（生物化学与分子生物学专业论文）萘降解菌株的分离、降解基因检测和萘污染土壤的生物修复.pdf

南开大学硕士学位论文 中英文摘要 中文摘要 萘是一种在环境中广泛存在的芳香烃污染物，是煤焦油及其产品中的一种主 要成分。由于它可以较容易地被土壤中的微生物降解，所以成为研究生物降解的 一种模型化合物。 本研究从纪庄子污水处理厂的活性污泥、大港油田和天津香料厂混合废水中 分离出4 8 株萘降解细菌，对它们进行了抗菌素抗性和质粒检测，并从中筛选出 一株萘高效降解菌n d 2 4 ，对其进行了利用碳源和氮源的种类，生长和降解特性， 及最适生长条件的研究。通过n d 2 4 菌株的1 6 sr r n a 基因的p c r 扩增、克隆和核 苷酸序列测定，将它的核苷酸序列与g e u b a n k 其它菌株的1 6 sr r n a 基因做了同 源性比较，结果表明它属于假单胞菌( y s e u d o m o n a ss p ) 。 利用本实验室以前分离的萘高效降解菌株n d 6 ，用p c r 方法扩增得到的萘降 解基因n a h y , n a h a c 、n a b 6 ，n a h u , n a h h , n a h f , n a bp ，等，以及儿茶酚邻位降解 途径的c a t a 基因和龙胆酸途径的n a g 基因，与此4 8 个株菌的总d n a 杂交，分 析它们的萘降解基因的种类和萘降解途径的区别。结果显示，趋化基因n a h y 和 降解基因n a h h , n a b 认n a b v 只存在于大港油田和天津香料厂混合废水中筛得的 菌株中，其它基因在两种来源的菌株中都存在。龙胆酸途径基因n a 9 1 在两种来 源的菌株中均不存在。杂交结果显示降解基因的种类与细菌的生存环境有定关 系。 用n d 2 4 菌株处理萘污染土壤，对其进行生物修复，结果显示试验组与对照 组相比降解速度有显著提高。 关键词：萘，生物降解，假单胞菌，分子杂交，土壤修复 南开大学硕士学位论文 中英文摘要 a b s t r a c t n a p h t h a l e n ei st h ea r o m a t i cc o m p o u n dt h a te x i s ta b r o a di ne n v i r o n m e n t ，i t sa m a i nc o m p o n e n ti nc o a lt a r s i n c ei tc a l lb ec a t a b o l i z eb yb a c t e r i ai ns o i le a 惑b ，i t b e c o m eam o d e lc o m p o u n dt os t u d yb i o d e g r a t i o n 4 8n a p h t h a l e n e - d e g r a d i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mi n d u s t r i a lw a s t e w a t e r o n e h i g h e f f i c i e n c yd e g r a d i n gs t r a i n ，n d 2 4 ，w a ss e l e c t e d ，a n dt h ea n a l y s i sf o ri t s a n t i b i o t i cr e s i s t a n c es p e c t r u m ，c a r b o ns o n r c e ，n i t r o g e ns o l a c e ，p l a s m i d s ，a n da b i l i t i e s o fg r o w t ha n dn a p h t h a l e n ed e g r a d a t i o i lw e r ec a r r i e do u t b yd n as e q u e n c i n ga n dh o m o l o g o u sa n a l y s i so f1 6 sr r n ag e n e so fs t r a i n n d 2 4 t h i ss t r a i nh a sb e e ni d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a s s p u s i n gt h ep r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt on a h y , n a h a c 。