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山东大学硕士学位论文 高产普鲁兰菌株的诱变筛选及发酵条件优化 研究生：相茂功 指导教师：郭学平研究员 王凤山教授 摘要 普鲁兰是出芽短梗霉产生的胞外多糖，它是一种易溶于水、安全无毒害、可 食用、低热值的天然多糖，因其可塑性、成膜性好、膜隔气性佳，故常用其作为 保色、保香、保鲜、抗氧化等的包装材料，在医药、食品、化妆品、农药等行业 具有广泛的用途。普鲁兰的生产在国内经过2 0 多年研究有了较大进展，但仍存在 较多问题，其中出芽短梗霉发酵过程中分泌黑色素及底物糖的转化率低成为制约 普鲁兰工业化生产的关键问题。目前国内外很多科研机构很难同时解决以上两个 问题，因此使得工业化进展缓慢。 本文通过诱变筛选得到高产普鲁兰及低色素水平出芽短梗霉菌株，通过摇瓶 及发酵罐进行了普鲁兰的发酵生产研究，确立了普鲁兰的发酵生产工艺，并研究 了普鲁兰胶囊的性质。 首先通过紫外诱变得到高产及低色素菌种，之后在摇瓶里使用响应面分析方 法优化普鲁兰的发酵培养基组成，特别是对普鲁兰产量有重要影响的因素：蔗糖、 氯化钠及硫酸铵的含量进行了研究，优化后培养基配方为：蔗糖1 0 5 ；酵母膏 0 2 ；n a c l0 0 9 8 ；m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 ；k 2 h p 0 40 6 3 ；( n h 4 ) 2 s 0 40 0 6 ， 初始p h 6 5 。 进行1 0 l 发酵罐发酵，装液量为6 5 l ，初始通气率为1 5 v v m ，初始搅拌速 度为2 0 0 r m i n ，发酵2 4 h 后根据溶氧情况对通气率和搅拌速度进行调节，使之维 持在3 0 以上，2 8 。c 发酵培养6 0 h 后普鲁兰产量为6 7 9 l 。 然后对普鲁兰的提取工艺进行研究，确定了使用板框过滤机对发酵液进行过 滤，使用2 倍体积的无水乙醇对多糖进行提取，使用不同孔径的超滤膜得到不同 分子量的浓缩糖液，得到一条较完整的下游提取路线。 同时研究了普鲁兰胶囊崩解时限及其阻氧方面的特性。研究发现普鲁兰为主 1 山东大学硕士学位论文 要原料的胶囊经过氧化加速实验后崩解时限仍能达到药典相关标准；通过测定维 生素c 的含量考察普鲁兰胶囊与普通明胶胶囊在防止药物氧化方面的作用，发 现经加速实验后普鲁兰胶囊中的维生素c 含量明显高于普通明胶胶囊。 关键词：普鲁兰；紫外诱变；发酵；下游提取；普鲁兰胶囊 2 山东大学硕士学位论文 s c r e e n i n go fh i g h - y i e l dp u l l u l a ns t r a i n sb yu vm u t a g e n e s i sa n d o p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s p o s t g r a d u a t e ：x i a n gm a o g o n g s u p e r v i s o r ： g u ox u e p i n g w a n gf e n g s h a n a b s t r a c t p u l l u l a n ，a ne x t r a c e l l u l a rw a t e r - s o l u b l em i c r o b i a lp o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e db y s t r a i n so fa u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ，i sal i n e a r d - g l u c a nm a d em a i n l yo fm a l t o t r i o s e r e p e a t i n gu n i t si n t e r c o n n e c t e dv i a - ( 1 ，6 ) 一l i n k a g e s i t i sak i n do fc h a r a c t e r i s t i c p o l y s a c c h a r i d e ，w h i c hw a sf n - s tf o u n db yr b a u e ri n19 3 8 p u l l u l a ni san o n i o n i ce x o p o l y s a c c h a r i d eo ff u n g a lo r i g i na n di sc u r r e n t l y e x p l o i t e di nt h ef o o di n d u s t r yd u et oi t sm a n yu n i q u ec h a r a c t e r i s t i c ss u c ha sg o o d f i l m - f o r m i n gp r o p e r t i e s ，o i lr e s i s t a n ta