（土壤学专业论文）bt蛋白在土壤中降解的影响因素研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕上研究生学位论文 b t 蛋白在土壤中降解的影响因素研究 摘要 利用基因工程得到的转b t 抗虫作物大大缓解了虫害给作物生产造成的危害，使 作物大幅增产，并减少了化学农药的使用。但转b t 基因作物大规模商品化的潜在 生态风险受到国内外学者广泛关注，土壤中b t 蛋白的生物活性及其残留是评价其 对非目标物种潜在风险和环境命运的重要参数。本文将纯化的b t 蛋白直接加入土壤 中，模拟自然状态下b t 蛋白在土壤中的降解，利用e l i s a 检测法，研究灭菌、温 度、p h 、初始浓度等对其降解的影响，以期为评价转b t 基因作物释放可能引起的 生态环境风险提供科学依据。结果表明： 1 ) 红壤、黄棕壤、黄褐土和砖红壤中的b t 蛋白本底值不同，且经过灭菌、酸 处理、碱处理之后，b t 蛋白的含量均发生改变。土壤经过灭菌后，b t 蛋白的含量明 显变少，而经过酸处理或碱处理之后，测得b t 蛋白的含量升高，其中，碱处理后的 土样中b t 蛋白含量最高。 2 ) 未灭菌和灭菌红壤的d t 5 0 分别为5 2 、1 1 2 天，d t 9 0 分别为2 3 1 、3 9 4 天； 未灭菌和灭菌黄棕壤的d t 5 0 分别为1 5 、4 1 天，d t 9 0 分别为5 2 、1 7 6 天，都是未 灭菌土样中b t 蛋白的小于灭菌土样，表明b t 蛋白在未灭菌土样中比在灭菌土样中 降解快，灭菌可减缓b t 蛋白的降解。 3 ) 5 、2 5 、4 0 c 时，红壤中b t 蛋白的d t 5 0 分别为8 1 、5 2 、5 4 天，d t 9 0 分别 为3 2 9 、2 3 1 、2 2 3 天，5 。c 时b t 蛋白的d t 5 0 和d t 9 0 大于2 5 。c 和4 0 。c 时；三个温 度下，黄棕壤中b t 蛋白的d t 5 0 分别为7 9 、1 5 、1 6 天，d t 9 0 分别为2 3 9 、5 2 、5 6 ， d t 5 0 和d t 9 0 的大小次序为5 。c 2 5 c 4 0 。c 。显然，在两种供试土壤中，5 。c 时b t 蛋白的残留时间较2 5 和4 0 时残留时间长，说明高温能加速b t 蛋白在土壤中的 降解。在蒸馏水中，5 、2 5 、4 0 。c 时，b t 蛋白的d t 5 0 分别为5 0 、0 9 、2 2 天，d t 9 0 分别为1 5 8 、3 1 、7 8 天，5 时b t 蛋白的d t 5 0 和d t 9 0 明显长于2 5 。c 和4 0 * c ，而 2 5 。c 时的d t 5 0 和d t 9 0 又明显小于4 0 。c 。三个温度中，2 5 。c 是b t 蛋白在蒸馏水中降 解的最佳温度。 4 ) 黄褐土p h 值分别为4 3 2 、5 3 1 、6 6 2 时，b t 蛋白的d t s o 为1 0 3 2 、4 2 6 、 b t 蛋白在- 卜壤中降解的影响因素研究 1 8 4 天，d t 9 0 为3 6 2 5 、1 6 2 9 、7 6 5 天。不同p h 值的黄褐土中b t 蛋白的d t 5 0 和 d t 9 0 的大小次序为p h 4 3 2 p h 5 3 1 p h 6 6 2 。表明，当黄褐土的p h 在4 3 2 6 6 2 之 间时，p h 越高b t 蛋白降解越快。 5 ) 砖红壤p h 值为3 7 5 、4 4 7 、5 1 7 时，b t 蛋白的d t 5 0 分别为1 0 2 9 、6 6 、3 2 6 天，d t 9 0 分别为3 9 5 5 、3 3 5 、1 1 6 0 天。不同p h 值的砖红壤中b t 蛋白的d t 5 0 和 d t 9 0 的大小次序为p h 3 7 2 p h 5 1 7 p h 4 4 7 。表明，较高p h 能够促进b t 蛋白的降 解，但当砖红壤的p h 在3 7 5 5 1 7 之间时，b t 蛋白的降解速度呈先加快后减慢的趋 势。 6 ) 供试土壤中加入三种不同初始浓度的b t 蛋白后，相同取样时间的b t 蛋白残 留量大小均随加入土壤中的b t 蛋白的初始浓度升高而增大。初始浓度分别为5 0 、 1 0 0 、2 0 0g gg 土以的b t 蛋白加入黄褐土中后，其d t s o 分别为1 3 7 、2 2 9 、2 8 3 天， d t 9 0 分别为5 0 2 、8 0 5 、1 0 5 3 天；加入砖红壤中后，其d t 5 0 分别为2 5 、6 2 、9 2 天，d t 9 0 分别为8 4 、3 0 1 、3 9 6 天。不同初始浓度的b t 蛋白在两种供试土壤中的 d t 5 0 和d t 9 0 的大小次序均随浓度增加而增大。b t 蛋白的浓度越高，在土壤中残留 的时间越长，越难降解消除。 