（植物营养学专业论文）铜污染对土壤微生物活性的影响及其PCRDGGE分析.pdf

扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权二够 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独畸：进；f 问f 究l ：作mi l v 州的 研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文彳：储禽j 川! 个八成他仆il 纥 发表的研究成果。对本文的研究做f 贡献的个人和集体，均i 三柏：艾i 以i j f i i 办 式标j 。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：p 龟秘 签字日期：始年善月日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，i i l 】：一校有权俅mj l ： 向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被论测羽l 借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数槲j ：进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、礼j ：编学化论文。m 时授 权巾同科! 学技术信息研究所将木学位论文收录到中忖、化沦义个义数 l i ：j i ， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 学位沦文作者签名：千乡和碧 签字同期：沙彩年b 月f 歹日 导j j i l j 签私： 吼。父垒一 签字目姚细g 髟f 0jjf 上i1 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r d g g e 分析 铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r d g g e 分析 摘要 本文以铜污染农田种植系统为试验平台，分析了不同季节、不同作物生产背 景下，不同程度的铜污染对土壤微生物活性的影响，并利用p c r d g g e 对土壤微 生物多样性进行了分析，探讨了铜污染在作物周年种植过程中对农田土壤微生物 活性影响的动态变化。主要研究结果如下： 1 、低浓度的铜污染( 2 0 0 p p m ) 明显降低了小麦不生育时期土壤微生物生物量 碳的含量，促进了水稻不同生育期土壤微生物生物量碳的含量提高，浓度的铜污 染( 4 0 0 p p m ) 对小麦及水稻不同生育期土壤微生物生物量碳的含量均有抑制作用； 种植小麦或水稻品种不同，均可影响土壤微生物生物量碳对铜污染的敏感程度； 无论是小麦还是水稻，生育后期( 成熟期) 土壤微生物生物量碳对铜污染的敏感 性总体上大于生育前期( 灌浆期或抽穗期) 。 2 、低浓度的铜污染明显降低了小麦和水稻不同生育期土壤微生物基础呼吸强 度，高浓度铜污染明显降低了小麦不同生育期土壤微生物基础呼吸强度，但明显 提高了水稻不同生育期土壤微生物基础呼吸强度；种植小麦或水稻品种的不同， 均可影响土壤微生物基础呼吸对铜污染的敏感程度；从不同生育期土壤微生物基 础呼吸对铜污染敏感程度看，小麦生育前期高于生育后期，而水稻生育后期高于 生育前期。 3 、低浓度的铜污染明显提高了小麦和水稻不同生育期土壤氨化作用，高浓度 的铜污染明显提高了水稻不同生育期土壤微生物氨化作用，但明显降低了小麦不 同生育期土壤微生物氨化作用；种植小麦或水稻品种的不同，均可影响土壤微生 物氨化作用对铜污染的敏感程度；从不同生育期土壤微生物氨化作用对铜污染敏 感程度看，小麦及水稻生育前期总体上均高于生育后期。 4 、不同程度的铜污染均明显降低了小麦和水稻不同生育期土壤微生物硝化作 用；种植小麦或水稻品种的不同，均可影响土壤微生物硝化作用对铜污染的敏感 程度；从不同生育期土壤微生物硝化作用对铜污染敏感程度看，不同小麦及水稻 2 扬州大学硕士学位论文 品种差异很大。 5 、利用凝胶成像分析软件对不同程度铜污染土样d g g e 图片的分析结果表 明：铜污染条件下，小麦生长季节基因条带数目明显增加，而水稻生长季节则相 反，说明铜污染对土壤微生物群落结构可能产生影响。 关键词：铜污染，土壤微生物活性，p c r ，d g g e 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r d g g e 分析 3 a b s t r a c t i nn l i ss t u t i y ，e x p r i ：m e n t a lp l a t f o 衄t 0c o p p e rp 0 1 1 u t i o no ff - 锄1 a n dc u l t i v a t i o n s y s t e m ，g i v ea r e s l l l tt o l ee 彘c to nt 1 1 ea c t i v i t ) ro fs o i lm i c r o o 玛a i l i s m sw 1 1 i c hu n d e rt 1 1 e d e a l 、析t l ld i 毹r e n ts e a s o n ，d i 