n di m p e r m e a b l et oo x y g e n d u et oi t sn o n t o x i c ， n o n i m m u n o g e n i c ，n o n m u t a g e n i ca n dn o n c a r c i n o g e n i cn a t u r et h e r ei sa na t t e m p tt o e x p l o r et h i sp o l y s a c c h a r i d ef o rv a r i o u sb i o m e d i c a la p p l i c a t i o n si n c l u d i n gt a r g e t e d d r u ga n dg e n ed e l i v e r ya n ds u r f a c em o d i f i c a t i o nr e c e n t l y u vm u t a g e n e s i sw a su s e dt oo b t a i nam u t a n ts t r a i no fa u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s w h i c hc o u l dp r o d u c eh i g hy i e l do fp u l l u l a na n dh a v el o ws e c r e t i o no fb l a c kp i g m e n t , t h e nt h ec o m p o s i t i o no fm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e db a s e d o nt h ey i e l do fp u l l u l a n ，a n daf e r m e n t a t i o nt e c h n i q u eo fp u l l u l a nw a sb u i l t a tl a s t ， t h ec h a r a c t e r i s t i co fp u l l u l a nc a p s u l e sw a ss t u d i e d am u t a n ts t r a i no fh i g hy i e l do fp u l l u l a na n dl o ws e c r e t i o no fp i g m e n tw a s o b t a i n e da n dt h em e t h o do fr s mw a su s e dt oo p t i m i z et h em e d i u mc o m p o s i t i o no f p u l l u l a nf e r m e n t a t i o ni nt h es h a k i n gf l a s k , t h ec o n t e n to fs u c r o s e ，n a c la n d ( n h 4 ) 2 8 0 4w h i c hh a di m p o r t a n te f f e c t so np u l l u l a np r o d u c t i o nw e r es t u d i e de s p e c i a l l y a f t e r 3 山东大学硕士学位论文 o p t i m i z a t i o n ，t h em e d i u mc o m p o s i t i o nw a sa sf o l l o w s ：10 5 s u c r o s e ，0 2 y e a s t e x t r a c t ，0 0 9 8 n a c l ，o 0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 ，o 6 3 k e h p 0 4 3 h 2 0 ，o 0 6 ( n i - 1 4 1 ) 2 s 0 4a n di n i t i a lp hv a l u e6 5 io lf e r m e n t o rw a su s e dt oo p t i m i z et h ec o n d i t i o no ff e r m e n t a t i o n ，t h es u i t a b l e c o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：t h ei n i t i a lp hw a s6 5a n dt e m p e r a t u r ew a sm a i n t a i n e da t 2 8 。