关键词：b t 蛋白，降解，灭菌，温度，p h ，初始浓度 i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕十研究生学位论文 a bs t r a c t t r a n s g e n i cb tc r o p so b t a i n e db yg e n e t i ce n g i n e e r i n g h a dg r e a t l yr e l i e v e dt h ed a m a g e c a u s e db yi n s e c tp e s t ，t h e r e b yi m p r o v e dt h ey i e l do fc r o p sa n dl e s s e n e dt h ea p p l i c a t i o no f p e s t i c i d e h o w e v e r , t h ep o t e n t i a le c o l o g i c a l r i s k b r o u g h tb y t h e l a r g e s c a l e c o m m e r c i a l i z a t i o no ft r a n s g e n i cb tc r o p sh a sb e e nh i g h l yc o n c e r n e db yt h es c h o l a r sf r o m d o m e s t i ca n da b r o a d ，s i n c et h eb i o a c t i v i t ya n dr e s i d u eo fa p p l i e db tp r o t e i ni n t os o i la r e t h ei m p o r t a n tp a r a m e t e r st oa p p r a i s et h e i rp r o t e n t i a lr i s kt on o n o b j e c t i v es p e c i e sa n df a t e o fe n v i r o n m e n t i nt h i se x p e r i m e n t ，w ea p p l i e dt h ep u r i f i e db tp r o t e i ni n t os o i lt os i m u l a t e t h ed e g r a d a t i o no fb tp r o t e i ni ns o i lu n d e rn a t u r a lc o n d i t o n sa n ds t u d yt h ee f f e c to f s t e r i l i z a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，p h ，i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no nt h ed e g r a d a t i o no fb tp r o t e i nb y e l i s af o rt h es a k eo fp r o v i d i n gs c i e n t i f i cb a s i sf o rt h ee v a l u a t i o no fe c o e n v i r o n m e n t r i s k sc a u s e db yt r a n s g e n i cb tc r o p s t h em a i nr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) t h ei n i t i a lc o n t e n to fb tp r o t e i ni nr e ds o i l ，y e l l o wb r o w ns o i l ，y e l l o wc i n n a m o n s o i la n dl a t o s o lw e r ed i f f e r e n ta n dt h ev a l u e sc h a n g e da f t e rt h es o i l sw e r ee i t h e rs t e r i l i z e d o ra d d e dw i t ha c i do ra l k a l i t h es t e r i l i z a t i o nm a d et h ec o n t e n to fb tp r o t e i nd e c r e a s eb u t a c i d i f i c a t i o n a l k a l i z a t i o nb r o u g h ti tt oi n c r e a s e m o r e o v e r , t h ec o n t e n to fb tp r o t e i ni nt h e s o i lt r e a t e dw i t ha l k a l ia t t a i n e dt ot h em a x i m u m 2 ) t h ed t s 0o fn o n s t e r i l i z e da n d s t e r i l i z e dr e ds o i lw a s5 2a n d11 2 d a y s r e s p e c t i v e l y , w h i l ef o rd t 9 0t h e yw e r e2 3 1 a n d3 9 4 ；t h ed t s oo fn o n s t