（微生物学专业论文）小穴壳菌（dothiorella+sp）htf3聚酮合酶基因的研究.pdf

摘要 摘要 本文旨在研究小穴壳菌属( d o t h i o r e i l as p ) 真菌i f f f 3 中，与c y t o s p o r o n e b 合成相关的聚酮合酶。在h t f 3 的生长过程中，产生了一系列聚酮化合物，其 中的c y t o s p o r o n eb 具有较好的抗真菌和细胞毒活性，有潜在的药用价值。我们 希望通过对c y t o s p o r o n eb 聚酮合酶基因的研究，揭示其生物合成途径，为改造 和应用该化合物奠定基础。同时，还希望在研究过程中，建立起一套可行的方法， 以便于广泛开展真菌的次级代谢产物研究。 本文研究内容主要包括：构建h t f 3 基因组文库，利用同源探针筛选文库获 得含p k s 基因的克隆子；分析克隆子插入序列的开放阅读框，获取完整的p k s 基因；通过同源重组敲除聚酮合酶基因，研究该基因与c y t o s p o r o n eb 的关系。 通过简并引物p c r 从h t f 3 基因组中扩增获得聚酮合酶基因片段0 6 0 1 和 1 1 0 1 ，序列比对结果显示，0 6 0 1 属于非还原型聚酮合酶基因，1 1 0 1 属于部分还 原型聚酮合酶基因。根据对c y t o s p o r o n eb 合成途径的推导，我们认为0 6 0 1 与 c y t o s p o r o n eb 合成有关，因此我们选择0 6 0 1 作为筛选文库的同源探针。 h t f 3 基因组文库采用黏粒载体s u p e r c o sl 进行构建，文库构建效率为5x 1 0 3 克隆数l ig d n a 。采用0 6 0 1 探针进行s o u t h e r n 杂交后，从文库中得到一个阳 性克隆。 通过对插入片段两端序列的分析，我们认为阳性克隆中可能含有完整的聚酮 合酶基因，并通过步移法从阳性克隆上p c r 获得该基因的完整序列，命名为 p k s 0 6 0 1 。p k s 0 6 0 1 全长5 3 4 0 b p ，编码的蛋白质中含有5 个可能的功能域，分别 是k s 、a t 、2 个p p - b i n d i n g 域和t e ，但没有参与b 酮基还原步骤的功能域，为 典型的非还原型聚酮合酶结构。序列比对发现，该p k s 与c o l e t o t r i c h u m a g e n a r j u m 中合成真菌黑色素( m e l a n i n ) 前体t h n 的聚酮合酶p k s l 有较高相 似性。 我们从阳性克隆的p k s 0 6 0 1 基因上、下游各截取一段序列，并在其中接入报 告基因潮霉素抗性基因h p h ，以p g e x - 4 t 一2 为载体构建得到了敲除质粒p g k 5 5 h y g ， 希望通过同源重组敲除h t f 3 基因组中的p k s 0 6 0 1 ，以检测基因缺失对 c y t o s p o r o n eb 代谢的影响。p g k 5 5 h y g 采用原生质体一p e g 法转化h t f 3 原生质 摘要 体，为获得理想的转化效率，我们事先优化了原生质体制备和再生的条件，确定 以含1 5 溶壁酶、1 5 纤维素酶和1 0 蜗牛酶的溶壁酶混合液制备原生质体， 并以含i m o l ln a c l 的p d a ( 5 0 9 6 海水) 作为再生培养基。 p g k 5 5 h y g 转化h t f 3 后，经过潮霉素b 筛选获得6 个转化子。转化子经p c r 检测，证实h p h 已经转入基因组中，但0 6 0 1 未被敲除。通过薄层色谱( t l c ) 检 测转化子的发酵液，均有c y t o s p o r o n eb 信号产生。目前，这些结果还无法说明 p k s 0 6 0 1 与c y t o s p o r o n eb 的关系，实验仍在进行中。 关键词：c y t o s p o r o n eb ；聚酮合酶；基因敲除 摘要 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y ，c y t o s p o r o n ebp o l y k e t i d es y n t h e s eg e n eo fd o t h i o r e l l a s p h t f 3w a si n v e s t i g a t e d c y t o s p o r o n eb ，o n eo fas e r i e so fp o l y k e t i d e s g e n e r a t e dw i t hh t f 3p r o l i f e r a t i o n ，h a dg r e a ta n t i f u n g a la n dc y t o t o x i n a c t i v i t i e s ，a n dm a y b eh a dp o t e n t i a lp h a r m i cv a l u e c y t o s p o r o n ebp k sg e n e w a ss t u d i e dt or e v