n a h g ，n a hu ，n a h h ，n a h f , n a h kc a t ag e n e sf r o mp s e u d o m o n a ss p ，a n dt h et o t a ld n ao fs t r a i nn d 2 4a s t e m p l a t e s ，t h e s eg e n e sw e r ea m p l i f i e d t h e s eg e n e sw e r eu s e da sp r o b e st o h y b r i d i z ew i t l lt h et o t a ld n ao ft h e4 8i s o l a t e s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tn a h h , n a h 阢n a b v a n dn a h y o n l ye x i s ti nt h es t a i n si s o l a t e df r o mi n d u s t r yw a s t e w a t e r , o t h e r g e n e se x i s ti na l ls t r a i n s t h e r eh a sar e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec a t a b o l i cg e n e sa n d e n v i r o n m e n t sw h e r et h es t a i n sl i v e di n t h es t r a i nn d 2 4w a si n o c u l a t e di n t o n a p h t h a l e n e p o l l u t e d s o i l sf o r b i o r e m e d i a t i o n ，n l er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec a t a b o l i cr a t eo ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u p w a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a to f t h ec o n t r 0 1 k e y w o r d s ：n a p h t h a l e n e ，b i o d e g r a d a t i o n ，p s e u d o m o n a ss p ，m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n , b i o r e m e d i a t i o no fs o i l s l l y8 0 5 0 2 8 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：辛书乏 如。歹年厂月，日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含 任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 鸯椒 加。f 年f 月，日 南开大学硕士学位论文 前言 第一章前言 1 - 1 芳香烃污染及危害 芳香烃及其衍生物是一大类严重危害人类健康的环境污染物，多环芳烃 ( p a h s ) 是指2 个或2 个以上的苯环稠合在一起的一类化合物，它们在环境中普 遍存在 1 p l 。随着苯环数量增加，其脂溶性越强，水溶性越低，在环境中存在时 间越长，遗传毒性越高，其致癌性随着苯环数的增加而增强口】。 有机物在不完全燃烧或高温处理条件下( 7 0 0 ) 可产生p a h s 。在自然界 中，有些藻类、微生物和植物能通过生物合成产生p a h s ，但数量不多。p a i l s 的自然来源有火山爆发，森林植被和灌木丛燃烧以及细菌对动物、植物的生化作 用等，但这不是环境中的主要来源。人类活动特别是化石燃料的燃烧是环境中 p a h s 的主要来源1 4 j 。 芳香烃通过废水摊放和使用过程进入到河流和土壤中。p a h s 由于水溶性差， 常被吸附于土壤颗粒上。因此，该类化合物易于从水中分配到生物体内、沉积层 中，土壤就成为p a h s 的主要载体，p a h s 污染土壤的生物修复，因此倍受关注。 p a h s 在土壤中有较高的稳定性，其生物降解及自然挥发损失是极少的，所以p a h s 在环境中是不断积累的。研究表明，在河水、海水沉积物中，p a t - i s 的浓度高且 积累速度快归l 。 作为环境污染物的p a h s 之所以受到人们的关注，是因为有些p a h s 具有强烈 的毒性。p a l l s 的毒性表现在3 个方面：其一，强致癌性、致突变性及致畸性【6 8 i 。 人类及动物癌症病变有7 0 9 0 是环境中化学物质引起的，而p a h s 则是环境中 致癌化学物质中最大的一类。其二，对微生物生长有强抑制作用pj 。p a l l s 因水溶 性差及其稳定的环状结构而不易被生物利用，它们对细胞有破坏作用，抑制普通 微生物的生长。其三，p a l l s 经紫外光照射后毒性更大( p a h s 的光致毒效应) l l o 。 