（内科学专业论文）embelin对hl60细胞凋亡的影响.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 前言g 0 0 0 8 仔u 吾”。 “”苎 材料与方法8 实验结果1 2 讨论1 6 结论1 7 四、本研究创新性的自我评价1 8 五、参考文献1 9 六、附录 综述( 含参考文献) 2 0 在学期间科研成绩2 7 致谢2 8 个人简介2 9 中文论著摘要 e m b e l i n 对h l 6 0 细胞凋亡的影响 刖罱 e m b e l i n 是一种中药提取物，最初主要用于抗感染、抗炎症以及抗增殖等方面 的研究。2 0 0 4 年n i k o l o v s 等通过计算机筛选发现e m b e l l i n 能与x 连锁凋亡抑制蛋 白( x 1 i n k e di n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n ，x i a p ) 的杆状病毒i a p 重复序列 ( b a c u l o v i r u si a pr e p e a t ，b r 3 ) 结构域c a s p a s e s 的第二个线粒体激活剂( s e c o n d m i t o c h o n d r i a la c t i v a t o ro f c a s p a s e s ，s m a c ) 结合位点相结合，是一种新型的a p 小分 子抑制剂。 目的 本研究旨在探讨e m b l i n 对人白血病细胞系h l 6 0 细胞凋亡的影响以及可能的 作用机制。 方法 一、细胞培养及实验分组 人白血病细胞系h l 6 0 细胞在3 7 c 、含5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养， 于含1 0 d x 牛血清、1 0 0u m l 青霉素和1 0 0l x g m l 链霉素的r p m i 一1 6 4 0 培养液中， 每2 - 3d 传代1 次。设5 个药物剂量组，分别为3 、1 0 、3 0 、1 0 0 及3 0 0 “g m l ，另设 细胞对照组和溶剂对照组。 二、m t t 法检测细胞活性 取对数生长期的h l 6 0 细胞，调细胞密度为1x 1 0 5 m l 接种于9 6 孔培养板中，每个 处理均做8 个复孔，常规培养1 2 、2 4 、4 8h 后，每孔分别加m t t2 0p l ，再培养4h ，2 0 0 0r m i n ，离，t 二, lom i n ，弃去上清，每孔加d m s o15 0 江，振荡10m i n ，用酶标仪钡u 5 7 0n l t i 的a 值。按如下公式计算：细胞增殖率= ( 实验组a 对照组a ) x 1 0 0 ，相应的细 胞增殖抑制率= ( 对照组a - 实验组a ) 对照组a 】x 1 0 0 。 三、a n n e x i nv 原i t c 复染流式细胞术检测细胞凋亡率 在待测细胞( 1 x 1 0 5 m 1 ) 中加入a n n e x i nv - f i t c 和p i ，使其终浓度分别为 5 0 1 x g m l 和1 0 0 k t g m l ，流式细胞仪激发波长为4 8 8 n m 。在双变量流式细胞仪的散点图 上，左下象限为正常细胞( f i t c p i ) ；右上象限为坏死细胞( f i t c + p i + ) ；右 下象限为凋亡细胞( f i t c + p i ) 。 四、j c 1 染色荧光显微镜( 单色滤光片) 观察 用p b s 洗涤e m b e l i n 处理后的细胞2 次( 离心2 0 0 0 r p m ，5 m i n ) ，收集1 x 1 0 6 的细胞，取5 0 0 1 x lj c 一1 工作液将细胞均匀悬浮，3 7 。c 、5 c 0 2 的培养箱中孵育 1 5 2 0 m i n ；室温离心( 2 0 0 0 r p m ，5 m i n ) 后收集细胞，用1 i n c u b a t i o nb u f f e r 洗2 次；吸取5 0 0 t l 1 i n c u b a t i o nb u f f e r 重新悬浮细胞；滴一滴上述细胞悬液于载玻 片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；正常细胞：单色滤光片下观察为黄绿色； 凋亡细胞：单色滤光片下观察则为绿色。 五、w e s t e r nb l o t 分析x i a p 、c a s p a s e 3 及e a s p a s e - 9 的表达 收集经过不同处理的细胞标本，使用细胞裂解液制备细胞总蛋白，以b r a d f o r d 蛋白分析系统检测蛋白浓度。取等量总蛋白上样进行s d s p a g e 凝胶电泳，转膜过 夜，5 脱脂牛奶室温封闭1 h ，加入x i a p ( 1 ：4 0 0 ) 、c a s p a s e 3 ( 1 ：5 0 0 ) 及c a s p a s e 9 抗体( 1 ：5 0 0 ) 4 c 过夜，之后加入二抗室温孵育1 h ，磷酸盐缓冲液( p b s ) 洗涤后， 加入显影剂，暗室显影。 