（应用化学专业论文）大环配体双核金属配合物的合成、结构及相关金属酶模拟研究.pdf

摘要 摘要 本文合成了3 个大环配合物：i c u z l ( c h 3 c n ) 2 ( c 1 0 4 ) ， 2 c u 2 l ( c h 3 c n ) 2 】( h 2 0 ) 2 ( c l ) 2 ，3 n i 2 l ( h 2 0 ) 2 ( c 1 0 4 ) 2 c h 3 0 h ，用元素分 析、电喷雾质谱和x 射线晶体衍射对其进行表征，并做了一系列的性质 研究。 本文主要的工作如下： 1 以2 ，6 二甲酰基4 c l - 苯酚和丙二胺通过p b 2 + 作模板进行缩合反 应，进一步与铜和镍盐反应合成了三个大环双核金属配合物，研究了两 个配合物的单晶结构。 2 通过核黄素光照法研究配合物三，l 的s o d 酶活性，与天然 c u z n s o d 的活性相比得到配合物的相对活性分别为11 8 2 5 和6 2 8 。 3 采用琼脂糖凝胶电泳手段，考察了配合物三，王对p b r3 2 2 d n a 的切割作用，结果表明：两个配合物均有一定的活性，配合物l 在浓度 为o 8 m m 时能将d n a 切割成线状d n a 。 4 用紫外吸收光谱法研究了配合物2 ，王对磷酸单酯键模型物n p p 的水解催化作用，从p h 、底物磷酸酯的浓度以及配合物浓度探讨了配合 物对磷酸酯水解速率的影响，发现配合物互可使n p p 的水解速率提高1 0 3 倍，配合物王可使n p p 的水解速率提高1 0 4 倍，其催化水解常数分别为 o 1 4 3 m o l l o s o 和o 5 9 3 m o l l j s 一，具有良好的催化活性。 关键词：大环配合物，s o d 活性，磷酸酯水解 武汉丁程大学硕上学位论文 a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，t h r e ec o m p l e x e sw e r es y n t h e s e s ( 1 c u z l ( c h 3 c n ) 2 】 ( c 1 0 4 。) 2 ，2 c u 2 l ( c h 3 c n ) 2 ( h 2 0 ) 2 ( c 1 。) 2 ，三 n i 2 l ( h 2 0 ) 2 】( c 1 0 4 。) 2 c h 3 0 h ) a n dc h a r a c t e r i z e d b yi n f r a r e d ，e l e m e n t a la n a l y s i s ，e s - m sa n dx r a y c r y s t a l l o g r a p h y ，a n das e r i e so fc h a r a c t e r so ft h ec o m p l e x e sw a ss t u d i e d t h em a i nw o r ko ft h i sd e s s e r t a t i o nw a sa sf o l l o w s ： 1 i nt h i sw o r k ，t w od i n u c l e a rc o p p e r ( i i ) c o m p l e x 三，2 - a n dad i n u c l e a r n i c k e l ( i i ) c o m p l e x 三w e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yp h y s i c a lm e t h o d s i nd e t a i l 2 t h es o d l i k ea c t i v i t yo ft h ec o m p l e x 三，2 - w e r es t u d i e db yi l l u m i n a t i o n o fn b t , t h er e l a t i v ea c t i v i t yo ft h ec o m p l e x1 ，2 - w e r e11 8 2 5a n d6 2 8r e l a t i v e t ot h en a t u r es u p e r o x i d ed i s m u t a s ee n z y m e 3 t h ec l e a v a g er e a c t i o n so fs u p e r c o i l e dp b r 32 2d n aw i t hc o m p l e x 三，兰 w e r em o n i t o r e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t ss h o wt h a t ： c o m p l e x 兰c a no n l yc l e a v a g es u p e r c o i l e dd n a t ot h en i c k e dd n a ( f o r mi i ) c o m p l e xc o m p l e x e s1c a ni n