（化学工程专业论文）微波辅助浸取枳椇总黄酮的研究.pdf

摘要 摘要 本文分别采用常压微波辅助、正交实验加压微波辅助和响应面法加压微 波辅助浸取枳棋总黄酮的工艺过程的研究。结果表明，三种方法的工艺优化 条件分别为：微波功率7 0 0 w 、辐射时间5 0 s ( 3 次) 、乙醇水溶液浓度5 0 、固 液比1 ：1 0 ；微波功率7 0 0 w 、压强1 3 1 7 3 3 k p a 、乙醇水溶液浓度5 0 、固液 比1 ：1 0 ；微波功率7 0 0 w 、乙醇水溶液浓度5 1 2 、浸取压强1 3 1 7 3 3 k p a 、液 固比1 0 4 5 。三种优化工艺条件获得的总黄酮提取率分别为7 0 4 6 、9 7 2 8 和 9 8 7 5 。采用响应面法和d e s i g n - e x p e r t 软件处理实验数据，得到了总黄酮提 取率的三元二次方程数学模型为：y _ 4 8 4 0 9 + 1 3 4 6 x l + 6 0 7 x 2 + 4 3 0 x 3 + 2 3 3 x1 0 - 3 x l x 2 + 0 0 1 5 x l x 3 - 2 9 4 x1 0 4 x 2 x 3 - - 0 7 0 x 1 2 - - 0 0 2 3 x 2 2 0 0 4 3 x 3 2 ，经 实验验证，该模型值与实验值十分相符，可预测不同条件下的总黄酮提取率。 自行设计和制造的聚四氟乙烯加压微波辅助浸取装置具有结构简单、操作方 便、节约能源和显著提高总黄酮提取率等优点，适合于实验室使用，并可放 大用于工业生产。 关键词：浸取，微波，枳棋，总黄酮，响应面法 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et e c h n i c a lp r o c e s s e so fe x t r a c t i o no ft o t a li s o f l a v o n e sf r o mh o v e n i ad u l c i s t h u m bb ym i c r o w a v e - a s s i s t e dm e t h o du n d e rn o m a lp r e s s u r e 、析t hs i n g l ef a c t o ra n d o r t h o g a n o le x p e r i m e n ta n du n d e rp r e s s u r ew i t ho r t h o g a n o le x p e r i m e n ta n dr e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g yw e r ec a r r i e do u tr e s p e c t i v e l yi nt h i sw o r k t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo p t i m a lt e c h n i c a lc o n d i t i o n so ft h et h r e ep r o c e s s e sw e r e ：m i c r o w a v ep o w e ro f 7 0 0 w ，r a d i a t i o nt i m eo f5 0s ( t h r e et i m e s ) ，a l c o h o lc o n c e n t r a t i o no f5 0 ， s o l i d - l i q u i dr a t i oo f1 ：1 0 ；m i c r o w a v ep o w e ro f7 0 0 w ，p r e s s u r eo f1 3 1 7 3 k p a , a l c o h o lc o n c e n t r a t i o no f5 0 ，s o l i d - l i q u i dr a t i oo f1 ：10 ；m i c r o w a v ep o w e ro f 7 0 0 w ，a l c o h o lc o n c e n t r a t i o no f51 2 p r e s s u r eo f13 2 6 7 k p aa n dl i q u i d s o l i dr a t i o o flo 4 5 r e s p e c t i v e l y t h em a x i m u me x t r a c t i o nr a t e so ft o t a li s o f l a v o n e so b t a i n e d u n d e rt h eo p t i m a lt e c h n i c a lc o n d i t i o n