（生物化学与分子生物学专业论文）贾第虫srna的鉴定、结构与功能研究.pdf

贾第虫s r n a 的鉴定、结构与功能研究 a m p a p b i s b p d n a c d n a r d n a d e p c d m s o d n t p d t t e d t a p g i p t g k b m o l m i n t o r f p c r r n a r r n a t r n a r n u s e r n p s i i o r n p s s d s t e m e d t m g 1 t i s x - g a l 肛i 缩略词 a m p i c i l l i n a m m o n i u mp e r s u l f a t e n n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e b a s ep a i r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c o m p l e m e n t a r yd n a r i b o s o m a ld n a d i e t h v lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i t h i o t h r e i t o l e t h v l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d m i c r o g r a m i s o p r o p y l t h i o - 1 3 - - d - g a l a c t o s i d e k i l ob a s e s m o l a r m i l i l i t e r n u c l e o t i d e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p s e u d o u r i d i n e r i b o n u c l e i ca c i d r i b o s o m a ir n a t r a n s f e rr n a r i b o n u c l e a s e r i b o n u c l e o p r o t e i np a r t i c l e s s m a l ln u c l e o l a rr n p s e v d b e r gu n i t s o d i u md o d e c y ls u l f a t e n ，n ，n ，n 一t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i m e t h y lg u a n o s i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n e 5 b r o m o 一4 一c h l o r o 3 一 i n d o l y l b d - g a l a c t o s e m i e r o l k e r 氨苄青霉素 过硫酸铵 n ，n 亚甲叉双丙烯酰胺 碱基对 脱氧核糖核酸 互补d n a 核糖体d n a 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 微克 异丙基硫代b d 半乳糖 苷 干碱基 摩尔 毫升 核苷酸 丌放读码框 聚合酶链式反应 假尿嘧啶 核糖核酸 核糖体r n a 转运r n a 核糖核酸酶 核糖核蛋白体颗粒 核仁小分子r n a 核蛋白 体颗粒 s e v d b e r g 单位 十二烷基硫酸钠 n n ，n ，n 一四甲基乙二胺 三甲基鸟嘌呤 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 溴4 氯3 吲哚 一p d - 半乳糖苷 微升 杨承勇中山大学博士学位论文 摘要 真核生物中拥有大量的非信使小r n a ( s m a l ln o n - m e s s e n g e rr n a ， s n m r n a ) ，它们在基因表达调控中发挥着多种作用。其中核仁小分子r n a ( s n o r n a ) 是细胞中s n m r n a 的重要组成部分，根据其结构特征主要包括两类： b o x c ds n o r n a 和b o x h a c as n o r n a 。自二十世纪9 0 年代以来，在不同的真 核生物以及古细菌中发现大量的s n o r n a ，对它们的结构、功能、基因组织和基 因表达的研究难不断深入。近来，在一些原始真核生物，包括薄肌眼虫( e g r a c i l i s ) 和锥虫( zb r u c e i ) 中鉴定了大量s n o r n a ，并发现这些原始真核生物 中s n o r n a 具有一些特点，如以基因簇为主的基因组织，b o xc ds n o r n a 中双 功能的分予较多，另外b o x h a c as n o r n a 全部是单环结构。由于单环也是古细 菌b o x h a c as r n a 的结构特点，因此认为单环代表了原始b o x h a c a r n a 的 分子结构。然而，目前关于原始真核生物s n o p a n a 的研究还只限于少数几种生物， 并不能得到足够的信息以全面认识早期真核生物中的s n o r n a 。贾第虫( g i a r d i a l a m b l i a ) 是一种原始的真核生物，系统学研究表明它的分化位于真核生物进化树 的最底部。但是和其它真核生物不同的是，它没有核仁，并具有一些原核生物的 特征。在某些方面，贾第虫被认为是原核生物和真核生物之间的一个过渡，因此 是研究真核细胞形成的理想模式生物。