e r i l i z e da n d s t e r i l i z e dy e l l o wb r o w ns o i lw a s1 5 ，4 1d a y sr e s p e c t i v e l y , a n df o rd t 9 0t h e yw e r e5 2 a n d17 6 a p p a r e n t l y , t h ed t 5 0a n dd t g oo fb tp r o t e i ni nn o n s t e r i l i z e ds o i lw e r el o n g e r t h a nt h o s ei ns t e r i l i z e ds o i lr e s p e c t i v e l y a sac o n c l u s i o n ，b tp r o t e i ni nn o n - s t e r i l i z e ds o i l d e g r a d e df a s t e rt h a n t h a ti ns t e r i l i z e ds o i la n dt h es t e r i l i z a t i o ns l o w e dd o w nt h e d e g r a d a t i o no f b tp r o t e i ni ns o i l 3 ) t h ed t s oo fb tp r o t e i ni nr e ds o i lw a s8 1 ，5 2 ，5 4d a y sa n dt h ed t 9 0w a s3 2 9 ， 2 3 1 ，2 2 3d a y si na c c o r d a n c ew i t ht h et e m p e r a t u r ea t5 c ，2 5 c ，4 0 cr e s p e c t i v e l y t h e d t 5 0a n dd t 9 0o f b tp r o t e i na t5 cw e r el o n g e rt h a nt h o s ea t2 5 ca n d4 0 c t h ed t s oo f b tp r o t e i ni ny e l l o wb r o w ns o i lw a s7 9 ，1 5 ，1 6d a y sa n dt h ed t 9 0w a s2 3 9 ，5 2 ，5 6 d a y su n d e rt h et e m p e r a t u r eo f5 c ，2 5 c ，4 0 。cr e s p e c t i v e l y t h ec o m p a r i s o no fd t s oa n d d t 9 0a td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ei s5 c 4 0 c - - 2 5 * c o b v i o u s l y , b o t h i nt h et w o e x p e r i m e n t a ls o i l s ，t h er e s i d u a lt i m eo fb tp r o t e i na t5 cw a sl o n g e rt h a nt h a ta t2 5 co r 4 0 。cd e n o t i n gt h a th i g h t e m p e r a t u r ew i l la c c e l e r a t et h ed e g r a d a t i o no fb tp r o t e i ni ns o i l i i i b t 蛋白在土壤中降解的影响因素研究 t h ed t s oo fb tp r o t e i ni nd i s t i l l e dw a t e rw e r e5 0 ，0 9 ，2 2d a y sa n dt h ed t 9 0w e r e15 8 ， 3 1 ，7 8d a y sw h e nt h et e m p e r a t u r ew a s5 c ，2 5 。c ，4 0 cc o r r e s p o n d i n g l y t h ed t s 0a n d d t 9 0o fb tp r o t e i na t5 cw e r ee v i d e n t l yl o n g e rt h a nt h ec o u n t e r p a r t sa t2 5 ca n d4 0 c o nt h eo t h e rh a n d t h ed t s 0a n dd t 9 0a t2 5 w e r ee v i d e n t l ys h o r t e rt h a nt h o s ea t4 0 a m o n gt h e t h r e ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，2 5 ci st h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o r t h e d e g r a d a t i o no fb tp r o t e i ni nd i s