c i s es u p e r c o i l e dd n at ot h en i c k e dd n a ( f o r m i i ) a n dt h el i n e a rd n a ( f o r mi i i ) w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni s0 8m m 4 h y d r o l y s i so f4 - n i t r o p h e n y lp h o s p h a t ec a t a l y z e db yt h ec o m p l e x 2 - ，3 - w e r ei n v e s t i g a t e db yu v a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y t h ee f f e c to fh y d r o l y t i c r a t eo fp h o s p h a t em o n o e s t e rw a ss t u d i e da saf u n c t i o no fp h ，a sw e l la s c o n c e n t r a t i o no ft h es u b s t r a t ea n dc o m p l e x r e s u l t ss h o wt h a tt h ec o m p l e x2 - a p p r o x i m a t e l yp r o v i d e s 3 o r d e r so fm a g n i t u d er a t ea c c e l e r a t i o nf o rt h e h y d r o l y s i sr e a c t i o n ，a n dc o m p l e x3 - a p p r o x i m a t e l yp r o v i d e s4o r d e r so f m a g n i t u d e t h er a t ec o n s t a n t so fc o m p l e x2 - a n d 一3a r eo 14 3 m o l l 1 s ， 0 5 9 3 m o l l 1 s a n de x h i b i t se f f i c i e n tc a t a l y s i s k e y w o r d s ：m a c r o c y c l i cl i g a n d ，s o d l i k ea c t i v i t y , p h o s p h a t a s eh y d r o l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研 究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：4 丕破涛 i 弘9 年6 月可日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解我校有关保留、使用学位论文的规定，即： 我校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅。本人授权武汉工程大学研究生处可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编本学位论文。 保密o ，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密“ ( 请在以上方框内打“4 ) 学位论文作者签名： 岔淑浩 炒7 年月7 日 指导教师签名嘲雅 扩c 7 年6 硝日 第1 章绪论 1 1 大环配合物 第1 章绪论 韦尔纳【1 】( a l f r e dw e n e r ) 于18 9 3 年在德国无机化学学报上发表第 一篇题为“对无机化合物结构的贡献”配位理论的论文，奠定了配位化 学的基础，他提出的配位理论的概念，是现代的配位化学理论的演进和 发展。 在韦氏时代，研究化合物配位构型的主要手段是化学分析、分子量 测定、电导、旋光，靠测定化合物异构体数日和性质等【2 4 】。五十年代初， d c w e r 和c h a t 解释了韦尔纳时代就制得的某些不饱和烯烃作为配体( 与金 属) 的成键性质【5 - 6 1 ，1 9 5 5 年二苯合铬 c r ( c 6 h 6 ) 2 】的合成发展了一大类环状 和链状不饱和配体配合物【7 1 。我们认为，含两个或多个可以独立存在的 简单物种通过各种结合作用形成的组成，结构一定的化合物既符合传统 配位化学又适应现代配位化学，更广泛意义上的配合物。 近几十年来，由于大环多胺金属配合物特殊的催化活。 , 生f 9 - 1 0 l 使其成为 当今化学领域非常活跃的研究课题之一【l1 。1 5 】。其与一般冠醚化合物相比 具有两个重要的特征：( 1 ) 能与许多金属离子能形成稳定的配合物，成环氮 原子具有强碱性，故能与一形成铵离子形式；( 2 ) 环上较易引入其他基团， 如亲水基团或功能基团等，能得到水溶性更好的配体。