最近，一种在真核生物中和b o xc d s n o r n a 结合并在r r n a 前体加工中起重要作用的蛋白一一核仁纤维蛋白 ( f i b r i l l a r i n ) ，在贾第虫中被发现，它和3 种贾第虫小分子r n a 的相互作用得到 研究。比较其它真核生物中s n o r n a 的数量，推测贾第虫中尚有许多s n o r n a 有 待发现和鉴定。对贾第虫中小分子r n a ( s r n a ) 的系统鉴定，将会提供大量有 关原始真核生物s n o r n a 同源分子的信息，有利于了解s n o r n a 基因从原核生物 到真核生物的进化过程。 本论文采用锚定引物法构建特异性的贾第虫c d n a 文库。初步测序的结果 表明，文库中目标序列得到很好的富集，大大提高了发现新的小分子r n a 的效 率。由于部分克隆重复出现，需要采用有效的方法进行文库筛选。在菌落p c r 初筛的基础上，改进以前的筛选方法，用p c r 法标记产生探针，然后直接与p c r 产物点阵膜杂交。经过优化筛选条件，该方法准确率达到9 0 ，可以在短时间 内对文库进行大量筛选。 经过大规模的文库筛选和测序分析，在贾第虫中共获得1 6 种具有b o xc d s n o r n a 特征的小分子r n a ，称之为b o xc ds r n a 。此外，在文库中还发现一 具有b o x h a c as n o r n a 结构特征的e d n a 序列，推测其属于b o x h a c as r n a 。 n o r t h e r n 杂交的结果证明它们都是贾第虫细胞中稳定存在的分子。 对1 6 种b o xc ds r n a 的功能分析表明，1 1 种b o xc ds r n a s r n a 具有 和r r n a 互补的序列，预测具有指导贾第虫r r n a 特定位点修饰的功能：其余5 种缺乏与r r n a 配对的反义序列，可能具有其它的功能。序列及功能同源性比较 分析表明，上述s r n a 有7 种在酵母、植物或脊椎动物中具有同源分子，其指导 的甲基化位点在相应的真核生物中保守。其中g i s r l 指导的1 6 sc m l 3 2 5 以及 g l s r 4 指导的2 3 sr r n a g i n 2 0 4 0 ，属于从原核生物大肠杆菌、古细菌到真核生物 中均保守的3 个r r n a 甲基化位点中的两个。 g l s r l 6 和g l s r l 7 均含有一段1 ln t 的序列，分别和贾第虫2 3 sr r n a 的 贾第虫s r n a 的鉴定、结构与功能研究 一段序列相同。而在这两段序列的后面，都有一类似b o xd 的结构元素。推测 这两种s r n a 的功能可能和r r n a 有关。此外，g l s r 2 有一段和贾第虫t r n a l e u 互补的片断，但是紧靠该互补片断的下游没有发现比较典型的b o xd d 结构，推 测可能是指导t r n a 甲基化修饰的s r n a 在进化过程中的“遗迹”。 g l s r 2 0 是贾第虫中发现的第一个b o xh a c as n o r n a 的类似分子。结构 分析表明，其二级结构出两个发夹组成，发央问以铰链相连，在其3 术端还有一 段很短的单链尾区，此外还拥有典型的a c ab o x 和不太典型的hb o x 。根据 b o x h a c as n o r n a 的结构与功能关系，推测g l s r 2 0 同时具有指导贾第虫2 3 s r r n a 上u 2 2 4 8 位和2 3 sr r n a 上u 2 3 6 5 位假尿嘧啶化修饰的功能。同源分析表 明，其在其它真核生物中的同源位点及相应的s n o r n a 都已经鉴定。 利用不同浓度d n t p 进行逆转录的方法，对贾第虫1 6 sr r n a 上的甲基化 位点进行了实验鉴定。1 6 sr r n a 中s r n a 预测的3 个甲基化位点，只有g l s r t 指导的c m l 3 2 5 被证实。而g l s r 3 预测指导的位点g m l l 7 8 ，经实验证实不存在， 说明该s r n a 可能有其它功能。此外还在1 6 sr r n a 上鉴定了6 个甲基化位点， 包括g m 7 3 9 ，g m9 4 2 ，u m l 0 0 9 ，g m l 0 1 l ，g m l l 8 3 和c m l 3 4 7 。经过比较，其中 只有u m l 0 0 9 和g m l 0 1 1 在其它真核生物中保守，而其它四个是贾第虫特有的甲 基化位点。 贾第虫s r n a 基因分布在基因组的两条链上，目前均只发现一个拷贝，所 处的位置都是基因间隔区，而且大多是单独编码的独立基因。s r n a 基因与上下 游蛋白质编码基因的间隔大多小于1 2 0 n t ，与上游基因的间隔一般要大于与下游 基因的间隔。 对贾第虫s r n a 的表达机制进行初步分析发现，贾第虫s r n a 基因的上游 没有t a t ab o x ，但是都存在1 3 个a t 富含序列。上述特点类似贾第虫蛋白质 基因的启动子特征，因此推测贾第虫s r n a 基因由上游a t 富含序列组成启动子， 并由r n a 聚合酶i i 负责转录。 本论文是国际上首次通过构建e d n a 文库对贾第虫s r n a 进行系统研究， 为原始真核生物中s n o r n a 的深入研究提供了丰富的材料，纠正了先前关于原始 真核生物s n o r n a 的一些片面认识：对b o xc ds n o r n a 的结构和功能分析表明， 双功能b o x c ds n o r n a 不是原始真核生物具有的普遍现象；对b o x h a c as r n a 的结构分析证明，早期的真核生物已经存在b o x h a c as r n a 的双环结构。通过 比较各种生物中s n o r n a 的结构、功能和基因组织特点，推测s n o r n a 可能具有 不同的进化方向。 