t i l l e dw a t e r 4 ) t h ed t s 0o fb tp r o t e i ni ny e l l o wc i n n a m o ns o i lw a s10 3 2 ，4 2 6 ，18 4d a y sa n d t h ed t 9 0w a s3 6 2 5 ，16 2 9 ，7 6 5d a y sw h e nt h ep hw a s4 3 2 ，5 31 ，6 6 2r e s p e c t i v e l y t h e c o m p a r i s o nf o rd t s oa n dd t 9 0o fb tp r o t e i ni ny e l l o wc i n n a m o ns o i lu n d e rd i f f e r e n tp h c o n d i t i o n sw a sp h 4 3 2 p h 5 31 p h 6 6 2i l l u m i n a t i n gt h a tt h eh i g h e rp hc a m et ot h e f a s t e rd e g r a d a t i o no f b tp r o t e i nw i t h i nt h ep hr a n g eo f4 3 2 6 6 2i ny e l l o wc i n n a m o ns o i l 5 ) t h ed t s oo fb tp r o t e i ni nl a t o s o lw a s10 2 9 ，6 6 ，3 2 6d a y sa n dt h ed t 9 0w a s 3 9 5 5 ，3 3 5 ，11 6 0d a y sw h e nt h ep hw a s3 7 5 ，4 4 7 ，5 1 7r e s p e c t i v e l y t h ec o m p a r i s o no f d t s 0a n dd t 9 0 0 f b tp r o t e i ni nl a t o s o la t t r i b u t e dt od i f f e r e n tp hw a sp h 3 7 5 p h 5 1 7 p h 4 4 7 w ec o u l dd r a wac o n c l u s i o nt h a tt h eh i g h e rp hc a na c c e l e r a t et h ed e g r a d a t i o no f b tp r o t e i n ，b u tt h ed e g r a d a t i o ns p e e d su pf i r s ta n dt h e ns l o w sd o w nw i t ht h ep hr a n g eo f 3 7 5 5 17i nl a t o s 0 1 6 ) a f t e ra d d i n gt h eb tp r o t e i na tt h r e ed i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n si n t ot h e e x p e r i m e n t a ls o i l sr e s p e c t i v e l y , t h eb tp r o t e i nr e s i d u er i s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fi n i t i a l c o n c e n t r a t i o na tt h es a m es a m p l i n gt i m e t h ed t s 0o fb tp r o t e i ni ny e l l o wc i n n a m o ns o i l w a s1 3 7 ，2 2 9 ，2 8 3d a y sa tt h et h r e ed i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so f5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 “g g - ls o i lr e s p e c t i v e l ya n df o rt h ed t 9 0t h e yw e r e5 0 2 ，8 0 5 ，10 5 3d a y s ；f o rt h ed t s oo fb t p r o t e i ni nl a t o s o lt h e yw e r e2 5 ，6 2 ，9 2d a y sa n df o rt h ed t g ot h e yw e r e8 4 ，3 0 1 ，3 9 6 d a y s t h ed t s 0a n dd t 9 0o fb tp r o t e i ni nt h et w oe x p e r i m e n t a ls o i l si n c r e a s e dw i t ht h e m o u n t i n gi n i t i a lc o n c e n t r a t i o n s t h eh i g h e rc o n