e a li t sb i o s y n t h s e sp a t h w a ya n df a c i1i t a t ei t s m o d i f i c a t i o na n da p p l i c a t i o ni nf u t u r e o nt h eo t h e rh a n d ，af e a s i b l e m e t h o d o l o g yw o u l db ee s t a b lis h e di ns t u d yp r o g r e s s ，s ot h a tm o r er e s e a r c h a b o u tf u n g is e c o n d a r ym e t a b o li t e sw il lb ed o n e r e s e a r c hc o n t e n t si nt h i ss t u d yi n c l u d e d ：h t f 3g e n o m i c1 i b r a r y c o n s t r u c t i o na n ds e a r c hc l o n ec o n t a i n i n gp k sg e n eb yh o m o l o g o u sp r o b e ； s e a r c h i n gt h ew h o l ep k sg e n e i nc l o n eb yo r fa n a l y s i s ：s t u d yt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np k sg e n ea n dc y t o s p o r o n ebb yg e n ek n o c k o u t t w op k sg e n ef r a g m e n t s0 6 0 1a n d11 0 1w e r ea m p li f i e df r o mh t f 3g e n o m e b yd e g e n e r a c yp c r a 1i g n m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a t ，0 6 0 1w a sa n r p k sg e n e ， a n d11 0 1w a sap r p k s 0 6 0 1m a yb er e f e r e dt oc y t o s p o r o n ebb i o s y n t h e sis a c c o r d i n gt ot h ed e d u c t i o no fb i o s y n t h e s i sp a t h w a ya n dw a sc h o s e na st h e h o m o l o g o u sp r o b e t h eg e n o m i c1 i b r a r yw a sc o n s t r u c t e do nc o s m i ds u p e r c o s1a n dc l o n e e f f i c i e n c yw a s5x1 0 3 c l o n e s i ig d n a o n ep o s i t i v ec l o n ew a ss c r e e n i n gf r o m g e n o m i ci i b r a r yw i t h0 6 0 1p r o b e t h ea n a l y s iso ft w oe n d so fi n s e r ts e q u e n c es h o w e dt h a t ，o n ep k sg e n e m a y b ec o n t a i n e di np o s i t i v ec l o n e ，a n dw a sg a i n e d b yg e n ew a l k i n go n p o s i t i v ec l o n e ，a s s i g n e da sp k s 0 6 0 1 p k s 0 6 0 1 ，w i t has i z eo f5 3 4 0 b p ，w a s at y p i c a ln r p k se n c o d i n gap u t a t i v ep k sw i t hf i v ec o n s e r v e dd o m a i n s ：k s 、 a t 、2p p - b i n d i n gd o m a i na n dt e ，a n dw i t h o u ta n yd o m a i nc a t a l y z i n gb k e t o r e d u c t i o n a n dt h i sp k s h a dh i g hi d e n t i t i e s w i t hc o l i e t o t r i c h u m a g e n a r j u ap k s l ，w h i c hs y n t h e s i z ep r e c e n t o ro fm e l a n