则会引起黄酮类化合物的 生物活性降低，而a ，b ，e 环的各种取代基则决定了其特定的药理作用。最近报道 了黄酮c 糖甙类化合物具有保肝、抗氧化、抗甲状腺、致甲状腺肿、杀虫、抗病毒 活性等。例如，黄芹甙、槲皮素、葛根素、山奈素、黄芹素、芸香甙等对心脑血管 疾病具有一定的作用。在黄酮类化合物抗炎活性的构效关系研究中发现，银杏双黄 酮的抗炎活性随着甲基数目的增加而降低，而a 环上羟基数目的减少及甲氧基的增 多和b 环上羟基的增多，使得黄酮类化合物的活性提高。由此可知，不同骨架的黄 酮类化合物对其产生的生物活性或药理作用产生很大影响。近年来，随着对黄酮类 化合物及其构效关系的深入研究，阐明了部分药理作用机制，为其在医药领域的应 用提供了理沦依据，也加快了黄酮类化合物的开发利用。利用先进的分析手段掌握 复杂生物体系中的常量、微量成分的化学结构及其含量成为活跃的领域，同时阐明 单体化合物或中草药有效组分群在体内的代谢物及其代谢途径己成为推进黄酮类新 贵州人学硕 = 论文 药研发的重要课题。 1 1 3 黄酮类化合物的理化性质( 北京中医学院，1 9 9 0 ) 1 1 3 1 物理性质 a 性状 黄酮类化合物大多数为结晶性固体，具有一定的结晶形状，少数( 如黄酮甙类) 为无定形粉末。黄酮类化合物多为黄色，其颜色深浅与其是否具有交叉共轭体系、 助色团的多少有关，一般具有交叉共轭体系的黄酮类化合物( 如黄酮、黄酮醇、查 尔酮) 多呈黄色或颜色较深而不含有交叉共轭体系的黄酮类化合物( 如二氢黄酮、 二氢查尔酮、异黄酮) 多无色或颜色较浅( 刘一升，1 9 9 0 ) 。黄酮类化合物在紫外光 下一般具有荧光，荧光颜色与分子结构有关。如c 。o h ( 黄酮醇) 显亮黄色或黄绿 色荧光，但当其甲基化或糖甙化后，或无羟基( 黄酮类) 时，仅显暗淡的棕色 ( p h o m m a r t s ；s u t t h i v a i y a k i t ，2 0 0 5 ) 。 b 溶解性 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态( 甙或甙元、单糖甙双糖甙或三糖甙) 不同而有很大差异。 一般游离甙元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶 剂及稀碱中。其中黄酮、黄酮醇、查尔酮等平面型黄酮类化合物分子间引力较大， 各分子层层重叠，难溶于水；而二氢黄酮、二氢黄酮醇及异黄酮等非平面型黄酮类 化合物处于半椅子式结构，破坏了分子的平面性，分子问引力较小，其水溶性大于 上述平面型黄酮类化合物。黄酮类化合物糖甙化后，水溶性增加，脂溶性降低，一 般易溶于热水、甲醇、乙醇、稀碱溶液，而难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等亲脂 性有机溶剂。游离黄酮及黄酮甙一般都含酚羟基，故都可溶于碱中，加酸后又沉淀 出来，可利用此性质提取、分离黄酮类化合物 c 酸碱性 黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶中。 由于黄酮类分子中有未共用的孤对电子，故又表现有碱性，可以与无机酸如硫酸、 盐酸等生成盐，但生成的盐不稳定，遇水后即可分解。 黄酮类化合物与硫酸反应生成的盐，常表现出特殊的颜色，由此可以鉴别黄酮 9 贵州犬学硕1 j 论文 类化合物。 1 1 3 2 化学性质 a 还原反应 a 盐酸锌粉反应 这是检查足否有黄酮类化合物的最常用方法之一。将样品溶于甲醇或乙醇，加 入少许锌粉振摇，再滴加几滴浓盐酸，1 2 分钟内( 必要时微热) 即可出现颜色。多 数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红、紫红色，少数显紫蓝色， 且b 环上有o 或o c h 3 取代时，颜色即随之加深。