合成方法大致可 以分为两类：第一类为直接合成法，大环配体与金属盐直接反应。第二 类称为模板合成法，金属离子在大环化合物中起着模板作用1 1 6 】。近年来， 模板合成法成为一种新兴的无机合成方法，其突出优点是产率高，选择 性高，操作简单等，因而广泛应用于大环配合物的合成【1 7 】。 1 2 金属酶模拟 酶一作为生化反应的催化剂，由于其反应条件温和、催化效率高和 高度的专一性而倍受关注1 1 8 _ 9 1 。1 3 以上的酶含有金属离子( 这类酶称为 武汉工程人学硕十学位论文 金属酶) ，生物体内的许多金属酶，如超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ) ，单加氧酶( m m o ) 、尿酶素、氨肽酶及磷酸酶等，其 活性中心均由双金属离子组成【2 0 1 。通常酶催化机理涉及到两个方面：( 1 ) 金属离子在水解金属酶中的作用；( 2 ) 水解金属酶中配位基的作用。一般催 化机理有三个方面：( 1 ) 金属一羟基机理，金属作为l e w i s 酸作用。( 2 ) 金属一氢氧离子机理，金属离子不仅作为l e w i s 酸结合底物，并且金属上 结合的氢氧负离子或水分子被极化后作为亲核试剂攻击底物。( 3 ) 双核 金属配合物中金属离子协同作用机理。目前研究得较为详尽的金属酶如 超氧化物歧化酶、碳酸酯酶、羧肽酶、碱性磷酸酯酶、及核酸酶等【2 1 | ， 它们都具有双金属活性中心，因而双核配合物模拟酶的研究倍受关注【2 2 1 。 1 2 1 超氧化物歧化酶模拟 1 9 3 8 年m a n n 和k e i l i n 2 3 1 ，首次从牛红细胞中得到一种含铜蛋白一 血铜蛋白。1 9 6 9 年m c c o r d 和f r i d o v i c h t 2 4 1 发现此蛋白能使超氧阴离子自 由基0 2 。发生歧化反应： 2 0 2 。+ 2 h + 嘎0 2 + h 2 0 2 将其定名为超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) s o d 是一种广泛存在于动植物和微生物中的金属酶，按活性中心金 属种类不同，可将s o d 分为三类：铜锌超氧化物歧化酶c u z n s o d ，锰超 氧化物歧化酶m n s o d ，铁超氧化物歧化f e s o d 2 5 1 。此外，还有 n i s o d t 2 6 1 。目前c u z n s o d 因其在防止0 2 对细胞的损害方面的重要作用 1 2 7 而研究最多。现有的超氧化物歧化酶的模拟物与天然的s o d 相比较， 还有很多缺陷，完善活性测定方法是当今研究s o d 模拟化学的一个挑战 【2 8 1 。 第l 章绪论 1 2 2 双核金属磷酸酯酶 在生物体内，存在着许多以金属离子为辅因子的水解酶称为水解金 属酶。它们能催化底物的加水分解，如水解肽键的肽酶、水解酯键的磷 酸酶( 包括核酸酶) 、水解酰胺键的脲酶等【2 9 1 ，在这类酶中，已被研究得 较为详细的水解金属酶有碳酸酐酶【3 0 1 ，羧肽酶a t 3 1 】，碱性磷酸酯酶，紫 红酸磷酸酯酶1 3 2 】，37 ，57 外切核酸酶【3 3 】，p 1 核酸酶等。它们在人类的 许多生理过程如蛋白质、肽、d n a 、磷酸酯等的合成与分解中起着十分 重要的作用，并且在光学异构体拆分、肽合成、生物工程中已有重要应 用【3 5 1 。因此，借助化学的理论和实验手段，设计合成合理的水解金属酶 模型进行模拟研究，不仅有助于深化对天然酶作用机制的认识，而且， 对人工水解金属酶的设计合成、基因工程、功能材料的设计以及化学武 器防护和环境保护等具有十分重要的意义。，金属离子作为金属酶中的活 性中心，在输送物质、电子的转移、键合外来分子和进行催化反应等过 程中扮演着极为重要的角色。由于金属酶中金属离子的成键方式、配位 环境和空间结构与金属配合物极其相似。因此，应用配位化学的基理论 和方法对金属酶进行研究，通过对配体的设计和剪裁，可以合成出与天 然酶活性中心结构相似的小分子配合物。 b r e s l o w 3 6 - 3 8 等首先用配合物模拟水解酶，并首次报道了金属离子协 同催化磷酸酯的水解【3 9 1 。金属间的间距以及配体分子的柔性和包容性对 磷酸单酯和二酯的催化水解机理有影响。 c h i n t 4 0 】等报道了双核c u ( i i ) 配合物高效催化磷酸二酯的水解，使r n a 模型物h p n p 的酯转移速率提了约1 0 4 倍。但对r n a 本身却无活性，这被 归结为空间阻碍的影响。 1 3 配合物的核酸活性 自1 9 7 9 年s i g m a n 等人发现第一个化学核酸酶【4 1 1 双l ，1 0 菲咯啉铜 ( 简称c u u ( p h e n ) 2 ) 以来，有越来越多的课题组开展了该领域的研究。 人工核酸切割试剂的研究是八十年代发展起来的生物无机化学领域的重 武汉工程人学硕上学位论文 要分支，2 0 年以来一直是生物化学和分子生物学最为活跃的前沿研究领 域之一1 4 2 1 。研究人工核酸切割试剂具有很重要的理论价值和应用价值。 