i n t 删， t w of r a g m e n t si nu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mo fp k s 0 6 0 1w e r ei n t e r c e p t e d 摘要 f r o mp o s i t i v ec l o n e ，a n dw a sl i n k e db yh y g r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n eh p ht o c o n s t r u c t e dp g k 5 5 h y g p g k 5 5 h y gw o u l dk n o c k o u tp k s 0 6 0 1f r o mh t f 3g e n o m e b yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，t os t u d yt h ee f f e c to fg e n ed e f i c i e n c yo n c y t o s p o r o n ebs y n t h e s i s p g k 5 5 h y gw a st r a n s f o r m e di n t oh t f 3p o t o p l a s tb y p o t o p l a s t - p e gm e t h o d ，a n dt h ec o n d i t i o no fp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n d r e g e n e r a t i o nw e r eo p t i m i z e df o rh i g ht r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y t h e c e llw a lld e g r a d i n ge n z y m e sm i x t u r ew a s1 5 p r o l y w a ll z y m e ， 1 5 c e l l u l a s ea n d1 0 s n a i l a s e ，a n dr e g e n e r a t i o nm e d i u mw a sp d a ( 5 0 s e aw a t e r ) w i t hi m o l ln a c l a f t e rt r a n s f o r m a t i o n ，6t r a n s f o r m e r sw e r es c r e e n e do u tb yh y g r o m y c i n bm e d i u m r e s u l t so fp c rt e s ts h o w e dt h a t ，h p hh a dt r a n s f o r m e di n t oh t f 3 g e n o m e ，b u td i dn o tk n o c k o u tp k s 0 6 0 1 t h e s et r a n s f o r m e r s b r o t hw e r e t e s t e db yt l ca n ds h o wp o s i t i v es i g n a lo fc y t o s p o r o n eb s u mu pt h e s e r e s u l t s ，w ec a nn o tr e v e a la n yr e l a t i v eb e t w e e np k s 0 6 0 1a n dc y t o s p o r o n e b ，a n ds t u d yg oo n k e yw o r d s ：c y t o s p o r o n eb ：p o l y k e t i d es y n t h a s e ：g e n ek n o c k o u t i v 常用英文缩写词 常用英文缩写词 ( 按字母顺序排列) a c p ：a c y lc a r r i e rp r o t e i n ，酰基载体蛋白域； a h b a ：3 - a m i n o - 5 - h y d r o x y l b e n o i ca c i d ，3 一氨基一5 一羟基苯甲酸； a r o ：a r o m a t a s e ，芳香化酶域； a t ：a c y l t r a n s f e r a s e ，酰基转移酶域； c h s - c h a l c o n es y n t h a s e ，查尔酮合酶； c l a p ：小牛肠碱性磷酸酶； c l f ：c h a i nl e n g t hf a c t o r ，链长决定因子； c - m e t ：c - m e t h y l t r a n s f e r a s e ，c 一甲基转移酶域； c r a b ：h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三甲基溴化铵； c