毹r e n tc r o pp l a n t e da 1 1 dd i 能r e mc o n c e n t r a t i o no fc o p p e r b y 廿l eu s eo fp c r - d g g et e c l l l l 0 1 9 ) r ，m a k e dad i s c u s sa b o u tt h ed i v e r s i 够o ft l l es o i l 血c r o b i a l g i v e na r e s e a c ha b o u tt h ed y n 锄i cc h a n g eo ft 1 1 ee 能c to nt 1 1 ea c t i v t i e so fs o i l m i c r o b i a lw h i c hu 1 1 d e rm es e a s o np l a i l ta n dc o p p e rp 0 1 l u t i o n k e yf i n g d i n g sa sf o l l o w s ： 1 l o w p o l l u t i o nc o n c e n t r a t i o no fc o p p e r ( 2 0 0p p m ) i nt h es o i ld e c r e a s e dt 1 1 es o i l 耐c r o b i a lb i o m a s ss i 嘶f i c a n t l yi ne a r l ys t a g e ( f i l l i i l gs t a g eo rh e a d i n g ) a n dm a t u r i 锣 w 1 1 e nw h e a t - p l a n t i i l g ，b u tw h e nr i c e - p l a n t i n g ，i ti so nt 1 1 ec o n 协a r y ；a st h ec o n c e n l 期r t i o no f c o p p e ri s4 0 0 p p m ，t 1 1 ep o l l u t i o ng i v e nai n h i b i t i o no nt 1 1 es o i lm i c r o b i a lb i o m a s sw h e n r i c e p l a n t i n ga n dw h e a t p l a n t i n g t l l e r e 、e r ed i 虢r e n c e so f 廿1 ep o l l u t i o ns o i lm i c r o b i a l b i o m a s sb e t 、) l ，e e n w h e a t p l a r l t i n g a n d r i c e p l a n t i n g ；e i t l l e r w h e a t p l a i l t i n g o r r i c e p l a n t i n g ，o nt h ew h o l e ，t h es o i lm i c r o b i a lb i o m a s so fm a t u r 埘s t a g ei sg r e a t e rt h a l l t 1 1 ee a r l ys t a g e ( f i l l i i l gs t a g eo rh e a d i n g ) 2 l o w p o l l u t i o nc o n c e n t r a t i o no fc o p p e r ( 2 0 0p p m ) mm es o i ld e c r e a s e dt h es o i l m i c r o b i a lr e s p i r a t i o ns i g l l i f i c a n t l yi ne a r l ys t a g e ( f i l l i n gs t a g eo rh e a d i n g ) a n dm a t u i i t y w h e nw h e a t - p l 觚t i n go rr i c e p 1 甜1 t i n g ，a st l l ec o n c e n t r a t i o no fc o p p e ri s4 0 0 p p m ，也e p 0 1 l u t i o ng i v e nai n l l i b i t i o no nt l l es o i lm i c r o b i a lr e s p i r a t i o nw h e nw h e a t - p l a n t i n g b u t 、 ，：h e nr i c e p 1 觚t i l l g ，i ti so n l ec o n t r a 巧；m e r e 、e r ed i 丘e r e n c e so fm es o i lm i c r o b i a l r e s p i r a t i o nb e 帆e e nw t l e a t - p l 趾t i n ga n dr i c e - p l a n t i n g ；o nt l l e 、! h 0 1 e ，_ u 1 1 d e rm ec o p p e r p o l l u