六、统计方法 所有指标均以均数加减标准差表示。用s p s s1 5 0 软件进行方差分析和各组 间率的比较。p 0 0 5 认为差别有显著性。 结果 1 、e m b e l i n 对h l 6 0 细胞具有增殖抑制作用，其抑制作用呈时间及剂量依赖 性。其中3 0 “g l 以上浓度的e m b e l i n 对h l 6 0 细胞的增殖抑制作用较为明显，与对照 组相比，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。显示3 0 肛l 以上 浓度的e m b e l i n 对h l 6 0 细胞有明显的细胞毒作用。 2 2 、1 0 0 1 x g m le m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后1 2 、2 4 及4 8 h 后的特异性凋亡率分别 为9 2 3 + 0 0 5 、2 5 8 6 + 0 3 0 和3 9 0 3 + 0 0 7 ，各组数据比较有统计学差异( p o 0 5 ) 。 j c 1 染色荧光显微镜( 单色滤光片) 观察3 0 9 9 m le m b e l i n 作用12 h 后，h l 6 0 细胞为黄绿色；作用2 4 d , 时后h l 6 0 细胞为绿色( 图2 ) 。 3 、w e s t e r nb l o t 结果显示e m b e l i n f l 邑够抑制a p 的表达。 4 、w e s t e r nb l o t 结果显示e m b e l i n 能够增) n c a s p a s e - 3 及c a s p a s e 一9 的表达。 结论 e m b e l i n 能够通过线粒体途径诱导h l 6 0 细胞凋亡，其机制可能与抑制x i a p 从 而释放c a s p a s e - 3 及c a s p a s e - 9 有关。 关键词 e m b e l i mh l 6 0 细胞；细胞凋亡；x i a p 英文论著摘要 e f f e c to fe m b e l i no na p o p t o s i so fi l l 6 0c e l l s f o r e w o r d e m b e l i ni san o v e lc e l lp e r m e a b l ei n h i b i t o ro fx l i n k e di n h i b i t o ro fa p o p t o s i s ( x i a p ) w h i c hw a sd i s c o v e r e db ys c r e e n i n gal i b r a r yo fn a t u r a lp r o d u c t sd e r i v e df r o m t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e t h e yh a v em u l t i p l eb i o l o g i c a l ，p h a r m a c o l o g i c a la n d m e d i c i n a l p r o p e r t i e si n c l u d i n ga n t i i n f l a m m a t o r y , a n t i b a c t e r i a l ，a n t i o x i d a n t a n d a n t i t u m o r o b j e c t i v e t h ep r e s e n ts t u d yw a su n d e r t a k e nt od e t e r m i n et h em o l e c u l a rm e c h a n i s m sb y w h i c he m b e l i ni n d u c e s a p o p t o s i s i nh u m a nl e u k e m i ac e l l sa n de x p l o r ep o s s i b l e m e c h a n i s m s m e t h o d s 1 c e l lc u l t u r ea n d g r o u pa s s i g n m e n t h u m a nl e u k e m i ac e l ll i n eh l 6 0c e l l sw a sg r o w na n dm a i n t a i n e di nr p m i - 16 4 0 l i q i u dc o n t a i n i n g 10 f e t a ls e r u m ，lo o u lp e n i c i l l i na n d10 0l x g m ls t r e p t o m y c i na ta l l 3 7 ca n d5 c 0 2i nac e l li n c u b a t o r c e l l sw e r ep a s s a g e de v e r yt w oo rt h r e e d a y s g r o u p si n c l