l c ：c l a i s e nc y c l a s e ，c l a i s e n 环化酶； c y c = c y c l a s e ，环化酶域； d a p i ：4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y li n d o l e ，4 ，6 一二脒基一2 一苯基吲哚； 6 - d e b ：6 一d e o x y e r y t h r o n o l i d eb ，6 一脱氧红霉内酯； d e b s ：6 - d e o x y e r y t h r o n o l i d ebs y n t h a s e ，6 一脱氧红霉内酯合成酶； 明：d e h y d r a t a s e ，脱水酶域； e r ：e n o y lr e d u c t a s e ，烯酰基还原酶域； f a s ：f a ta c i ds y n t h a s e ，脂肪酸合成酶； k r ：k e t or e d u c t a s e ，酮基还原酶域； k s ：b k e t o a c y ls y n t h a s e ，酮基合成酶域； l d ：l o a d i n gd o m a i n ，负载酶域； p k s ：p o l y k e t i d es y n t h a s e ，聚酮合酶； t e ：t h i o e s t e r a s e ，硫酯酶域； t h n ：1 ，3 ，6 ，8 一t e t r a h y d r o x y n a p h t h a l e n e ，四羟基萘； v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文 写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法 享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：飞彩岛 砷毫砷b 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的 内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的 学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在，年解密后适用本授权书。 。 2 不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名：丑彩毽移e t 剪i -作者签名：虫彩b 移 翮群潮妒 f 月刁日 占月 7 1 日 1 前言 1 1 微生物来源聚酮研究概况 聚酮化合物( p o l y k e t i d e s ，p k s ) 是一类广泛分布于自然界的重要的天然产 物，在动物n 一1 、植物嘲、各类微生物“1 体内均有发现。其中，微生物来源的聚酮 数量庞大，结构多样( 图1 ) ，具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗肿 瘤、抗病原生物、抗结核和免疫抑制等作用，其中许多成员已被开发成药物，广 泛应用于医疗事业和农、牧业中，包括临床上应用的红霉素( e r y t h r o m y c i n ) 、 四环素( t e t r a c y c l i n e ) 、利福霉素( r i f a m y c i n ) 、两性霉素b ( a m p h o t e r i c i nb ) 、 阿霉素( d e x o r u b i c i n ) 、洛伐他汀( 1 0 v a s t a t i n ) 、雷帕霉素( r a p a m y c i n ) 等抗 生素以及农牧业用的阿弗菌素( a b a m e c t i n ) 、莫能星( m o n e n s i n ) 和泰乐菌素 ( t y l o s i n ) 等，具有重要的应用和经济价值。当前，从聚酮化合物中开发新药 物的工作仍在继续，随着聚酮化合物生物合成途径的揭示和合成基因的克隆，代 谢工程技术被应用于聚酮化合物合成主要集中在寻找合适宿主、改变代谢流以提 高目的产物的产量以及合成聚酮类新抗生素等方面，在聚酮化合物生物合成的研 究和开发方面具有很大的应用潜力隋。 由于聚酮化合物的重要性，以至于在还未完全清楚它们的应用范围前，研究 者已开始关注它们在生物体内的合成。对聚酮化合物合成的研究起始于一个多世 纪前j a m e sc o l l i e 对地衣酚( o r c i n 0 1 ) 的研究，但他提出的观点在当时并未引 起注意。直到2 0 世纪中期，a r t h u rb i r c h 的研究工作使得对聚酮合成的研究得 以复苏。a r t h u rb i r c h 的贡献在于提出了合成单元的假设，他根据同位素饲喂 实验的结果，提出：许多天然产物的合成单元与醋酸有关。而关于聚酮生物合成 途径的研究则随着2 0 世纪8 0 年代遗传技术的发展而进入新的发展阶段h 1 。 尽管聚酮化合物的化学结构多样，但其生物合成机制基本相似。