据报道，p a h s 吸收紫外光能后，被激发成单线态及三线态分子，被激发分子的 能量可通过不同途径损失，其中一部分被激发的p a h s 分子将能量传给氧，从而 产生出反应能力极强的单线态氧，它能损坏生物膜1 。 每年有数百万吨石油产品和原油从炼油厂和石化厂的废弃物中排放到世界 范围的海洋环境中。由于多环芳烃的潜在毒性、致癌性及致畸诱变作用，所以对 人类健康和生态环境具有很大的潜在危害，并引起各国环境科学家的极大重视。 美国环保局在8 0 年代初把1 6 种未带分支的多环芳烃确定为环境中的优先污染 物，我国也把多环芳烃列入环境污染的黑名单中。 在2 0 0 1 年的中国环境状况公报公布的数据中，石油类污染是长江、黄 河、松花江、海河及浙闽片水系的主要污染之一。 南开大学硕士学位论文 正是由于上述原因，所以对它们的生物降解机理进行研究显得尤为重要。萘 是一种在环境中大量存在的芳香族化合物，是煤焦油及其产品中的一种主要成 分。作为有机合成中的一种主要化学药品，萘在石化工厂被的大量生产。根据美 国环保局的估计，在3 5 个工业类别的污水样品中，萘污染的检出率高达1 0 。 同时，由于它可以较容易地被土壤中的微生物降解，所以成为研究生物降解的一 种模型化合物【1 “。 1 2 芳香化合物的生物降解途径 研究发现，自然界存在大量能够降解芳香烃的微生物【1 3 】。革兰氏阴性细菌假 单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 是降解微生物的主要成员，它们通过降解芳香烃得到细 胞生长和繁殖所需要的碳源和能量。在革兰氏阳性细菌中也存在芳香烃降解菌， 如某些r h o d o c c u s 菌株，但其降解的生物化学和遗传学性质有所不同h 1 。近几十 年来，随着分子生物学的发展和应用，对芳香烃微生物降解的生化途径、基因组 织、进化关系和遗传工程的研究已取得重要进展1 1 5 1 6 。研究比较深入的有甲苯， 萘和联苯等。 两种甲苯降解途径已进行了遗传学分析：r o d 途径和五y 途径。在r o d 途径 中，甲苯分子被连续的双羟基化和双氧化，最后生成3 一甲基儿茶酚。苯的降解 也可利用这条途径生成儿茶酚( 邻苯二酚) d t 。在x y l 途径中，甲苯被连续氧化 生成儿茶酚。这个途径的底物非常广泛，包括甲苯和甲苯的烷基取代物1 1 8 1 。联苯 和萘都有两个芳香环，开始两步与r o d 途径是相同的，分别生成二羟基联苯和二 羟基萘，再由外切双加氧酶催化生成单环产物，进一步转化成儿茶酚i 旧1 。在这四 个途径中，从芳香烃到儿茶酚的降解步骤是不同的，儿茶酚以后的降解步骤是相 同的，也就是说，儿茶酚是是这些降解途径的共同中间物。 t 9 9 4 年，w i l l i a m s 和s a y e r s 在总结了这些以及其他一些降解途径的基础上， 为芳香烃化合物的降解提出了个普遍的规律：那就是芳香烃的好氧代谢途径大 致可以分为三个阶段【2 0 】。第一阶段，芳香烃在单加氧酶或双加氧酶的作用下，分 子上引进取代基羟基，产生双羟基化合物，通常是儿茶酚或其衍生物。儿茶酚几 乎是所有芳香族化合物好氧代谢的中间产物。第二阶段，儿茶酚在双加氧酶的作 用下，环上的一个碳一碳键在氧分子的攻击下断开，生成不饱和脂肪酸。作用于 环裂解的双加氧酶分为两类，一类是作用于两个羟基一侧的碳键，造成间位 ( m o t e ) 裂解的外插入式( e x t r a d i 0 1 ) 双加氧酶，即儿茶酚2 ，3 一双加氧酶，反 应产物为2 一羟基粘康酸半醛，该酶的辅助因子是f e ”。另一类酶是作用于两个羟 基之间的碳键，造成邻位( o r t h o ) 裂解的内插入式( i n t r a d i 0 1 ) 双加氧酶，即 儿茶酚1 ，2 一双加氧酶，反应产物是顺丁烯二酸，该酶的辅助因子是f e ”。第三阶 段，儿茶酚环裂解产物在酶的作用下进一步氧化生成小分子化合物，如乙酰辅酶 南开大学硕士学位论文 a 等，进入三羧酸代谢循环( 图1 一i ) 。 i ，。譬一一一。，一1 譬c n ，v s m ，i 。熹。at z 。z o l ： 。 2 “ 靠“一2 ，+ 。： 。1 脚“2 矽v “ 甜 瓢一一一 | 旺黜l ：3 + 0 2 d z o m e h s e r 黑。一一一一一。a 帆c n 州。 - 。r “ip a t ：h v a y + 丁一3 图1 一l 芳香烃化合物生物降解的三个阶段 1 3 萘生物降解途径 萘的生物降解途径可以分为两大类，一类是水杨酸降解途径，另一类是龙胆 酸降解途径。水杨酸降解途径又可以分为儿茶酚问位切割途径和儿茶酚邻位切割 途径( 国1 2 ) 。目前所研究的萘降解菌大多数是革兰氏阴性细菌，以假单胞菌为 主【l ”。在革兰氏阳性细菌中也存在萘降解菌，如 z h o d o c c u ss p ，但其萘降解的 生物化学和遗传学性质有所不同”。近几十年来，微生物降解萘的研究一直得到 广泛关注，特别是随着分子生物学的发展和应用，对萘微生物降解的生化途径、 基因组织、进化关系和遗传工程的研究已取得重要进展。 南开大学硕士学位论文 ! ：笠显占：篮武： 鳓 掺o h 8lo h 国“ 醪： 暾o m f 。