u d ee m b e l i no f3 ，10 ，3 0 ，10 0a n d 3 0 0p 咖1 c e l lc o n t r o la n ds o v e n t c o n t r o lw e r ed e s i g n e d 2 m t ta s s a yt od e t e c tc e l lv i ab i l i tyhl60c e l l sw e r es e e d e di n9 6h o l e so ft h ep l a t ew i t l l8p a r a l e l eh o l e sf o rlxl0 5 m 1 d i m e t h y ls u l f o x i d ew a sa d d e dt od i s s o l v et h ei n s o l u b l ep u r p l ef o r m a z a np r o d u c ti n t oa c o l o r e ds o l u t i o n t h ea b s o r b a n c eo ft h i sc o l o r e ds o l u t i o nw a sb e q u a n t i f i e db y m e a s u r i n ga tac e r t a i nw a v e l e n g t h ( 5 7 0 n m ) b yas p e c t r o p h o t o m e t e r c e l lp r o l i f e r a t i o n r a t e 2 ( ao ft e s tg r o u p ao fc o n t r o lg r o u p ) ，a n dc o r r e s p o n d i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n i n h i b i t i o nr a t e 2 【( ao fc o n t r o lg r o u p - ao ft e s tg r o u p ) ao fc o n t r o lg r o u p 4 3 a n n e x i nv - f i t ca n dp is t a i n i n ga n df a c st od e t e c tc e l l a p o p t o s i sr a t e a n n e x i nv - f i t ca n dp 1w e r ea d d e dt oc e l l sw i t lf i n a lc o n c e n t r a t i o no f5 0 9 g m l a n dl0 0 1 x g m lr e s p e c t i v e l y i r r i t a t i o nw a v e l e n g t ho ff a c si s4 8 8 n m i ns c a t t e rp l o t ，l l q u a d r a n ti sn o r m a lc e l l s ( f i t c p i ) ；r uq u a d r a n ti sd e a dc e l l s ( f i t c + p i + ) ；r l q u a d r a n ti sa p o p t o t i cc e l l s ( f i t c + p i 一) 4 j c 一1s t a i n i n ga n do b s e r v a t i o nu n d e r m i c r o s c o p y c e l l sw e r ew a s h e db yp b st w i c ea n dw a sc o l l e c t e da b o u tlxl0 0a n d 5 0 0 “1j c - 1 w o r k i n g f l u i ds u p p e n d e dc e l l s ad r o po fc e l ls u s p e n s i o nw a sf i x e di nf l i m s u n d e r m i c r o c o p y , n o r m a lc e l l si sy e l l o w - g r e e n i s ha n da p o p t o t i cc e l l si sg r e e n i s h 5 w e s t e r nb l o tf o ra n a l y s i so fx i a p , c a s p a s e 一3a n dc a s p a s e - 9 s a m p l e sw e r et a k e nf r o mc e l lc u l t u r ea f t e rd i f f e r e n tt r e a t m e n t c e l l sw e r eb r o k e n d o w nb yc e l ll y s i sb u f f e ra n da n a l y z e db yb r a d f o r dp r o t e i na n a l y s i ss