（生物物理学专业论文）耐辐射球菌抗氧化相关调控子及紫外辐射后转录组的研究.pdf

论文评阅人1 ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 评阅人4 ： 评阅人5 ： 答辩委员会主席： 周雪垩数援逝江太堂盔些皇生物莛苤堂院 委员1 ：拯笠至熬援逝江太堂生盒型堂堂院 委员2 ：昱熟数援塑堑太堂生金型堂堂院 委员3 ：盒亟松主任医生浙江太堂匡堂院 委员4 ：吐迭宣熬握浙江太堂壅些皇生物挞查堂院 委员5 ：堡题遘熬援逝逛太堂壅些皇生物鼓盔堂院 答辩日期： 2 0 10 6 5 ! ：坠q 坠y 匹q 坠墨! 曼y i 曼塑星 d a t eo f o r a ld e f e n e e ：j u n5 ，2 0 l o 一 一一一一一一一一一 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘鲎有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权迸姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月日 项目资助 本研究受到 国家高科技发展计划( 2 0 0 7 a a 0 2 1 3 0 5 ) 国家自然科学基金重点项目( 3 0 8 3 0 0 0 6 ) 农业部“核技术农业应用”专项( 2 0 0 8 0 3 0 3 4 ) t h i sw o r kw a ss u p p o r t e db yag r a n tf r o mt h en a t i o n a l h i t e c hd e v e l o p m e n tp r o g r a m ( 2 0 0 7 a a 0 2 13 0 5 ) ，ak e y p r o j e c tf r o mt h en a t i o n a l n a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no f c h i n a ( 3 0 8 3 0 0 0 6 ) a n dt h ep r o j e c t “a p p l i c a t i o no fn u c l e a r t e c h n i q u e s i n a g r i c u l t u r e ”f r o mt h ec h i n e s em i n i s t r y o f a g r i c u l t u r e ( 2 0 0 8 0 3 0 3 4 ) 平台和创造了自由的学术氛围，我有幸在一个充满活力的优越实验室中快乐学习 和生活，这五年的科研学习经历是我毕生的财富。这笔财富将在我以后的学习、 工作和生活道路上终生受益。 本论文是在恩师的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验的开展、困难的 解决和论文的撰写，都倾注着大量的心血。博士学习期间，得到了很多老师的热 心指导和支持。感谢浙江大学原子核农业科学研究所的陈子元院士、叶庆富教授 的指导和辐照中心的傅俊杰副教授、赵小俊老师和孙志明老师的在辐照处理方面 的帮助。感谢实验室的田兵副教授、孙宗涛博士、沈绍传博士、孙红星博士、华 孝挺博士、李铭峰博士、焦健东博士、汪虎博士、徐虹博士、张惠博士、刘程智 博士、王超硕士、詹红丹硕士、马婷婷硕士、胡雅萍硕士、王媛硕士、王云光硕 士、夏雯蓉硕士、王飞硕士等同学以及已经毕业的周庆博士、林军博士、吴媛媛 博士、应南娇博士等师兄姐们在实验和生活中的帮助。特别感谢陆辉明博士、许 光治博士、王梁燕博士和陈欢博士在实验完成和论文撰写过程中的鼎力相助。 还要感谢浙江大学加州纳米国际研究院华大颂博士、浙江大学作物所桂毅杰 博士、昆虫所田俊策博士和环资学院刘玉学博士在实验讨论和生活上给予的帮 助。 我还深深的感谢我的父母和其他家人对我无私的爱和长期的鼓舞，你们勤劳 和热爱生活的态度影响我一生，你们默默的支持是我最大的精神动力，也要感谢 我的女友朱巧玲对我的关心。 最后，向参加论文评阅和答辩的各位专家致以诚挚的谢意。 尹龙飞 2 0 1 0 年5 月于浙大华家池 摘要 耐辐射球菌不仅对电离辐射具有惊人的抗性，而且对过氧化氢、紫外线和干 燥以及其它物理化学诱变因子都具有极强的抗性。迄今为止，我们对它的极端抗 性的分子机制了解的还很有限。研究证明电离辐射对d n a 直接损伤为2 0 ，8 0 d n a 的损伤是由氧化压力间接产生的，说明了耐辐射球菌的抗氧化能力是其电 离辐射抗性一个重要因素。活性氧应激子o x y r 是一种广泛存在于细菌中的 l y s r 型转录调节因子家族的成员，大肠杆菌o x y r 能够感受过氧化氢胁迫并启 动细胞的抗氧化系统。本文对耐辐射球菌中氧化相关的转录因子o x y r 2 ( d r a 0 3 3 6 ) 在抗氧化过程中的作用进行了一定的研究，有助于从另一个角度 深入理解这极端抗性。本论文还利用基因芯片技术对紫外辐射后耐辐射球菌的全 基因组表达进行了分析。 1 、首先生物信息学分析发现除了o x y r ( d r 0 6 1 5 ) 耐辐射球菌中可能存在 e c o f i o x y r 的另一个同源物o ) ( y r 2 ( d r a 0 3 3 6 ) 。