c 0 2 “ 睡复：蔷竺。 f l ” 蓼： $ 工a 韭l 丑i 巨c y i ! l 立a t 型e 一 一 ：。 = ；：。耄江三。 嘴：y “”“尊篇溉v” 乏薄： e 嚣审叫 7l ij。h 黟：卜警”庐y ”。2 “ ( 葛- 1 l o c 、o ：h 。 f ”u m ? a f a “l l 。f 茜一c s 。一。1 二搿 cl l 一丫p。丫嚣一 c 1 - 1 3 c 0 2 h 、一c 0 2 h ij ”、? ”掣。“ j c e h 4 r t i 图卜2 萘的生物降解途径 1 3 1 水杨酸途径 8 0 年代初，y e n 和g u n s a l u s 【2 i 利用t n 5 转座子随机插入萘质粒n a h 7 ，引起 极性突变造成基因失活的方法，确定了n a h 7 上存在两个与萘降解有关的操纵子 和一个调控基因( 圈l 一3 ) 。萘降解的生物过程是由系列酶催化的，可分为上游 途径( 由n a h 操纵子控制) 和下游途径( 由阳操纵子控制) 。上游途径的酶使 萘氧化成水杨酸( 邻羟基苯甲酸) ，此过程由n a h a a a b a c a d b f e e d 9 个基因编码的 酶催化。下游途径的酶使水杨酸经问位裂解氧化成小分子化合物丙酮酸和乙醛， 或经邻位裂解氧化为琥珀酰c o a 和乙酰c o a 。大部分萘降解菌株采用间位裂解途 径，陔途径由n a h g h n l o m k j 等9 个基因编码的酶所催化。编码这些酶的基因在 菌体内的分布，不同的菌株会有所不同。其中研究较为深入的3 个菌株是：恶臭 假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) g 7 和n c i b9 8 1 6 菌株，以及施氏假单胞菌 s t u t z e r i ) a n i o 菌株拉”“。前两个菌株的萘降解途径由质粒编码，a n i o 菌株由 染色体编码。这些菌株的萘降解基因组成3 个操纵子，上游操纵子( n a h 操纵子) 4 南开大学硕士学位论文 n q 云 编码的酶使萘氧化成水杨酸，下游操纵子( s a l 操纵子) 编码的酶把水杨酸进一 步降解成三羧酸循环的中心代谢产物。调节基因拧是第三个操纵子，它编码的蛋 白对力a 操纵子和舳操纵子的表达进行正调控。 1 3 2 龙胆酸途径 最近，英国威尔士大学的w i l l i a m s 等人矧在r 3 1 s t o n f a u 2 菌株中发现了萘 的另外一条降解途径，即萘被降解成水杨酸以后接着被氧化为龙胆酸( 2 ，5 - 二羟 苯甲酸) ，而不是儿茶酚，然后降解为小分子化合物。与n a u 7 不同的是，u 2 菌 株的n a g y 趋化性基因及n a g g 调控基因均在降解基因的上游。其上游途径降解基 因n a g a a a b a c a d b f c o e d 催化萘氧化为龙胆酸。与n a h 7 相比，上游途径基因多了 与n a h 7 水杨酸羟化酶基因同源的水杨酸5 一羟化酶基因n a g o h o 下游途径基因 n a g t i k l a i n 则与上游途径基因组成一个共转录的操纵子。上下游基因并不与调控 基因册蝴共转录。 a ，一- _ h 、 图卜3 荼降解质粒n a h 7 的物理和遗传图谱图 i n l j 8 0 0 0 r p m 离心2 0 3 0 s e c 。 倒掉液体，加入5 0 0ul 溶液c 于离心柱中8 0 0 0 r p m 离心2 0 3 0 s e c ，弃液体。 重复上述步骤。 1 2 0 0 0 r p m 再次离心i m i n ，甩干剩余液体以除去残余酒精。 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5 41 0 m i n ，使乙醇挥发。 加入2 0 3 0 p 1 溶液d ( 5 0 。c 水浴) ，静置2 m i n 。 1 5 0 0 0 r p m 离心l m i n ，管底溶液即为所需d n a 。 对溶液进行真空抽滤，使其浓缩至连接反应所需d n a 浓度。 ( 5 ) p e r 产物与载体的连接： 连接体系： p m d l 8 一tv e c t o rd n a ： 1ul 纯化产物：4 u 1 s o l u t i o ni ： 5 u 1 t o t a l ： 1 0 l il 1 6 过夜反应 ( 6 ) ee o l i d h 5 n 感受态细胞的制备和重组质粒的转化 接种d h s a 单菌落于2 0m ll b 培养基，3 7 。c 振荡培养过夜。 取0 5m l 菌液接于5 0m ll b 培养基中，3 7 。c 振荡培养至0 1 3 6 0 0 = o 4 o 6 。 将菌液转到用冰预冷的5 0m 1 聚丙烯离一t l , 管中，在冰上放置1 0r a i n ，使培养 物冷却至o 。 于4 。c ，4 0 0 0r r a i n 离心1 0 m l n ，回收细胞，控干，用1 0 m l 用冰预冷的0 1 m o l l c a c l 2 悬浮细胞，蔗于冰浴上1 0m i n 。 