y s t e m t h e p r o t e i n so ft h es a m p l ea r es e p a r a t e du s i n gs d s p a g e ( s d sp o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) a n d t r a n s f e r r e dt oam e m b r a n eo v e r n i g h ta t 4 c b l o c k i n g o f n o n - s p e c i f i cb i n d i n gw a sa c h i e v e db yp l a c i n gt h em e m b r a n ei nad i l u t es o l m i o no f n o n - f a td r ym i l k x i a p ( 1 ：4 0 0 ) 、c a s p a s e 一3 ( 1 ：5 0 0 ) a n d c a s p a s e - 9a n t i b o d y ( 1 ： 5 0 0 ) w e r ea d d e da n dk e p to v e r n i g h ta t4 ca n dt h e ns e c o n da n t i b o d yw a sa d d e d t w o h o u r sl a t e rm e m b r a n ew a sw a s h e db yp h o s p h a t eb u f f e ra n dd e v e l o p e rw a sa d d e db e f o r e d e v e l o p e d 6 s t a t i s t i c a la n a l y s i s s p s s15 0s o f t w a r ew a su s e df o ra n a l y s i s ，ft e s tw a su s e df o rv a r i a t i o n s c o m p a r i s o na n dx 2t e s tw a su s e df o rr a t i oc o m p a r i s o n r e s u l t s 1 e m b e l i ns h o wi n b i b i o no nh l 6 0c e l l si nat i m e - a n dd o s e - d e p e n d e n tm a i l l a e r a n di n h i b i t i o ni so b v i o u s 嘶t l lc o n c e n t r a t i o no v e r3 0 t g l ( p o 0 5 ) e m b e l i ns h o w s c y t o t o x i t yt oh l 6 0 2 a f t e rt r e a t m e n to fh l 6 0c e l l s b ye m b e l i n ，s p e c i f i ca p o p t o s i s r a t ei s ( 9 2 3 士0 0 5 ) ，( 2 5 8 6 士0 3 0 ) a n d ( 3 9 0 3 士0 0 7 ) r e s p e c t i v e l ya t10 0 t g m lo fe m b e l i n 谢t 1 1l2 - ，2 4 - a n d4 8 - h o u r s a c t i o nc o r r e s p o n d i n g l y ( p 0 0 5 ) 5 3 w e s r e nb l o ts h o w se m b e l i ni n h i b i t se x p r e s s i o no fx i a p 4 w e s r e nb l o ts h o w se m b e l i ni n c r e s e se x p r e s s i o no fc a s p a s e - 3a n dc a s p a s e 9 k e y w o r d s e m b e l i n ；h l 6 0c e l l s ；a p o p t o s i s ；x i a p 6 英文缩略语 7 论文 e m b e l i n 对h l 6 0 细胞凋亡的影响 刖 罱 凋亡程度降低是发生肿瘤的重要机制，x 连锁凋亡抑制蛋白( x 1 i n k e d i n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n ，x i a p ) i 因为对c a s p 嬲e s 凋亡途径具有明显抑制作用而 成为凋亡抑制蛋i 刍( i n h i b i t o r so f a p o p t o s i sp r o t e i n ，i a p s ) 家族中被研究的热点。同时， 随着对x i a p 抗凋亡机制的不断认识，x i a p 抑制剂做为靶向治疗的热点也逐渐进 入实验及临床研究。 e m b e l i n 是一种中药提取物，最初主要用于抗感染、抗炎症以及抗增殖等方面 的研究。