c e n t r a t i o no fb tp r o t e i nc o n t r i b u t e dt ot h e l o n g e rr e s i d u a lt i m ed e m o n s t r a t i n gt h a tt h eb tp r o t e i ni ns o i lw a sd i f f i c u l tt oe l i m i n a t eb y d e g r a d a t i o n k e yw o r d s ：b tp r o t e i n ，d e g r a d a t i o n ，s t e r i l i z e ，t e m p e r a t u r e ，p h ，i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 径如需保密，解密时间。二，r 年j ：月? 7e l 是否保密v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 张杏矿帆叩年6 月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文储张办畛锄鲐郴i 碑 蝴期：抄f 年6 月7 日 鳓期：叫年月夕日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 1 前言 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 是革兰氏阳性，芽孢杆菌属陆 生习性的细菌。苏云金芽孢杆菌存在于土壤中，也可寄生在一些蛾类和蝶类的幼虫 上，甚至是植物表面。苏云金芽孢杆菌由日本细菌学家石渡繁胤和德国科学家恩斯 特贝尔林纳( e r n s tb e r l i n e r ) 分别在1 9 0 1 年和1 9 11 年独立发现，与蜡样芽胞杆菌 和炭疽杆菌同属芽孢杆菌属，区别在于质粒的不同。与同属的其他成员一样，这三 种杆菌需氧且可产生内孢子。 苏云金芽孢杆菌分泌出的由c r y 基因编码的c r y 蛋白对鳞翅目、双翅目和鞘翅 目有很大杀伤力。因此，可将苏云金芽孢杆菌发酵生产制成高效生物杀虫剂，或用 c r y 基因制成防虫害的转基因产品。 苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白生产出的杀虫剂，由于其窄谱杀虫活性，被广 泛认为是环境友好的杀虫剂，对人体、野生生物、传粉昆虫和其它多数益虫几乎没 有作用。比利时植物遗传系统公司在1 9 8 5 年首次报道开发出含c r y 基因的转基因烟 草。1 9 9 0 年，中国农科院与江苏省农科院合作，成功地将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体 蛋白基因导入棉花品种中，获得了抗棉铃虫的转基因棉植株。 自从s c h n e p f 等( 1 9 8 1 ) 首次成功地克隆了第一个编码b t 杀虫晶体蛋白基因， 至u 2 0 0 4 年5 月，人们已经克隆了3 2 3 个杀虫晶体蛋白基因，其中3 1 5 个已定名 ( c r i c k m o r ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。大量b t 基因的克隆，为利用转基因技术进行植物品种改 良提供了丰富和有效的抗虫基因资源，已成为植物抗虫基因工程中应用最广泛的抗 虫基因( 姚艳玲等，2 0 0 5 ) 。迄今为止，国际上已命名的c r y 和e y t 杀虫蛋白基因有 1 3 0 多个( c r i c k m o r ee ta 1 ，1 9 9 8 ；s c h n e p f e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。其中部分被转入棉花、玉米 等农作物中并得到应用( 赵建周等，1 9 9 6 ；喻子牛等，1 9 9 5 ) 。据不完全统计，在美 国已商品化的转b t 棉花和玉米占种植品种的2 0 4 0 ；在我国转b t 棉花已通过安 全性评价并进入商品化生产( 潘家荣等，2 0 0 6 ) 。植物抗虫基因工程中，由于b t 蛋 白基因表达产生的6 内毒素具有对昆虫毒力高、专一性强、修饰后在植物体内表达 水平高等优点，越来越多的植物被导入b t 蛋白基因( 崔林开等，2 0 0 6 ) 。 b t 杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的，转基因植物产生 的主要是其中的6 内毒素。在菌体内的杀虫蛋白以一种前体的形式存在，称为原毒 b t 蛋白在士壤中降解的影响因素研究 素( p r o t o x i n ) 并自发形成伴胞晶体，在昆虫中肠的碱性和还原环境下被降解为6 0k d a 左右的活性肽，并与受体蛋白结合，嵌合于细胞膜，引起膜穿孔，最终导致昆虫瘫 痪或死亡( c u m m i n g se ta 1 ，1 9 9 4 ：f e r r ee ta 1 ，1 9 9 5 ：h o r ee ta 1 ，1 9 8 9 ；v a ne ta 1 ，9 9 0 ) 。 但插入转基因作物体内的修饰基因不是编码合成非毒性的原毒素，而是编码合成活 性的杀虫晶体蛋白。