本实验选用的p b r 3 2 2d n a 是分子生物学中常用的一种，也是研究得最 多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。它有如下优点： ( 1 ) 相对分子质量较小，( 2 ) 它带有一个复制起始位点，保证了该质粒 只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能，( 3 ) 具有两种抗生素抗性基 因，可供转化子的选择标记，( 4 ) 具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩 增以后，每个细胞中可累积1 0 0 0 3 0 0 0 份拷贝，该特性为重组体d n a 的制备提供了极大的方便。 1 4 本课题研究内容及方法 1 以丙二胺和2 ，6 一二甲酰基4 c 1 苯酚通过p b 2 + 作模板进行缩合反应 得到大环铅配合物，浓硫酸脱铅后进一步与铜盐和镍盐反应合成了三个 大环双核铜配合物，获得了单晶结构。用物理方法对上述化合物进行了 系统的表征。 2 通过核黄素光照法研究配合物呈，2 ，生的s o d 酶活性，得到配合 物l 的活性单位i c 5 0 = 0 4 7 3 u m o l l ，配合物互的活性单位0 2 5 1 m o l l ，配 合物生的活性单位o 7 1 m o l l ，与天然c u z n s o d 的活性相比得到配合物 的相对活性分别为1 1 8 2 5 ，6 2 8 和1 7 7 5 。 3 凝胶电泳成像实验表明配合物l 在反应时间为6 小时，浓度为 o 8 m m 能将超螺旋d n a ( p b r 3 2 2 ) 切割成线性d n a 。配合物王只能将其 切成带缺口的环状d n a 。 4 配合物三，王对磷酸酯的催化水解作用，在p h = 8 5 6 时有最大催化 水解速率，改变底物及配合物的浓度，分别得到配合物旦，王对磷酸酯的 催化水解常数为o 1 4 3 m o l l 1 s 一，配合物3 对磷酸酯的催化水解常数 为0 5 9 3 m o l l 。1 s 。 第2 章大环双核金属配合物的合成及表征 第2 章大环配体双核金属配合物的合成及表征 2 1 合成路线 本实验选用模板法合成了还原的大环双核铜和镍配合物，并用红外、 元素分析、电喷雾质谱和x 射线晶体衍射对其晶体结构进行表征。 ( 1 ) 配合物的合成： c i c c i o h 三m e o h 2 0 ( i ) 】 f i n a lr i ，w r 2 【1 2 0 ( i ) 】 so nf 2 9 8 8 0 0 ( 5 ) 10 8 4 2 4 ( 4 ) 8 4 3 o ( 5 ) 1 1 6 9 3 4 3 8 0 7 1 0 7 3 2 3 3 2 6 0 0 2 19 7 0 0 9 1 8 ，0 1 8 7 3 1 0 6 0 表2 4 配合物l 的主要键长和键角 t a b l e2 4s e l e c t e db o n dd i s t a n c e sa n da n g l e so ft h ec o m p l e x s l _ 武汉t 程人学硕士学位论文 图2 4 配合物l 的阳离子晶体结构图 f i g 2 4ap e r s p e c t i v ev i e wo ft h es t r u c t u r eo ft h ec o m p l e x 三 配合物l 是个对称的双核结构，两个铜的配位环境相同，每个铜分 别与酚基中的两个氧原子，侧基上的两个氮原子，以及乙腈分子中的氮 原子形成5 配位的四方锥结构，两个酚基氧原子和两个侧基氮原子构成 四方锥底平面，而乙腈氮原子处于锥顶位置，c u 2 + 离子位于底平面的中心， 酚基上的两个氧原子分别桥联着两个铜原子，c u ( 1 ) 和c u ( 2 ) 的距离为 3 0 7 a 。 2 3 2 配合物3 n i 2 l 2 ( h 2 0 ) 2 ( c 1 0 4 ) 2 ( c h 3 0 h ) 的晶体结构 表2 5 配合物王的晶体数据和有关数据收集及结构精修数据 t a b l e2 5as u m m a r yo fc r y s t a l l o g r a p h i cd a t aa n dd a t ac o l l e c t i o np a r a m e t e r so ft h e c o m p l e x s 墨 c o m p l e x 3 e m p i r i c a lf o r m u l a c 2 3 h 3 8 c 1 4 n i 2 n 4 0 9 f o r m u l aw e i g h t7 7 3 7 6 c r y s t a ls y s t e mo r t h o g o n a l i t y 第2 章人环舣核金属配合物的合成及表征 s p a c eg r o u p 岛( a ) b ，( a ) c ，( a ) q ，( o ) p ，( o ) y ，( o ) v o l u m e ( a 3 ) z