2 0 0 4 年n i k o l o v s 等通过计算机筛选发现e m b e l l i n f l 邑与x i a p 的杆状病毒i a p 重复序y u 3 ( b a c u l o v i r u si a pr e p e a t3 ，b i r 3 ) 结构域c a s p a s e s 的第二个线粒体激活 剂( s e c o n dm i t o c h o n d r i a la c t i v a t o r o f c a l s p a s e s ，s m a c ) 结合位点相结合，是一种新 型的x i a p 小分子抑制剂。本研究旨在探讨e m b l i n 对人白血病细胞系h l 6 0 细胞凋亡 的影响。 实验材料与方法 一、实验材料 ( 一) 细胞系 1 h l 6 0 细胞系由中国医科大学附属一院肿瘤科刘云鹏教授惠赠。 ( 二) 主要试剂 l 、r p m i 1 6 4 0 p 培养液( 美i 雪h y c l o n e 公司) 2 、新生胎牛血清( 美 s i g m a - a l d r i c h 公司) 3 、x i a p ，c 唧a u s e 一3 ，c a l s p a s e 一9 试剂盒( 美国b d 公司) 4 、鼠抗p - a c t i n ( 美i 雪s i g m a - a l d r i c h 公司) 5 、e m b e l i n ( s i g m a - a l d r i c h 公司1 6 、噻唑蓝( m t t ) ( 北京博奥森生物技术有限公司) ； 8 7 、a n n e x i n v p i 流式检测试剂盒( 北京四正柏生物科技有限公司) 8 、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒j c 1 试剂盒( 南京凯基生物科技发展有 限公司) 9 、e m b e l i n ( 美i 垂is i g m a - a l d r i c h 公司) ( 三) 主要实验仪器 1 、c 0 2 培养箱( 德国h e r ac e l l1 5 0 ) 2 、超净工作台( 北京c j t - 1 2 ) 3 、小型台式离心机( 美i 雪s i g m a - a l d r i c h ) 4 、紫外分光光度计( 英国u v - v i s i b l es p e c t r o m e t e ru v 3 0 0 ) 5 、水平摇床( 美国g f l ) 6 、垂直板电泳装置( 美国b i o r a dm i n i p r o t e i ni i i ) 7 、c h e m ii m a g e 5 5 0 0 凝胶电泳成像分析系统( 美 虱a l p h a i n n o t e c hc h e m i i m a g e r ) 8 、酶标仪( 瑞士s u n r i s e ) 9 、转印电泳槽( 美国b i o r a ds e m i d r yt r a n s f e rs y s t e m ) 1 0 、流式细胞仪( 美国b df a c sc a l i b u r ) 二、实验方法 ( 一) 细胞培养及实验分组 人白血病细胞系h l 6 0 细胞由中国医科大学附属第一医院肿瘤科刘云鹏教授 惠赠，在3 7 c 、含5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养于含1 0 d 、牛血清、1 0 0u m l 青霉素和1 0 0l x g m l 链霉素的r p m i 1 6 4 0 培养液中，每2 - - 3d 传代1 次。设5 个药 物剂量组，分别为3 、1 0 、3 0 、1 0 0 及3 0 0 i t g m l ，另设细胞对照组和溶剂对照组。 ( 二) m t t 法测量细胞增殖抑制率 取对数生长期的h l 6 0 细胞，调细胞密度为1x 1 0 5 m l 接种于9 6 孑i , 培养板中，每孔 加入5 0 “l 细胞悬液，对照组每孔加入5 0i x l 无血清培养基，各实验组每孔加入5 0 “l 用无血清r p m i 一1 6 4 0 培养基稀释的药物。每个处理均做8 个复孔，常规培养1 2 、2 4 、 4 8h 后，每孑l 分别加m t t2 0p l ，再培养4h ，2 0 0 0r m i n ，离一t 二, 10m i n ，弃去上清，每孔加 d m s o1 5 0t t l ，振荡1 0m i n ，用酶标仪钡u 5 7 0n n l 的a 值按如下公式计算：细胞增殖 9 率= ( 实验组a 对照组a ) x 1 0 0 ，相应的细胞增殖抑制率= ( 对照组a 一实验 组a ) 对照组a 】x 1 0 0 。e m b e l i n 的浓度分别为3 、1 0 、3 0 、1 0 0 及3 0 0 i _ t g m l 。 ( 三) a n n e x i nv f i t c 复染流式细胞术检测细胞凋亡率 以浓度为1 0 0 “g m l 的e m b e l i n 作用1 2 、2 4 及4 8 h 后收集细胞。 