因而活化原毒素的肠道高p h 和专一蛋白酶不是其产生毒性的 必需因素，尤其是导入土壤中的蛋白能被结合到土壤颗粒而不易被微生物降解并仍 然保持杀虫晶体蛋白活性，能导致杀虫晶体蛋白的累积，从而使土壤的特异生物功 能类群以及土壤生物多样性都有可能因此改变( h e e k e le ta 1 ，1 9 9 4 ：k o s k e l l ae ta 1 ， 1 9 9 7 ；m c g a u g h e y e ta 1 ，1 9 9 2 ；s i m se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 1 1 转b t 作物和b t 蛋白表达 1 1 1 转b t 作物的规模 至2 0 0 3 年，转基因作物的全球种植面积约为6 6 7 0 万h m 2 ，其中4 9 7 0 万h m 2 为耐 除草剂的大豆、玉米、欧洲油菜和棉花，另# b 1 2 2 0 万m 2 为抗虫作物，而又以b t 杀 虫基因应用的最早并最为广泛( j a m e se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。随着转基因技术的日趋完善，科 学家们也开始致力于其他作物的开发，转b t 基因作物的种类发生了很大变化( 朱路 青等，2 0 0 5 ) 。抗虫玉米、棉花、马铃薯、番茄等已实现商品化应用，2 0 0 3 年全球 种植抗虫转基因作物的面积已达n 1 2 2 0 万h m 2 ，占转基因作物总种植面积的1 8 ( c l i v ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 棉花是重要的农作物，但其种植易受到棉铃虫的危害，甚至造成棉花年减产近 1 0 1 5 ( 束春娥等，1 9 9 7 ) 。国内外已成功将人工改造的b t 基因转入棉花中，从 而获得了b t 基因表达量显著提高的抗虫棉。转b t 基因棉因可显著抑制棉铃虫幼虫 的危害，且不影响棉花性状而具有较好的发展前景( 董双林等，1 9 9 7 ) 。因此，在一 系列研究试验的基础上，国内外从1 9 9 6 年已开始大面积的商品化生产应用( p e f e r o e n e ta 1 1 9 9 7 ) 。目前，转基因棉花已经成为中国唯一大规模种植的转基因大田作物， 占棉花总种植面积的5 0 左右( 张锋等，2 0 0 6 ) 。 b t 玉米是全球商品化程度最高的抗虫转基因作物之一。2 0 0 3 年，全球共种植 b t 玉米1 5 5 0 万h m 2 ，占转基因作物总面积的2 3 ( j a m e se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。美国商品化种 植的b t 玉米主要是b t l l 、m o n s l 0 和e v e n t1 7 6 ( u se p a ，2 0 0 0 ) ，其中m o n s a n t o 的 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕十研究生学位论文 m o n 8 1 0 已于1 9 9 8 年获准在我国东北三省进行环境释放( 农业部基因工程安全管理 办公室) 。中国农业大学选育的b t 玉米也已获准在河北和东北等地环境释放( 农业 部基因工程安全管理办公室) ，但转b t 基因作物大规模商品化的潜在生态风险仍是 国内外学者关注的焦点问题( 聂呈荣等，2 0 0 3 ；s a x e n ae ta 1 ，2 0 0 0 ：s t o t z k ye ta 1 ，2 0 0 0 ； 王建武等，2 0 0 2 1 王建武等，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 转b t 作物中蛋白表达的时空动态 国内外许多学者对抗虫作物各器官蛋白的表达特性进行了研究( b r u n se ta 1 ， 2 0 0 3 ；陈松等，2 0 0 0 ；s a c h se ta 1 ，1 9 9 8 ；t r a o r ee ta 1 ，2 0 0 0 ；张永军等，2 0 0 1 ) ，结 果表明，由于作物内部发育的调控及其生长环境、管理条件等一些外界条件的不同 而对杀虫晶体蛋白的表达产生影响，导致杀虫晶体蛋白在不同转b t 基因作物组织、 不同生长发育时期的表达具有一定的时空特性。 采用e l i s a 法研究转b t 基因大豆不同生长时期各器官中b t 蛋白含量变化的结 果表明，转b t 基因大豆不同器官在不同生育期b t 蛋白含量表现出较大差异。顶叶中 b t 蛋白的表达随植株的生长不断加强，顶叶中b t 蛋白的表达在苗期比较旺盛，分 枝期略有下降并保持相对稳定，在开花期时又明显增加，直到成熟期；在相同生育 期内，转基因大豆营养器官中b t 蛋白的含量高于生殖器官。根中的b t 蛋白含量最 高，茎其次，叶中的b t 蛋白含量最低。花和幼荚器官中的b t 蛋白含量虽然相对低 于其他器官中的，但仍处于较高水平。新生幼荚中的b t 蛋白含量比其它器官中都低， 但在3 0 天后开始迅速增a n ( 朱路青等，2 0 0 5 ) 。 