于4 。c ，4 0 0 0r r a i n 离心1 0r n i n ，去上清，将管倒置1m l n ，控干，每5 0 m 1 初始培养物用2t n l 用冰预冷的o 1m o l lc a c l 2 悬浮。 取l o o 山感受态细胞至4 m l 聚丙烯管中，与质粒d n a 混合( 体积1 0 山， 质量5 0n g ) ，轻轻旋转混匀，冰浴3 0r a i n 。 将管放到4 2 。c 水浴中热击9 0s ，迅速将管转移到冰浴中，冷却l - 2r a i n ，向 管中加入4 0 0g ls o c 培养基，3 7 。c 振荡培养1h ( 2 2 5r r a i n ) 。 在含有5 0 l x g m l a m p 的l b 平板上涂4 9 l x g a l 贮存液和g 山i p t g 溶液。 分别吸取5 0 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0n l 菌液涂于上述平板上。另取两个平板，一个 2 0 南开大学硕士学位论文 材料与方法 涂5 0u l 感受态细胞作为空白对照，p u c l 8 质粒转化作为j 下对照，3 7 。c 侄0 置培养过夜。 将平板4 。c 放置2 4 小时，使蓝色充分显现，挑出白色菌落做进一步分析。 ( 7 ) 重组质粒提取 1 5m l 过夜培养的细菌培养液放入1 5m l 微量离心管中，4 。c1 2 0 0 0r m i n 离 心0 5 m i n ，弃上清，控干。 将菌体重悬于1 0 0l a l 冰预冷的溶液i 中，剧烈震荡混合均匀。 向微量离心管中加入新配置的2 0 0p 1 溶液i i ，快速颠倒离心管几次，确保混 匀，冰浴5 8 分钟，至液体清亮。 待悬液变澄清后，立即往管中加入冰预冷的1 5 0 此溶液i ，温和颠倒离心 管，使溶液m 在粘稠的细菌裂解液中混匀，冰浴3 5m i n 。 1 2 0 0 0r m i n4 离心5m i n ，上清转入另一离心管，加入2 “lr n a s e a ( 1 0 m g r r d ) ，3 7 水浴中反应3 0 6 0 m i n 。 加入等体积酚一氯仿( 1 ：1 ) 振荡混匀，1 2 0 0 0r m i n 4 c 离心5m i n 。 吸取上清至另一离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，室温静置1 0f n i n ，沉 淀d n a 。 1 2 0 0 0r r a i n 4 。c 离心5 m i n 收集d n a 沉淀，弃上清，空干。 用1m l7 0 7 , 醇洗涤d n a 沉淀两次，控干沉淀，室温开盖放置1 5 - - 2 0m i n 用1 5h l 无菌水溶解沉淀，2 0 c 保存。 ( 8 ) 重组质粒的检测和酶切鉴定 p m d l 8 - t 载体是由p u c l 8 载体改建而成，p u t l 8 载体的多克隆位点处的x b a i ， s a l i 识别位点插入e c o r v 识别位点而成。用e c o r v 进行酶切反应后，再在两侧 的3 末端添加t 而成。由于大部分耐热性聚合酶都有在p c r 产物的3 末端添加 一个a 的特性，因此该试剂盒大大提高了p c r 产物的连接，克隆效率。由于 p m d l 8 一t 载体上有一个多克隆位点处有e c o r i ，p s t i 位点，因此采用这两种酶双 酶切，正确克隆的酶切的琼脂糖电泳结果是肯定有一条线性p m d l 8 - t 的d n a 带， d n a 片断长度为2 6 9 2 b p ，另外一条d n a 片断的长度( 或多条d n a 片断，它们长度 之和) 与插入载体的1 6 s r r n a 基因相同，在1 5 0 0 b p 左右 内切酶：如球i ，p s t i 活性浓度：8 - 2 0 u pl 配套试剂：1 0 b u f f e rh 乙酰化b s a ( 1 m g m 1 ) 反应条件：l b u f f e rh ，3 7 2 1 南开大学硕士学位论文材料与方法 反应体系：1 0 0 1 d d h z o ：5 6 9 l 1 0 b u f f e rh ：1 0 u l a c e t y l a t e db s a ( 1 m g m j ) ：1 0 u l d n a 底物：2 0 u l p s t i ：2 p , 1 将上述反应混合物放入3 74 c 水浴保温9 0r a i n ，然后用1 1 0 体积的乙酸钠 ( 3m o l l ，p h 5 2 ) 和两倍体积无水乙醇沉淀d n a ，用7 0 乙醇洗涤两次后溶 于1 2 山无菌水，再用e c o p d 进行酶切，反应体系和条件同上。 ( 9 ) 1 6 sr r n a 基因的核苷酸序列测定 将含有1 6 sr r n a 基因的细菌的菌液送到北京三博远志公司测序。 ( 1 0 ) 序列数据处理和系统进化树构建 将测序的结果登录h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v 网站，进行核苷酸序列的 b l a s t 比较，得到相关菌株的1 6 sr r n a 的核苷酸序列，利用d n a m a n 软件，构建 系统进化树。 2 2 4 萘降解基因的鉴定 1 细菌总d n a 的制备 ( 1 ) 培养菌。 ( 2 ) 离心0 5 m l 菌液，菌体用i m ln a c l ( 0 5 m o l l ) 洗一次。 ( 3 ) 用0 5 m l1 0 ：1t e 悬浮菌体，加5 斗1p r o t e i n a s ek ( 2 0 m g m l ，i nd d f t 2 0 ) 和2 5 “l2 0 的s o s ，室温作用直至裂解液清亮。 ( 4 ) 加入0 5 m l 酚一氯仿( 1 ：i ) ，用取液器反复吸排3 分钟，1 4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，取上层水相。 ( 5 ) 加入0 5 m 1 氯仿抽提，1 4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，取上层水相。重复次。 ( 6 ) 加十分之一体积乙酸钠( 3 m o l l ) 和一体积异丙醇，室温放置l o 分钟，离 心，弃清液，空干沉淀。 ( 7 ) 用0 5 m l7 0 的乙醇洗d n a 沉淀，离心，弃清液，空干沉淀。重复洗1 次。 ( 8 ) 真空抽干d n a 沉淀，加15 0 ul 无菌双蒸水，6 5 加热1 5 分钟，一2 0 保存。 2 探针制备 用p c r 法扩增下列基因，用作杂交探针：n a h a c ，n a h 只n a b kn a b gn a h u ， c e l t a n a h zn a b y 。 参考质粒p n d 6 1 中的n a h a c ，重复基因n a h v 和n a h f ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o 南开大学硕士学位论文材料与方法 a y 2 0 8 9 1 7 ) 的序列，重复基因n a h u ( g e n b a n ka c c e s s i o n n o g i 4 1 0 4 7 6 4 ) 和n a h g ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o g i l 2 0 0 6 7 1 8 2 ) 的序列及p e t - 2 1 b ( + ) l 拘多克隆位点设计引 物。p r i m e r p r e m i e r5 0 引物分析软件辅助设计，引物序列由上海s a n g o n 合成。 1 ) n a h a c 基因引物 f ：5 - t g g c g a t g a a g a a c t t t t c c 一3 t m ：5 5 8m w ：6 1 0 9 r ：5 一a a c g l 、a c g c t g a a c c g a g t c 一3 t m ：5 9 9 m w ：1 2 2 2 2 2 ) n a h v 基因引物： 上游引物：5 g g a g a c a t 点互qa c c g t a c a a c t g g t g a t f g a t3 ， 下划线碱基为n d ei 的酶切位点，斜体为保护碱基。 下游引物：5 c c a a t 丛鱼! ig a ag g g a t a a g gc t gg c c3 ， 下划线碱基为h i n di i i 的酶切位点，斜体为保护碱基。 3 ) n a h f 基因引物： 上游引物：5 g g a 删c 爿r 丛缱鱼a a g a c a a a a c t g t t t a t c a a t3 ， 下划线碱基为n d ei 的酶切位点，斜体为保护碱基。 下游引物：5 c c a a t q ! ! g a a g g g a t a t t g c t g c t c g a a3 ， 下划线碱基为h i n d i l l 的酶切位点，斜体为保护碱基。 4 ) n a h u 基因引物： 上游引物：5 g g a g a ca t 煎鲢gc a aa a t t e t a c t t c t g c te t g a a 3 下划线碱基为n d ei 的酶切位点，斜体碱基为保护碱基。 下游引物：5 c c 口a l ! g 垦gg g cc g c t t ge g o g c3 下划线碱基为x h oi 的酶切位点，斜体碱基为保护碱基。 5 ) n a h g 基因引物： 上游引物：5 g g a g a c a tc a j _ 监a a a a r ca a ta a ac c t g g c t t g3 下划线碱基为n d ei 的酶切位点，斜体碱基为保护碱基。 下游引物：5 c c a a t ! g 鳄c c c t t g a c g t a gc a c a c ec3 下划线碱基为x h oi 的酶切位点，斜体碱基为保护碱基。 