1 、离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2 0 0 0r p m ，离心时间5 m i n ，弃培养 基； 2 、用冷p b s 洗涤细胞两次； 3 、用4 0 0 p 11 xb i n d i n gb u f f e r 悬浮细胞，浓度大约为1x1 0c e l l s m l ； 4 、在待测细胞( 1 x 1 0 5 m 1 ) 中加入a n n e x i nv - f i t c 和p i ，使其终浓度分别为 5 0 p g m l 和1 0 0 p g m l ，轻轻混匀后于2 8 。c 避光条件下孵育1 5 分钟； 5 、加入l o l x lp i 后轻轻混匀于2 8 0 c 避光条件下孵育5 分钟； 6 、在1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测：流式细胞仪激发波长为 4 8 8 n m 。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为正常细胞( f i t c 卯i ) ；右 上象限为坏死细胞( f i t c + p i + ) ；右下象限为凋亡细胞( f i t c + p i ) 。 特异性凋亡率= 1 0 0 实验组凋亡率( ) - 自发凋亡率( ) 】 1 0 0 - 自发凋 亡率( ) 】，自发性凋亡率应q 5 【2 】。 ( 四) j c 1 染色荧光显微镜( 单色滤光片) 观察 以浓度为3 0 t g m l 的e m b e l i n 作用1 2 及2 4 h 后收集细胞。 1 、用p b s 洗涤细胞2 次( 离，d 2 0 0 0 r p m ，5 m i n ) ，收集不多于l x l 0 6 的细胞； 2 、取1 0 0 1 x l1 0 xi n c u b a t i o nb u 伺衙加9 0 0 “l 灭菌去离子水稀释成l i n c u b a t i o n b u f f e r ，混匀并预热至3 7 ； 3 、吸取5 0 0 t l i xi n c u b a t i o nb u f f e r ，加入1 p lj c 1 ，涡旋混匀配成j c 1 工作液； 因j c 1 在水中的溶解度很小，所以通过离心的方法( 1 0 ，0 0 0 r p m ，l m i n ) 去除不 溶的颗粒，吸取离心后的上清使用，以消除干扰； 4 、取5 0 0 mj c 1 i 作液将细胞均匀悬浮，3 7 c ，5 c 0 2 的培养箱中孵育1 5 m i n ； 5 、室温离心( 2 0 0 0 r p m ，5 m i n ) 收集细胞，用1 i n c u b a t i o nb u l y e r 洗2 次； 6 、吸取5 0 0 p 1 1 i n c u b a t i o nb u f f e r 重新悬浮细胞； 7 、滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；正常 1 0 细胞：单色滤光片下观察为黄绿色；凋亡细胞：单色滤光片下观察则为绿色。 ( 五) w e s t e mb l o t 分析x i a p 、c a s p a s e 3 及c a s p a s e 9 的表达 以浓度为0 、1 0 、3 0 及1 0 0 p g m l 的e m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后提取蛋白检测 x i a p ；浓度为3 0 1 x g m l 的e m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后提取蛋白检测c a s p a s e 一3 和 c a s p a s e 9 。 1 、蛋白的提取：取各组1 x 1 07 细胞，加入冰预冷的细胞裂解液2 0 0 i t l ，冰水浴 中超声粉碎。4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 小时，取上清。 2 、蛋白浓度的测定：参考试剂盒说明，采用考马斯亮蓝法。标准蛋白为 o 5 6 m g m l ，加入考马斯亮蓝g 2 5 0 后室温静置1 0 分钟，于5 9 5 n m 处、l c m 光径，空 白管调零，测各管吸光度值。 各标本蛋白含量( m g m 1 ) = o d 标本o d 标准品标准浓度 根据检测结果，用裂解缓冲液调整各标本至相同蛋白浓度。 3 、蛋白变性：取标本蛋白l o o p , 1 ，7 j i l x a 0 0 i d 样品缓冲液( 2 x ) ，煮沸5 分钟。 4 、配胶：1 0 分离胶1 0 m l ：a c r3 2 m l ，t r i s h c l 缓冲液( p h 8 8 ) 2 5 m l ，蒸馏水4 m l ， a p s5 0 9 l ，s d s10 0 i t l ，t e m e d2 0 p , l ；4 浓缩胶10 m l ：a c r1 4 m l ，t r i s h c l 缓冲液 ( p h 6 8 ) 2 5 m l ，蒸馏水6 m l ，a p so 1 m l ，s d so 1 m l ，t e m e d2 0 1 x l 。