关键词：s n o r n a ，s n m r n a ，s r n a ，r n a 修饰，贾第虫 6 杨承勇中山大学博士学位论文 a b s t r a c t e u k a r y o t e sc o n t a i na nu n e x p e c t e d l yl a r g en u m b e ro f s m a l ln o n - m e s s e n g e rr n a s ( s m n r n a s ) w h i c ha r et h o u g h tt op l a yi m p o r t a n tr o l e sa tv a r i o u ss t e p si nt h ec o n t r o l o fg e n ee x p r e s s i o n as u b s t a n t i a lp r o p o r t i o no fs n m r n a si d e m i f i e ds of a ra r es m a l l n u c l e o l a rr n a s ( s n o r n a s ) m o s to fw h i c hf a l li n t ot w of a m i l i e s ，b o xc da n db o x h a c as n o r n a sw h i c hc a l lb ed i s t i n g u i s h e do nt h eb a s i so fc o m m o ns e q u e n c e m o t i f sa n ds t r u c t u r a lf e a t u r e s s i n c el9 9 0 s 1 0 t so fs n o r n a sh a v eb e e ni d e n t i f i e d f r o mv a r i o u se u k a r y o t i co r g a n i s m sa n ds o l h ea r c h a e a io r g a n i s m s ，a n dt h e ks t r u c t u r e s ， f u n c t i o n s ，g e n eo r g a n i z a t i o na n dt r a n s c r i p t i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d m o r er e c e n t l y ， t h ei d e n t i f i c a t i o no fs n o r n a so rs n o r n ah o m o l o g u e sf r o ms o m ep r i m i t i v e e u k a r y o t e s ，i n c l u d i n ge u g l e n ag r a c i l i sa n dt r y p a n o s o m ab r u c e i , h a v eo u t l i n e dt h e c h a r a c t e r i s t i c so fs n o r n a si nt h e s ee a r l yd i v e r g e n te u k a r y o t e s s u c ha st h e p o l y c i s t r o n i cc l u s t e ro r g a n i z a t i o l l - d o u b l e f u n c t i o no fb o xc ds n o r n a sa n dt h e s i n g l eh a i r r i i ns t r u c t u r eo f b o xh a c as n o r n a s s i n c et h el a t e rf e a t u r ej sc o m n l o nt o a r c h a e at o o i ti sp r o p o s e dt h a tt h es i n g l eh a i r p i nr e p r e s e n t st h ep r i m o r d i a lh a c a s t r u c t u r e h o w e v e r p r e s e n ts t u d yo ns n o r n a si np r i m i t i v ee u k a r y o t e si sl i m i t e di n s e v e r a lo r g a n i s m sa n dc o u l dn o tg e te n o u g hi n f o r m a t i o nf o raf u l lu n d e r s t a n d i n go f t h es n o r n a si nt h ee a r l ys t a g eo fe u k a r y o t e s f u r t h e rs t u d ys h o u l di n c l u d em o r e p r i m i t i v ee u k a r y o t e st h a tw o n l dp r o v i d em o r ed e e pi n s i g h t st ot h ee v o l u t i o no f s n o r n a s p h y l o g e n e t i ca n a l y s e sh a v ec o n s i s t e n t l yp l a c e dt h ed i v e r g e n c eo fg i a r d i a l a m b l i a ( gl a m b l i a l ，o n e , o ft h ep r i m i t i v ee u k