6 ) o a t a 基因引物 上游引物：5 g c ac c at t ga g g g c cc g cl c ta c3 南开大学硕十学位论文材料与方法 下游引物：5 g g a l a tc g cc a a t c a g g cc g t c a3 7 ) n a h h , 加厅j ，已克隆到p m d t l 8 载体上，用s a li 和e c o ri 双酶切。 酶切体系：1 0 b u f f e r2 ul b s a2 u1 p m d t l 8 4 l , t1 s a li & e c o ri 各ln1 h 2 0 1 0 ul t o t a l ： 2 0 u 1 3 点膜 将提取的总d n a ( 包括待检测的菌株、阴性对照和阳性对照) 依次点在尼龙 膜上，将探针点在三个角上，起定位作用。待其晾干后，浸入变性液1 5 分钟， 取出后，再浸入中和液1 5 分钟，取出用滤纸吸于，放入3 0 烘箱干燥3 0 分钟 以上，最后放入8 0 。c 烘箱固定2 小时。 4 杂交 ( 1 ) 探针标记 标记之前先将探针9 5 水浴5 分钟，之后冰浴5 分钟。 体系：探针 8 ul k e l e n o we1u l 5 x r e a c t i 0 1 2b u f f e r2 仙l 随机引物 1 | i1 d n t p s ( d a t p 、d t t p 、d g t p )各2 l ll ”p d e t p4 i j 1 d d h = , o2u l 总体积：2 5ul 3 7 水浴标记2 小时。 ( 2 ) 杂交 1 ) 将杂交膜放入杂交管，加入5 0 m l6 x s s c 浸泡2 分钟，倒出溶液，加入 预杂交液5 0 m l ，6 5 预杂交2 小时。 2 标记好的探针9 50 c 水浴5 分钟，冰浴5 分钟，弃去预杂交液，加入3 0 m 1 杂交液和变性探针，6 5 v 杂交1 6 小时以上。 2 4 南开大学硕士学位论文 材料与方法 ( 3 ) 洗膜 1 ) 杂交液倒入废液缸，用适量2 x s s c - 0 5 s d s 洗膜2 分钟，倒掉溶液， 重复两次。 2 ) 用适量2 x s s c 一0 i s d s 洗膜1 0 分钟，倒掉溶液，重复2 次。 3 ) 用适量0 1 x s s c o i s i _ 】s 洗膜1 5 分钟，倒掉溶液，重复3 次。 4 ) 用0 1x s s c 洗膜5 分钟，取出杂交膜置于滤纸上吸去水分。 ( 4 ) 曝光及显影 1 ) 在暗室中，将杂交膜放入曝光夹，加上胶片，合紧夹子，一7 0 放置2 4 小时。 2 ) 将曝光夹在3 7 。c 放置1 小时，于暗室中取出胶片，显影液显影，蒸馏水 停影，最后用定影液定影5 分钟，流水冲洗，晾干。 2 2 5 土壤修复试验 从筛选出的菌株中取萘降解能力最强的一株做土壤修复试验。土壤取自南开 大学理科图书馆后空地。将士块敲碎，筛去其中的石块和杂物，1 8 0 。c 灭菌2 小 时，备用圳。 试验组( a 组) ：2 0 9i ：嚷+ 4 0 m g 萘+ 2 0 m l 菌液+ 4 m lm m 培养基，共1 0 卜培养皿。 对照组( b 组) ：2 0 9 - l 壤+ 4 0 m g 萘+ 2 0 m l 蒸馏7 ( + 4 m l m m 培养基，共 1 0 个培养皿。 试验方法： 1 ) 每天分别给a ，b 两组加o 5 m l 蒸馏水，搅拌使土壤保持湿润。每两天 取一个样，密封存于一3 0 ，修复时间为2 周。 2 ) 把保存于平皿中的土壤转入2 5 0 m l 锥形瓶中。取2 0 m l 蒸馏水分4 次清 洗平皿，并倒入锥形瓶中。再取2 0 m l 二氯甲烷，分四次清洗平皿，倒入锥形瓶。 将锥形瓶封口，放入摇床振荡3 小时，使萘充分溶解。 3 小时后，把混合液转入离心管，3 0 0 0 d n f i n 离心1 5 分钟。取下相液，过 o 4 5um 滤膜，滤液用气相色谱检测。 南开大学硕士学位论文 结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 萘降解菌株的分离和鉴定 3 1 1 菌株分离 从两种来源的污染样品中分别分离出2 4 个萘降解菌株，1 号来源样品分离 出的菌株命名为n a h l ( 1 - 2 4 ) ，2 号来源污水分离出的菌株命名为n a h 2 ( 1 - 2 4 ) 。 此4 8 株菌均能在以萘为唯一碳源的无机盐培养基中生长，其区别为1 号来源的 菌株无法直接在萘培养基中生长，需先在水杨酸培养基中培养2 4 4 8 小时，当 其菌体浓度o d 6 0 0 0 6 后，按2 的接菌量转入萘培养基，此后才能以萘为唯一 碳源生长。2 号来源的菌株则可直接在萘培养基中生长，无须水杨酸的诱导。从 n a h l ( 1 - 2 4 ) 菌株中选择一个降解性能最好的菌株n d 2 4 ，进行详细研究。 3 1 2 菌株抗药性鉴定 将此4 8 株菌分别接种在含四环素( t c ，2 0l ag m 1 ) ，氨苄青霉素( a p ，5 0 1 tg m 1 ) ，卡那霉素( k m ，2 0 ug m 1 ) ，链霉素( s m ，2 0 ug m 1 ) ，氯霉素( c m ，5 0 pg m 1 ) 的基本培养基上，观察其抗药性。