so ft h et h r e ef a c t o rg r o u p sw e r e7 0 4 6 、 9 7 2 8 a n d9 8 7 5 r e s p e c t i v e l y t h er e s p o n s es u r f a c em e t h o da n dd e s i g n - e x p e r t s o f t w a r ew e r eu s e dt ot r e a te x p e r i m e n t a ld a t aa n dt h em a t h e m a t i c a lm o d e lo ft e r n a r y q u a d r a t i ce q u a t i o nf o re x t r a c t i o nr a t eo f t o t a li s o f l a v o n e sw a se s t a b l i s h e da s ：y = 一4 8 4 0 9 + 1 3 4 6 x l + 6 0 7 x 2 + 4 3 0 x 3 + 2 3 3 x1 0 。x l x 2 + 0 0 1 5 x l x 3 - 2 9 4 x10 4 x 2 x 3 - 0 7 0 x 1 2 - 0 0 2 3 x 2 2 0 0 4 3 x 3 2 t h em o d e lw a sv e r i f i e dt oh a v ea g o o da g r e e m e n tw i t ht h et h r e et i m e so fr e p e a t e de x p e r i m e n t sa n dc a nb eu s e dt o p r e d i c tt h ee x t r a c t i o nr a t e su n d e r d i f f e r e n tt e c h n i c a lc o n d i t i o n s t h es e l f - d e s i g n e da n d m a d ep r e s s u r i z e dm i c r o w a v e - a s s i s t e d l e a c h i n gd e v i c e ，w h i c hw e r em a d eo f p o l y t e t r a f l u o r o e t h y l e n e ( t e f l o n ) ，p o s s e s s e sm a n ya d v a n t a g e s ， s u c ha s s i m p l e c o n s t r u c t u r e ，c o n v e n i e n to p e r a t i o n ，e c o n o m i c a le n e r g y ，h i g h e rl e a c h i n gr a t eo f t o t a li s o f l a v o n e s ，a n ds oo i l t h ed e v i c ei ss u i t a b l et oe x p e r i m e n t a lu s ea n dc a na l s o b ea m p l i f i e df o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n k e y w o r d s ：l e a c h i n g ，m i c r o w a v e - a s s i s t e d th o v e n i ad u l c i st h u m b ，t o t a li s o f l a v o n e s ， r e s p o n s es u r f a c em e t h o d i i 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌文学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：施磊氰 签字日期：) 。f 。 年1 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌史学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ：榴磊矛、 签字日期：2 。，d 年 ，月7 日 新签名c 翻：诱私复 签字日期：2 ，1 0 年，月夕e l 第1 章引言 第1 章引言 近年来，植物有效成份以其天然低毒的特点倍受青睐， 在全世界范围内兴 起了用天然草本植物来预防和治疗各种疾病以及保健、美容等的热潮。