a r y o t e s ，n e a rt h er o o to ft h ee u k a r y o t i c b r a n c ho fe v o l u t i o n h o w e v e r , gl a m b l i ah a sn on u c l e o l u sa n de x h i b i t ss o m e p r o k a r y o t i ef e a t u r e s w h i c hi sr a t h e rd i f i e r e n t 矗o mo t h e re u k a r y o t e s i ns o m er e s p c o t s t h i s o r g a n i s mm i g h tb er e g a r d e d a sam i s s i n gl i n kb e t w e e ne u k a r y o t e sa n d p r o k a r y o t e s ， a n di t i sa no p p o r t u n em o d e lf o ru n d e r s t a n d i n gt h eg e n e t i ci n n o v a t i o n s t h a t l e dt ot h ef o r m a t i o no fe u k a r y o t i cc e l l s r e c e n t l y , f i b r i l l a r i n ，ap r o t e i nw h i c h r e m a i n sa s s o c i a t e dw i t hb o xc ds n o r n a si ne u k a r y o t e sa n dp l a y sa 1 1 i m p o r t a n tr o l e i np r e - r r n ap r o c e s s i n g m o d i f i c a t i n na n dr i b o s o m ea s s e m b l y w a sf o u n di ng l a m b l i aa n di t si n t e r a c t i o nw i t ht h r e egf a m b l i as m a l li 州a s ( s r n a s ) w a s i n v e s t i g a t e d c o m p a r e dw i t ht h e s i t u a t i o ni no t h e re u k a r y o t e s i ti sr e a s o n a b l et o d e d u c et h a tt h e r es h o u l db em o r es m a l lr n a se x i s t e di ng 1 a m b l i a t h es y s t e m a t i c i d e n t i f i c a t i o no ft h es r n a si ng 1 a m b t i ah a v ep r o v i d e dv a l u a b l ei n f o r m a t i o na b o u t t h ec h a r a c t e r i s t i c so fs m a l lg u i d er n a si no n eo ft h em o s tp r i m i t i v ee u k a r y o t e sa n d w o n l dc o n t r i b u t et ot h eu n d e r s t a n d i n go ft h ee v o l u t i o no fs m a l ln o n m e s s e n g e rr n a g e n e sf r o mp r o c a r y o t e st oe u k a r y o t e s i nt h i sp a p e r , as p e c i a l i z e dg t a m b l i ac d n al i b r a r yw a sc o n s t r u e t e du s i n g a r c h o r i n gp r i m e r s t h er e s u l to ft h ef i r s ts e q u e n c es h o w e dt h et a r g e ts e q u e n c e sw e r e e n r i c h e da n dt h ee m c i e n c yo fs e a r c h i n gf o rn e ws r n a sw a si n c r e a s e d a ne f f e c t i v e s c r e e nm e t h o dw a sn e e d e dt oe x c l u d et h er e p e a t e dc l o n e s a t i e rt h ef i r s tr o u n ds c r e e n 7 贾第虫s r n a 的鉴定、结构与功能研究 b yc l o n e p c r ，af o r m e rs c r e e nm e t h o dw a si n p r o v e da n da p p l i e ds u b s e q u e n t l y t h e p r i m e r sw e r ep r o d u c e da n dl a b e l e db yp c r a n dh y b r i d i z e dw i t hp c r - p r o d u c td o t s m e m b r a n e s a f t e ro p t i m i z