多序列比对表明涉及d n a 结 合结构域、蛋白四聚化、激活区域和形成疏水中心的多个关键氨基酸位点和一个 重要的半光氨酸位点c 2 0 8 都是十分保守，这是第一次发现细菌中可能存在两个 o x y r 同源物。利用完全缺失突变的方法构建了o x y r 2 基因的单突变菌株、o x y r 2 和o x y r 基因的双突变菌株d m ，同时构建完整补偿株m o x y r 2 一m c 和n 端截短 4 8 个核苷酸的补偿株m o x y r 2 一c n ，再利用定点突变法构建半胱氨酸定点突变 的补偿株包括m o x y r 2 一m c 2 2 8 ，m o x y r 2 - m c 2 7 2 和m o x y r 2 - m c z g o 。 2 、对各个突变株和补偿株的特性进行分析，过氧化氢胁迫下的生存率分析 表明o x y r 2 基因的敲除导致突变株对过氧化氢氧化胁迫很敏感，进一步分析表明 突变株内的过氧化氢酶总活性降低以及r o s 积累更多。双突变d m 比单突变对 过氧化氢处理更敏感，过氧化氢酶更低以及r o s 积累更多。补偿实验表明耐辐 射球菌的全基因以和n 端截短4 8 个核苷酸的o x y r 2 都能完全补偿其氧化抗性， 但耐辐射球菌o x y r 2 不能补偿ec o l 的o x y r 突变株g s 0 9 。半胱氨酸定点突变 的补偿株分析表明o x y r 2 的c 2 2 8 是耐辐射球菌在氧化胁迫过程中存活的一个关 键位点。q r t - p c r 结果表明耐辐射球菌的o x y r 和o x y r 2 是持续表达的而且彼 此的突变株并不存在由于氧化胁迫而导致的转录补偿。这些实验结果说明o x y r 2 n 是耐辐射球菌抗氧化过程所必须的。 3 、利用耐辐射球菌全基因组的o l i g 芯片分析了d r a 0 3 3 6 突变株全基因组 的转录水平，比较了突变株和野生株在2 0 m m 过氧化氢处理后转录水平差异。 发现m o x y r 2 中共有1 0 3 个基因改变了其表达模式，表现出r o s 的应急反应： 抗氧化相关基因，铁代谢相关基因以及容易产生r o s 的相关基因受到明显抑制。 4 、用基因芯片技术从转录水平研究耐辐射球菌紫外辐射后全基因组的表达 谱，耐辐射球菌在8 0 0 j i m z 紫外辐射后的总共有1 6 7 个基因发生表达模式改变， 其中8 7 个基因表达上调和8 1 个基因表达下调，d n a 修复相关的基因u v s e ， u v r a 2 ，u v r b ，u v r c ，u v r d ，r e c a 和p p 从都受到紫外辐射的诱导。同时芯片数 据表明耐辐射在紫外辐射后没有表现出一个经典的s o s 反应机制，而且d n a 复制的起始因子d n a a 和分裂有关因子m i n e 的下调说明紫外辐射后可能存在一 个停滞的修复期。 关键词：耐辐射球菌；抗氧化机制；基因芯片；u v 辐射：o x y r 2 ；o x y r m ab s t r a c t d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n si sc h a r a c t e r i z e db yi t se x t r a o r d i n a r yr e s i s t a n c et oa l l k i n d so fd n ad a m a g i n ga g e n t s ，s u c ha si o n i z i n gr a d i a t i o n ，h y d r o g e np e r o x i d e ， u vr a d i a t i o n d e s i c c a t i o na n do t h e rp h y s i c a la n dc h e m i c a ld n ad a m a g i n g a g e n t s h o w e v e r , t od a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mr e s p o n s i b l e f o rt h e a s t o n i s h i n gr e s i s t a n c ei sn o tw e l iu n d e r s t a n d i th a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a t d a m a g i n ge f f e c t so fi o n i z i n gr a d i a t i o na r ed u e t ot h ei n d i r e c to x i d a t i v es t r e s st o d n a t h i si n d i c a t e st h a tt h ea n t i o x i d a t i o na b i l i t yi si m p o r t a n t l yc o n t r i b u t e dt o t h er e s i s t a n c et oi o n i z i n gr a d i a t i o n o x y rw h i c hb e l o n g st ot h el y s rf a m i l yo f t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o