d c ( g c m 3 ) f ( 0 0 0 ) m ok c tr a d i a t i o n ( a 3 ) 0r a n g e ( d e g ) o b s e r v e dd a t a 【i 2 0 ( i ) 】 f i n a lr i ，w r 2 【i 2 0 ( i ) 】 so nf 二 1 p b c n 1 5 9 8 3 7 ( 13 ) 1 7 1 4 8 4 ( 1 4 ) 1 2 0 1 0 2 ( 1 0 ) 9 0 0 0 9 0 0 0 9 0 0 0 3 2 9 1 9 ( 5 ) 4 1 6 8 6 1 7 2 0 0 7 1 0 7 3 2 3 8 2 6 0 0 2 5 0 0 0 0 7 1 9 0 1 5 5 2 1 1 3 4 表2 6 配合物王的主要键长和键角 t a b l e2 6s e l e c t e db o n dd i s t a n c e sa n da n g l e so f t h ec o m p l e x s 3 _ 1 3 武汉i 程 学坝十学位论空 图2 5 配合物的阳离子晶体结构图 f i g 25 a p e r s p e c t i v e v i e w o f t h es t r u c t u r eo f t h ec o m p l e x ! 配合物也是个对称的双核结构，两个镍的配位环境相同，每个镍 原子分别与酚基中的两个氧原子，侧基上的两个氮原子，一个水分子和 一个c 1 0 4 的氧原子配位，形成了六配位扭曲的八面体构型。两个酚基氧 原子和侧基氮原子形成赤道平面，高氯酸根的氧原子和水分子处于两个 锥顶位置，配位c l o ；的两个氧原子分别连接着两个铜离子，由于c l n 。 在大环配体的一侧参与配位，使大环配体的两个苯环平面向同一边弯折， 这与配合物l f f 3 两个苯环平面平行不同。 合成了三个还原的大环职核配合物，得到了两个单晶，通过、电喷 第2 章大环舣核金属配合物的合成及表征 雾质谱以及x 一射线晶体衍射对配合物晶体进行了表征，证实了目标产物 的存在。 第3 章配合物的性质研究 3 1 引言 第3 章配合物的性质研究 b r e s l o w 5 0 1 提出人工酶( a r t i f i c i a le n z y m e ) 的概念以来，水解金属酶 的模拟也越来越热门f 5 卜5 引。本章主要研究了配合物三，一2 ，王的电化学性 质，配合物三，对d n a ( p b r 3 2 2 ) 的切割活性，配合物旦，2 ，生的s o d 模拟，配合物垄，羔对磷酸酯的水解作用。 3 2 实验仪器与试剂 y 一1 a 稳流稳压电泳仪( 江苏兴化分析仪器厂，4 5 0 8 0 0n i n ，5 0w ) ； 6 h _ 1 型横向电泳槽( 江苏兴化分析仪器厂) ，h a c h s e n s i o n 型精密p h 计 ( 上海精密科学仪器有限公司) ；电子天平( 上海精密科学仪器有限公 司) 。 琼脂糖( 生化试剂) ，e d t a ( 生化试剂) ，溴酚蓝( a m l e s c o 分装，武 汉市华顺生物技术有限公司) ，t r i s 一碱( a m r e s c o 分装，武汉市华顺生物 技术有限公司) ，冰乙酸( 国药集团试剂有限公司) ，n b t ( 氯化硝基四氮 唑兰) ：( t e t r a z o l i u mb l u ec h l o r i d e ，n a t ) ，f l u k a 进口分装，细菌学用试剂， 核黄素( 生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司) ，蛋氨酸( 生化试剂， 上海伯奥生物科技有限公司) ，n a c i ，k c i ，n a 2 m 0 4 ，k h 2 p 0 4 均为分 析纯( a r ) 国药集团试剂有限公司。 3 3 实验方法 3 3 1 电化学性质 采用循环伏安法研究配合物在除氧的情况下的电化学性质。用纯氮 气保护，溶剂为乙腈 5 4 - 5 5 1 ( 需重蒸) ，高氯酸四丁基胺( t b a p ) 作为支持 电解质，配制浓度为0 i m o l l ，样品浓度为5 1 0 4 m o l l 。高氯酸四丁基 铵( v a h p ) 在水中重结晶四次，然后在1 2 0 0 c 下真空干燥【5 6 1 后使用。 测量前先用少量的g a m m aa l u m i n ap o w d e ro 0 5m i c r o n 和二次水将玻 碳电极打磨1 5 m i n 后，将磨好的电极用二次水冲洗后，超声波洗1 5 m i n 。 以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极作对电极，a g a g c l 作为参比 电极，测前先用空白样作基线扫描一次，扫描速度为1 0 0 m v s 。 3 3 2 配合物一1 ”一2s o d 模拟 目前研究超氧化物歧化酶及其模拟物催化超氧阴离子自由基0 2 一歧 化反应动力学的方法大致分2 类。