e d t h en e wm e t h o dh a sa na c c u r a c yo f9 0 a n dc a nb e a p p l i e dt os c r e e nt h ec d n al i b r a r ye 街c i e n t l y a f t e rs c r e e n i n ga n ds e q u e n c i n go ft h ec d n al i b r a r y , at o t a lo f16b o xc d s i a sw h i c hs h o w e dt h et y p i c a lf e a t u r e so fb o xc ds a n r n a sw e r ei d e n t i f i e d f u r t h e r m o r e o n eb o xh a c as i t n aw h i c hs h o w e dt h et y p i c a lf e a t u r e so fh a c a s n o r n a sw a si d e n t i f i e dt o o t h er e s u l t so f n o r t h e mb l o t sc o n f i r m e dt h e i re x i s t e n c ei n gl a m b l i a a m o n gt h e16b o xc ds r n a si d e n t i f i e df r o mt h ec d n al i b r a r y , l lh a v e a n t i s e n s ee l e m e n t st or r n a sa n dw e r ep r e d i c t e dt o g u i d et h es i t e s p e c i f i c 2 一o r i b o s o m em e t h y r l a t i o no fr r n a s t h er e m a i n i n gf i v es r n a sw e r ed e v o i do f r r n aa n t i s e n s ee l e m e n t sa n ds h o u l dh a v eo t h e rf u n c t i o n s e v e no ft h e16s r n a s h a v eh o m o l o g si ny e a s t ，p l a n ta n dv e r t e b r a t e ，a n dt h ec o r r e s p o n d i n gm e t h y l a t i o ns i t e s a r ec o n s e r v e d s p e c i a l l y , 1 6 sc m l 3 2 5 ( g u i d e db yg l s r l 、a n d2 3 sr r n ag m 2 0 4 0 ( g u i d e db yg l s r 4 ) a r et w oo f t b et h r e er r n am e t h y l a t i o ns i t e sc o n s e r v e df i - o m 最c o b ， a r c h a e aa n de u k a r y o t e s g l s r l 6a n dg l s r l 7a r ef o u n dt op o s s e s sa n1ln ts t r i n g c o r r e s p o n d i n gt oap a r t o fgl a m b l i a2 3 sr r n as e q u e n c e r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e b o t ho ft h et w o1 1n t s t r i n g sa r el o c a t e dj u s tu p s t r e a mab o xd - l i k em o t i f , w h i c hm a yi m p l ys o m ec l u e so f t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e s et w os r n a sa n dr r n a a na n t i s e n s ee l e m e n tt o t r n a l e uw a sf o u n di ng l s r 2 w h i c hh a dn ob o xd d m o t i fl o c a t e dd o w n s t r e a m i t s e e m e dt h ea n t i s e n s ee l e m e n tw a sar e l i co f t h ea n c i e n ts r n ag u i d i n gt h em e t h y l a t i o n o f t r n a g l s r 2 0w a st h ef i r s th o m o l o go f b o x h a c as n o r n ai d e n t i f i e di ngl a m b l i a i t c a nb ep o t e n t i a l l yf o l d e di n t oat y p i c a lb o xh a c as n o r n a l i k es t r u c t u r ew h i c h c o n s i s t so ft w oh a i r d i n sl i n k e db yah i n g ea n das h o r tt a i l i th a sat y