c ；t h ei n i t i a la g i t a t i o ns p e e dw a s2 0 0 r m i na n dt h ea e r a t i o nr a t ei s1 5 v v m ，a f t e r a b o u t2 4 ht h ea g i t a t i o ns p e e da n da e r a t i o nr a t es h o u l db ea d j u s t e da c c o r d i n gt ot h e d i s s o l v e do x y g e nw h i c hs h o u l db ea b o v e3 0 a f t e r6 0 h sf e r m e n t a t i o n , t h ey i e l do f p l l u l u a nw a sa b o u t6 7 9 l t h e nt h ed o w n s t r e a mp r o c e s s i n gw a ss t u d i e d ，ae x t r a c t i o np r o c e d u r ew a sa s f o l l o w s ：p l a t ea n df r a m ef i l t e rw a su s e dt or e m o v eb a c t e r i af r o mt h ef e r m e n t a t i o n b r o t h ，a n dt h e ns e p a r a t ep u l l u l a ns o l u t i o n so fd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t sb yu l t r a f i l t r a t i o n ，a tl a s te t h a n o lw a su s e dt oe x t r a c tt h ep o l y s a c c h a r i d e t h ec h a r a c t e r i s t i co fd i s i n t e g r a t i o nt i m el i m i t e da n dt h ec a p a c i t yo fo x y g e n r e s i s t a n c eo fp u l l u l a nc a p s u l ew e r ea l s os t u d i e d a f t e rt e m p e r a t u r ea c c e l e r a t e dt e s t , t h ed i s i n t e g r a t i o nt i m el i m i t e do fp u l l u l a nc a p s u l ew a sa c c o r d 、析t hc h i n e s e p h a r m a c o p o e i a t h ec a p a c i t yo fp u l l u l a nc a p s u l eo fo x y g e nr e s i s t a n c ew a ss t u d i e db y c o m p a r i s o nt h ec o n t e n to fv i t a m i nc a f t e ra c c e l e r a t e dt e s t ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e c a p a c i t yo fo x y g e nr e s i s t a n c eo fp u l l u l a nc a p s u l ew a sb e t t e rt h a ng e l a t i nc a p s u l e k e yw o r d s ：p u l l u l a n ；u vm u t a g e n e s i s ；f e r m e n t a t i o n ；d o w n s t r e a me x t r a c t i o n t e c h n o l o g y ；p u l l u l a nc a p s u l e 4 山东大学硕士学位论文 英文符号 a d jr - s q u a r e d a d e qp r e c i s i o n c p c v d e d o h m i n o d p r e dr s q u a r e d p d a r s m r m i n r s q u a r e d s u v v c v 符号说明 中文 校正决定系数 信噪比 厘泊 变异系数 还原糖占糖浆干物质百分比 溶氧 小时 分钟 光密度 预测拟合度 土豆葡萄糖琼脂培养基 响应面法 转分钟 拟合度 秒 紫外线 维生素c 单位体积培养基在单位时间内通气量 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：脚日期：判 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 一i 棒聊躲私 山东大学硕士学位论文 第一章前言 普鲁兰糖亦称茁霉多糖、出芽短梗孢糖或普聚多糖。