t i o nd e a l 1 es o i lm i c r o b i a lr e s p i r a t i o no fe a r l ys t a g e ( f i l l i i l gs t a g e ) i s 黟e a t e rt 1 1 觚 l em 砌t ) rs t a g ew k m w h e a t - p l a n t i n g b u tw h e nr i c e p l 趾t i n g ，i ti so n t l l ec o n l 捌哆 3 、 l o 、v p o n u t i o nc o n c e n 仃a t i o no fc o p p e r ( 2 0 0p p m ) i nt h es o i li m p r o v e d 廿1 es o i l i i l i c r o b i a la m m o i l i a t i o ns i g i l i f i c a n t l yi ne a r l y ( f i l l i n gs t a g eo rh e a d i n g ) s t a g ea n dm 砌t ) r 4 扬州大学硕士学位论文 w h e nw h e a t - p l 趾t i l l go rr i c e - p l a n t i n g ，a st l l ec o n c e n 仃a t i o no fc o p p e ri s4 0 0 p p m ，m e p 0 1 l u t i o ng i v e na i 1 1 l l i b i t i o no nm es o i lm i c r o b i a l 锄m o n i a t i o nw h e n w h e a t p 1 趾t i n g b u t w h e nr i c e - p l a i l t i i l g ，i ti so nt 1 1 ec o n 缸a r y ；t h e r ew e r ed i 丘- e r e n c e so ft l l es o i l1 1 1 i c r o b i a l a 加m o i l i a t i o nb e t 、e e nw h e a t - p l 姐t i n g 甜l dr i c e - p l a l l t i n g ；o nt l l ew h o l e ，u i l d e rt h ec o p p e r p o l l u t i o nd e a l ，廿l es o i lm i c r o b i a la m m o n i a t i o no fe a d ys t a g e ( f i l l i n gs t a g e ) i s 伊e a t e r l a nt l l em 枷锣s t a g ew h e n w h e a t - p l 胍t i i l ga i l dr i c e p l 趾t i n g 4 、t l l ev a r yc o n c e n 仃a t i o n ( 2 0 0 p p mo r4 0 0 p p m ) c o p p e rp o l l u t i o ng i v e nai n l l i b i t i o n o nm es o i lm i c r o b i a l 枷f i c a t i o ni ne 碰ys t a g e ( f i l l i n gs t a g eo rh e a d i i l 曲a 1 1 dm 狐l r i 锣 w l l e nw h e a t - p l a n t i n ga n dr i c e p l a r l t i n g 1 e r ew e r ed i n e r e n c e so ft h es o i lm i c r o b i a l 1 1 i 仃i f i c a t i o nb e t 、7 佗e nw h e a t - p 1 删n ga r l dr i c e - p l a m i r 毽；a c c o r d i n gt l l ed i f r e r e n tf e r t i l i 锣 s t a g e ，m ec h a n g eo ft l l es o i lm i c r o b i a l1 1 i t r i f i c a t i o ni sg r e a tm l r i n gt l l ev a r yp l a n t s k e yw o r d s ：c o p p e rp 0 1 1 u t i o n ，s o i lm i c r o b i a la c t i v 峨p c r d g g e 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r - d g g e 分析 文献综述 土壤重金属污染是指人类活动将重金属加入到土壤中，致使土壤中重金属含 量明显高于原有含量、并造成生态环境质量恶化的现象【1 】。重金属进入土壤后，首 先对土壤微生物的生理、生化性能及土壤理化性质产生影响，从而影响土壤生态系 统结构和功能的稳定性。