聚酮由一些 简单的羧酸单位如乙酸、丙二酸、丁酸等，经过连续脱羧缩合反应合成的，而催 化这一过程的关键酶称为聚酮合酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e ，p k s ) 。聚酮合酶一 般由多个不同的功能单位组成，这些功能单位在聚酮合成过程中的作用不同，按 一定顺序催化聚酮碳链的合成。聚酮合酶的基本组成单位包括k s 、a t 和a c p ， 部分聚酮合酶中还有k r 、明和e r ，催化聚酮链中b 一酮基的还原，另外，还有 负责最终产物释放的t e ，负责碳链环化的c y c 和在真菌聚酮合酶中负责甲基转移 的c - t e t 册等。 l b 红霉素，e r y t h r c m y c i n 利福霉素，r i f a m y c i n 前言 四环素，t e t r a c y c l i n e k 0 - 阿霉素， 臂帕霉素，r a p a m y c i n 洛伐他汀l o v a s t a t i n 图1 已进入临床使用的几种聚酮化合物药物 f i g 1s o m ep o l y k e t i d em e d i c i n e su s e di nc l i n i c a l 2 从酶的结构和反应机制可以看到，p k s 与脂肪酸合成酶( f a s ) 具有非常密 切的关系。同位素标记的实验表明，在各种脂肪酸和聚酮生物合成的生化本质是 相同的，都包含着羧酸酯的脱羧缩合反应，都需要泛酰巯基化的a c p 承载中间产 物以及a t 在酰基辅酶a 与酶之间、反应底物与产物之间转移中间产物并起着转 酯作用( t r a n s - e s t e r i g f i c a t i o n ) ，而系统发育学的分析结果显示，大多数聚酮 和脂肪酸的生物合成基因在生物进化上具有共同的起源，由同一个祖先基因分化 而成抽1 。由于p k s 和脂肪酸合酶的相似性，研究者在对p k s 进行分类时，借鉴了 f a s 的分类方式。根据结构的不同，p k s 被分为3 型：i 型p k s 与i 型f a s 类似， 是一类多功能酶，由多个具有催化活性的单元组成；型p k s 与型f a s 类似， 是一组分立的酶组成的复合体，各个酶能够多次重复催化同一性质的反应；植物 聚酮类化合物的合成机理与上述两类都不同，该类化合物的合成酶直接以简单羧 酸的乙酰辅酶a 为底物，被归为型p k s 。虽然p k s 和f a s 非常相似，但并非完 全相同，由于p k s 对起始单元的选择较多样化，在一些p k s 中k r 、d h 、e r 不同 程度的缺失，以及各种环化、芳环化反应，使得p k s 的结构更复杂，产物更丰富 【9 】 o 1 2 细菌i 型陬s 细菌i 型p k s 是一类巨型蛋白，一般由多条肽链组成，每条肽链上又包含若 干个“模块 结构( m o d u l a r ) ，每个模块包含了完成一轮延伸反应所需的所有活 性位点，因此又称为模块式聚酮合酶( m o d u l a rp k s ) ，已知的该类p k s 包括红霉 素的d e b s 、雷帕霉素合成酶( r a p s ) 、制霉菌素合成酶等，其中r a p s 是自然界 中已知最复杂的多酶系统之一，由3 条肽链1 4 个模块组成，共有7 0 个催化位点。 红霉素的d e b s 是研究较早的细菌i 型p k s ，最早的研究报告发表于1 9 9 0 年，经 过一系列精细的研究，d e b s 已成为研究得较为透彻的p k s 之一( 图2 ) ，我们将 以之为例进行，对细菌i 型p k s 进行说明。 红霉素是常见的大环内酯类抗生素，其结构中的环酯部分为一7 一酮链酯化 而成，由6 一脱氧红霉内酯合成酶( d e b s ) 催化合成。d e b s 由3 个蛋白组成，每 个蛋白都含有两套结构和功能相近的模块( m o d u l e ) ，模块中含有k s 、a t 和a c p 三个基本功能域，部分模块还含有k r 、d h 和e r ，除了6 个模块外，在d e b s1 的n 端有一个由a t 和a c p 组成的l d 域，它负责选择和结合作为起始单元的第一 3 前言 个小分子羧酸；在d e b s3 的c 端有一个t e 域，负责在反应的最终阶段将聚酮从 p k s 上水解下来n 仍。在整个分子的合成过程中，每个模块只催化一轮碳链的延伸， 反应起始于l d 特异性的选择丙酸为起始物，并将其转到l d 的a c p 上，基因敲除 实验证实，该部分在红霉素合成过程中不是必需的，但该部分缺失将会引起红霉 素产量的显著下降】；延伸单元的选择由各个m o d u l e 的a t 域决定，m o d u l e 卜a t 选择结合的丙二酸单酰基传给m o d u l e 卜a c p 上的泛酰磷酸基，在m o d u l e1 - k s 催化缩合下形成b 酮，m o d u l e l k r 以n a d p h 还原b 酮成为羟基，完成第1 轮循 环；第2 、第5 和第6 轮延伸反应与第1 轮相似；m o d u l e3 中只有k s 、a t 和 a c p 三个酶域( 有1 个类似的k r ，但其上没有n a d p h 结合位点，因而没有功能) ， 故第3 轮延伸相应的b 