1 9 3 9 年r b a n e r 首先在 出芽短梗霉菌( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 的发酵液中发现一种黏性物质，即普鲁 兰糖【1 1 。19 5 9 年b e n d e r 等首先表征了出芽短梗霉发酵产生的普鲁兰是由中性葡萄 糖组成，他认为普鲁兰是由2 个反1 ，4 糖苷键连接a d 葡萄糖形成麦芽三糖，再经 仅1 ，6 糖苷键连接的直链型大分子，并定名为普鲁兰( p u l l u l a n ) 。相对分子质量 4 8 x 1 0 4 2 2 x 1 0 6 ，分子结构如下1 2 , 3 】。 图1 - 1 普鲁兰糖的分子结构 f i g 1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f p u l l u l a n 1 1 普鲁兰糖发酵生产研究概况 早在上世纪6 0 、7 0 年代人们对普鲁兰糖的发酵及菌种选育就有了系统的研 究，其中英国人在理论研究方面作了许多工作，以c a t l e y 等人为代表1 4 j ，他们在 菌种诱变、发酵以及普鲁兰合成的部分机理都进行了细致的研究。迄今为止，普 鲁兰的工业生产仍为菌种直接发酵，因此，许多人利用各种方法，试图得到高产 普鲁兰菌株。有学者采用溴乙烷处理菌种得到一系列菌株，发现酵母型的茁芽短 梗霉最有利于普鲁兰生产【5 1 。到了8 0 年代，前苏联科学家i m s h e n e t s k i i a a 等人， 对普鲁兰的菌种选育进行了仔细研究【6 】。其中i m s h e n e t s k i i 利用紫外照射和0 3 伙 水仙素处理野生菌种，使其染色体加倍，得到二倍体和四倍体的菌种，使用秋水 仙素处理，可以使普鲁兰产量增加7 0 0 - - 8 0 0 m g 1 0 0m l 。利用紫外处理得到的二 倍体菌种比原始单倍体菌种的普鲁兰产量高2 7 倍【_ 7 1 。此外，有些人采用其它的物 理或化学方法进行诱变，但效果都不很明显【8 9 】。 6 山东大学硕士学位论文 国内学者对出芽短梗霉诱变筛选做了大量研究，赵红【l o 】通过紫外诱变得到高 产变异株b 9 ，其多糖转化率达到5 2 ，色素较少；方宣钧【】也通过紫外照射得到 变异株z y 0 4 7 ，通过优化培养条件多糖转化率达到5 4 1 ，色素水平较低；李卫旗 【1 2 】通过6 0 c o 对不同形态的出芽短梗霉进行辐射诱变，得到变异株a 8 2 ，多糖转化 率达到6 1 4 ，但色素水平高，他发现对出芽短梗霉原生质体进行诱变比其他形 态的细胞更容易得到正突变株；王长海【1 3 】从变异菌株w 5 1 8 出发，通过对二价阳离 子的研究以及添加表面活性剂和碳酸钙，优化培养基后底物糖转化率达到6 1 5 ， 且基本没有色素；还有其他学者也采用诱变方法获得了变异菌株，但是兼具多糖 转化率高和色素水平低的菌株报道很少，而且对下游提取工艺研究也较少，导致 工业化进程缓慢。 早在上世纪7 0 年代中期，日本林原生化株式会社就进行了中试水平的生产， 进而形成较大的批量生产规模，至今仍然垄断国际市场。我国自上世纪8 0 年代初 期开始相关研究，多家研究单位报道筛选到色素分泌少，底物糖转化率高的优良 菌株。糖转化率约5 0 0 o - - - 6 0 ，产量达n s o 6 0 9 l 。由于出芽短梗霉具有复杂的 生活史，普鲁兰的生物合成也是一个极其复杂的、动态的，受多种因素影响的过 程，不同碳源、氮源以及其他因素，如发酵过程中初始p h 、发酵温度、发酵时 间等都直接影响普鲁兰的产量和色素分泌【1 4 1 。同时普鲁兰下游提取工艺也相当复 杂，如何除去菌体，降低提取普鲁兰中的蛋白含量，除去少量色素，减少酒精用 量，提高品质，降低成本等工业化技术都有较大难度，导致国内研究机构虽众多， 但是一直未能实现普鲁兰工业化生产【”】。 1 2 普鲁兰糖发酵条件的研究 普鲁兰的生物合成是一个极其复杂的、动态的，受多种因素影响的过程，不 同碳源、氮源以及其他因素，如发酵过程中初始p h 、发酵温度、发酵时间等。 都直接影响普鲁兰的产量和色素分泌。 碳源对普鲁兰发酵的影响 出芽短梗霉可利用蔗糖、葡萄糖等小分子糖，不同碳源有不同的转化效率，其中 蔗糖，以及d e 值为5 0 左右的淀粉水解液转化效率最高。k a z u h i s a o n o t l q 以5 蔗 糖为碳源，经过中试实验，转化率可达到7 0 ；林原公司加藤以1 0 淀粉水解液 7 山东大学硕士学位论文 为碳源，转化率也能达到7 0 【17 1 。同时f h a m o h a m m a 研究发现【1 引，不同浓度 的碳源有不同的发酵最适时间，其中5 碳源发酵9 6 h 最佳，而1 0 的碳源以发酵 1 4 4 h 为最佳发酵时间。 氮源对普鲁兰发酵的影响 氮源同样为影响发酵水平的重要因素，氮源过高，特别是n h 4 + 浓度过高激 活磷酸激酶和丙酮酸酶而促进了细胞过度生长，消耗了大量碳源而抑制了多糖合 成，同时b r a d l e ys c a m p b e l l 1 9 】发现如果以n h 4 + 为唯一氮源，必须氮消耗完，多 糖才开始分泌。