灌注分离胶后， 加注少量去离子水，室温下充分聚合后，倾去去离子水，滤纸吸干，灌注浓缩胶， 聚合后，拔出梳子。各标本蛋白上样5 0 山。 5 、电泳：上清用1 2 s d s p a g e 分离，b i o r a d 电泳板，双板条件为1 5 0 v , 3 0 m a ，2 小时。 6 、转印：硝酸纤维素膜在转印液中平衡1 0 分钟，然后胶在负极，膜在正极的 原则，经2 d , 时5 0 v 的转印后t t b s 洗膜1 次。 7 、封闭：用含5 去脂奶粉的t t b s 封闭4 c 过夜。 8 、一抗孵育：取出膜后，t b s 洗膜5 分钟3 次，加入x i a p ( 1 ：4 0 0 ) 、c a s p a s e 3 ( 1 ：5 0 0 ) 及c a s p a s e 9 抗体( 1 ：5 0 0 ) ，室温下2 小时。 9 、二抗孵育：n x 碱性磷酸酶标记的二抗( 1 ：2 0 0 0 ) ，室温下2 小时。 1 0 、清洗：t t b s 沈5 分钟2 次，t b s 洗5 分钟1 次。 1 1 、显色：酶显法，显色剂显色。 1 2 、w e s t e r nb l o t 结果量化分析：采用f l o u r c h e mv 2 0 凝胶成像分析软件 ( a m e r i c a ) 分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行定量分析。 实验结果 二、e m b e l i n 对h l 6 0 细胞的增殖抑制作用 e m b e l i n 对h l 6 0 细胞具有增殖抑制作用，其抑制作用呈时间及剂量依赖性。 其中3 0 p g m l 以上浓度的e m b e l i n 对h l 6 0 细胞的增殖抑制作用较为明显，与对照 组相比，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ( 表1 及图1 ) 。 表1 ，e m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞不同时间后的细胞存活率( 又士s d ，n _ 8 ) 1 2 1 4 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 01 22 4 4 8 时间( h ) 图1 ，不l 司浓度e m b e l i n 对h l 6 0 细胞增殖率的影响( n = 8 ) 二、e m b e l i n 对h l 6 0 细胞凋亡的影响 1 0 0 p g m le m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后1 2 、2 4 及4 8 d , 时的特异性凋亡率分别为 9 2 3 - 4 - 0 0 5 、2 5 8 6 - 4 - 0 3 0 和3 9 0 3 + 0 0 7 ，各组数据比较有统计学差异( p o 0 5 ) ( 图2 ) 。 j c 1 染色荧光显微镜( 单色滤光片) 观察3 0 1 x g m le m b e l i n 作用1 2 h 后，h l 6 0 细胞为黄绿色( 图3 a ) ：作用2 4 d 时后h l 6 0 细胞为绿色( 图3 b ) 。 细胞生存率一文一 。 i 麓 i + ：一j + 溺 辫： 鼹 量 ， 。 警善委融 瓣蘸j 图2 ，1 0 0 1 1 9 m le m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后细胞凋亡率 a - c ：10 0 p , g m le m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后12 t j , 时细胞凋亡率； ( a ：9 2 3 ：b ：9 1 8 ：c ：9 2 8 ) d f ：1 0 0 p , g m le m b e l i n 作用丁h l 6 0 细胞后2 4 d 时细胞凋亡率； ( d ：2 5 2 5 ；e ：2 5 9 5 ；f ：2 6 1 1 ) ； g - l ：1 0 0 “g m le m b e l i n 作用于h l 6 0 细胞后4 8 d 时细胞凋亡率。 ( g ：3 8 9 7 ；h ：3 9 0 1 ；i ：3 9 1 1 ) 1 4 ： d ： ：+ ， _ 巍譬 j 。 j 二 溺 鼯o j 蘸_ ： r ab 图3 ，a ：3 0 弘v m le m b e l i n 作用1 2h ) 舌h l - 6 0 细胞；b ：3 0 1 x l m le m b e l i n 作用2 4h 后肌6 0 细胞 j c l 染色荧光显微镜( 单色滤光片) x 4 0 0 ，缩放比率：2 5 】 四、e m b e l i n 对h l 6 0 细胞x i a p 、c a s p a s e 一3 及c a s p a s e - - 9 表达 的影响 浓度为o ，1 0 ，3 0a n d1 0 0 1 t t g m l 的e m b l i n 作用于h l 6 0 细胞2 4 h 后x i a p 蛋白的表 达随药物浓度的增加而减少( 图4 ) 。 