在确立土壤环境容量和土壤质量标准时，不仅要考虑对人 体健康、农作物和动物以及周边环境( 大气、地表水和地下水) 的影响，更应该考虑污 染物对土壤微生物的影响【5 】ob a b i c h 等【6 1 早就提出，一种化学污染物对某一生态 系统中微生物活性的影响，可以间接反映出这种化学品对该生态系统的影响。因此， 在研究工作中不管是重金属污染土壤的修复还是质量评价，均需一套较为敏感的 指标体系，才能便于评价者对一种土壤是否被污染、污染的程度以及环境恢复的 情况做出科学、客观的判断。微生物在土壤功能及重要土壤环境过程中直接或间 接地起着重要作用，包括对动植物残体的分解、养分的贮藏转化、水分入渗、气 体交换、土壤结构的形成与稳定、有机物的合成及异源生物的降解等方面【4 】。因 此，微生物学生理生态参数可作为检测土壤污染状况的早期、敏感的生物学指标。 1 重金属对土壤微生物生物量的影响 1 1 土壤微生物量生物量的基本概念及测定意义 土壤微生物量是指土壤中体积小于5 1 0 3 耐的生物总量，包括细菌、真菌、 放线菌和小型动物，不包括植物残体。土壤微生物生物量包括微生物生物量碳、 微生物生物量氮、微生物生物量磷及微生物生物量硫。通常以微生物生物量碳来 表示，早在1 9 8 1 年j e m 血s o na n dl a d d 【7 】就认为其所含养分有效性较高，常被看作 是土壤活性有机质组分。在土壤生态系统中，微生物生物量作为有机质降解和转 化的动力，是植物养分的重要源和库，对植物养分转化、有机碳代谢及污染物降 解具有极其重要的作用【6 】。因此，微生物生物量库可以直接影响到养分循环及其生 物有效性。它能代表参与调控土壤中能量流动和养分循环以及有机质转化的相应 微生物的数量。 6 扬州大学硕士学位论文 1 2 重金属污染对土壤微生物生物量碳的影响 有关重金属对土壤微生物生物量的影响前人曾作过大量报道。部分研究结果 表明，含有较低浓度重金属的污泥施入土壤能够刺激微生物的生长，增加土壤微 生物的生物量。d a r ( 1 9 9 7 ) 【8 】研究指出砂壤土、壤土和粘土中施用0 7 5 的污泥， 土壤微生物生物量碳增加7 1 8 左右，砂壤土中增加较明显，壤土和粘土中则 较少。但是，含有较高浓度重金属的污泥施入土壤或者土壤中长期使用污泥等污 染物，土壤微生物生物量则会出现明显下斛7 卅。d a ra n dm c 研砒发现在w r o b 啪 和l u d d i n 昏o n 试验农场施用含有较高重金属浓度的污泥或堆肥于土壤中，与施用 农家肥和无机肥相比，土壤微生物生物量下降了5 0 。但是，在l u d d i n g t o n 试验 农场土壤微生物生物量的降低仅发生在施用含有c u 或n i 的污泥中，然而富含c r - 或z n 污泥的施用并没有影响微生物生物量的大小。 总之，长期施用大量污泥污染物可能导致土壤中重金属积累，从而对土壤微 生物区系产生负面效应以及降低土壤微生物生物量【1 0 j 。 2 重金属污染对土壤生物活性的影响 土壤生物活性是指土壤中所有微生物( 包括细菌、真菌、放线菌、原生动物、 藻类以及微小动物) 的总体代谢活性【1 1 1 。微生物活性在维持土壤生产力可持续性 方面起着十分关键的作用。因为土壤中有机质的周转和矿化、养分转化以及有机 废弃物的循环等均依赖于土壤微生物的代谢功能。因此，在土壤生态系统的形成、 功能演变过程中微生物活性是必不可少的要素之一，其活性的变化能够敏感地反 映土壤质量的健康状况【1 2 】。 2 1 重金属污染对土壤呼吸作用的影响 土壤呼吸速率是研究土壤中金属污染用得较多的微生物参数之一【4 】。在大多数 情况下，低浓度重金属污染土壤有利于c 0 2 的释放，但高浓度重金属污染土壤， 其呼吸速率极显著的下降1 3 15 1 。而b r o o k e s 和m c g r a l c h 【1 6 1 研究发现，重金属污染 严重的土壤其基础呼吸比轻度污染土壤要高得多。f l i e b b a c h 等【1 7 】也报道在土壤中 施入含低浓度重金属和高浓度重金属的污泥时，其土壤基础呼吸则随着重金属浓 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r - d g g e 分析 7 度的增加而上升。l l h 锄【1 硼曾应用1 4 c 标记葡萄糖施入重金属污染土壤中进行研 究发现，土壤基础呼吸( 呼吸释放c 0 2 标记微生物生物量c ) 的比值则随着重金 属的胁迫加剧而增加，这表明重金属胁迫下微生物代谢活性从生物合成转向能量 释放分解代谢过程。后来许多学者进一步研究肯定了重金属污染土壤具有较高的 基础呼吸特性。但也有人发现加入低浓度c d 和z n 反而会促进呼吸作用【l 引。微生 物代谢商也是微生物活性的重要指标之一，即用来定量表征单位生物量的微生物 在单位时间里的呼吸作用的大小。土壤环境受到胁迫或干扰条件下，微生物为了 维持生存可能需要更多的能量，而使土壤微生物的代谢活性发生不同程度的反应。 大量的研究表明，土壤微生物的代谢商通常随着重金属污染程度的增加而上升。 c h 甜l d e r 和b r o o k e s 【2 0 ，2 1 】 采用1 4 c 标记葡萄糖和玉米为基质，研究土壤微生物对不同浓度重金属的反 应，高浓度重金属污染土壤中微生物利用有机碳更多地作为能源，以c 0 2 形式释 放，而低浓度重金属污染土壤中微生物能更有效地利用有机碳转化为生物量碳。 