m r e e s l e v t 2 0 ，2 1 】研究氮源与碳源比例时发现，当发酵培养基氮源 较少时，酵母状细胞：菌丝体= 4 0 ：6 0 ，多糖产量在比较高的一个水平，当发酵培 养基为碳源限制时，菌丝体占细胞总量的8 5 9 0 ，并且没有多糖产出。 培养基p h 对普鲁兰发酵的影响 培养基p h 值的变化也会影响普鲁兰的产量，同时对菌株的形态和生成普鲁 兰的分子大小都有作用，特别是初始p h 值的大小更是很大程度上影响普鲁兰的 产量【2 2 1 。与其它微生物不同的是，p h 值还影响短梗霉的菌体形态。短梗霉类酵 母在液体培养条件下可向环境分泌酸性物，使p h 下降。但培养液初始p h 原本就 很低时，产酸能力似乎受到抑制，培养终点p h 变化不明显；反之，若初始p h 较高， 则培养终点时p h 下降明显。c a t l e y t 8 ，9 ，2 3 】首先提出在高p h 时，培养基中的葡萄糖 用来合成菌体，在合成晚期，p h 较低的情况下才开始多糖的合成。钱新雷【3 0 】的 研究指出，当起始p h 值小于5 5 时生物量大，起始p h 值升高，多糖产量增加，起 始p h 值6 5 时多糖产量最高，但p h 值升高，黑色素也增加，一般研究都得出最 佳起始p h 值是6 0 。在发酵过程中，发酵液的p h 在4 8 h 1 为降低速度很快，然后保 持稳定，p h 值的快速下降抑制杂菌的生长，所以短梗霉多糖发酵在发酵4 8 h 后很 少有杂菌污染的危险。p h 值下降速度越快，多糖产量越低，在低p h 值( f 值( p 值) 的大小表明模型及各个考 察因素的显著水平。p r o b f 值小于0 0 5 表明模型或各因素有显著影响，p r o b f 值 小于0 0 1 表示影响高度显著。 分析结果如图3 8 、表3 3 所示。 3 2 山东大学硕士学位论文 表3 - 2p 1a c k e t t - b u n l l a n 实验设计及响应值 t a b l e 3 - 2e x p e r i m e n td e s i g na n dr e s p o n s e v a l u e so f p1a c k e t t b u m l 粕 y a c t u a l yp r e d i c t e d p - - 0 010 8r s a = 0 9 3 图3 - 8 模型拟合曲线及参数 f i g 3 _ 8f i t t i n gc u r v ea n dp a r a m e t e ro ft h em o d e l 3 3 山东大学硕士学位论文 由上图可知，该模型所模拟曲线的拟合系数为o 9 3 ，且该模型的p 值为0 0 1 0 8 o 0 5 ，表明模型显著，所以该模型对于本实验的分析是可靠的。 表3 3p l a c k e t t - b u r m a n 实验各因素的影响 t a b l e 3 - 3t h ei m p a c to fe x p e r i m e n t a lf a c t o r so f p1a c k e t t - b u r m a n 由表3 3 可见，x 2 、x 4 、x 5 这三个因素具有显著正效应，其中x 2 和x 4 具有 高度显著正效应，因此可以选择x 2 、x 4 、x 5 即蔗糖、硫酸铵及氯化钠作为下一 步研究对象。 3 3 2 2b o x b e h n k e n 试验 通过p l a c k e t t b u r m a n 试验，我们得到了三个对普鲁兰发酵影响显著的因素。 为了得到这三个因素对普鲁兰发酵的确切影响情况及其最佳配比，我们使用 b o x b e h n k e n 试验方法对这三个因素进行了考查。 表3 - 4b o x b e h n k e n 试验水平及编码 t a b l e 3 - 4e x p e r i m e n t a ll e v e l sa n dc o d i n go f b o x b e h n k e n 3 4 使用d e s i g n e x p e r t7 0 软件进行试验设计，共需要做1 7 组试验，每组平行三次。 山东大学硕士学位论文 具体试验方案如下： 表3 5b o x b e h n k e n 试验设计及响应值 t a b l e 3 - 5e x p e r i m e n td e s i g na n dr e s p o n s ev a l u e so fb o x - b e h n k e n 根据上述试验方案，接种量为2 ，培养温度2 8 ，转速2 0 0 r m i n ，摇床培养 9 6 h 。计算各组产量，得到响应值。 