rw i d e l y e x i t i nb a c t e r i a ec o i lo x y rr e g u l a t e s e x p r e s s i o no ft h em a j o r i t yo fg e n e sr e s p o n s et oh y d r o g e np e r o x i d e i nt h i s s t u d y , t h ef u n c t i o no fd r a d i o d u r a n so x y r 2 ( d r a 0 3 3 6 ) w e r ei n v e s t i g a t e d i n a d d i t i o n ，t h eg e n o m et r a n s c r i p t i o n a lp r o f i l i n go fd r a d i o d u r a n sf o l l o w i n g8 0 0 j m 2u vr a d i a t i o nw a ss t u d i e d t h er e s u l t sa sb e l o w ： 1 a n a l y s i so ft h ed r a d i o d u r a n sr 1g e n o m eu s i n gt h eb l a s tp r o g r a mw i t h t h ee ，c o i lo x y ra m i n oa c i ds e q u e n c ea saq u e r ys e q u e n c er e v e a l e dt h e p r e s e n c eo fa n o t h e rp u t a t i v eh o m o l o gd r a 0 3 3 6 ( o x y r 2 ) m u l t i p l ea m i n oa c i d s e q u e n c ea l i g n m e n ti n d i c a t e da m i n oa c i dr e s i d u e so fo x y r 2i n v o l v e d i nd n a b i n d i n gd o m a i n ，p r o t e i nt e t r a m e r i z a t i o n ，p o s s i b l ea c t i v a t i n gr e g i o na n dk e y c y s t e i n er e s i d u ec 2 0 8 a r ec o n s e r v e d i ti sf i r s tf o l u n dt h a tt h e r ee x i tt w o h o m o l o g u e si no n eb a c t e r i u m t oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o n ，w ec o n s t r u c t e dt h e d e l e t i o nm u t a n to fo x y r 2a n dt h ed o u b l em u t a n to fo x y ro x y r 2 1 0 x y r 2 m o x y r 2 cs t r a i n sa n dm o x y r 2 - c ns t r a i n s ，c o m p l e m e n t e db yf u l lo x y r 2o r o x y r 2w i t hnt e r m i n a la b s e n c eo f16a m i n oa c i d sr e s p e c t i v e l y ，w e r ea l s o c o n s t r u c t e d p c rs i t e - d i r e c t m u t a g e n e s i s w a s p e r f o r m e d t oc o n s t r u c t m o x y r 2 - m c 2 2 8 ，m o x y r 2 一m 0 2 7 2 和m o x y r 2 - m c 2 9 0 s t r a i n s 2 a l lm u t a n ts t r a i n sa n dc o m p l e m e n t a r ys t r a i n sw e r ec h a r a c t e r i z e d s u r v i v a l r a t ea s s a yw i t hh 2 0 2t r e a t m e n ti n d i c a t e dt h a tm o x y r 2w a ss i g n i f i c a n t l ym o r e s e n s i t i v et oh 2 0 2c o m p a r e dt ot h ew i l dt y p e t h ec o m p i e m e n t a “o ne x p e r i m e n t s h o w e dt h a tt a n s e x p r e s s i o no ft h eo x y r 2o ro x y r 2w i t hnt e r m i n a la b