但查耳酮、橙酮、儿茶素类则不 显反应。异黄酮类除少数例外，均不显色( j b 哈本等，2 0 0 4 ) 。 b 四氢硼酸酸钠( 钾) 反应 该还原剂足对二氢黄酮类化合物专属性较高的一种还原剂。反应产物为红色或 紫色，其它黄酮类化合物均为无颜色反应 b 络合反应 黄酮类化合物分子可以与铝盐、铅盐、镁盐生成黄色并具有荧光的络合物，可 用于黄酮的定性或定量分析 c 硼酸显色反应 取1 - 2 m g 样品溶于去离子水中，加l m l 5 硼酸溶液，充分振荡后，若溶液颜色 呈现亮黄色，则示有5 羟基黄酮或2 羟基查耳酮，而其它黄酮类均为负反应。 1 1 4 黄酮类物质的生物活性及药效 黄酮类物质植物成分范围很广( w u ，e l ；h s u ，y l ，2 0 0 5 ) ，种类数目繁多， 不同的成分可能具有不同的生物活性、不同的药效作用。 黄酮类化合物抗油脂过氧化的活性( 张英等，1 9 9 8 ) 。在2 0 世纪6 0 年代就已经 被证实，认为它足作为一级抗氧化剂而起作用的。2 0 世纪8 0 年代以来，对黄酮类 化合物的研究逐渐转向其对活性氧自由基的清除及对老年病的防治功效上( p e t e r c h h o l l m a n ，2 0 0 7 ；胡春，1 9 9 6 ；陈雨亭1 9 8 9 ，) 。许多黄酮类化合物已被证实有很 强的清除活性氧自由基的能力。 黄酮类化合物具有亲水性和亲脂性，其主要的抗氧活性基团足酚羟基，特别是 l o 贵州人学硕t 论文 b 环4 、位羟基和3 、4 位的邻二羟基，其次足2 ，3 位的双键。对黄酮类化合物的生物 活性的研究己经进行很多。经证实，黄酮类化合物足优良的活性氧清除剂和脂质抗 氧化剂( s c o t tra n ds l a t e rt f ，2 0 0 3 ； c h e nye ta 1 ，2 0 0 7 ) 。它们抗自由基和抑制脂 质过氧化的机理是：与氧阴离子反应阻止自由基反应的引发；与铁离子络合阻止羟 基自由基的生成；与脂质过氧基反应阻止脂质过氧化过程。黄酮类化合物能在高胆 固醇模式的大鼠体内抑制脂质过氧化作用，降低血脂及胆固醇。体内的槲皮素能明 显抑制血小板聚集，选择性地与血管上的血栓结合，起到抗血栓形成的作用。槲皮 素及其衍生物能抑制动物体内m d a 类物质的生成。美国加州大学教授l e i g h t o n 称： 槲皮素是己知最强的抗癌剂之一，能在毫摩尔浓度直接阻滞癌细胞增殖。 众多的实验研究表明黄酮类化合物具有较强的抗癌防癌作用，其作用主要通过 三个途径，即对抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长、对抗致癌促癌因子。 综合文献报告，此类植物成分主要有以下方面的作用： a 维生素p 样作用 延长。肾上腺素作用，维持血管的正常渗透压，降低血管的脆性，缩短流血时间， 这种作用称为维生素p 作用。具有此种活性的成分包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮和 查耳酮类等类型的衍生物。 b 杀菌作用 主要是一些黄酮衍生物，具有抑菌或杀菌作用，并在低浓抑菌，高浓杀菌。 c 、抗癌作用 曾经有关于6 0 多种黄酮类物质植物成分的抗癌实验结果的报道；发现其中的 1 0 种具有不同程度的抗癌活性，它们在c 6 位上都有甲氧基，3 和4 位上有羟基或甲 氧基( r o b a r d sk 2 0 0 6 ) 。 d 冠状动脉作用 能够扩张冠状动脉，增加其流量，改善心肌营养，降低心肌耗氧量，并直接作 用于外周血管平滑肌，扩张血管，降低血压。具有此种药效作用的主要是黄酮类衍 生物。 