g i o v a n m 等研究认为，土壤中重金属含量与土壤呼吸作用呈正相关，而且代谢商 与重金属浓度的相关性更好。飚l m 跚【2 8 】等采用1 4 c 标记葡萄糖为基质添加至土壤 进行研究，认为生物代谢商的变化是土壤呼吸作用或脱氢酶活性变化值得两倍。 因此，土壤微生物的代谢商( qc 0 2 ) 可作为重金属胁迫下土壤微生物生理代谢特 征的一个敏感指标。 2 2 重金属污染对土壤生化作用过程的影响 微生物是推动土壤碳、氮元素转化的原动力，氮素转化是土壤元素生物化学 循环的主要环节之一。研究结果表明，土壤中有机氮素的矿化作用、氮素硝化作 用、反硝化作用以及微生物固氮作用等生物化学过程均受重金属胁迫的影响。重 金属污染抑制了土壤有机物质的降解作用，导致了有机物质的积累【3 9 j 和土壤腐殖 质质量的下降【捌。比如在c u 5 0 0m g 蚝。1 和z n l o o om g k g 。1 下，木质素针叶林凋 落物降解较无污染土壤明显减缓【2 3 】。土壤氮素循环过程也受到重金属的抑制，包 括有机氮矿化作用【2 4 】、反硝化作用【2 5 1 以及固氮作用【2 6 1 。土壤中有机氮素的矿化作 8 扬州大学硕士学位论文 用与其污染水平呈负相关。w i l l ( e 2 7 1 研究了几种重金属和非重金属污染物对n 素转 化的长期影响，发现除s e 和s n 外，其它污染物均能抑制有机氮素的矿化作用。 在重金属胁迫条件下。人们通过室内培养方法对土壤中氮素的各种转化过程进行 比较研究，结果表明，土壤中硝化作用比有机n 的矿化作用对重金属毒性更敏感。 但野外田间试验研究结果却与此相反，如w i l k e 【2 7 】发现，硝化作用不如有机氮的矿 化作用敏感，对反硝化作用来说，在c d 、c u 、z n 、p b 中，c d 对反硝化作用抑制 最强，p b 几乎无影响。r o t h e r 等【2 8 】研究了c d 、p b 、z n 污染土壤中微生物固氮作 用的季节性变化，发现重金属对固氮作用并无明显影响。但室内研究却表明，由 c u 、c r 引起的污染土壤对土壤微生物固氮作用特别敏感，且比呼吸强度、脲酶活 性和硝化强度等指标敏感1 0 倍以上【2 8 】。王淑芳等【2 9 1 的研究结果也表明，固氮菌的 固氮强度随土壤c d 、p b 、a s 、c u 含量增加而趋于降低。b r o o k e s 等【2 9 】研究施用污 泥的土壤中蓝绿藻的固氮作用，发现在很低的重金属浓度下固氮强度降低5 0 ； 另外还研究了室内条件下不同重金属浓度对生物固氮的影响，结果表明固氮作用 于重金属浓度有显著负相关，低浓度重金属污染土壤中微生物的固氮量是高浓度 重金属土壤的1 0 倍。 3 重金属污染对土壤微生物群落结构的影响 土壤微生物群落结构( 即微生物多样性) 是指土壤微生物群落的种类和种间 差异，包括生理功能多样性、细胞组成多样性及遗传物质多样性等。土壤微生物 种群结构势表征土壤生态系统群落结构和稳定性的重要参数之一，它能较早地预 测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一【4 5 】。 由于土壤微生物的种类庞大，使得有关微生物区系的分析工作身份耗时费力。因 此，微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成，即通过描述为 生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落的影响， 揭示土壤质量与微生物数量和活性的关系。 现存的微生物群落结构测试方法较多，传统的方法是用平板计数分离来评价 土壤微生物群落结构状况。有研究表明，同样在a s 、c d 、c r 、c u 、p b 、n i 、z n 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r d g ( 疆分析 9 复合污染的土壤中，重金属总量达到6 5 8 om g k g 。1 时，细菌和真菌数量分别是对 照( 1 2 1 0m g k g d ) 的2 9 和4 5 ，而当重金属总量为3 4 4 6 6m g k g 。时，其分别 下降达到8 l 和8 5 【3 0 】。不同类群微生物对重金属污染的耐性也不同，通常为真 菌 细菌 放线刮5 9 】。d u ) ( b u r y 和b i c l l n e u 研究了自然土重金属污染土壤中的细菌 种群，发现重度污染土壤比轻度污染土壤中耐性细菌的数量多1 5 倍。n a i i l o t o 等发现对照土壤( c u 1 0 0m g k g 。1 ) 有3 5 种真菌，中等污染土壤中( c ul o o o m g k g 。1 ) 有2 5 种真菌，高度污染土壤( c u1 0 0 0 0m g k g d ) 只有1 3 种真菌【4 刀。可 见，重金属胁迫对土壤微生物种群结构会产生一定程度的影响。但该分离方法存 在很大的局限性，即所测结果在一定程度上决定于提取的方法和选用的培养基类 型，并且绝大部分土壤微生物无法用现有的分离方法进行培养。近年来，随着生 物化学及分子生物学等分析技术的发展，国内外学者采用较为先进的碳素利用法 ( b 1 0 l o g 测试系统) 、脂肪酸甲基酯( p l f a ) 分析法及核酸测定法( d n a 定量 分析技术) 研究土壤环境中微生物种群结构多样性。