s e n c eo f 16a m i n oa c i d si nm o x y r 2c o u l df u l l yr e s t o r et h eh 2 0 2r e s i s t a n c e 0 2 2 8i sa c r u c i a ls i t ef o rs u r v i v a li nh 2 0 2s t r e s s t h ed o u b l em u t a n td m w a ss i g n i f i c a n t l y m o r es e n s i t i v et oh 2 0 2t h a na n yo ft h es i n g l em u t a n t s m o x y r 2a c c u m u l a t e d m u c hm o r er o st h a nt h ew i l dt y p er 1a n dd ma c c u m u l a t e dt h eh i g h e s tl e v e l o fr o s d e l e t i o no fo x y r 2a t t e n u a t e st h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo fc a t a l a s ea n d d mh a da l m o s tn oi n c r e a s ea f t e rt h et r e a t m e n tw i t hh 2 0 2 t h e s er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h eo x y r 2g e n ei sr e s p o n s i b l ef o rt h es e n s i t i v i t yt oh y d r o g e n p e r o x i d e 3 t ot e s tt h er o l eo fo x y r 2i nd r a d i o d u r a n su n d e rh 2 0 2t r e a t m e n t ，t h ew h o l e g e n o m ee x p r e s s i o np r o f i l eo fm o x y r 2w a sp e r f o r m e di nc o m p a r i s o nw i t hr 1 a f t e rt r e a t m e n tw i t h2 0m mh 2 0 2d u r i n gt h ee x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s e 。t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt o t a l10 3g e n e sc h a n g e dt h ee x p r e s s i o np a t t e r na n d e x h i b i t e dr e s p o n s et or o se m e r g e n c y o n eo b v i o u sc h a r a c t e rw a s t h a tm a n y g e n e sr e l a t e dw i t hp r o d u c t i o n o fr o s ，a n t i o x i d a t i o na n di r o nm e t a b o l i s m s i g n i f i c a n t l yd o w n r e g u l a t e d 4 t ob e t t e ru n d e r s t a n dt h er e s p o n s em e c h a n i s mh o wd r a d i o d u r a n sc o p e d w i t ht h eu vi r r a d i a t i o n ，t h ei n v e s t i g a t i o no ft h eg l o b a lg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e i nr e s p o n s et ou vi r r a d i a t i o nw a sp e r f o r m e d o v e r a l l ，16 7o ft h et o t a lp r e d i c t e d d r a d i o d u r a n sg e n e sr e p r e s e n t e do nt h ec h i pw e r ep r o n o u n c e d l yd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e df o l l o w i n gu v i r r a d i a t i o no f8 0 0j m 2a f t e r3 0m i no fp o s t i r r a d i a t i o n i n c u b a t i o n d n ar e p a i rg e n ei n c l u d i n gu v s e , u v r a 2 ，u