e 其他作用 有个别成分具有特殊的药效作用，如解痉挛、降血压作用、女性激素样作用、 抑制胆碱酯酶作用、祛痰作用、治疗肝炎作用等。 贵州人学硕：l 二论文 总之，黄酮类物质大多具有不同的药效作用，对它们的研究是对我国天然药物 医学的贡献。 1 2 黄酮类化合物分离纯化的研究概况 1 2 1 黄酮类化合物的提取 黄酮类化合物囚其结构和来源不同，溶解特性差异也很大，因此应据其极性和 水溶性的大小选择合适的溶剂进行提取。目前，对甙类和极性较大的甙元，常用某 些极性较大的混合溶剂如甲醇一水( 1 ：1 ) 、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯进行 提取，而对大多数甙元则采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性较小的溶剂进行提取。 a 有机溶剂萃取法 对黄酮类化合物的分离提纯是其研究起点，没有较好的提取工艺，就更谈不上 对其进一步研究。近年来，许多科研工作者在这方面作出了突出的贡献。马文平( 马 文平、秦垦，2 0 0 2 ) 初步研究了枸杞色素的分离及其冷冻干燥技术。利用离心和超滤 技术分离枸杞鲜果色素，再经冷冻干燥制成枸杞色素粗粉，其中，b 胡萝b 素含量 在6 以上，可作为食品、化妆品和添加剂，也是提取b 胡萝b 素的理想原料，具 有广阔的开发前景。邢秀芳( 邢秀芳，2 0 0 1 ) 研究纤维素在葛根总黄酮提取中的应 用，结果显示在纤维素的作用下，葛根总黄酮的收率提高了1 3 。利用黄酮类化合 物与混入的杂质极性不同，选用不同的溶剂萃取可达到精制纯化目的。 b 碱性水提法 黄酮甙类有一定极性，溶于水，易溶于碱性水，难溶于酸性水，故可用碱性水 进行提取，再将碱性提取液调成酸性，黄酮甙类即可沉淀析出。王永宁等( 王永宁， 2 0 0 3 ) 采用了碱性水提取和乙醇提取两种不同的方法，对槐花中的黄酮类化合物进 行提取研究后发现，碱性水提取法的提取率比乙醇提取法的提取率高，在提取时应 注意所用的碱浓度不宜过高，以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物的母核。 c 醇类提取 甲醇和乙醇是常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇( 如9 0 9 5 ) 适于 提取甙元，6 0 左右浓度的醇适于提取甙类，提取次数一般是2 4 次，可用冷浸法 或加热抽提法提取。用醇类提取黄酮的报道较多，白风梅等用75 甲醇回流，从洋 1 2 贵州人学硕十论文 葱鳞和洋葱皮中提出类黄酮物质，研究了其中槲皮素的含量；马希汉，用8 0 乙醇 7 0 下对银杏叶粉末浸提3 次，浸提液经回收乙醇得类黄酮物质：王常青用9 5 乙 醇6 0 c 恒温浸提黄刺玫叶片也得到黄酮仞提物；贾冬英等人用正交法探讨了苦荞麦 茎及籽壳中总黄酮的乙醇提取工艺，确定了最佳的乙醇浓度、提取温度、提取时间 和乙醇用量。贾冬英，还比较了几种提取方法的提取效率，得出的结论是索氏抽提 法比浸渍法的黄酮得率高，溶剂用甲醇比用乙醇黄酮得率高。 d 热水提取 热水提取可用浸提法，也可用煮提法，一般提取2 3 次。刘峥等人对银杏叶总 黄酮水浸提法作了研究，采取正交实验，确定了最佳的水浸提条件：苏刚用8 5 9 5 热水浸泡山桔，然后回流提取，得到含量为1 3 的黄酮类物质：利用芦丁在热水和 冷水中的溶解度相差较大，槐米粗粉用水煮沸后，放冷即可析出大量芦丁结晶。热 水提取仅限于提取甙类，但因提取杂质多，提取物易霉变，故不常使用。 e 胶性稀醇或碱性水提取 黄酮类化合物分子中多有酚经基，显酸性，故可用碱性溶液提取。严赞开等人 探讨了用饱和c a ( o h ) 2 溶液从桔皮中提取橙皮甙的优化工艺，实验表明，主要浸 提剂与原料的重量比为2 0 ：1 ，在5 0 下保温3 小时，浸提率可得1 5 。