一类是直接测定0 2 一消耗速率的直接法， 如脉冲辐解法，停止流动法等，本实验采用的是n b t 一光照法旧。 ( 1 ) p h 值为7 4 的混合磷酸钾缓冲溶液的配制 称量k c l ，0 2g ，n a c i ，8g ，k h 2 p 0 4 ，0 2 7g ， n a 2 h p 0 4 ，1 4 2 g ，混合倒入1 l 容量瓶中，再向容量瓶中加约8 0 0 m l 去离子水，加h c l 将p h 值调节至7 4 ，然后加入去离子水定容至ll ，高温高压灭菌后， 室温保存。 ( 2 ) 核黄素、蛋氨酸及n b t 溶液的配制 用配制好的p h 值为7 4 的混合磷酸钾缓冲溶液作溶剂分别配制核黄 素( 8 5 0 x 1 0 。6m o l 1 ) 、蛋氨酸( o 0 5m o l 1 ) ，n b t ( i 1 6 5 x 1 0 3m o l 1 ) 溶液， 分别取l m l ，5 m l ，l m l 将各溶液混合后，通空气平衡1 0 分钟后，静置 片刻。在恒定强度的光下每隔3 0 s 测其在5 6 0 n m 处的最大吸收，每个样 品1 1 次。 第3 章配合物的性质研究 c u z n s o d 及其c u ( i i ) 模型化合物催化歧化0 2 的机理大多数认为， c u ( i i ) 先被0 2 。还原为c u ( i ) 然后再被0 2 。氧化为c u ( i i ) 。 两步反应式如下： c u ( i i ) + 0 2 。一c u ( i ) + 0 2 c u ( i ) + 0 2 。+ 2 h + _ c u ( i i ) + h 2 0 2 分别测定空白溶液和5 组加入配合物浓度吸光度随光照时间变化的 数据。 3 3 3 配合物旦，乏对d n a ( p b r 3 2 2 ) 的切割活性 当超螺旋型( c c c ) d n a ( f o r mi ) 的一条链上出现一个缺刻( n i c k ) ( f o r mi i ) 时，超螺旋结构解开形成开环型( o c ) 。两条链在同一位置均发生 断裂时则变为线性分子( f o r mi i i ) 。 1 溶液的配制 ( 1 ) t a e ( 5 0 ) 缓冲溶液：2 4 2gt r i s 溶于8 0 0m l 蒸馏水，向其中加入5 7 1 m l 冰醋酸，3 7 2ge d t a ，定容至l l ，p h = 8 0 ，通高纯氮气半小时，密 封后长期保存，用时稀释5 0 倍。 ( 2 ) 加样缓冲液( 6 x ) ：0 2 5 9 溴酚蓝，4 0 9 蔗糖，加水稀释至1 0 0 m l ， 4 c 密封保存，长期使用。 ( 3 ) 溴化乙锭( e b ) 染色液：5 0 0 m l 电泳缓冲液( 内含1 1 t g m l 。1 e b ) ( 4 ) 配合物溶液：由于配合物的水溶性不好，因此溶剂用d m f 。 2 实验步骤 ( 1 ) 将所有试剂、溶剂及耗材高温高压灭菌3 0m i n ，冷却待用。 ( 2 ) 制备凝胶：在5 0m l 锥形瓶中准确称取0 1g 琼脂糖，l om l t a e 缓冲液( 1 ) ，微波炉加热2 - 3 m i n 至沸腾，得无色透明液体，冷却至5 0 6 0 ，小心倒入带有梳子并事先调节为水平的凝胶槽中，冷却待用。 ( 3 ) 待凝胶凝固，小心取出梳子，将带有凝胶的样品架放置于电泳槽 中，加入t a e 缓冲液( 1 ) ，缓冲液量以漫过胶上表面1m m 为宜，令样品 孔自然充满缓冲液。 ( 4 ) 在每个e p 管中分别依次加入o 5p l d m f ，o 5 止配合物溶液和 o 5 止d n a 的水溶液，混匀后，小心加入点样孔中。 ( 5 ) 加样后，让样品自动沉入胶底，采用1 3 5 v 电压电泳，适时终止 电泳，约6 0 分钟。 ( 6 ) 小心取出凝胶，在溴化乙锭溶液中浸泡1 5m i n ，用水漂洗脱色后 在凝胶成像系统上分析电泳结果。 配合物溶液：配合物( 1 ) ，( 3 ) 用d m f 做溶剂配成如下浓度梯度： 2 m m o l l ，1 2 m m o l l ，0 8 m m o l l ，0 4 m m o l l ，0 2 m m o l l ，0 1m m o l l 的溶液。 3 3 4 磷酸酯水解 配合物催化底物对硝基苯酚磷酸酯水解反应如下： e + s + h 2 0 一 e - s 一 e - p 】_ e - i - p ( 1 ) e 代表配合物，s 代表底物对硝基苯酚磷酸酯，p 代表水解产物对硝 基苯酚。 以上反应式可简化为： e + s n p + 水解反应速率可表示为反应物浓度减少速率或产物增加浓度速率： 第3 章配合物的性质研究 d i s 】d n p 】 v = 。2 d t d t 根据比尔定律：a = e b c 其中1 9 = 1c m 水解产物对硝基苯酚的浓度变化可表示为： d n p = d a v ：d n p ：上竺 所以dt dt 反应速率是各种因素( 除配合物外主要有 【0 h 】) 贡献之和，可表示为： v = 一d a = ( k c + k o n - 1 o h 】+ ) s 】- ( 2 ) 上式中c 为配合物的浓度，k 为配合物的催化水解速率常数，k o h 为缓冲溶液的催化水解速率常数。 