目前应用较多的是b i o l o g 测试系统，但较为时髦的方法是d n a 定量分析技术，该方法是利用d n a 重组动 力学测定土壤微生物遗传物质的多样性，即用变形d n a 单链的重组速率测定样品 中d n a 的不均匀性。变性的d n a 可以重组，其速率决定于相同d n a 链的浓度。 种群的差异越大，重组的时间越长。对于数量少的土壤微生物来说，国际上广泛 应用的有效测试技术是核糖体d n a 限制性分析法( a m p l i f i e d 鼬b o s o m a ld n a r e s t r i c t i o na n a l y s i s ) 。由于微生物体内1 6 s 核糖体d n a 基因含有一定的保守序列 和非保守序列，保守序列可应用于p c r 引物的设计，非保守序列则可应用于不同 种类微生物间的比较鉴定。s m i t 等【3 l 】用核糖体d n a 限制性分析法研究了土壤微生 物对外源铜的反应，表明两种土壤中的微生物种群结构均发生一定程度的变化。 4 分子生物学技术在分析微生物群落结构中的应用 在d n a 分子技术出现之前，人们对微生物的认识大多数靠平板培养分离方法 研究土壤微生物多样性，或者直接观察微生物的形态来获得部分信息。但是由于微 生物形态过于简单，并不能提供太多的信息，而且自然界中有8 5 9 9 9 的微生物 l o 扬州大学硕士学位论文 至今还不可纯培养【3 2 】这给客观认识环境中的微生物存在状况造成了严重障碍。 1 9 8 6 年，p a c e 【4 6 】等首先用核酸测序技术研究微生物生态和进化，将分子生物技术应 用于微生物生态学的研究。分子技术的应用突破了传统方法的限制，使得微生物研 究者可以从基因水平上估计种的丰度、均度，查明种的变异情况等，从而可以更客观 地认识环境中微生物天然的生态状况。目前用于微生物生态研究的分子技术有 r r n a pr d n a 序列分析、r f l p ( 限制性内切酶酶切片段长度多态性分析) 、 凡p ( 随机扩增多态性分析) 、核酸探针检测技术、t g g e ( 温度梯度凝胶电泳) 、 d g g e ( 变性梯度凝胶电泳) 等。其中d g g e 是近几年在国外应用比较广泛的分子 技术之一。是根据序列的不同，将片段大小相同的d n a 序列分开。双链d n a 分子 中a 、t 碱基之间有2 个氢键，而g 、c 碱基之间有3 个氢键连接，因此a 、t 碱基对 对变性剂的耐受性要低于g 、c 碱基对。由于这四种碱基的组成和排列差异，使不同 序列的双链d n a 分子具有不同的解链温度。当双链d n a 分子在含梯度变性剂( 尿 素、甲酰胺) 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相 关，所以当某一双链d n a 序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即 开始部分解链，部分解链的d n a 分子的迁移速度随解链程度增大而减小，从而使具 有不同序列的d n a 片段滞留于凝胶的不同位置，结束电泳时，形成相互分开的带谱。 理论上认为，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，有一 个碱基差异的d n a 片段都可被分开。 4 1d g g e ( 变性梯度凝胶电泳) 在微生物生态研究中主要方面的应用 4 1 1 研究微生物类群的多样性： 从环境样品直接提取总d n a ，经p c r 扩增得到含有某一高变区的目的d n a 序列产物，通过d g g e 得到分离开的d n a 带谱。因为每个条带很可能就代表一个不 同的微生物物种，所以d g g e 带谱中条带的数量，即反映出该环境微生物群落中优 势类群的数量。但为了得到更详实的信息，往往采用种或类群专一性探针与得到的 条带进行杂交或将条带切下，重新扩增后测序，进而得到部分系统发育信。m u y z e r 【3 3 】 首次应用d g g e 研究了菌藻席和细菌生物膜中微生物的遗传多样性。在得d g g e 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r - d g ( 记分析 1 l 带谱后，将其印迹转移到尼龙膜上与硫还原细菌特异性探针进行杂交，与其中一样 品的带谱出现了强烈的杂交信号，表明该环境中存在硫还原细菌。f e r r i s 3 4 】等通过 d g g e 对美国黄石公园一温泉中不同温度菌藻席中的细菌多样性进行比较。发现 从相同温度采集的样品的d g g e 带谱相同，而从不同温度得到的样品的带谱差异 很大，表明其中的细菌多样性不同。通过对得到的d g g e 条带进行测序并与纯培养 及克隆得到的序列进行比较，探测到以往己得到的序列，同时还探测到一些尚不能 确定其系统发育地位的细菌类群。 4 1 2 用于环境中微生物变化的动态监测： d g g e 技术的一个显著特性就是可以同时对多份样品进行分析，因此适合于 监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化。d u i l l e v e l d 【3 5 】应用d g g e 研究了菊 花生长过程中其根际细菌类群多样性的动态变化，发现生长过程中根际细菌类群的 d g g e 带谱通过u p g m a 算法聚类分析，带谱之间的相似性为8 2 ，没有发生显著 变化，与同时通过纯培养方法进行研究的结果一致，因此认为根的生长过程对根际 优势细菌类群的影响不大。