v r b ，u v r c , u v r d , p p 阴a n d r e c aw e r ei n d u c e d t h em i c r o a r r a yr e s u l t si n d i c a t et h a tt h e r em a yb en os o s r e s p o n s ea f t e ru vr a d i a t i o ni nd r a d i o d u r a n s d n ar e p l i c a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r v v i 主要缩略词 d s b d o u b l es t r a n db r e a k 双链断裂 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 e s d s a e x t e n d e ds y n t h e s i s d e p e n d e n ts t r a n d 延伸合成依赖的链退火 a n n e a l i n g h 2 0 2 h r n e r n h e j qr p c r r o s u v h y d r o g e np e r o x i d e h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r n o n h o m o l o g o u se n dj o i n i n g q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s i d t r a v i o l e t 过氧化氢 同源重组 核苷酸切除修复 非同源末端连接 实时定量p c r 活性氧 紫外 目录 致谢i 摘要i i a b s t r a c t i v 主要缩略词i l 文献综述1 1 1 耐辐射球菌的研究进展1 1 1 1 耐辐射球菌的分类、生长特性和形态结构1 1 1 2 耐辐射球菌的基因组4 1 1 3 耐辐射球菌的电离辐射抗性机制5 1 1 4 耐辐射球菌氧化抗性机制：1 2 1 2o x y r 的研究进展1 6 1 2 1o x y r 的结构及作用。l6 1 2 2o x y r 调节子的组成。1 7 1 2 3o x y r 调 节子的作用。1 7 1 2 4o x y r i 周控作用的分子机制1 9 1 3 参考文献2 2 2 耐辐射球菌d r a 0 3 3 6 的生物信息学分析以及突变株和相关3 4 2 1 引言3 4 2 2 实验材料与方法3 5 2 2 1 试剂与仪器3 5 2 2 2 生物信息学分析3 5 2 2 3 菌株，质粒与生长条件3 6 2 2 4 基因缺失突变株的构建方法3 8 2 2 5 突变体的功能补偿株的构建3 9 2 2 6d r a 0 3 3 6c 2 2 8 ，c 2 7 2 和c 2 位点的定点突变3 9 2 3 结果与分析4l 2 3 1d r a 0 3 3 6 的生物信息学分析4 1 2 3 2d r a 0 3 3 6 缺失突变株的构建4 6 2 3 3d r a 0 3 3 6 和d r 0 6 1 5 缺失的双突变株的构建4 7 2 3 4d r a d i o d u r a n so x y r 同源物的敲除突变株对过氧化氢敏感。4 8 2 4 讨论5 0 2 5 参考文献5l 3 耐辐射球菌m o x y r 2 突变株和补偿株的特性分析5 4 3 1 引言5 4 3 2 材料与方法5 4 3 2 1 试剂与仪器5 4 v m 3 2 2 菌株及生长条件5 4 3 2 3 过氧化氢处理后耐辐射球菌细胞存活率分析5 6 3 2 46 0 c o 电离辐射处理后耐辐射球菌细胞存活率分析5 6 3 2 5 蛋白溶液中过氧化氢酶总活性的测定5 6 3 2 6 细胞内活性氧( r o s ) 积累量的测定5 7 3 2 7 耐辐射球菌d r a 0 3 3 6 补偿大肠杆菌o x y r 突变株g s 0 9 的菌株构建5 8 3 2 8 大肠杆菌的过氧化氢敏感性实验5 8 3 2 9 实时定量p c r 5 9 3 3 结果与分析6 0 3 3 1d 叼氓2 基因的敲除导致突变株对过氧化氢氧化胁迫很敏感6 0 3 3 2 双突变株对过氧化氢处理更敏感6l 3 3 3o x y r 2 基因的敲除导致突变株细胞内积累更多的活性氧( r o s ) 。6 2 3 3 4o x y r 2 基因的敲除削弱过氧化氢酶的总活性。6 3 3 3 5 耐辐射球菌o x y 9 2 的c 2 2 b 是一个关键位点6 4 3 3 6 耐辐射球菌o x y r 2 不能补偿ec o l i 的o x y r 突变株g s 0 9 6 6 3 3 7 突变株m o x y r 2 和m o x y r 不伴随o x y r 和o x y r 2 转录水平的补偿6 7 3 4 讨论6 9 3 5 参考文献7 l 4 耐辐射球菌d r a 0 3 3 6 突变株的转录谱的分析7 3 4 1 引言7 3 4 2 实验材料与方法7 4 4 2 1 基因芯片和实时定量p c r 所需的试剂和仪器7 4 4 2 2 细菌培养和处理7 5 4 2 3 耐辐射球菌总r n a 的抽提，质检和浓度测定7 5 4 2 4 耐辐射球菌寡核苷酸芯片的制备7 6 4 2 5 杂交探针的制备7 6 4 2 6 寡核苷酸芯片的预杂交，杂交和清洗7 7 4 2 7 数据分析7 7 4 2 8 实时定量p c r ( q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c r ，q r t - p c r ) 7 9 4 3 结果与分析7 9 4 3 1 突变株转录谱明显改变7 9 4 3 2q r t - p c r 方法验证芯片数据8 5 4 4 讨论8 6 4 5 参考文献8 9 5 耐辐射球菌紫外辐射后的转录组研究9 l 5 1 引言。