p i c a la c ab o x a n dan o n t y p i c a lhb o x i ti sp r e d a t e dt og u i d et h ep s e u d o u r i d y l a t i o no fu 2 2 4 8a n d u 2 3 6 5i n2 3 sr r n a w h i c ha r ec o n s e r v e d a m o n go t h e re n k a r y o t e s a n d t h e c o r r e s p o n d i n gg u i d i n gs n o r n a sw e r ei d e n t i f i e d ap r e v i o u s l yd e s c r i b e dm e t h o d ，c o n c e r n t r a t i o n d e p e n d e n tr e v e r s et r a n s c r i p t i o n w a su s e dt om a pt h em e t h y l a t i o ns i t e so ngl a m b l i a1 6 sr r n a o n l yo n ef 1 6 s c m l 3 2 5 ，t a r g e to f g i s r l ) o f t h et h r e ep r e d i c t e dm e t h y l a t i o ns i t e si n1 6 sr r n aw a s p o s i t i v e l yc o n f i r m e di no u re x p e r i m e n t s i ti sn o t e w o r t h yt h a tt h em e t h y l a t i o ns i t e ( 1 6 sg m l l 7 8 ，p r e d i c t e db yg i s r 3 ) ，w h i c hi sn o tc o n s e r v e di no t h e ro r g a n i s m s ，w a s a n a l y z e da n dr e s u l t e di nan e g a t i v es i g n a li nt h er e v e r s et r a n s c r i p t i o na s s a y t h i s c o u l dr e f l e c tad i s t i n c tf u n e t i o no ft h ec o g n a t es r n a t h ep r i m e re x t e n s i o na n a l y s e s a l s or e v e a l e ds i xm o r em e t h y l a t i o ns i t e si ngl a m b l i a16 sr r n a i n c l u d i n gg r n 7 3 9 g m9 4 2 ，u m l 0 0 9 ，g m l 0 1 l ，g m l l 8 3a n dc m l 3 4 7 c o m p a r e dw i t ht h em e t h y l a t i o n s i t e so fo t h e re u k a r y o t e s ，o n l yt w os i t e s ( u m l 0 0 9 ，g m l 0 1 1 1a r ec o n s e r v e di n e v o l u t i o n ，a n dt h er e s tf o u rm i g h tb es p e c i f i ci ngl a m b l i a t h egl a m b l i as r n ag e n e sl o e a t e do nt w os t r a n d so f t h eg e n o m ew i t ho n l yo n e c o p yf o u n d a n a l y s e ss h o w e dt h a ta l lo ft h es r n ag e n e s1 0 e a t ei nt h es m a l i 8 杨承勇中山大学博士学位论文 i n t e r - 0 r f si nt h egl a m b l i ag e n o m ea n ds e e mt ob ee n c o d e db yi n d e p e n d e n tg e n e t h ed i s t a n c eb e t w e e ns r n ag e n e sa n dt h en e a r b yp r o t e i n c o d i n gg e n e si sl e s s e n1 2 0 mi nm o s to ft h ec a s e s 1 1 玲d i s t a n c eb e t w e e ns r n ag e n ea n dt h eu p p e rg e n ei s a l w a y sf a rt h a nt h a tb e t w e e ns r n aa n dt h ed o w n s t r e a mg e n e n o 弋通kb o xb u to n et ot h r e e a r i c he l e m e n t sw e r ef o u n di nt h eu p s t r e a m s e q u e n c e so ft h egl a m b l i as r n ag e n e s w h i c ha r es i m i l a rt ot h ep r o m o t e r so f p r o t e i n - c o d i n gg