以普鲁兰产量为响应值，首先通过d e s i g n e x p e r t7 0 软件对表3 5 进行回归拟 合，得到回归方程： 产量= + 6 2 6 1 + 3 6 3 x a 一3 1 8 x b + 0 4 9 x c + 0 8 1 x a x b 0 2 1 x a x c 一1 1 3 x b x c 7 5 2 x - 4 5 6 x b 2 0 16 x c 2 一 3 5 山东大学硕士学位论文 表3 6b o x b e h n k e n 试验方差分析 t a b l e 3 - 6v a r i a n c ea n a l y s i so fb o x - - b e h n k e n 表3 7 模型的可信度分析 t a b l e 3 - 7t h ec r e d i b i l i t yo f t h em o d e l m e a r l r - s q u a r e d a 由r s q u a r e d p r e dr - s q u a r e d a d e qp r e c i s i o n c v 5 7 4 4 0 9 8 2 1 0 9 5 9 0 0 8 2 7 2 2 2 0 6 1 1 9 4 由表3 6 可知，大于f 值的概率 0 0 0 0 1 ，说明模型具有较高的可信度，同时 在本模型中，除了c 及c 2 外其他各项对普鲁兰的产量均有显著的影响。( 可信度大 于9 0 ) 。 同时由表3 7 可知：拟合度( r - s q u a r e d ) 为0 9 8 2 1 ，说明预测值与实测值之间具 3 6 m 车大学颅士学位论文 有高度的相关性，校正决定系数( n a jr - s q u a r e d ) 为0 9 5 9 0 ，说明该横型能解释 9 5 9 0 响应值的变化。预测拟合度( p f e d r - s q u a r e d ) 为08 2 7 2 ，说明他与校正决 定系数保持合理的一致性。而本模型的信噪比( a d e qp r e c i s i o n ) 为2 2 0 6 1 ，一般来 说模型的信噪比大于4 就可以说明这个模型是比较好的，从而进一步说明该模 型合理可靠。 通过失拟( 1 a c ko f f i 0 检验，l a c k o f f i t f - v a l u e 为16 9 ，p 值为03 0 5 5 ，说明该模 型不存在显著失拟。 因此我们可以确定，本模型是可靠的，我们可以使用这个模型进行数据分析。 利用d e z i g n - e x p e r t7 0 软件对模型进行响应面分析，得到响应面立体分析图， 见图3 - 9 、图3 1 0 、图3 1 1 。 图3 9 蔗糖与硫酸铵的相互作用 f i g3 - 9 t h e i n t e r a c t i o n o f s u e r o s ea n d f n h 4 ) 2 s 0 4 m 东大学硬士学位论文 由图3 9 可见，该图存在一个峰顶，即说明硫酸铵与蔗糖吉量在特定值时普 鲁兰的产量存在最大值。 图3 1 0 氯化钠与硫酸铵的相互作用 f i g 3 1 0 t h e i n t e r a e l i o n o f n a c l a n d ( n i h h s o , 由图3 - 1 0 可见，硫酸铵对普鲁兰产量有较明显的影响，但是氯化钠含量的变 化对普鲁兰产量的影响不是很大。 山东大学碗学位论文 图3 1 1 蔗糖与氯化钠的相互作用 f i g3 - 1 1 t h e i n t e r a c t i o no f s u c r o s ea n d n a c i 由图3 1 i 可见，蔗糖浓度对普鲁兰产量也有明显的影响，同时氯化钠对产量 的影响也不很明显。 通过d e s i 留a - e x p e r t7 0 软件进行分析，发现蔗糖水平在02 8 ，硫酸铵水平在 04 8 ，氯化钠水平在02 8 时，普鲁兰产量最高，预测可达到6 37 2 3 3 9 l 。即蔗糖 浓度为1 0 56 9 ：l ，硫酸铵浓度为06 0 4 9 l ，氯化钠浓度为09 8 4 9 l 时普鲁兰产量最 大。以此条件配制发酵培养基，以5 0 0 m l 三角瓶装8 m n l 培养基，接种量为2 ， 培养温度2 8 3 2 ，转速为2 0 0 r m i n ，摇床培养9 6 h ，普鲁兰产量平均值为6 4 2 5 9 l 。 山东大学硕士学位论文 3 3 3 普鲁兰发酵条件的研究 3 3 3 1 接种量对普鲁兰发酵的影响 对于普鲁兰发酵而言，接种量过低易导致生长缓慢从而影响多糖的合成和分 泌，同时若接种量过高则易使菌体在开始阶段生长过度，导致菌体利用大部分能 量用于生长，同样会影响多糖的产生。 5 0 4 5 曲 面 4 0 钆 3 5 3 0 246 81 0 接种量( 呦 图3 1 2 接种量对普鲁兰发酵产率的影响 f i g 3 12t h ee f f e c to fi n o c u l u mc o n c e n t r a t i o no np u l l u l a ny i e l d 由上图可见，接种量在2 8 时对产量影响不大，但是到1 0 时就会导致产 量有明显的降低。因此普鲁兰发酵时接种量不宜过高，应控制在8 以内。 3 3 3 2 固定通气量对普鲁兰发酵的影响 使用优化后发酵培养基进行进行i o l 发酵罐发酵，装液量为6 5 l ，接种量 为2 ，培养条件通气率为1 5 v v m ，搅拌速度为2 0 0 r m i n ，温度为2 8 ( 2 ，培养 9 6 h 。