位酮基( c 9 位) 被保留；m o d u l e4 中不仅有k s 、a t 和 a c p ，而且有d h 和e r ，这一轮循环完全类似于饱和脂肪酸的合成，故在c 7 位为 饱和烃键；当完成6 轮缩合反应后，d e b s3 的c 端的t e 通过酯环化 ie r y a i i i h 饥h 瞳麟l s t ui “b a l e l 咖l 2 _ _ _ l - 一_ _ _ _ _ 一_ _ _ _ _ 一 啦鼹 i o d u l dm o & l dh d _ _ _ _ o 图2 红霉素聚酮合酶结构及其生物合成途径嘲 f i g 2o r g a n i s a t i o no fe r y t h r o n y c i np o l y k e t i d es y n t h a s ea n dt h eb i o s y n t h e s i s p a t h w a y 4 前言 将聚酮链从酶上解离出来n 幻。从合成途径还可以看到，细菌i 型聚酮的碳链长度 与模块数的比例呈线性关系，因为每个模块只催化一轮反应，所以加入的合成单 元数受到模块数的限制，从而控制了聚酮碳链的长度。 已知的细菌i 型p k s 还有与雷帕霉素结构相近的f k 5 0 6 、同属大环内酯类的 螺旋霉素( s p i r a m y c i n ) 、竹桃霉素( o l e a n d o m y c i n ) 、多烯类的匹马霉素 ( p i m a r i c i n ) 等，它们的反应机制基本相同，但在起始单元和延伸单元的选择 上略有不同。细菌i 型p k s 的生物合成起始单元的多样性较高，如常见的乙酰辅 酶a ，丙酸，丙二酸酰胺和丙二酸，而在利福霉素b 中则是非常见的3 一氨基- 5 - 羟基苯甲酸( a h b a ) ，而延伸单元也同样具有多样性，并且同一聚酮合成途径中 延伸单元的选择也不均一。另外，某些p k s 还含有无功能的模块，使得细菌i 型 p k s 更为复杂。 1 3 细菌型p k $ 细菌i i 型p k s 因其代谢产物为芳性多酮类化合物，又称为芳香族聚酮合酶， 临床上使用的四环素类抗生素和蒽环类抗生素均是由该类p k s 合成。芳香族聚酮 合酶的结构与i 型p k s 不同，是一组分立的单功能酶组成的复合体，各个酶的功 能不同，在合成过程中，各个酶能够多次重复催化同一性质的反应，中间体在该 复合体上进行“环绕 式碳链增长。相比于细菌i 型p k s ，该型p k s 的结构相对 简单，对起始单元和延伸单元的选择也较为单一，主要是乙酰辅酶a 和丙二酸单 酰辅酶a 。 细菌型p k s 中研究最早的是放线紫红素( a c t i n o r h o d i n ) 聚酮合酶n 毛嘲。 放线紫红素是一个二聚体分子，由两个相同的三环结构组成，每个三环结构为一 个聚酮，由一个乙酸单位与七个丙二酸单位组成。研究结果显示，放线紫红素合 成酶由k s 、c l f 、k r 、a c p 、a r o 和c y c 6 个蛋白组成，分别由染色体上成簇排列 的基因a c t l l i 、a c ti o r f l 、a c ti - o r f 2 、a c ti o r f 3 、a c t v l l 、a c t i v ( 图3 ) 编码获得，合成放线紫红素时，k s 、c l f 、a c p 负责将一个乙酰辅酶a 起始单位 与七个丙二酰辅酶a 延伸单位组装成一个非还原的聚酮体，并形成第一个芳香 环；k r 使9 位酮基羟化，随后在a r o 和c y c 的作用下第二个芳香环形成，经t e 作用释放后，再经剪裁修饰反应形成放线紫红素。 在细菌i i 型p k s 中，由k s 、c l f 、a c p 三个酶组成的结构称为最小p k s ( m i n i m a l 刚西 p k s ) ，在比较了放线紫红素合成酶和其后陆续发现的多个细菌i i 型p k s ( 表1 ) 发现，尽管不同来源的酶复合物在组成上差别较大，但都含有k s 、c l f 、a c p ， 00o 珏 k s c l f扯p 如c t c 0 l a c t i o l l 引舢k s c 0 0 + 八 0 i io c 0 0 h 厥拔紫红采a c t i 帅r h o d i n 图3 放线紫红素( a c t i n o r h o d i n ) 基因簇及其合成途径 f i g 3t h eg e n ec l u s t e ro fa c t i n o r h o d i na n di t sb i o s y n t h e si sp a t h w a y 而且三者在结构和组成上具有很高的同源性( 图4 ) ，由它们组成了整个p k s 的 核心部分，由它们合成了聚酮的基本结构。c l f 与k s 同源性较高，遗传进化分 析显示它们的基因来自同一祖先，是由一原始基因复制后分化而成，但c l f 中缺 少缩合反应所需的催化位点，因此不认为c l f 具有与k s 相同的功能，现有的研 究发现，c l f 可能参与了聚酮化合物碳链长度的控制。