9l 5 2 实验材料与方法9 2 5 2 1 试剂与仪器9 2 x 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 1 文献综述 耐辐射球菌( d e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n s ) r 1 是1 9 5 6 年美国科学家a n d e r s o n 等人在x 射线辐照过的肉类罐头中首次分离得到的一种极端微生物( a n d e r s o n e fa 1 9 5 6 ) ，之后不久在医院的空气污染物中也分离到耐辐射球菌s a r k 菌株。 耐辐射球菌( d e 仃o c o c c u sr a d i o d u r a n s ) 以其惊人的电离辐射抗性而闻名，它 能在慢性辐照下( 6 0 g y h ) 正常生长而不影响外源基因的表达( b r i me ta l2 0 0 0 。 v e n k a t e s w a r a ne ta 1 2 0 0 0 ) ；在超过15 k g y h 的急性辐照条件下既不会死亡也 不会产生突变( d a l ye ta l19 9 4 ) 。然而，大肠杆菌在6 0 g y h 的辐照条件下就不 能生长而且被杀死，枯草芽孢杆菌在此条件下也不能生长( t h o m l e y19 6 3 ) 。耐辐 射球菌不仅对电离辐射而且对干燥、紫外线、强氧化剂和丝裂霉素等各种化学诱 变剂都表现出超强的抗性( m o s e l e y & e v a n s1 9 8 3 ，m i n t o n1 9 9 4 ，w a n g & s c h e l l h o r n19 9 5 ，m a t t i m o r e & b a t t i s t a19 9 6 ，l a n g ee ta l19 9 8 ) 。 耐辐射球菌的抗电离辐射机制受到了科学家的更多关注，而其抗氧化及抗紫 外辐射的研究相对较少。细菌在进化过程中形成了一套抵抗氧化损伤作用的抗氧 化系统，目前已发现o x y r 、s o x r s 、p e r r 及o h r r 等蛋白能通过转录调控其他 基因应答氧化胁迫。根据比较基因组学的初步研究发现耐辐射球菌中存在有两个 o x y r 同源物，推测它们在耐辐射球菌的抗氧化系统中起着重要的作用。 本章将分别对耐辐射球菌以及o x y r 的研究进行综述。 1 1 耐辐射球菌的研究进展 1 1 1 耐辐射球菌的分类、生长特性和形态结构 耐辐射球菌第一次分离到时被归为m i c r o c o c c u s 属，经过3 0 多年的研究将 它重新划分到一个新属d e i n o c o c c u s 。根据1 6 sr r n a 序列的分析表明图1 1 ， 该属和嗜热属( t h e r m u s ) 最为接近都属于d e i n o c o c u s s - t h e r m u sf l ( r a i n e ye t a 1 1 9 9 7 ) 。根据b c b i 数据库对d e m o c o c c u s 属的统计，该属还包括d e m o c o c c u s g o b i e n s i s ( y u a n e ta l 2 0 0 9 ) ，d e i n o c o c c u s g e o t h e r m a l i s ，d e i n o c o c c u s l 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 a e r i u s ( y a n g e ta l2 0 0 9 ) ，d e i n o c o c c u sa e t h e r i u s ( 、( a n ge ta l2 0 10 ) ，d r a d i o p u g n a n s ，d e i n o c o c c u s r a d i o p h i l u s ，d e m o c o c c u s r a d i o t o l e r a n c e ， d e i n o c o c c u s g r a n d i s ( r a i n e ye ta l2 0 0 5 ) ，d e m o c o c c u sp e r a n d i l i t o d s ( r a i n e y e fa l2 0 0 7 ) ，d e m o c o c c u ss a x i c o l a ，d e i n o c o c g u sf r i g e n s ( h i r s c he ta l2 0 0 4 ) 和d p r o t e o l y t i c u s 等3 0 多个菌种。