表3 i 是此4 8 株菌的抗菌素抗性比 较。 表3 - 1 萘降解菌株的抗生素抗性 n a h l1 31 4 1 5 1 61 71 81 92 02 12 22 32 4 南开大学硕十学位论文结果与讨论 n a h 21 31 4 1 51 61 71 81 92 02 l2 2 2 3 2 4 a p + + t c + +十+ + c m+ + s m + +- i -+ k r a 一 一 一 一 一 3 1 3 质粒检测 按2 3 2 的方法提取2 号来源2 4 株菌质粒，经琼脂糖凝胶电泳后发现均含有 一条由大质粒形成的d n a 带，且与n d 6 的质粒p n d 6 1 形成的d n a 带处于同 一位置，因此其分子量与p n d 6 1 相近，约为1 0 2 k b ( 图3 一l ，图3 2 ，图3 3 ) 。1 号来源2 4 株菌的质粒的条带非常不清晰( 图略) 。 1234 5678 n d 6 图3 1 2 号来源1 8 号菌株及n d 6 质粒电泳图 2 7 南开大学硕士学位论文 结果与讨论 91 01 l1 21 31 41 51 6 图3 - - 22 号来源9 1 6 号菌株质粒电泳图 1 71 81 92 02 12 2 2 3 2 4 n d 6n d 6 图3 32 号来源1 7 2 4 号菌株及n d 6 电泳图 3 1 4 n d 2 4 菌株的底物特异性 分别以8 种萘和水杨酸的类似物为碳源培养n d 2 4 和n d 6 菌株，结果表明， 2 个菌株的降解底物完全样。它们除了能降解萘以外，还能降解邻苯二甲酸、 邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸( 表3 - 2 ) 。 南开大学硕士学位论文 结果与讨论 表3 - 2n d 2 4 和n d 6 菌株的碳源利用比较 3 1 5 n d 2 4 菌株展适生长条件的筛选 1 、生长曲线和萘降解曲线 表3 - 3 是萘残留量的气相色谱测定数据。图3 - 4 是n d 2 4 菌株的生长和萘降 解盐线。从图可以看出，在最佳生长条件下，8 - 2 0 h 为对数生长期，在此期间萘 的降解速度也最快，到3 0 h 细菌生长进入平衡期，到4 8 h 萘基本被降解完全。因 此n d 2 4 的生长曲线和降解蟪线是正相关的，其降解效率为9 8 4 1 。 南开大学硕士学位论文结果与讨论 0 1 02 03 。0 t i m e ( h ) 图3 4n d 2 4 菌株的生长曲线和萘降解曲线 2 、n 1 ) 6 、n d 2 4 和n a h l1 4 三株菌生长曲线比较 n d 2 4 和n a h l1 4 分别为2 号来源菌株和1 号来源菌株中生长速度最快的一 个。将此二株菌与n d 6 做生长曲线的比较。由图可知n d 2 4 的生长速率最快， n d 6 其次，n a h l1 4 最慢。 e g o o 图3 5n d 6 、n d 2 4 和n a h l1 4 三株菌生长曲线比较 3 、p h 对n d 2 4 菌株生长的影响 从图3 - - 6 可知，当p h 为6 5 7 5 时菌体生长得比较好，说明p h 6 5 7 5 是 3 0 一爨一1u8罨n 僦 蚰 柏 o ecoo一00 南开大学硕十学位论文 结果与讨论 n d 2 4 菌株生长的最适p h ，当p h 为6 0 和8 0 时o d 6 0 0 值均有所下降，但p h 6 0 比p h 8 0 下降的多，p h 为5 0 、8 5 和9 0 时菌体基本不生长。 图3 6p h 对n d 2 4 菌株生长的影响 4 、底物浓度对n d 2 4 菌株生长的影响 从图3 7 可知，当萘浓度为o 0 5 时，n d 2 4 菌株生长得较为缓慢，说明底 物浓度太低，无法满足菌体生长的要求。当萘浓度增大到0 2 时，培养液的o d 6 0 0 值大幅度增加，菌体生长状态良好。但当萘浓度继续增大到0 4 直至1 0 时， 培养液的0 1 ) 6 0 0 值不但没有增加，还有所下降，4 8 h 后还有较多的萘没有被利用， 说明过量的底物浓度会对菌体生长产生定的抑制作用。适合n d 2 4 菌株生长的 最适底物浓度为0 - 2 。当底物浓度为o 2 时，培养液的o d 6 0 0 值最高，4 8 h 后 萘基本降解完全。 坦 伸 一eoo心一凸。 南开大学硕+ 学位论文结果与讨论 t i m e ( h ) 图3 - - 7 底物浓度对n d 2 4 菌株生长的影响 5 、氮源对n d 2 4 菌株生长的影响 图3 8 表明，这4 种氮源均能使n d 2 4 菌株较好地生长，且对n d 2 4 菌株 生长的影响没有太大差异。 t i m e ( h ) 图3 - - 8 氮源对n d 2 4 菌株生长的影响 种 协 他 仙 吣 一ec009)o o o eu()09)do 南开大学硕士学位论文 结果与讨论 6 、微量元素对n d 2 4 菌株生长的影响 从图3 9