将产物为十酮 t e t r a c e n o m y c i n 的聚酮合酶的c l f 被产物为八酮a c t i n o r h o d i n 或g r a n a t i c i n 的聚酮 合酶的c l f 替代时，产物相应的变为八酮n2 i 。而对放线紫红素合成酶的c l f 进行 6 定点突变也说明了同样的情况。在比对了多个型p k s 的c l f 发现，c l f 的氨基 酸序列高度保守，仅在四个氨基酸位点上有区别，对a c t 中的这四个氨基酸做定 点突变，代谢产物的链长会有不同程度的变化，甚至没有代谢产物形成n 们，说明 c l f 确实起着链长决定作用。细菌型p k s 并未发现a t 的存在，因而早期的研 究者曾经猜测，聚酮合成过程中借用了f a s 的a t ，但k e v i nr e y n o l d s 的研究发 现m ，当t e t r a c e n 伽y c i n 的a c p ( t c m m ) 与来自e c o l if a s 的a c p ( a c p p ) 共 同孵育时，不仅自身可以丙二酰基化，还可以催化h c p p 的丙二酰基化，说明t c m m 不但起着承载酰基的作用，还具有酰基转移的功能，从而解释了细菌型p k s 中a t 缺失的原因。 表l 已知的放线菌来源型p k s 基因簇嘲 t a b 1c l o n i n ga n ds e q u e n c i n go ft y p ei ip k sg e n ec l u s t e r sf r o ma c t i n o m y c e t e s a 菌株聚酮产物基因序列检索号 s t r e p t o e y c e s c o e l i c o l o r & v i o l a c e o r u b e r & r o s e o f u lv u s 曼g r i s e u s 5 ：g _ l a u c e s c e n s & c o e l i c o l o r & h a l s t e d i i 5 ：c u r a c o i 曼r i m o s u s p e u c e t i u s s s p c 5 sn o g a a t e r 曼a r g i l l a c e u s sf r a d j a e 曼v e n e z u e a e n a n a o m y ci n f r e n o li c i n g r i s e u s i n t e t r a c e n o m y c i n s p o r ep i g m e n t s p o r ep i g m e n t p r o b a b l ys p o r ep i g m e n t o x y t e t r a c y c li n e d a u n o r u b i c i n d a u n o r u b i c i n n o g a l a m y c i n m it h r a m y ci n u r d a m y c i n j a d o m y c i n 7 6 9 4 8 5 4 2 o 4 b 0 0 2 9 3 5 弱 必 m 踮 舯 舛 他 殿 碉 鼹 蹦 跚 喊 丛 9 3 6 6 7 o 5 5 影 尉 5 4 8 9 刁 3 舡 ；呈 n 眩 盯 鹏 烙 臌 拟 b n 及 黔 髓 比 纵 哪 霎 吣 细 栅 眺 m 眦 如 咖 暑| 咖 哪 ：曼 前言 s a c c h a r o p o y s p o r a h i r s u t a k i b d e l o s p o r a n g i u m a r i d u m u n k n o w n u n k n o w n u n k n o w n m o nz 1 1 5 1 1 h i rm 9 8 2 5 8 a r dl 2 4 5 1 8 k e y ：兰t m i n i m a l p k s 0 l f a ( 甲 k e t o 删u c l a s c o t h e r c h ， o r e d p d d a u s 加 卵胁 埘 l 以 堋 h ， a m c y c l a s e s a r o m a t a s c s 图4 部分放线菌来源的细菌型p k s 基因簇结构n 2 1 f i g 4o r g a n i s a t i o no fg e n ec l u s t e r sf o rt y p ei ip k s si na c t i n o m y c e t e s 注：图中基因名与表l 中的基因名相对应。 肌 觚 盼 胁 删 砌 前言 1 4 真菌迭代i 型p k s 真菌也是聚酮的主要来源之一，在真菌生长、产孢以及其他生理活动中，产 生了形形色色的具有不同化学结构和功能的聚酮，如黄曲霉素( a f l a t o x i n ) 、伏 马毒素( f u m o n i s i n ) ，6 一甲基水杨酸( 6 一m e t h y l s a l i c y l i ca c i d ，m s a ) 、四羟基 萘( t e t r a h y d r o x y n a p h t h a l e n e ，t 删) 等( 图5 ) n 羽，除色素和抗生素外，还有 部分是对动物有害的真菌毒素。 