s m i t 【3 6 】等也应用d g g e 对一麦田中优势细菌的多样性 随季节的变化做了研究，结果显示不同季节样品的d g g e 带谱有差异，但差异仅出 现在较弱的条带上，表明麦田中的优势细菌相对稳定，但在较弱条带所代表的细菌 类群上存在着较大差异。通过对带谱进行聚类分析，发现虽然其中的优势细菌类群 相对稳定，但七月份的带谱与其它月份的明显不同，表明七月份麦田中的细菌多样 性发生了某些变化。这一结果与通过纯培养得到的结果相同，虽然这两种方法可能 探测到完全不同的细菌类群。 4 1 3 有助于发现新的微生物 目前，自然界中可获得纯培养的微生物仅占1 1 5 ，这些微生物只是易于在 人工的营养条件及培养条件下形成克隆，并不一定是天然的优势菌群，分子生物技 术又通常只能检测到优势菌的存在，因此自然界中还有很大一部分微生物尚未被发 现。应用d g g e 与富集培养相结合有助于发现这一部分微生物。s a i l t e g o e d s 【3 7 1 等 对美国黄石公园一温泉中的菌藻系进行了不同的富集培养，通过d g g e 检测到了以 1 2 扬州大学硕士学位论文 往利用纯培养及分子技术均没有发现的1 0 个好氧化能合成细菌类群基因。通过对 d g g e 条带测序得到的遗传信息并结合己知的生理生化知识有助于发现新的微生 物物种，并分离得到纯培养。t e s k e 【3 8 】就成功地应用该方法从一菌藻系共生体中分离 纯化得到了两个纯的菌种：d e s u l f o v i b r i os p l 和心c o b a c t e rs p l 。 4 。l 。4 用于不同d n a 提取方法效果的比较 在分子微生物生态学的研究中，从环境样品中提取得到总d n a 是关键的一步。 一般采用直接提取和间接提取两种方法，直接提取法即对样品直接进行处理使其中 的微生物细胞裂解从而释放出d n a ，而间接提取法则是先将样品中的细胞与环境 中其它物质如土壤颗粒等分离，然后再对其进行裂解、提取等处理。总d n a 的提取 期望尽可能多的提出环境中微生物的d n a 。通过对不同提取方法得到的d g g e 带 谱进行比较可以评价提取效果的好坏。k b z d f 6 jp 9 】等应用d g g e 对直接和间接从土 壤中提取d n a 的效果进行了比较，选用的四种方法得到的d g g e 带谱几乎相同，聚 类分析表明相似性达8 2 以上，差异也仅体现在较弱的条带上。因此他们认为在该 实验中所选用的直接提取和间接提取方法具有相同的提取效果。g e l s o 础o 【4 0 】等的 研究也得到相同的结论。 4 1 5 对功能基因多样性的研究 微生物多样性及其生理代谢活动在生态系统的物质循环和能量循环中起着重 要的作用，是微生物生态研究的主要内容之一。对环境样品总d n a 的直接检测能够 从基因水平上反映出该环境中微生物的多样性状况，这其中包括了代谢旺盛的、休 眠或无代谢活性的微生物，不能单独反映该环境中有代谢活力的微生物的状况。代 谢旺盛的细胞中具有较多的核糖体，因此可以通过对m r n a 的研究来反映环境中 处于不同生理代谢活动期的微生物。【n i f e 氢化酶在d e s u l f o v i b r i o 菌株的能量代 谢中起着重要的作用，通过对6 株菌的研究表明，在指数生长期时才可以检测到 n i f e 氢化酶i i l i 矾a 的存在，而在稳定期时则检测不到。因此，可以将它的有无作为 检测这些细菌代谢活性时相的一个标准。w a w e r 【4 1 】等通过p c r d g g e 对不同环 境下的生物反应器中d e s u l f o v i m o 菌株的 n i f e 】氢化酶大亚基基因进行了研究。 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r - d g g e 分析 1 3 分别提取出总d n a 及r n a ，进行p c r 和i 玎p c r 得到目的基因，通过d g g e 分 析并对得到的条带进行测序，结果表现出丰富的基因多样性，并且表明 n i f e 氢化酶 基因的转录与细菌在生长周期所处的时相密切相关，这一结果与用纯菌株的研究结 果相同。该研究提示可以通过d g g e 对环境中的功能基因多样性进行研究。 4 1 6d g g e 技术所存在的缺限 d g g e 作为一种分子生物技术，除了多数分子技术所固有的缺点，如在p c r 过 程中产生的偏差等之外，其本身还有一些很难克服的缺点。首先，d g g e 最多能分离 l k b 的d n a 片段，但通常选用的片段只有几百个碱基，因此这些序列只能提供有限 的系统发育信息；第二，如果选用的条件不是特别适宜，不能保证可以将有一定序列 差异的d n a 片段完全分开，从而会出现序列不同的d n a 迁移到胶的同一位置。 v 酊1 a e y s 【4 2 】等在研究中就发现了这种情况；第三，有些细菌具有多操纵子，d g g e 能 将其在p c r 时形成的不同序列分离开，这样就可能导致过高的估计环境中的微生 物多样性；第四，d g g e 只能检测到一定数量的微生物的存在，通常只能检测到环 境中优势菌群的存在。