我国拥 有丰富的中草药和天然植物资源， 其中黄酮类化合物在植物中分布较广，含有 黄酮类化合物的植物很多，如枳棋、银杏叶、茶叶、葛根、大豆、山楂等。黄 酮类化合物是植物中主要活性成分之一，研究表明，它们大多具有多种生物活 性和药理功制，这些作用使其在医药领域，及食品、化妆品等工业中应用广泛。 随之，黄酮类化合物的提取及分离纯化工艺的研究就成为这一领域的一大研究 热点。 枳棋子，又名拐枣，为鼠李科拐枣属植物。药用部分为带有肉质果柄的果 实或种子，成熟时红褐色，光滑无毛，甜香可口。果实圆球形，内含三粒红褐 色种子。它既是名果之一，也是一种稀罕的药用食用果品。该植物始载于唐 本草果部：李时珍称它为金果树。并在本草纲目第3 1 卷中有记载。此外 雷公炮炙论救荒本草等多部医药著作中均有收载。该物属养阴、生津、 润燥、止渴、凉血类药物，中医认为其有清热利尿，解酒毒之功效，主治酒毒、 烦热、口渴、呕吐、二便不利等型m j 。 枳棋属植物有3 种， 另有2 变种。北枳棋( 原变种) ，俅江枳棋( 变种) ，毛 果枳棋( 原变种) ，光叶毛果枳棂( 变种) 。本属植物生于沟边、路边或山谷中，分 布于中国、印度、朝鲜、日本。在我国主产于陕西秦巴山区，四川、湖北、浙 江、江苏、安徽、福建、江西等地。在世界各国也常有栽培1 3 j 。 北枳棋的果实、种子可以清热利尿、止渴除烦、解洒毒，用于热病烦渴、 呃逆、呕吐、小便不利、酒精中毒；树皮可活血、疏筋解毒， 用于腓肠肌痉 挛，食积，铁棒锤中毒；果梗可健胃、补血，用于滋养补血；叶可用于死 胎不出；汁液用于腋下狐臭。枳棋的种子可止渴除烦、解洒毒、n - 便， 用 于醉酒、烦热、口渴、呕吐、二便不利；果序轴可治疗风湿。毛果枳棋的种子 可止渴除烦、解酒毒、利二便1 4 j 。 第1 章引言 近年来，国内外学者对枳棋子药理作用及其机制进行了大量的研究，有文献 报道称，枳棂子对急性洒精中毒有预防作用。研究发现，黄酮类化合物是枳 棋子的主要化学成分之一。现代医学表明：黄酮类物质具有降低心肌耗氧量， 使冠状动脉和脑血管中血流量增加，抗心律失常，软化血管，降低血糖、血脂， 抗氧化，消除机体内自由基，抗衰老和增强机体免疫力的功能【5 】。 随着枳棋药理作用的研究深入及应用的推广，枳棋中总黄酮的提取及分离 纯化工艺的研究也越来越受到人们的重视，如何提取和分离得到较高质量的枳 棋黄酮类化合物是当前研究的一大课题。近年来，枳棋黄酮类化合物提取及分 离方法研究较多，但很多还存在缺陷，如许多传统方法所需能耗大，时间长， 效率低，这些都造成了资源的浪费和环境的污染，同时经济效益也较低。而一 些新技术，如微波浸取技术，与传统技术相比，因其具有进取效率高、选择性 强、节省时间、节省溶剂、节能、污染小等众多优点，目前，已应用到包括黄 酮等几大类天然化合物的提取，引起了科技工作者们的广泛关注。此外，大孔 树脂吸附法是近些年发展起来的较新的分离纯化技术，因其具有吸附容量大、 洗脱剂无毒( 常用乙醇) 、不受无机物影响、效率高、再生方便、工艺简单、生产 成本低等明显优点，在黄酮类化合物分离提纯中也应用颇多。针对当前的现状， 开发新技术、扩大先进工艺研究与应用，探索出成本低、效率高、又能分离得 到较高质量的枳棋有效药用成份的新工艺，对于充分开发利用枳棋资源具有重 大意义，也对我国中草药和天然植物资源的综合开发利用具有一定的借鉴意义。 1 1 黄酮类化合物 1 1 1 黄酮类化合物的结构分类 黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类化合物，植物界汇总的黄酮类 化合物目前达5 0 0 0 余种销】。由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄 酮。黄酮类化合物在植物体内大部分与糖成甙，一部分以甙元形式存在。目前 黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的芳香环( a 与b 环) 通过中间三碳链相互联结 第1 章引言 而成的一系列c 6 一c 3 一c 6 化合物，主要是指以2 一苯基色原酮为母核的化合物， 其基本结构如下： 7 6 8 1 2 3 2 苯基色原酮( 黄酮类) 4 7 6 54 c 6 - c 3 c 6 图l - l 黄酮类化合物结构图 一般黄酮类化合物主要是以六元c 环的氧化状况和b 环所连接的位置不同为 依据进行分类，可以分为黄酮( f l a v o n e ) 及黄酮醇( f l a v o n 0 1 ) 类，如芦丁、槲皮素； 二氢黄酮( f l a v o n o n e ) 及二氢黄酮醇( f l a v a n o n 0 1 ) 类，如陈皮苷；异黄酮( i s o f l a v o n e ) 及异黄酮醇( i s o f l a v o n 0 1 ) 类，如葛根素；黄烷醇( f l a v a n 0 1 ) 类，如儿茶素：花色素 ( a n t h o c y a n i d i n s ) 类，如飞燕草素；双黄酮( b i f l a v o n o i d s ) 类，如银杏素；查耳酮 ( e h a l e o n e s ) 类，如红花苷；其他黄酮类，如异芒果素【8 1 等；以及一系列的黄酮衍 生物。 