实验中测得水解产物对硝基苯酚的特征吸收波长( 4 0 0 n m 附近) ，收集 紫外可见光谱仪测定得到a t 的数据测定反应不同时间n p 的吸光度，分 别取反应开始前小段时间为研究对象，改变配合物浓度得到不同的斜率。 再以斜率值对配合物的浓度作图，由公式( 2 ) 就可求得催化水解反应速率 常数k 值1 6 7 - 6 8 1 。 实验温度为2 5 左右，缓冲溶液用三羟甲基胺基甲烷( t r i s ) j hh c i 配制成浓度为o 0 1m o l l ，k c i 维持溶液的离子强度i = 0 1 m o l l ，其浓度 为1 0 m m o i l 一，配合物及底物磷酸酯均用d m f 和水以体积比2 ：3 比例 混合，作溶剂配成总浓度分别为：配合物1 0 m o l l ，底物为1 0 。m o l l 的 溶液。 表3 9 不同p h 值时对硝基苯酚的摩尔消光系数 t a b l e 3 9 t h e o f p n i t r o p h e n o li nd i f f e r e n tp h 武汉t 程大学硕上学位论文 3 4 结果与讨论 3 4 1 电化学性质 0 2 0 4 0 6 0 81 o p o t e n u a l n f i g 3 1c y c l i cv o l t a m m o g r a m so fc o m p l e x1 c h 3 c ns o l u t i o n s ，s c a nr a t e10 0m v s ， c o n c e n t r a t i o n5x10 m 0 1 d m - 3 配合物l 的循环伏安曲线见图3 1 ，在o 2 1 2v 的扫描区间中有一 对氧化还原峰，e p a - 0 1 7 7 v ( n h e ) ，e 萨o 5 3 7 v ( n h e ) ，其半波电位e l 2 为0 3 5 7 v ( n h e ) ，a e = 3 6 m v 。 p o t e n t i i ，v f i g 3 2c y c l i cv o l t a m m o g r a m so fc o m p l e x2c h 3 c ns o l u t i o n s ，s c a nr a t e10 0m v s ， c o n c e n t r a t i o n5x10 4 m 0 1 d m 3 配合物互的循环伏安曲线见图3 1 ，在o 2 1 2v 的扫描区间中有一 2 2 第3 章配合物的性质研究 对氧化还原峰，e p a - o 2 5 7 v ( n h e ) ，e p c o 4 7 7 v ( n h e ) ，其半波电位e l 2 为0 3 6 7v ( n i - 砸) ，a e = 2 2m v 。 由图3 1 ，3 2 可见，配合物三，2 在实验条件下的氧化还原过程是一准可 逆双电子转化过程( c u ( i i ) c u ( i i ) c u ( i ) c u ( i ) ) 。 在生理p h 溶液中，0 2 岐化反应涉及两个电极反应： 0 2 + e o z ( 1 ) 0 2 + 2 h + + 2 e h 2 0 2 ( 2 ) 由于e ( 1 ) _ 0 1 6 v ( n h e ) ，e ( 2 ) _ o 8 9 v ( n h e ) ，要想有效地催化歧化超氧 阴离子自由基，模型配合物的氧化还原电位必须处于一0 1 6v o 8 9 v ( n h e ) 之间。 模型铜配合物的电极反应分别为： 配合物旦c u ( i i ) + e 乞一一c u ( i ) e = 0 3 5 7v ( n t m ) 配合物垄c u ( i i ) + e 乙一一c u ( i ) e = 0 3 6 7v ( n h e ) 其电位都在0 16v o 8 9v ( n h e ) 之间，理论上能有效地催化歧化超 氧阴离子自由基。 3 4 2 配合物一1 ，互的s o d 模拟 表3 2 配合物l 不同浓度不同光照时间的吸光度值 t a b l e 3 2 t h ev a l u eo f o b s o r b t i o no f c o m p l e x 三i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s a n d t i m e 浓度空白0 0 7 1 o 1 4 3 0 2 8 4o 5 6 8 0 7 1 4 时间( u m o l 1 ) ( u m o v d ( u m o l 1 ) ( u m o l q ) ( u m o l 1 ) ( u m o l 1 ) 0 5 l 1 5 0 1 3 9 0 2 5 3 0 3 5 8 0 1 2 6 0 2 1 8 0 3 2 2 o 1 0 6 o 1 9 5 0 2 5 8 0 0 9 8 0 1 4 3 0 1 9 6 0 0 8 3 o 1 2 4 0 1 6 2 0 0 6 7 o 1 0 2 o 1 3 8 2 q ：丝兰 q ：堡q 垒q ：i ! !q ：2 箜q ：三q i 业：z _ - _ - - - - l _ - - _ - _ _ l _ - _ l _ _ _ _ _ - - - l _ _ _ - - _ _ - _ - - - - l - _ _ l l - _ _ _ - - _ - _ _ _ _ l l 一 一 2 3 武汉工程人学硕+ 学位论文 a 5 6 0 n m 对时间t 作图，经拟合可得到一条直线，其斜率反应了甲簪产 生速度的快慢。