发酵过程中的各种参数变化及溶氧情况如下图： 4 0 山东大学硕士学位论文 熏 j 璺 z a 7 o 6 5 6 o 5 5 5 o 4 5 4 0 皇 3 5 呈 3 0 篓2 5 螳 楹4 m 2 0 1 5 1 o 0 5 0 o 1 0 0 8 0 6 0 o 081 62 43 24 0钙5 66 47 28 08 89 6 发酵时间( h ) 图3 1 3 固定通气量发酵曲线 7 0 6 0 5 0 4 0 摹 蹲3 0 缝 2 0 1 0 o f i g 3 - 1 3t h ef e r m e n t a t i o nc u r v eo f f i x e dv e n t i l a t i o nr a t e 061 21 82 4 3 04 24 8 , 5 46 0 6 6 7 2 7 8 8 4 9 0 发酵时间( h ) 图3 1 4 发酵过程溶氧情况 f i g 3 14 d i s s o l v e do x y g e ni nf e r m e n t a t i o np r o c e s s 4 1 毫 姆 鼷 - - r * 卿 钆 耀 蚺 山东大学硕士学位论文 通过上图可见，普鲁兰残糖含量在发酵结束时仍然较高，说明结束时仍有部 分蔗糖未被菌体利用或参与合成普鲁兰；另外最终p h 值为4 5 左右，与摇瓶相 比略高，这也可能与溶氧有关。 在本次发酵试验中，普鲁兰产量最终为5 2 l ，较摇瓶产量低，这应该是由 于供氧不足引起的，因此在下一步试验中应该调节通气量及转速，使整个发酵过 程保持充足的氧气供给。 3 3 3 3 调节通气量对发酵的影响 通过控制通气量和搅拌速度调节发酵过程的溶氧情况，使溶氧保持在3 0 以上，发酵曲线如下图： 061 21 82 43 03 64 24 85 4 6 06 67 2 发酵时间( h ) 图3 1 5 调节溶氧后发酵曲线 f i g 3 - 15f e r m e n t a t i o nc u r v eo fd y n a m i c c o n t r o lo fd i s s o l v e do x y g e n 在发酵过程中通过控制转速与通气量来调节溶氧后，p h 值有了明显的变化， 在发酵到1 2 h 以后就明显下降，较不调节溶氧时的下降时间提前，并且降幅增大， 4 2 迥| c i o 5 o 5 o 5 0 5 0 5 0 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 阳 柏 约 竹 。 一鸯絮鼷黑删址糖输 山东大学硕士学位论文 当到2 0 h 左右p h 值基本稳定的3 7 左右，最终p h 为3 6 5 ，比不调节溶氧要低； 在发酵到7 2 h 时，残糖为1 4 2 9 l ，考虑到特别是发酵过程后期，出芽短梗霉在 合成普鲁兰的同时也会分解利用普鲁兰，因此在此时停止发酵，测得普鲁兰产量 为6 5 2 9 l ，底物糖转化率为6 5 2 。相对于目前文献报道的发酵时间为9 6 - - 1 4 4 h 而言，大大提高了发酵效率。由此可见，在普鲁兰发酵过程中保持充足的溶氧是 至关重要的。 后期经过多次重复试验，继续对细节进行改进，发酵6 0 h 时普鲁兰产量可达 到6 7 l ，在国内处于领先水平。 3 4 本章小结 1 通过单因素试验，对出芽短梗霉的发酵有了初步了解，对培养基组成及摇瓶 发酵装液量进行了研究，考查了碳源，氮源，p h ，二价阳离子等影响因素，基 本确定发酵培养基的组成。 2 通过p l a c k e t t b u r m a n 试验对培养基组成进行了深入的研究，发现其主要影响 因素为蔗糖，氯化钠和硫酸铵 3 通过b o x b e h n k e n 试验研究得到了这三个主要因素的最佳配比，预测最高产 量为6 3 7 9 l ，并通过摇瓶发酵验证了这一预测。 4 通过发酵罐发酵得到了普鲁兰发酵过程中的参数变化规律，通过控制通气量 及转速，调节发酵液中的溶氧，使产量进一步提高，同时大大缩短了发酵时间， 提高了普鲁兰发酵产率。 4 3 山东大学硕士学位论文 4 1 试验材料 4 1 1 试验仪器 第四章普鲁兰下游提取工艺的研究 直联便携式无油空气压缩机 筒式压滤器 澄清板 超滤系统 电热恒温水浴锅 p h 计 加热磁力搅拌器 干燥箱 电子天平 紫外可见分光光度计 d a w ne o s 十八角激光光散射仪 d s p 示差折光检测器 4 1 2 试验试剂 淄博宏润工贸有限公司 山东三清不锈钢设备有限公司 山东长清新兴过滤板厂 m i l l i p o r e 公司 北京市永光明医疗仪器厂 北京赛多利斯仪器系统有限公司 江苏省金坛市大地自动化仪器厂 北京科伟永兴仪器有限公司 上海恒平科学仪器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 美国w y a t tt e c h n o l o g y 技术公司 美mw y a t t t e c h n o l o g y 技术公司 胃蛋白酶、无水乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、异戊醇、碳酸钠、氢氧化钠、 硫酸铜、酒石酸钾、f o l i n 一酚试剂 以上试剂均购自国药集团化学试剂有限公司 珍珠岩粉、活性炭为山东福瑞达生物化工提供 4 2 试验方法 4 2 1 发酵液过滤除菌 将澄清板固定在筒式过滤器上，取一定量的珍珠岩粉，加适量水，将其预涂 到澄清板，助滤剂预涂结束后，在发酵液中加入适量珍珠岩粉，摇匀后缓慢倒入 4 4 山东大学硕士学位论文 筒式过滤器中，密封好过滤器并加一定的气压，使发酵液从过滤器底部留出，得 到的即为除菌后糖液。 