1 1 2 黄酮类化合物的理化性质及显色反应1 9 1 ( 1 ) 性状 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮甙类) 为无定形粉末。分子中常 带有的吡喃酮环或羰基，构成了生色团的基本结构，根据羰基的数目、结构的 位置与交叉共轭体系，构成了黄酮类化合物的呈色，一般黄酮、黄酮醇及其甙 类多显灰黄到黄色。 ( 2 ) 溶解性 黄酮类化合物的溶解度，因结构及存在状态( 甙及甙元，单糖甙，双糖甙 第1 章引言 或三糖甙) 不同而有很大差异。一般游离甙元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、 乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。黄酮甙一般易溶于水、甲 醇、乙醇等强极性溶剂中，糖链越长，则水溶度越大。 ( 3 ) 酸性与碱性 黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡 啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中；y 吡喃环上的1 氧原子，因有未共用电子对，故 表现微弱的碱性，可与强无机酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水 后即可分解。 ( 4 ) 显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及y 一吡喃酮环有关。结构中 带有3 o h 、5 - o h 或邻位羟基者，均能与金属盐类试剂，如镁盐、铝盐、锶盐和 铁盐等形成颜色较深的络合物，黄酮类化合物一般对盐酸一镁粉或锌粉、三氧 化铝、氢氧化钠水溶液及浓硫酸等各呈红一紫红、黄、深黄、橙、紫等颜色反 应。 1 1 3 黄酮类化合物的生物活性、药理作用及应用 天然黄酮类化合物多是具有c 6 c 3 c 6 基本结构的衍生物，常见取代基有 o h ，o c h 3 以及萜类侧链等。但黄酮类化合物因结构不同，表现出来的生物活 性差异很大，研究表明：黄酮类化合物分子中心的a 、p 不饱和吡喃酮是其具有 各种生物活性的关键，c 7 位羟基糖苷化和c 2 、c 3 位双键氢化则会引起黄酮类化 合物的生物活性降低，而a 、b 、c 三环的各种取代基则决定了其特定的药理活 性【，从而决定了其不同生物活性和药理作用。 研究已表明黄酮类化合物具有抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎抑菌、 抗病毒、抗氧化、抗突变、抗过敏、抗辐射、雌激素样作用、以及增强免疫能 力等广谱的生理活性。能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病等，如对 治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果，对防治心肌梗塞、心肌缺血，心 4 第1 章引言 律失常等也起重要作用【1 9 1 0 1 1 1 。 由于黄酮类化合物的这些生物活性，促使其在医药、食品、化妆品等工业 中有广泛的应用。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然 低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目此外， 因其毒性较低及显著的生物活性，还可应用到保健品食品方面，及用作食品、 化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等【1 2 1 3 1 。 1 2 枳棋及其黄酮类化合物 1 2 1 概述 在我国枳棋分布广、资源丰富。每1 0 0 克枳棋子含水分8 3 2 克，蛋白质0 9 克，脂肪0 5 克，纤维5 9 克，碳水化合物9 2 克，灰分0 3 克，硫胺素o 0 2 毫克，抗坏血酸6 0 毫克，钾3 2 5 毫克，钠0 4 毫克，钙1 6 毫克，铁0 2 毫 克，锌0 1 8 毫克，磷2 7 毫克。此外，还含有大量的苹果酸、草酸、乙酸等。 其中，葡萄糖、钙的含量较其他水果要高。枳犋作为传统中药材应用历史悠久， 己被卫生部药品标准收载。国外的研究工作者对枳棋的药理作用也进行了一些 研究。结果表明：枳棂具有保肝、抗肿瘤等药理活性，值得瞩目。