该属的物种尽管形态结构各不相同，但是一 个共同特点就是对电离辐射具有极强的抗性。在这些细菌中由于d r a d i o d u r a n s 易于遗传转化和基因操作，因此它受到研究者的更多关注，被作为研究原核生物 d n a 损伤修复和抗性相关分子机制的模式细菌。 图1 1 基于1 6 sr r n a 基因序列的细菌进化树 f i g 1 1ap h y l o g e n yo ft h em a i nl i n e a g e so fd o m a i nb a c t e r i ab a s e do n16 s r r n ag e n es e q u e n c e t h es c a l eb a rr e p r e s e n t s10i n f e r r e dn u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n sp e r10 0n u c l e o t i d e s 耐辐射球菌是一种需氧的球形细菌，在缺氧条件下基本不能生长；其菌落在 培养基上为圆形且由于能产生粉红色色素而显红色，直径在1 - 2 p m 之间( 图 1 2 ) ：该菌没有孢子不能运动也不会致病( a n d e r s o ne ta l1 9 5 6 ) 。 2 图1 2 耐辐射球菌透射电镜下和t g y 平板上的形态 f i g1 2m o r p h o l o g yo fd r a d i o d u r a n sw i t ht r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y a n do nt h et g yp l a t e 其最适的生长温度是3 0 c ，不能在高于4 5 c 或低于4 下生长( m e i m a l i d s t r o m2 0 0 0 。l e c o i n t ee t a l2 0 0 4 a ) ，细胞的每个传代时间在1 5 3 h 不等。在 指数生长期耐辐射球菌9 0 以二联体存在；生长后期开始形成四联体而在稳定 期绝大多数以四联体存在( 图1 3 ) ( m i n t o n1 9 9 6 ) 。 图1 3 稳定期的耐辐射球菌在扫描电镜下的形态( m i n t o n1 9 9 6 ) f i g1 3m o r p h o l o g yo fd r a d i o d u r a n sa ts t a t i o n a r yp h a s ew i t hs c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e 3 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 耐辐射球菌的细胞壁比较特殊，其成分与革兰氏阴性菌相似，但是肽聚糖层 比较厚导致革兰氏染色呈阳性，故一般把耐辐射球菌归为革兰氏阳性菌。耐辐射 球菌的细胞膜由细胞质膜和外膜组成，中间被一个1 4 2 0 n m 的肽聚糖层和分隔 层分开。在电镜下观察其细胞膜一般可以分为六层，从外到内依次是规则排列的 六角形中间体层( 典型的细菌的s 层) ；电子致密层；外膜；分区层( 分成无数 细小的区域) ；富含肽聚糖的细胞壁( 其上分布很多孔) 和最里面的细胞膜，有 的最外面还有一层多糖外膜( q u i n t e l ae ta l1 9 9 9 ) 。耐辐射球菌的外膜和内膜具 有相同的脂质成分，但是与其脂肪酸的成分与其它的细菌明显不同。耐辐射球菌 含有单不饱和脂肪酸而不含有多不饱和、分支和环丙基脂肪酸，也不含有细胞膜 的传统成份磷脂( t h o m p s o ne ta l19 8 0 ) 。膜脂而是由甘油磷脂和一些列的羟基 胺组成( a n d e r s o n & h a n s e n19 8 5 ) 。虽然在嗜热菌属中也发现含有葡萄糖胺的 脂质，但甘油磷脂仍被认为是耐辐射球菌所特有的( p a s k - h u g h e s s h a w 1 9 8 2 ) 。 1 1 2 耐辐射球菌的基因组 w h i t e 等人在19 9 9 年将耐辐射球菌r 1 菌株的全基因组序列成功解析，整 个基因组由染色体i ( 2 6 5 m b ) 、染色体i i ( 4 1 2 k b ) 、一个大质粒( 1 7 7 k b ) 和 一个小质粒( 4 5 7 k b ) 组成，整个基因组的平均g + c 含量高达6 6 6 ( w h i t ee t a 1 9 9 9 ) 。根据预测，基因组共编码3 1 8 7 个开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ， o r f ) ，平均大小为9 3 7 b p 。详细的o r f 信息可见表1 1 ，大约有1 3 的基因未 能从数据库中找到同源物，其中匹配的还有5 1 1 个是功能未知的基因，这其中可 能蕴含着许多与耐辐射球菌的超强抗性机制相关的重要基因，如已经被证明在电 离辐射抗性中起多效性作用的基因p p r ( 也称为i r r e ) ( e a r le ta l2 0 0 2 ，h u ae ta l 2 0 0 3 ) ，在目前的所有的数据库中不能找到p p r 的同源基因，序列分析表明包含 三个保守的结构域：h t h 、p e s t 和z n 依赖性的多肽酶。 表1 1 耐辐