4 2 2 多糖提取 将糖液加入2 倍体积的有机溶剂中，搅拌，将沉淀及溶液置于布氏漏斗上， 抽干后得到的沉淀即为普鲁兰。 4 2 3 多糖蛋白含量测定 取一定量o 5 9 的普鲁兰溶于水中，用1 0 0 m e 容量瓶定容，稀释到适当浓度， 用l o w r y 法测蛋白含量【6 踟。 ( 1 ) 2 碳酸钠0 1 m o l l 氢氧化钠溶液的配制 1 0 9 碳酸钠，2 9 氢氧化钠，加水至5 0 0 m l ( 2 ) 0 0 4 m o l l 硫酸铜溶液的配制 1 9 硫酸铜，加水至1 0 0 m l ( 3 ) 2 酒石酸钾溶液的配制 2 9 酒石酸钾，加水至1 0 0 m l ( 4 ) 碱性铜液的配制 临用前取试剂( 3 1 ) 5 0 m l ，试剂( 3 2 ) 和( 3 3 ) 各0 5 m l 混匀配制而成。 ( 5 ) f o l i n 酚试剂溶液的配制 f o l i n 酚试剂与纯化水按1 ：l 配制成f o l i n 酚试剂溶液 ( 6 ) 标准蛋白配制 准确称量配制l m g m l 标准人血清白蛋白贮备液。精确量取标准蛋白贮备液 5 m l 于5 0 m l 容量瓶中，加水至刻度，为标准蛋白使用液( 1 0 0 l ag m l ) 。 l o w r y 法标准曲线的建立 精确量取标准蛋白质使用液0 、0 2 、0 4 、0 6 、0 8 、1 0 m l 分别置于6 个试 管中，每个试管加蒸馏水补至l m l ，混匀。精确量取一定体积( 体积l m l ) 样 品( 含蛋白质5 0ug 左右) 于试管中，加5 m o l l 碱性铜液，混匀，于室温放置1 0 m i n ， 快速加入0 5 m lf o l i n 酚试剂溶液，混匀，于室温放置3 0 m i n ，在6 5 0 n m 波长读 出吸光值，减去样品的空白即为样品的o d 6 5 0 值，分别读出它们的o d 6 5 0 值。 4 s 山东大学硕士学位论文 得到标准曲线如下 g c o n 口 0 1 2 0 1 o 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 or 2 04 06 0 8 01 0 01 2 标准蛋白浓度 图4 - il o w r y 法测蛋白标准曲线 f i g 4 - 1s t a n d a r dc u r v ef o rl o w r y sm e t h o d f o rd e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n 4 2 4 胃蛋白酶酶解 0 调节糖液p h 至3 0 左右，置于8 0 。c 水浴锅中保温3 0 m i n ，冷却至3 7 。c ，加 入适量胃蛋白酶，3 7 恒温水浴锅中保温1 h 。 4 2 5 超滤浓缩分子量分级 超滤膜使用前先用蒸馏水充分冲洗，然后用0 1 m o l ln a o h 冲洗，再用蒸馏 水洗至p h 中性，整个处理过程不回流。运行参数：回流压力5 l o p s i ，进口压力 2 0 3 0 p s i 。 超滤时首先使用较大孔径滤膜( 1 0 k d ) 进行超滤，当糖液体积浓缩至原体积 1 5 左右时停止超滤，对滤出液进行多糖提取，得到分子量较小的多糖；将浓缩 液加水稀释至原体积，使用较d , ；f l 径的滤膜( 1 0 0 k d ) 进行浓缩，体积浓缩至原体 积1 5 左右时停止超滤，对滤出液进行多糖提取，得到分子量居中的多糖，然后 对浓缩液进行多糖提取则得到分子量较高的多糖。若使用多个滤膜进行超滤则可 4 6 山东大学硕士学位论文 以得到分子量范围更小的多糖。 4 3 结果与讨论 4 3 1 过滤除菌试验 助滤剂的用量为影响除菌效率及多糖损失的重要因素。我们选择用珍珠岩粉 作为助滤剂，首先考查了珍珠岩粉使用量对发酵液过滤时间及多糖得率的影响。 其中过滤体积为2 0 0 m l 发酵液，结果如下图： 7 0 6 0 5 0 g 4 0 g 暑：3 0 血 2 0 1 0 1 0 8 6 删 4删 ：i 1 1 啦 奄| 皿 2 0 z j， 7 jl dl z 珍珠岩用量( 曲 图4 1 珍珠岩粉用量对过滤除菌的影响 f i g 4 - 1t h ee f f e c to fa m o u n to fp e r l i t ep o w d e ro nf i l t e rr e m o v i n gb a c t e r i a 从图中可见，珍珠岩粉用量过少则使得过滤缓慢，随着用量的增加过滤时间 逐步减少，7 5 9 以后过滤时间较快且变化不大；同时珍珠岩粉用量也影响多糖过 滤时的得率，由图中可见，珍珠岩粉用