研究工作 显示：枳棋能够解酒毒、保肝、抗肿瘤、抗乙肝病毒，对网氧嘧啶引起的高 血糖也有拮抗作用。 中药产品国际市场很大，但我国现有产品的市场占有率又很低( 约l ) 。 究其原因，老产品技术含量低，不易为外国人接受；剂型不能完全顺应外国人 的习惯；其功能也不全适应国外多数消费者的需要等。研制开发新产品在试验 设计时就应考虑到国际市场的需要，有针对性地开展研究工作。如品种可选择 易于发挥中医药优势，针对当前国际上防治疾病的热点，重点开发具有特色的 常用药。 大部分中药的化学成分不完全明确，其中已知的化学成分往往不能代表中 药的全部疗效。中药和西药不同，一般而言，绝大多数西药是化学成分单一的 第1 章引言 化合物或者是化学成分明确的混合物，这些化学成分的性质和数量决定了药品 的疗效，因此，定性和定量的控制这些化学成分，即可以全面地控制药品的内 在质量【1 4 1 。故中药产品要进入国际市场，必需分离和提取中草药中有效成分， 以提取物的形式占据市场。 虽然我国枳棋资源丰富，但对枳棋中有效成分提取的研究却相对较少，中 国的中药界正提出中药国际化的方针，作为中国传统中药材的一种，我们对枳 棋子化学成分和药理作用及其提取工艺有必要作进一步研究。 1 2 - 2 枳棋子的药理作用p j 1 2 2 1 对酒精中毒的作用【7 1 3 1 枳棋子具有解酒作用主要原因是能够缩短小鼠醒酒时间，加快乙醇代谢，对 血中谷胱甘肽过氧化物酶( g s h 2 p x ) 活力的影响，对肝脏过氧化脂质含量的影 响，抑制乙醇诱导的肌松作用，枳棋子中分得的二氢黄酮对乙醇诱导的肌松作 用有抑制作用，对乙醇所致肝损伤的预防作用，可制成治疗和预防酒精中毒的 食品，对脂多糖( l p s ) 诱发长期饲喂乙醇大鼠肝损害具保护作用 1 2 2 2 保肝活性【1 乒1 7 】 枳棋子的保肝活性主要表现在对c c l 4 和d 2 氨基半乳糖6 脂多糖诱导的实 验性肝损伤的肝保护作用；对c c l 4 诱导的体外培养肝细胞损伤具保护作用；对 d 2 g a l n 诱导的体外培养肝细胞损伤具保护作用；原代培养大鼠肝细胞有促生长 作用 1 2 2 3 抗致突变【1 8 - 2 0 l 北枳棋果实和种子经提取精制得到的物质在艾姆氏试验中有极好的抗致突 变活性，可用于防癌。 1 2 2 4 抗肿瘤 体内实验表明：枳棋子对小鼠腹水型肉瘤抑制率达7 1 1 ：体外实验表明： 枳棋对癌细胞生长有抑制作用。临床用其治疗脑垂体肿瘤。 1 2 2 5 抑制组胺释放 在4 8 6 8 0 和钙离子载体a 2 2 3 1 8 7 诱导的大鼠腹腔肥大细胞释放组胺试验中， 自枳果实和种子中分得的枳棋皂苷a 1 、a 2 和b l ，b 2 对组胺释放呈现明显的 6 第1 章引言 抑制活性。其中a 2 和b l 对4 8 6 8 0 诱导的组胺释放抑制强度稍大于a 1 、b 2 ； a 2 、b 2 对a 2 2 3 1 8 7 诱导的组胺释放抑制活性较好。 1 2 2 6 对循环系统的作用【1 9 - 2 0 1 1 2 2 7 降压作用 小鼠静脉注射3 - - - ，1 0 m g k g 枳棋皂苷时，均有短暂的降压作用。 1 2 2 8 选择性阻滞 p d c 0 1 6 - - 4 0 m m o l l 双氢杨梅黄素能显著抑制去甲肾上腺素、k c l 、c a c l 2 所致兔胸主动脉条的收缩，量效曲线右移，最大反应降低，对高k + 所致兔胸主 动脉条收缩的抑制作用明显大于去甲肾上腺素所致兔胸主动脉条收缩的抑制作 用。双氢杨梅黄素对去甲肾上腺素引起的依赖内c a 2 + 释放的收缩有明显抑制作 用，而对去甲肾上腺素依赖细胞外c a 2 + 性收缩仅在较高浓度时才显示抑制作用， 提示双氧杨梅黄素可能对电压依赖性钙通道( p d c ) 有选择性阻滞作用。 除此之外，枳棋子对消化道也有一定的影响，还有镇静、抗痉、镇痛利尿， 甜味抑制作用【2 1 之5 1 1 3 黄酮类化合物的提取工艺 随着黄酮类化合物多样的生物活性和药理功能的研究深入，及其在医药、 食品、化妆品等工业广泛的应用前景，黄酮类化合物的提取与分离纯化技术已 成为当前这一领域研究的一大热点。 目前，黄酮类化合物的提取工艺主要有水提法、有机溶剂提取法、碱液法、酶 解法、超声波法、超临界萃取法、微波辅助萃取法，以下将逐一介绍，并对本 实验将采用的新技术微波辅助萃取法进行重点介绍。 1 3 1 水提法 由于黄酮苷类物质易溶于水，所以对黄酮苷类物质含量较高的原料，可以采 取水提取法，浸提、煮提均可，提取次数一般为2 - - 3 次。阮俊等采用正交试验 法考察了野菊花总黄酮提取方法，分别用乙醇和水提取，测定结果为：用乙醇 提取所得黄酮提取率为3 3 7 ，用水提取所得黄酮提取率为3 2 9 ，结果显示 第1 章引言 乙醇提取略优于水提取。但考虑到生产实际中野菊花在提取过程中吸收2 3 倍 的溶剂，造成生产成本显著提高，因而选用价廉的水作为提取溶剂。