加入配合物作为竞争物时，n b t 会与配合物形成竞争而 降低甲簪生成的速度，具体表现为斜率会降低。 023456 时间t ( m i n ) 图3 3 配合物卫不同浓度的下的吸光度与时间的变化( a - t ) f i g 3 3t h ep l o to fc o n c e n t r a t i o nv st i m e 由公式1( 1 - k 瓜) x 1 0 0 ，可求出配合物q 的抑制率t 1 。 以配合物的浓度c 为x 轴，抑制率t 1 为y 轴作图，可求得抑制率为 5 0 时配合物的浓度，即为活性单位i c 5 0 ，随着配合物浓度的增加，配合 型果娶 第3 章配合物的性质研究 物的抑制率增大。 表3 3 配合物上配合物的不同浓度下的抑制率 t a b l e 3 3r e s t r a i n i n gr a t eo f c o m p l e x l i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n c c u ( u m o l 1 ) k t 1 抑制率( ) o o 0 7 l 0 1 4 3 0 2 8 4 0 5 6 8 o 7 1 4 葶 粲 求 舡 啦 最 7 0 5 0 3 0 2 0 1 0 o o 1 7 l 0 1 6 2 0 1 2 2 o 1 1 0 0 0 8 5 o 5 3 2 8 7 3 5 7 5 0 3 0 0 6 7 6 0 8 配合物浓度( u m o l 1 ) 图3 4 配合物l 不同浓度下的抑制率 f i g 3 ，4r e s t r a i n i n gr a t eo fc o m p l e x 三i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n 2 5 武汉1 = 程人学硕七学位论文 表3 4 配合物互不同浓度不同光照时间的吸光度值 t a b l e 3 4 t h ev a l u eo fo b s o r b t i o no fc o m p l e x2i nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n dt i m e 浓度空白 0 0 7 10 1 4 3o 2 8 4o 5 6 80 7 1 4 时间 ( u m o l 1 ) ( u m o l 1 )( u m o l 1 )( u m o l 1 )( u m o l 1 ) ( u m o l 1 ) 0 0 4 0 0 9 8 o 1 6 8 0 2 3 5 0 2 8 7 0 3 5 4 0 4 0 3 0 4 5 1 0 5 0 3 0 5 5 6 0 6 1 1 0 1 1 3 0 0 3 5 0 0 7 5 0 1 1 9 0 1 6 5 0 2 0 5 0 2 4 5 0 2 9 8 0 3 3 5 0 3 8 1 0 4 2 6 0 4 6 3 0 0 8 7 0 0 2 8 0 0 6 5 0 0 9 7 0 1 3 7 0 1 7 4 0 2 0 8 0 2 4 4 o 2 8 1 o 3 1 5 0 3 5 2 0 3 9 4 0 0 7 3 0 0 2 7 0 0 5 3 o 0 8 1 o 1 1 2 o 1 3 8 0 1 6 l o 1 9 2 o 2 1 6 0 2 4 2 0 2 6 8 0 3 0 2 0 0 5 4 0 0 2 2 0 0 4 3 0 0 6 5 0 0 8 8 0 1 0 9 0 1 3 1 0 1 5 4 o 1 8 2 0 2 0 8 0 2 3 l 0 2 5 4 0 0 4 7 0 0 1 7 0 0 3 4 0 0 5 5 0 0 7 1 0 0 9 4 0 1 1 l 0 1 3 l 0 1 4 7 o 1 6 5 o 1 9 l 0 2 0 6 0 0 3 8 吣 。 2 ” 3 ” 4 帖 5 k 第3 章配合物的性质研究 o 7 o 6 o 5 o 4 d 0 3 o 2 o 1 o o o2 34 56 t ( m i n ) 图3 5 配合物互不同浓度不同光照时间的吸光度值 f i g 3 5t h ep l o to f c o n c e n t r a t i o nv st i m e 由公式1 1 = ( 1 - k 瓜) x 1 0 0 ，可求出配合物q 的抑制率t 1 。 表3 5 配合物互配合物的不同浓度下的抑制率 t a b l e 3 。5 r e s t r a i n i n gr a t eo f c o m p l e x2i nd i f f e r e n