m u y z e r 【4 3 】的研究表明，只有占整个群落细菌数量约1 或以 上的类群能够通过d g g e 检测到。 4 1 7 减少实验偏差的解决办法 对于以上存在的缺限，首先可以从优化电泳及p c r 条件着手改善；其次，在进行 d g g e 之前，可以通过软件来分析检测p c r 过程中形成的嵌合体【删以减少误差；再 者，与其他技术方法结合使用，如纯培养、直接形态观察、克隆、核酸探针检测技术 及原位杂交等，这样不仅可以更客观的从不同方面反映环境中微生物多样性信息， 还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。 5 问题与展望 综上所述，重金属污染土壤的微生物生态效应，不仅在土壤微生物生物量、 种群结构、生理生化代谢活性以及生物修复的机理等基础理论研究上取得了一定 的研究成果，且在生产实践中也得到一定程度的应用。但其广泛应用难度较大， 目前尚未获得突破性的进展。主要存在以下几个方面问题： 1 4 扬州大学硕士学位论文 5 1 土壤的非均质性 由于土壤环境本身的非均质性，由于土壤p h 值、有机质含量、粘粒含量、铁 铝氧化物含量和e h 值等性质都会改变重金属对土壤微生物及其生物化学过程，加 之外界环境条件变化比较复杂，难以确定不同土壤条件下重金属对土壤微生物的 毒害临界值以及寻找有价值的微生物学评价指标，因而尚未制定出一个统一的土 壤重金属环境质量量化标准。因此有必要系统地对土壤多样性与重金属污染土壤 的微生物和微生物过程间进行深入研究，尤其要深入研究不同形态的重金属对土 壤微生物和微生物过程胁迫效应。 5 2 重金属胁迫的根际效应 从研究对象所涉及的范畴来看，前人的研究结果主要揭示的是土壤一重金属 微生物系统或土壤一重金属一植物体系中的重金属生物毒性效应。从植物的重 金属胁迫或毒害的研究结果表明，植物在生长过程中对其根际土壤微环境产生了 影响，如植物吸收硝酸根或钙离子导致根际土壤p h 值变化，植物根系得生长增加 了根际土壤中有机质含量和土壤阳离子交换量【4 9 】，有机物质增加使一些重金属形 成了稳定的重金属一有机复合物【5 0 1 ，等等，最终影响重金属在土壤溶液中的形态 和生物有效性。 5 3 重金属胁迫的离子效应 土壤微生物重金属胁迫的离子效应有待于进一步研究。一些研究结果表明， 重金属对生物体( 植物或微生物) 的胁迫存在离子效应。重金属离子的不同价态 以及阴、阳离子形态影响生物体的胁迫程度。不同的重金属对不同的土壤微生物 有不同的毒害程度，如农田土壤中细菌对z n ，c r 较为敏感，真菌对c u 较敏感，放 线菌对c d 较敏感 4 8 1 。因此，在评价重金属对土壤微生物和微生物学过程胁迫程度 时，需要对重金属形态及相伴离子效应作进一步研究。 阮菊俊铜污染对土壤微生物活性的影响及其p c r - d g g e 分析 1 5 5 4 重金属胁迫下土壤质量评价的微生物指标体系 重金属污染土壤的微生物指标的研究在九十年代后逐渐展开，已报道的研究 几乎包括了所有的土壤微生物指标和土壤动物指标。但是由于方法上的局限性， 利用现有手段和技术通过平板培养分离法从土壤中提取的可培养微生物数量不到 总量的1 5 ，并且无法用实验室的结果来预测田间的重金属胁迫程度，甚至有 很多研究结果存在相互矛盾难以解释，导致许多表征指标不稳定性，不可重复性， 不能作为有效的、标准的微生物指标。b r o o k e s 【l l 】探讨了土壤污染程度表征的微生 物指标的选择标准，认为：a 这些指标必须可能以在广泛土壤类型中和土壤条件 下得到精确地测定；b 必须适合大批量样品的简单、经济测定；c 必须是土壤 本质特性，并且其对照或背景值也可测定；d 必须能灵敏地表征污染程度并且充 分可靠，以免误判；e 必须具有基于现有科学知识上的科学有效性；需要无重 金属污染的原始环境或对照，测试2 个或3 个指标组成的指标体系。因此，我们 有必要以微生物种群和数量及其活性为基础，采用先进的微生物生态分析方法以 及多指标的模拟模型手段来为重金属污染农田土壤环境质量评价提供一套较为满 意的生物学指标体系。 5 5 重金属污染土壤微生物修复的技术难题 目前应用微生物修复重金属污染环境仍存在许多技术上的难题。例如，环境 中的重金属污染往往呈复合形态，怎样将具有不同修复功能的高效菌株加以混合 培养? 怎样将微生物修复技术与其它环境净化技术进行有效的组装、配套、随着 分子生物技术和基因工程技术的迅速发展，从分子水平上去研究重金属对土壤微 生物的影响机制已成为可能，这为开发和运用微生物生物修复技术提供科学依据。 1 6 扬州大学硕士学位论文 1 材料与方法 1 1 供试土壤和土培实验的设计 土壤采自扬州大学农学院农场土，栽培实验设计如下： 实验选了7 个植株品种，本实验在采样时选择了地上植物长势最优和长势最 差的品种的土壤作为研究对象培池规格为3 8m 1 33 m o 4 5m ( 面积约5 0 5 1 1 1 2 ；体积约2 3m 3 ) 。灌水后表面下沉，保持上表面距池口5c m 左右( 防止大雨 漫水) 培小区设计为裂区试验，铜处理设对照( 不添加) 、2 0 0p p m 、4 0 0p p m3 个 处理，品种7 个( 见上) ，重复2 次。共计3 ( 处理) 7 ( 品种) x 2 ( 重复) = 4 2 小区小区污染土壤的制备，采用清洁无污染土壤( 已测c u 、c d 、p b 含量，) 。 根据背景值计算c u c l 2 用量