此工艺成 本低、安全，适合工业化大生产；但由于水的极性大，易把蛋白质、糖类、无 机盐等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液存放时，易腐败变质，为后续的 分离带来困难。现在，已经很少单一使用本法【2 6 】。 1 3 2 有机溶剂提取 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂萃取，可达到提 取分离的目的。这是目前国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生产。 常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等，但由于甲醇、丙酮 等的毒性较大，因此一般采取乙醇为提取溶剂。本法主要用于提取脂溶性基团 占优势的黄酮类物质，对设备要求简单，产品得率高，但成本较高，杂质含量 也较高。常见的可以分为三种方法：冷浸法、温浸法、渗漉法、回流法。冷浸 法不需加热，但费时较长，效率低；渗漉法由于保持一定的浓度差，所以提取 效率较高，浸液杂质较少，但费时较长，溶剂用量大，操作麻烦；回流法效率 较冷浸法和渗漉法高，速度快，但含受热易破坏的原料不宜用此法。根据不同 原料特点采用不同方法。例如：元宝枫叶粉中提取黄酮类物质用的是冷浸法， 用7 0 乙醇提取，提取率和黄酮含量都很高，提取物较易浓缩和干燥【3 4 j ；陈皮 苷提取用乙醇渗漉法，使用5 0 或6 0 的乙醇，1 6 倍提取物时提取效果最佳【2 7 1 。 从水飞蓟中提取水蓟宾，用乙酸乙酯做溶剂，用索氏提取法连续回流抽提9 次 然后在甲醇中经多次重结晶可得水蓟宾纯品【2 8 1 。 1 3 3 碱液法 碱液法是因黄酮类化合物分子中多有酚羟基，因此可以用碱性水或碱性稀 醇溶液浸出，经酸化后得出黄酮类物质。主要用的碱性溶液是稀氢氧化钠和石 灰水( 氢氧化钙水溶液) 。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多不利于纯化。 石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀，有利于浸液纯化，但 是浸出效果不如氢氧化钠水溶液效果好，同时有些黄酮类化合物能与钙结合成 第1 章引言 不溶性物质，不被溶出。一般可以根据不同的原料使用不同的碱性溶液。例如 从菊花中提取黄酮类物质时，用p h 为1 0 的氢氧化钠溶液浸出效果较好【2 9 1 ；而 从槐米中提取芦丁，则应用碱性较强的饱和石灰水作溶剂，这样则有利于芦丁 成盐溶解【3 0 l 。 1 3 4 酶解法 对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料可以采用酶法提取。例 如山楂中，由于黄酮类物质部分被以纤维素为主的细胞壁所包围，并且这些细 胞间尚有果胶粘结，因此采用酶法要比一般方法( 醇提法) 的提取率要高。现将预 先干燥并粉碎的山楂用蒸馏水浸泡，恒温至4 5 后，加入以果胶酶和纤维素酶 为主的复合酶液，用l m o l l n a o h 调节p h 4 5 5 ，在4 5 c 恒温酶解1 5 - 2 5h ， 然后将酶解溶液回流、提纯。采用这种方法，使提取率比目前常用的方法提高 了2 3 。此提取原理是复合酶充分破坏了以纤维素为主的细胞壁结构及其 细胞问相连的果胶物质，将山楂中的果胶完全分解成小分子物质，使提取传质 阻力减小，使果肉中的黄酮类物质充分地释放出来【3 1 1 。 1 3 5 超声波法 超声技术提取是目前比较新的提取方法。近年来，超声技术已应用于提取 植物中的生物碱、苷类、生物活性物质等研究。本法是利用超声波产生的强烈 振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，加速药物有效成分进入溶剂， 从而提高提出率、原料的利用率，缩短提取时间，并且避免高温对提出成分的 影响【3 2 1 。纪松岗等用超声提取黄芪药材中的黄酮类成分，研究表明超声提取的 效率优于浸泡提取和索氏提取，且同这些方法比较，超声提取具有效率高、时 间短和操作简便的优点。 1 3 6 超临界萃取法 超临界萃取技术是9 0 年代国际最新的高科技项目，它多是以液态c 0 2 为溶 剂进行提取的，通过控制温度和压力以及调节改性剂的种类和用量，可以实现 选择性萃取和分离纯化有效成分的目的；它既有与气体相当的高渗透能力和低 9 第1 章引言 的粘度，又具有与液体相近的密度和对物质优良的溶解能力，是一种不同与传 统黄酮类物质提取的新工艺。与水蒸气蒸馏和溶剂提取法相比，超临界流体提 取具有提取率高、无溶剂残留、产品无污染、活性成分和热不稳定成分不易被 分解破坏等优点。但是由于超临界提取所需设备价格昂贵生产成本高，且提取 物中烷基酚含量较高，目前，仍不能进行规模化生产。