碱性提取 时，所用碱的浓度不宜过高，以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。提 取液中加入酸，黄酮甙类即可沉淀析出。加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成 群盐，致使析出的黄酮化合物又重新溶解，降低产品收率。 系统溶剂提取 用极性由d , n 大的溶剂依次提取，可以提取出大多数游离的黄酮化合物，但此 法日前仅限用于实验室，很难工业化。 g 超声提取法 超声技术提取超声技术提取是目前比较新的提取方法。超声的空化作用对细胞 膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断震荡，有助于溶 质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在5 7 ，对原料有水浴作用。裴凌鹏等 ( 2 0 0 3 ) 采用超声波方法从葛根中提取总黄酮，用正交法确定了超声波方法提取总 黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度7 0 超声波提取2 5m i n ，提取次数3 次，温度 2 5 。邢秀芳研究了纤维素酶在葛根总黄酮提取中的应用，结果显示在纤维素的作 贵州大学硕 ：论文 用下，葛根总黄酮的收率提高了1 3 。林翠英等的研究发现在浸提与沉淀两阶段都 超声处理，不但芦丁得率高，而且总取时间大大缩短：不管用什么溶剂，也不管用 什么方法浸提，只要沉淀阶段加超声波处理，芦丁自浸出液中于2 0 3 0 分钟内均可 被凝聚沉淀完全，超声波的聚沉作用，在由槐米提取芦丁过程中，对提高提取率和 缩短提取时问起重要作用。郭孝武等运用超声技术提取黄酮甙也证实了此法可缩短 提取时间，提高了有效成分的提出率及药材的利用率。 1 2 2 黄酮类化合物的分离纯化 黄酮类化合物的分离纯化方法很多，主要有各种柱层析法、h p l c 法、薄层层 析法、纸层析法以及近年来才发展起来的超临界c 0 2 萃取法和大孔树脂吸附等。 ( 1 ) 柱层析法 a 聚既胶柱层析留酰胺对各种黄酮类化合物有较好的分离效果，其层析容量 较大，适合于制备性分离，洗脱剂常用水甲醇，也有用水一乙醇和甲醇，氯仿； b 硅胶注层析法：此法的应用范围最广，不仅可以分离黄酮甙，还可以分离 各种甙元。例如k i k u c h 等人用此法从正丁醇提取物中分离得到8 个黄酮和黄酮甙； l i n 等人亦用此法分离出具有抗血小板活性的黄酮碳甙： c 葡萄糖凝胶柱层析法它主要靠分子筛作用分离黄酮甙类，在洗脱时，一般按 分子量的大d , j i n 序洗出柱体。李教社等人用此法从蜜蒙花中分离得到3 个黄酮甙类 化合物：李文魁国等人亦用此法从朝鲜淫羊霍地上部分分离得到2 种黄酮甙类化合 物： ( 2 ) 纸层析法 郭新华等人应用表面活性剂胶束水溶液纸色谱分测定了5 种黄酮及黄酮甙类 化合物的闭值，此法操作简单，无环境污染，便于分离、检识含量较少的黄酮及黄 酮甙类化合物。 ( 3 ) h p l c 法 应用h p l c 法分离黄酮甙类化合物的报道较多。邬安珍等人对1 8 种黄酮及黄酮 甙类化合物在c 8c 1 8 和c n3 种固定相上的梯度沈脱、r p h p l c 法分离作了研究， 结果表明，c 1 8 柱基本可以对植物黄酮甙元和配基实现分离，但它对极性大的甙部 分洗脱出慢峰，总洗脱时间增长和分离效果不太理想，而c 8 填料极性介于c 1 8 和c n 1 4 贵州大学硕一 ：论文 二者之间，因而对黄酮甙类的分离比较理想，峰形和分离度也最好。 ( 4 ) 超临界c 0 2 萃取法 超临界c 0 2 萃取法是一项萃取高新技术，它具有工艺简单、无有机溶剂残留、 操作条件温和等优点而倍受食品工业的青睐，用其生产出来的产品属绿色食品，具 有很大的市场竞争力。 ( 5 ) 大孔树脂吸附法 大孔树脂足近l o 年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，他具有物化 稳定性高、吸附选择性好、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使 用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等优点，广泛应用于物质的分离纯化。如 采用弱极性a b 8 大孔树脂对葛根黄酮、银杏叶黄酮进行吸附分离，提取物中黄酮 含量提高近一倍，用c a d 一4 0 大树脂分离纯化柚皮甙效果很好等。由于这种方法提 取率较高、成本低，所以适合工业化生产。吉云秀等曾用d 1 0 1 型吸附树脂成功的 纯化了银杏叶中的黄酮类化合物，效果良好( 吉云秀，2 0 0 0 ) 。 ( 6 ) 离心分配色谱技术 作为现代逆流色谱的一种，离心分配色谱( c p c ) 是一种新型的制备色谱技术， 它以高效率和无固相吸附剂污染等优点，被应用于天然黄酮及花青素粗提物的进一 步分离提纯中( 刘江邹，2 0 0 3 ) 上世纪6 0 年代有人提出双水相萃取，它是利用待分 离物质在两卡h 问具有分配系数，通过温度诱导相分离实现分离目的。近2 0 年研究表 明，该技术对于各种酶、核酸细胞、蛋白质、菌株进行分离十分有效，是一种很有 ， 前途的分离技术：近年来也发现，高聚物溶液与无机盐溶液也可形成“双水相体系”， 如p g e 葡萄糖、e p g 磷酸盐和p g e 硫酸盐体系。“双水相萃取”设备与溶剂萃取相 似，可用柱式、离子式萃取设备，该技术可用于生理活性黄酮的分离( 吉云秀，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 树脂精制法 树脂吸附是目前国内采用较多的精制方法，可选用的树脂主要有聚苯乙烯，聚 酸胺，活性炭，硅胶和大孔吸附树脂等。不同的吸附剂吸附原理是不同的，例如聚 酞胺吸附柱是依靠聚酞胺分子中的酞胺键与黄酮的羟基形成氢键而产生吸附作用； 大孔吸附树脂借助范德华力产生吸附作用；聚苯乙烯则是依靠分子中的亲脂键和偶 极离子的作用。 贵州人学硕一 ：论文 大孔吸附树脂足2 0 世纪6 0 年代发展起来的一类具有良好i 吸附性能的不含离子 交换基团的有机高聚物吸附剂，具有很好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以 通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。由于具有物理化学稳定性高、吸附 选择性独特、不受无机物影响、再生简便、高效节能等诸多优点，目前己在环保、 食品、医药领域得到了广泛的应用。大孔吸附树脂在中草药有效成分精制纯化中的 应用也逐年增加，在中草药化学成分的分离、富集中的应用越来越受到人们的重视。 中科院很早对黄芩素、金丝桃甙、葛根总黄酮、田基黄总黄酮的碱性水溶液进行初 步实验，在d 1 0 1 和d a 2 0 1 树脂上均吸附力弱，易被水洗脱，而游离的黄酮，树 脂对它们吸附量大，特别是葛根总黄酮( 马建军，2 0 0 1 ) 。近年来对黄酮分离的应用 研究更加广泛，麻秀萍( 麻秀平等，1 9 9 7 ) 等比较了l o 种大孔吸附树脂对银杏叶中 黄酮的吸附性能及吸附动力学过程，筛选实验研究的结果表明，弱极性树脂a b 8 型具有较大的吸附量，易吸附、易解吸，是一种性能良好的吸附剂，为银杏叶黄酮 的生产提供一个有效手段( 王杰，任仲皎，1 9 9 4 ) 。