1 1 3b t 蛋白对作物相关性状的影响 克螟稻大田生长试验表明其农艺性状也发生了不同于其亲本的明显变化，如植 株高度降低、分蘖力增强、穗长、穗粒数、千粒重明显下降等( c u ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。亲 本稻秀水1 1 中导入苏云金杆菌杀虫蛋白基因( c r yl a b ) 等外源基因后，水稻秸杆中 的某些化学物质含量发生了较大的变化，如秸杆含碳量和速效钾含量的下降以及氮 和磷含量的上升等。营养基质含量的较大差异可能导致淹水条件下土壤微生物种群 数量、种群结构和组成的变化，从而导致土壤脱氢酶活性的显著差异( 吴伟祥等， 2 0 0 3 ) 。 3 b t 蛋白在士壤中降解的影响因素研究 1 2b t 蛋白的检测技术 b t 晶体蛋白是转b t 基因生物的b t 基因表达产物，是鉴定抗虫性的重要指标， 其快速、准确测定可为育种、虫害管理和基因标识提供技术支撑( 潘家荣等，2 0 0 6 ) 。 1 2 1 酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 由于酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 检测转b t 植物，具有快速、灵敏、可定 量分析等优点，而越来越多地被应用。目前国内已有e l i s a 在转b t 棉花、玉米、 水稻和油菜( 陈松等，1 9 9 9 ：刘光明等，2 0 0 2 ；秦崇涛等，2 0 0 3 ；林良斌等，2 0 0 1 ) 等植物上应用的研究报道。 现有三种e l i s a 检测方法。( 1 ) 直接法e l i s a ：b t 杀虫蛋白直接包被，1 b s a ( 牛 血清白蛋白) 封闭后加酶标抗体，最后加底物显色并读数。( 2 ) 间接法e l i s a ：b t 杀 虫蛋白直接包被，1 b s a 封闭后加一抗再加酶标二抗，最后加底物显色并读数。 ( 3 ) 夹心法e l i s a ：包被i g g ，1 b s a 封闭后j j l l b t 杀虫蛋白再加酶标抗体，最后 加底物显色测定。 在对转b t 基因植物体内表达的b t 杀虫蛋白进行检测时，三种e l i s a 法都有应 用( 崔林开等，2 0 0 5 ) 。秦崇涛等( 2 0 0 3 ) 认为夹心法e l i s a 较好，可能是由于提 取液中大量可溶性蛋白的存在，对e l i s a 法的检测有一定的干扰作用，而夹心e l i s a 由于先用i g g 包被酶标板，可选择性结合b t 杀虫蛋白，受到的影响较小。目前多使 用间接法e l i s a 或夹心法e l i s a 。 1 2 2 其它检测方法 除e l i s a 检测法外，还有其它一些比较有效的b t 蛋白检测法，我们可根据不同 的使用条件选择应用。 ( 1 ) b t 晶体蛋e t c r y l a c 放射免疫检测技术( 潘家荣等，2 0 0 6 ) ：与酶联免疫法 测定结果比较，此法利用磁性微粒连接i g g 带t j 备免疫分离剂，在磁场的作用下，抗原 抗体复合物自动沉淀，不需离心即可分离，具有使用方便，制样简单，不用离心分 离等优点，且种子样品不用去酚和脱脂，灵敏度即可达至l j l 0 0 p gm l 一，在一定程度 上优于酶联免疫法。c r y1 a c 放射免疫检测方法快速准确测定的特点，为育种、转基 因植物的虫害管理和基因标识提供了另一种检测手段。 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 ( 2 ) 斑点酶联免疫吸附法( 崔林开等，2 0 0 6 ) ：斑点酶联免疫吸附法( d o t e l i s a ) 是在常规酶联免疫吸附法的基础上以纤维素膜为载体的一种新型免疫检测技术，这 种微孔滤膜对样品吸附量大，且包被牢固，样品用量少，试验结果可通过颜色斑点 的出现与否和色泽进行判定，不需特殊仪器，其敏感性及特异性高于或相当于常规 e l i s a 及放射免疫测定( 李文敏等，2 0 0 3 ) 。也分为直接法d o t e l i s a 、间接法 d o t e l i s a 和夹心法d o t e l i s a 法( b u r d o ne ta 1 ，19 8 4 ) 。直接法和间接法d o t e l i s a 在进行定性测定的同时，还可以进行半定量测定。3 种d o t e l i s a 相比，间接法 d o t e l i s a 的效果较好，特别是使用a k p 系统时，灵敏度更高。 ( 3 ) 生物测定法( 汤慕瑾等，2 0 0 0 ；倪珏萍等，2 0 0 2 ) ：是目前最为广泛采用 的鉴定方法，其原理是根据不同昆虫对蛋白不同敏感性或者同一昆虫的不同死亡率 来进行的。其以棉铃虫初孵幼虫为测试生物，采用人工饲料混药法，7 2 h 检查试虫 死亡率，测定b t 的相对毒力，比较毒力效价( j e n k i n se ta 1 ，1 9 9 3 ) 。生物测定对于综 合、全面评价转b t 基因棉花的抗虫效果，甚至于在其他实验方法无法检出浓度的情 况下具有重要意义。 ( 4 ) s d s p a g e 电泳法( 刘丰茂等，1 9 9 8 ；李萍等，1 9 9 6 ；l i ue ta 1 ，1 9 9 9 ) ： 即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电脉，该法通过运用实验室s d s p a g e 电泳，依 据不同蛋白质相对分子质量的差异，使转b t 基因棉中的有效毒素蛋白与其他杂蛋白 分离，之后用电泳图像扫描仪或薄层扫描仪对毒素蛋白区带进行扫描，由于凝胶上 每条蛋白带的量与其吸收蜂的面积成j 下比，据此计算出样品中有效蛋白的含量，实 现对b t 毒蛋白的定量测定。实验表明，该法简单，耗时较短，重复性好，与生物测 定法具有较好的相关性。 ( 5 ) 协同凝集反应( 戴经元等，1 9 9 8 ) ：协同凝集反应是一种类似于间接凝集 反应的血清学检测方法，其是在一定电解质存在的情况下，抗原吸附其相应抗体而 产生凝集块的反应。该法用金黄色葡萄球菌s p a 作为i g g 抗体的载体，以检测相应 抗原。协同凝集反应的特异性强，灵敏度高。研究表明，其与生物学测定法结果具 有一定的相关性。 ( 6 ) 抗生素抗性鉴定法( 叶鹏盛等，2 0 0 3 ；李俊兰等，2 0 0 4 ；朱加保等，2 0 0 3 ) ： 研究表明，转b t 基因棉花中含有抗生素抗性的n p t - i i 基因( 新霉素磷酸转移酶i i 基 因) ，而这类基因常与b t 基因融合在一起，据此可对转基因棉株进行早期筛选。该 5 b t 蛋白在十壤中降解的影响冈素研究 法的原理是基于转b t 基因抗虫棉含有如n p t - i i 基因类的抗生素抗性基因，使棉花对 卡那霉素产生一定的抗性，转基因棉花能在含卡那霉素的培养基中正常生长，而非 转基因棉花在含卡那霉素的培养基中则黄化，最后死亡。该法是转b t 基因棉花快速 鉴定和纯度鉴定的有效方法。 1 3b t 蛋白与土壤的相互作用 1 - 3 1b t 蛋白进入土壤的方式 b t 玉米的b t 蛋白可通过根系分泌、残茬分解或秸秆还田以及花粉飘落进入土 壤生态系统( l o s e ye ta 1 ，1 9 9 9 ；s a x e n ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ，其中，秸秆还田是最主要的途 径( 王建武等，2 0 0 5 ) 。 在转b t 基因作物的释放过程中还可通过残茬或花粉等形式向土壤中导入杀虫 晶体蛋白，而杀虫晶体蛋白在土壤中的累积可以受许多因子影响，不仅可能与杀虫 晶体蛋白的类型、形式( 孢子或晶体) 、浓度有关，而且可能与土壤类型、湿度、微 生物构成、耕作深度、连作次数和气候等因子有关( p u s z t a le ta 1 ，1 9 9 1 ；w e s te ta 1 ， 1 9 8 5 ) 。因而转b t 基因作物释放后导入土壤中杀虫晶体蛋白的生物活性及其在土壤 中的残留特性是评价其对非目标物种潜在风险和环境命运的重要参数( 孙彩霞等， 2 0 0 3 ) 。 1 3 2b t 蛋白与土壤颗粒的吸附结合 在实验室内进行的纯化杀虫晶体蛋白与土壤性质关系的研究表明( 孙彩霞等， 2 0 0 4 ) ，杀虫晶体蛋白能快速被土壤吸附并紧紧地结合，结合态杀虫晶体蛋白仍保持 杀虫活性且比游离态杀虫晶体蛋白更抗降解( v e n k a t e s w e r l ue ta 1 ，1 9 9 2 ；t a p pe ta 1 ， 1 9 9 5 ；c r e c c h i oe ta 1 ，1 9 9 8 ；c r e c c h i o ，2 0 0 1 ) 。b t 蛋白进入土壤后，可快速吸附在土 壤活性颗粒表面，与之紧密结合而避免生物降解，并至少保持8 个月的杀虫活性 ( s t o t z k ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。美国的s t o t z k y 矛1 d o n e g a n 研究小组( t a p pe ta 1 ，1 9 9 8 ；s a x e n ae t a 1 ，2 0 0 1 ；d o n e g a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 先后对转b t 棉花和转b t 玉米所产生的杀虫蛋白的环 境行为进行了研究，发现转b t 玉米和转b t 棉花所表达的杀虫蛋白能迅速和紧密地 与粘土矿物、腐殖酸及土壤表面活性颗粒等结合，其在土壤中的持留期可达1 8 0 d 以 上，且仍保留相当高的杀虫活性( s a x e n ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 6 华中农业人学2 0 0 9 届硕士研究生学位论文 s a x e n a ( 2 0 0 2 ) 等比较了粘土对b t 毒素垂直运动的影响，他们在0 、3 、6 、 9 和1 2 等不同粘粒含量的土壤中分别加入从植株中纯化的b t 蛋白和b t 作物的秸 秆，在没加粘土的土壤渗透液中b t 蛋白含量最高( 7 5 ) ，在粘土含量为1 2 土壤渗 透液里b t 蛋白含量最低( 1 6 ) ，而在未加入b t 蛋白的土壤或者加入非转b t 基因作 物秸秆的土壤渗透液中检测不至t j b t 蛋白，土壤渗透液里的b t 蛋白含量随着加入蛋白 浓度的增加而增加，但随着土壤中粘粒含量的增加而降低。粘粒对b t 蛋白具有很强 的吸附性，土壤粘粒含量较高有利于b t 毒素与土壤颗粒