本法在生产银杏黄酮内 脂的技术上取得了较大的突破【3 3 。4 】。 1 3 7 微波辅助浸取法 1 3 7 1 微波辅助浸取技术的国内外发展状况 微波辅助浸取( m i c r o w a v e a s s i s t e d e x t r a c t i o n ，m a e ) 技术是在传统有机溶剂萃 取技术的基础上发展起来的一项新型萃取技术。它始于匈牙利学者g a u z l e r k 在 1 9 8 6 年报导了应用微波能可以加速提取食品中的某些有机成分，为有机分析特 别是环境有机分析试样预处理开辟了一条新路子。不久，g a u z l e r k 3 5 1 又将微波 浸取技术应用于提取植物细胞中的天然产物。p a r e 3 6 】将此技术细化，完善，申请 了专利。现已经有了作为分析用、样品前处理( 微波浸取) 的商业化设备，世界两 大微波设备公司，美国的c e m 公司和意大利的m i l e s t o n e 公司均生产适用于消 解、浸取和有机合成的系列微波产品。2 0 世纪9 0 年代初，加拿大环境保护署和 c w t t r a ni n t e r n a t i o n a l 公司合作开发了微波萃取系统m a p ，并于1 9 9 2 年开始 陆续取得了美国、墨西哥、日本、西欧和韩国的专利许可，该系统现己广泛应 用于香料、调味品、天然色素、中草药和化妆品等领域。并在中国也得到了知 识产权的保护，他们还与中国环境科学院和南开大学合作开发该技术。到1 9 9 5 年，国外已授权两家中国公司发展工业规模的微波浸取技术，并授权给另外3 家公司开发微波分离技术在食品分析领域、食品科学与工程等方面的应用【3 7 。9 1 。 目前，此项技术的应用范围己从最初的环境分析样品制备迅速扩展到食品、化 工和农业、天然产物等领域 4 0 - 8 6 1 。 1 3 7 2 原理与技术特点 微波辅助浸取技术( m a e ) 是微波能与传统有机溶剂浸取相结合的一项新型 l o 第1 章引言 萃取技术。微波是波长介于l m m - - l m ( 频率在3 0 0 m h z , - - - - 3 0 0 g h z ) 的特殊的电磁 波。微波在传输过程中遇到不同的物料，会根据物料性质不同而产生反射、穿 透、吸收现象，极性分子接受微波辐射能量后，通过分子偶极以每秒数十亿次 的高速旋转产生热效应。在m a e 过程中，一方面微波辐射过程是高频电磁波穿 透萃取介质，到达物料内部的维管束和腺胞系统。由于吸收微波能，细胞内部 温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁的膨胀承受能力，导致细胞破裂， 胞内有效成份自由流出，在较低的温度条件下被萃取介质捕获并溶解。通过进 一步过滤和分离，便获得萃取物料。另一方面，微波所产生的电磁场加速了被 浸取组分趋向浸取溶剂界面的扩散速率，从而使浸取速率提高数倍，同时还降 低了浸取温度，最大限度地保证浸取的质量。在此过程中是整个物料同时被加 热，即“体加热”过程，因此克服了传统传导加热时温度上升慢的缺点，保证了能 量的快速传导和充分利用，微波加热过程实质上是介质分子获得微波能并转化 为热能的过程【8 7 9 3 1 。 与其它的提取方法相比较，微波浸取技术具有以下特点：( 1 ) 较高的选择性： 微波浸取能对浸取体系中的不同组分进行选择性加热，可以使目标组分直接从 基体中分离：( 2 ) 快速高效：微波加热利用分子极化或离子导电效应直接对物质 进行加热，因此热效率高，升温快速均匀，大大缩短了浸取时间，提高了浸取 效率：( 3 ) 质量稳定：可以在较低的温度条件下完成浸取操作，有效地保护药品、 食品以及其他化工物料中的有用成分：( 4 ) 耗能低：溶剂用量少( 可较常规方法少 5 0 - - 9 0 ) ，低耗能，安全无污染，符合绿色化学与环境保护要求；( 5 ) 可以提 高收率及提取物纯度。 1 3 7 3 影响因素 在天然植物有效成分的微波萃取中，影响萃取效果的主要因素有微波功率、 浸取剂量、物料含水量、浸取时间、浸取温度及溶剂p h 值等例。 微波功率 功率的选择应以最有效地萃取出目标成分为原则，般选用的微波功率在 第1 章引言 2 0 0 - - - 1 0 0 0 w ，频率在2 0 0 0 - 3 0 0 0 0 0 hz ，微波辐照时间不可过长。微波功率和 辐射时问对提取效率具有明显的影响。功率越高，提取的效率越高。但如果超 过一定限度，则会使提取体系压力升高到打开容器安全阀的程度，溶液溅出， 导致误差。 浸取剂量 浸取溶剂的选择对浸取结果的影响至关重要。微波浸取的选择性主要取决 于目标物质和溶剂性质的相似性，所选溶剂对被提取物具有较强的溶解能力， 所以必须根据被提取物的性质选择极性或非极性溶剂。