e n e sa n a l y z e di ngl a r n b l i as of a r s oi ti si n f e r e dt h a tm o s ts r n a so f gl a m b l i am i g h tb ei n d e p e n d e n t l yt r a n s c r i b e db yr n a p o l y m e r a s ei i t h i sw a st h ef i r s ts y s t e n u a t i cr e s e a r c ho ngl a m b l i as r n a sb yc o n s t r u c t i n ga n e d n al i b r a r y t h er e s u l t sp r o v i d e dv a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o rt h el u t h e rs t u d yo n s n o r n a si np r i m i t i v ee u k a r y o t e sa n dc o r r e c t e ds o m em i s u n d e r s t a n d i n g s ，a n a l y s i so r l b o xc ds r n a ss h o w e dt h a td o u b l e g u i d i n gi sn o tp r e v a l e n ti np r i m i t i v ee u k a r y o t e s a n da n a l y s i so nb o x h a c as r n ac o n f i r m e dt h ee x i s t e n c eo f d o u b l e h a i r p i ns t r u c t u r e i np r i m i t i v ee u k a r y o t e s ，c o m p a r i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r u c t u r e ，f u n c t i o na n d g e n o m eo r g a n i z a t i o no f d i f i e r e n to r g a n i s m s ，i ti si n f e m dt h a ts n o i 州am i g h te v o l v ei n d i 虢r e n tl i n e a g e s k e y w o r d s ：s n o r n a ，s n m r n a ，s r n a ，r n am o d i f i c a t i o n ，gl a m b l i a 9 贾第虫s r n a 的鉴定、结构与功能研究 第一章综述 前言 二卜世纪五十年代，d n a 双螺旋结构模型和中心法则的发现，揭丌了现代 分子生物学的新篇章。d n a 是遗传信息的储存者，遗传信息主要是从d n a ，通 过r n a 的传递，以蛋白质的形式表现出其生理功能的。长期以来我们都认为r n a 在生命活动中仅以三种类型发挥作用：r r n a 、t r n a 和m r n a 。但是近二十年 来，特别是随着多种生物基因工程( 如酿酒酵母、果蝇和人类) 的完成，科学家 们越来越认识到，除了编码上述三种r n a 外，绝大部分( 特别是高等生物) 基 因组的产物并不属于上述三种r n a 。不同的文献对它们的名称不一样，在古细 菌中称为s m a l lr n a ( s r n a ) ，在真核生物中称为n o n - c o d i n gr n a ( n c r n a ) 、 s m a l li l o f l m e s s e n g e rr n a ( s n m r n a ) 、n o n m e s s e n g e rr n a ( n m r n a ) 或o t h e r r n a ( o r n a ) 等i l ，2 3 】。我们认为s m a l ln o n m e s s e n g e rr n a ( s r t m r n a ) 更能准 确反映该类r n a 的特点，故本文统一采用s n m r n a 作为其统称。 人类和小鼠9 9 的蛋白编码基因相同，而人类个体基因组之间的序列差 异约3 ，0 0 0 ，0 0 0 个，其中仅约1 0 ，0 0 0 ( 0 ，3 ) 差异发生在蛋白编码序列中1 4 1 ( 而 且大多数差异在第三个碱基，属隐形变异) 。上述证据表明，个体或物种之间的 表型差异也许很大程度上要归因于s n m r n a 的不同，以及由其导致的基因表达 的差异。目前的研究表明，s n m r n a 在生命活动中具有许多非常重要的功能，它 们不仅在染色体扩增、转录调控、r n a 的加工与修饰等方面起重要作用，而且 在调控m r n a 的稳定性与翻译水平、蛋白质的降解和细胞定位等过程中有重要 意义1 5 j 。如最近在线虫、果蝇、哺乳动物、植物中发现了大量的m i c r o r n a ( m i r n a ) ， 能与m r n a 形成相互配对的双链结构，从而起到抑止翻译产物成熟或诱导 m r n a 的降解的作用【6 1 ；另外在植物中发现调控花叶发育的m i r n a ，在果蝇中 发现m i r n a 与细胞增殖、细胞凋亡以及脂肪代谢的调控有关【7 ，引。s i r n a 是近 来发现的一类与m i r n a 大小相近的小分子r n a ，具有诱导同源m r n a 降解、 使基因表达沉默的功能，即所谓r n a 干涉( r n a i ) 9 1 。目前的观点认为，r n a i 现象是生物界普遍存在的种基因组的免疫系统，对于细胞防御病毒的感