浓度为3 0 1 a g m l 的e m b l i n 作用t - h l 6 0 细胞6 、1 2 7 ) 2 4 h 后e a s p a s e 一3 及c a s p a s e 一9 的表达均随药物作用时问的延长而增加( 图5 ) 。 一 f - - _ 二一删x i a p ， q：q凶l 娅 f m o e l i n ( u g m 1 ) ，2 4 h 图4 ，e e m b l i n 作用于h l 6 0 细胞2 4 h 后x i a p 蛋白的表达 ? 贼端矗c a s p a s e 一3 一- - 嗣- 謦 一一黼一- ” ”驾c a s p a s e 一9 蝴奴獭_ 簟簟 嘲皤鼢嘲蚴孵 州；= 岫0 ；”挑鼍掣9 “吧：= 一誓掌? ：辩 糖_ _ 瓣1 3 - a c t i n 曼曼塾兰2 睦兰璺坠 e m b e l i n ( 3 0 p g m 1 ) 图5 ，e m b e l i n 对h l 6 0 细胞c 雏p 嬲e - 3 及c a s p a s e - - 9 表达的影响 讨论 x i a p 因为对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶( c y s t e i n y la s p i r a t e s p e c i f i c p r o t e i n a s e s ，c a s p a s e s ) 凋亡途径的明显抑制作用而成为i a p s 家族中被研究的热点。 同时，随着对x i a p 抗凋亡机制的不断认识，x i a p 抑制剂做为靶向治疗的热点也逐 渐进入实验及临床研究。 一些研究人员已经应用e m b e l l i n 对乳腺癌、胰腺癌及胃癌等实体肿瘤细胞进 行了研究【3 5 1 ，证实e m b e l i n 确实可以通过抑制x i a p 而促进凋亡。b zc a r t e r 等 应用免疫印迹分析的方法对所有白血病细胞系进行了x i a p 蛋白的检测，结果表 明h l 6 0 细胞表达x i a p 蛋白【6 1 。鉴于促进凋亡是目前治疗白血病的主要方法，我 们研究了e m b e l i n 对h l 6 0 细胞的促进凋亡的作用。 实验结果表明e m b e l i n 在3 0 - - 3 0 0 p g m l 浓度范围内，对h l 6 0 细胞具有增殖抑制 作用，且呈时间与剂量依赖性。之后的a n n e x i nv f i t c 复染流式细胞仪检测显示， e m b e l i n 对h l 6 0 细胞的增殖抑制作用是通过诱导凋亡实现的。细胞凋亡信号通路 分为由细胞表面死亡受体介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径。外源性 途径的起始c a s p a s e s 是c a s p a s e 8 、1 0 ，而在内源性途径中是c a s p a s e 9 、一2 。e m b e l i n 促进细胞凋亡的分子作用机制被认为是与b i r 3 结构域结合后释放- j c a s p a s e9 ，从 而激活了线粒体凋亡的下游途径1 1 ；线粒体跨膜电位( m i t o c h o n d r i a l 1 6 t r a n s m e m b r a n ep o t e n t i a l ，甲m ) 是线粒体内膜两侧电子的不对称分布造成的，在 细胞凋亡的早期阶段，a 甲m 已经出现改变。因为j c 1 染色的原理为细胞a q m 发 生改变，故上述结果也说明e m b e l i n 促进h l 6 0 细胞凋亡的机制与激活线粒体凋亡 的上游途径也有关系。 本实验检测了e m b e l i n 作用2 4 h 后h l 6 0 细胞x i a p 的表达，结果表明随着 e m b e l i n 浓度的增加，x i a p 表达逐渐减少，说明e m b e l i n 对x i a p 的抑制是浓度依赖 性的。x i a p 在肿瘤中的抗凋亡作用已被大量实验所证实，它对凋亡的拮抗主要是 通过抑带l j c a s p a s e s 来实现：x i a p 分子可以直接结合和抑制启动性的c 硒p 弱e 一9 和 效应性的c a s p a s e - 3 和c a s p a l s e - 7 ，但是不能抑制c a s p a s e 一1 、c a s p a s e - 6 、c a s p 豁e - 8 和c a s p a s e 1 0 。这种对c a s p a s e s 的选择性是由b i r 结构域上保守氨基酸残基和b i r 区间连接区l i n k e r 的特点决定的。b i r l 和b i r 2 间的连接区能与c a l s p 嬲e 3 及 c a s p a s e - 7 的活性中心结合，竞争性抑制两者的活性，b i r 2 区能够稳定x i a p c a s p a s e 复合物。x i a p 的b i r 3 可结合c a s p a s e 一9 形成异源二聚体，使之丧失催化 活性。 鉴于x i a p 抑制凋亡的机制是结合c