蝴叫 d o 、r o h 佣 伽 苔色酸，o r s e l l i n i ca c i d ( 2 )四羟基萘，删( 3 ) p 甲基水杨酸，6 m s a ( 4 ) t - 毒素，t - t o x i n ( 5 ) 图5 部分真菌来源的聚酮结构 f i g 5s t r u c t u r e so f8 0 l ep o l y k e t i d e si nf u n g i 真菌p k s 也是一个多功能蛋白，整体结构与i 型f a s 相似，故将其划入i 型 p k s n 副，其功能域的组成类似于细菌i 型p k s ( 图6 ) ，包括k s 、a t 、a c p 、k r 、 阴、e r 等，但这些功能域在聚酮链的装配过程中大多是重复进行催化，因此将 它单独作为一类，称为迭代i 型聚酮合酶( i t e r a t i v et y p eip k s ) 。除了与细 菌i 型p k s 相似的功能域，真菌p k s 的还具有一些独特的功能域，例如c - m e t 。 9 前言 细菌聚酮中的甲基支链一般由合成单元携带，如红霉素中的甲基丙二酰c o a ，而 真菌一般使用乙酰基作为合成单位，聚酮链中的c 一甲基由c - m e t 域从s 一甲硫氨 酸转移到聚酮碳链上；另外，在某些真菌聚酮合酶中缺少t e 功能域，合成的聚 酮链可能通过环化反应从酶上脱离。 真菌聚酮按分子中b 酮基的还原程度分为非还原型聚酮( 图5 中1 、2 、3 ) 、 部分还原型聚酮( 图5 中4 ) 和高度还原型聚酮( 图5 中5 、6 ) ，相应的p k s 也 分为三类非还原型p k s ( n r p k s ) 、部分还原型p k s ( p r p k s ) 和高度还原型 p k s ( h r p k s ) 。n r p k s 不具有k r 、d h 、e r ，产物多为酚类化合物；p r p k s 一般 具有k r 、d h ，产物中的b 酮基将被转化成羟基或烯键；h r p k s 则含有k r 、d h 、 e r ，b 酮基最终转化成饱和烃链( 图6 ) 。各类酶均以循环作用的形式合成产物， 但从产物结构中发现，p r - p k s 和h r p k s 中，部分功能域并不参加每一轮延伸反 应，使得产物结构复杂化。例如t 一毒素p k s 中带有k s 、a t 、a c p 、k r 、d h 、e r 和t e ，但产物中出现不同的b 酮基转化形式，类似的情况在许多真菌聚酮中出 现。在细菌i 型p k s 中，可由不同模块控制b 酮基的转化，但真菌聚酮p k s 只有 一套功能域，显然只能由它完成聚酮的合成，是何种调控机制决定k r 、d h 、e r 参与反应与否，目前还是未知的，这些机制如何运作、何时运作，还需要进行更 多的研究数据来解释n 9 i 。 k s a t 洲c l t 翰岫妒 j 山h “p k s n 蛔娜ld k g 把r r l n k s c k l 量t 。| t l 叩粗bw k 3 1 图6 部分真菌i 型聚酮合酶结构呦1 f i g 6o r g a n i s a t i o no fs o m ei t e r a t i v et y p eip k s si nf u n g i 真菌聚酮的链长可能是受其他蛋白调控的，而不由p k s 自身决定，而这些调 控蛋白的编码基因，一般位于位于同一基因簇内的p k s 编码基因的上、下游，。 1 0 前言 例如，通过异源表达研究l o v a s t a t i nl n k s 的功能时发现，当只有l n k s 表达时， 碳链延伸会提前终止，产生一些较短的碳链，并且在错误的位置进行环化，而加 入其下游的基因l o vc 共表达时，才能合成正确的产物n 钔。 虽然真菌p k s 不像细菌i 型p k s ，使用多套功能域合成一个聚酮化合物，但 一些真菌聚酮的合成也涉及不同的p k s ，由不同的p k s 分别合成结构中的不同部 分，然后再将各部分组装起来，并且，这些p k s 的编码基因也位于同一基因簇中， 受同一调控因子调控表达，例如l o v a s t a t i n 、c o m p a c t i n 1 和z e a r a l e n o n e 啤1 的 合成。l o v a s t a t i n 是一种有效的降胆固醇药物，这种真菌次生代谢产物及其衍 生物是胆固醇生物合成限速酶h m g _ c o a 还原酶的竞争性抑制剂。利用异源表 达和基因敲除等方法通过对基因簇中单个基因的研究发现，1 0 r b 、l o v f 分别编 码聚酮合酶l n k s 和l d k s ，l n k s 含有k s 、a t 、d h 、a t 、k r 和a c p 六个功能域， 而l d k s 还含有e r 功能域( 图7 ) 。在合成过程中，l n k s 和l d k s 分别催化合成 l o v a s t a t i n 的1 8 - c 的二氢莫那可林l ( d i h y d r o m o n a c o l i nl ) 和另一条4 一c 链； l o v c 的翻译产物则与l n k s 催化碳链正常延伸和环化有关，而l o r d 则编码转酯 酶