周长凤等进行了广枣黄酮提取工 艺的研究，比较了三种树脂，结果表明a b 一8 型吸附黄酮较好，可用2 5 5 0 的乙 醇洗脱( 伍明，2 0 0 3 ) 。林秋风等人研究了a b 8 大孔吸附树脂对金莲花总黄酮的吸 附和解吸特性，并比较了a b 8 树脂与聚酞胺对金莲花总黄酮的纯化能力，结果表 明，经a b 一8 树脂纯化的总黄酮纯度为3 8 9 ，比粗提物的总黄酮纯度提高了2 8 8 倍( a z l o t o r z y n s k i ，2 0 0 4 ) 。郁建平等人利用热水浸提荞麦茎叶，用大孔吸附树脂 分离制备芦丁的新工艺，制得的芦丁纯度达9 5 以上，提取率达8 5 以上，采用本 - 。 方法分离制备芦丁，具有工艺流程简单、安全、试剂无毒、成本低廉的特点，对于 充分开发利用荞麦资源有一定意义( 陈莉月，1 9 9 7 ) ，但利用大孔吸附树脂精制避 黄酮的研究国内外报道较少。关于吸附树脂提纯黄酮的报道有很多( 麻秀平等，1 9 9 7 ) 不同的树脂提纯的效果有很多的差别，主要是树脂的结构和性能以及吸附液和沈脱 剂等因素造成的。因此对树脂精制黄酮的研究还必须进行。 1 3 黄酮类化合物的检测 1 3 1 黄酮类物质的鉴定( 定性鉴定) 对分离得到的化合物进行结构解析，从而确定其化学结构是较为重要的一步。 1 6 贵州大学顺f - 4 文 未知化合物的结构鉴定有多种方法( 北京大学化学系仪器分析教学组，1 9 9 7 ) 。经典 的化学方法在结构解析中曾经起了非常重要的作用。近几十年来，红外光谱( i r ) 、 紫外光谱( u v ) 、核磁共振谱( h n m r ”c n m r ) 、质谱( m s ) 的迅速发展，使 得人们对未知化合物的结构鉴定变得更为简单、容易( 中国科学院上海药物研究所 植物化学研究室，2 0 0 5 ) 而元素分析( e a ) 也是一种不可忽略的分析手段，它与四 大谱图相互提供未知物有关的信息。 紫外光谱( u v ) 紫外吸收光谱( u i t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ，简写为u v ) ，是由分子中 电子能级的跃迁而产生的，位于可见紫外光区，可以用可见一紫外分光光度计进行 测定。它是一种利用某些物质的分子吸收2 0 0 8 0 0 纳米光谱区的辐射来进行分析测 定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃 迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。物质的紫外吸收光谱基本上是分 子中发色团和助色团的特性。在研究化合物结构中的主要作用是推测功能团结构中 的共规关系和共扼体系中取代基的位置、数目等。 黄酮的紫外光谱特征 大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成，带i 在 3 0 0 4 0 0 n m 区间，由b 坏肉桂酰基系统的电子跃迁所引起的；带i i 在2 0 0 2 8 5 n m 之 间，起因于a 坏苯甲酰基系统电子跃迁引起的吸收，不同类型的黄酮类化合物，带 i 或带i i 的峰位、峰形或吸收强度不同，因此从紫外光潜可以推测黄酮类化合物的 结构类型( k r 马一卡姆，2 0 0 3 ；中国科学院上海药物研究所植物化学研究 室，1 9 8 1 ) 如下表所示： 1 7 贵州大学硕： ：论文 表1 2 不同黄酮类化合物的紫外吸收波长 t a b 1 2u l t r a - v i o l e ta b s o r p t i o nw a v el e n g t ho fv a r i a n tf l a v o n o i d 红外光谱( i r ) 红外光谱又称为分子振动转动光谱，也是