微波浸取要求溶剂必须 有一定的极性才能吸收微波进行内部加热，通常的做法是在非极性溶剂中加入 极性溶剂。一般来说，在微波辅助浸取应用中，有机溶剂用于浸取有机化合物 或水和含盐的水的混合物，酸或碱用于除去不同样品中的无机元素和有机金属。 在准备样品时经常加一些水以便这些样品能够更有效地吸收微波照射，并使浸 取物更快地分离。在微波辅助浸取中，水也作为一种浸取溶剂，用于滤去溶予 水的有机化合物。物料中的含水量对微波能的吸收关系很大。若物料不含水分， 选用部分吸收微波能的浸取介质，由此介质浸渍物料，置于微波场进行辐射的 同时发生提取作用。当然也可采取物料再湿的方法，使其具有足够的水分，便 于有效地吸收所需要的微波能。此外，物料含水量的多少对于萃取时间也有很 大的影响。 一般浸取剂和物料之比( l kg ) 在1 ：1 和2 0 ：1 的范围内选择。固液比是 提取过程中的一个重要因素，主要表现在影响固相和液相之间的浓度差，即传 质推动力，固液比的提高，必然会在较大程度上提高传质推动力，但同时也提 高了生产成本和后续处理的难度，所以固液比不宜过高 9 0 l 。 萃取时间和温度 m a e 连续辐照时间与试样重量、溶剂体积和加热功率有关，通常在1 0 一 1 0 0 s ，对于不同的物质，最佳萃取时间不同。连续辐照时间也不可太长，否则容 易引起溶剂的温度太高，造成不必要的浪费，还会带走目标产物，降低产率。 第1 章引言 萃取的温度应低于萃取溶剂的沸点，不同的物质最佳萃取温度不同。为了 减少高温的影响，可分次进行微波辐射，冷却至室温后再进行第2 次微波提取， 以便最高得率地提取出所需活性化合物。此外，物料在提取前最好经粉碎等预 处理，以增大溶剂与物料的接触面积，提高提取效率。 溶剂p h 值 孔臻、刘钟栋采用微波法从苹果渣中提取果胶时，保持其他条件不变，而 改变体系的p h 值。发现当p h 在1 9 以上时，随着p h 值的降低，果胶得率增加； 但是当体系p h 值小于1 7 时，由于酸度过高，使得果胶质水解得到的果胶进一 步脱脂裂解，造成果胶得率下斛叭】。 1 3 7 4 微波萃取技术在提取天然植物中黄酮类化合物的应用及发展前景 在国外，微波萃取法已经用于提取人参、生姜、大蒜、葡萄籽、芝麻、芦 荟等。加拿大政府积极推广微波萃取技术，并应用于食用油的提取和从土壤中 大规模除去污染物等环保项目。m a r i n a 等【5 3 1 利用微波萃取法从红豆杉中提取紫 杉醇等。与固相萃取相比效果相当，但显著降低提取时间和花费。在我国，微 波萃取已列为2 1 世纪中药制药现代化推广技术之一。很多科研工作者已经开始 用微波萃取技术对中药进行研究。国内有关微波萃取的报道也越来越多。目前， 已涉及到的天然有效成份包括黄酮类，以及苷类、多糖、萜类、挥发油、生物 碱、单宁、甾体和有机酸等 9 4 - 9 6 。 黄酮类成分在植物中分布较广，几乎大部分中草药中都含有，而且很多都 具有各自不同的药理功能。近年来，已有较多文献报道微波用于中草药中黄酮 类成分的提取。刘传斌等【明把微波破细胞与溶剂提取相结合的方法提取高山红 景天愈伤组织中红景天苷。与传统提取方法相比，前者具有时间短，不需加热， 提取液中杂质少等优点。段蕊等【5 8 】也用此方法提取银杏叶中黄酮。用微波处理 5 m i n 后，以7 0 乙醇回流提取1h ，得到提取物中黄酮类物质的量比未用微波 处理的高出1 8 8 ，纸层析表明在使用的微波温度下，黄酮类物质性质不发生 改变。郭振库等5 9 】对黄芩中黄芩苷微波提取作了研究，用正交设计优选了最佳 第1 章引言 工艺为7 0 微波功率( 最大功率8 5 0 w ) 下，以3 5 乙醇作溶剂，溶剂倍量3 0 ， 压力0 1 5 m p a ，恒压时间3 0s 即可获得好的得率，比超声法高近1 0o 6 0 。张梦军 等【5 6 】用均匀设计法考察了微波提取甘草黄酮，发现微波法提取率明显优于水提 法。 在传统中药生产中，微波萃取技术与传统煎煮法相比较，克服了药材细粉 易凝聚、易焦化的弊病；与水提、醇提比较明显节省了时间，提高了收率；与 超声波提取比，得率也更高。此外，因为它的一些优点，微波萃取对于一些稀 少、贵重的天然有效成份的提取及快速检测也是一项极具发展潜力的技术。正 因为它具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分得率高、不产生 噪音、适合于热不稳定成分且能在短时间内灭活植物中的水解酶等优点，而且 作为吸收微波最好介质的水也是中药提取的主要溶剂，因此微波萃取技术在中 药提取中有良好的应用前景，目前已成为国内外研究的热点，公开发表的论文 很多【9 8 】。随着我国中药现代化进程地加快和国际交流的进一步扩大，必将为m a e 技术的发展提供新的更好的契机。但目前微波萃取技术还主要限于实验室研究， 如何针对中药复方的特点设计微波萃取方案以及工业化微波萃取设备的开发等 有待研究的主要问题，还需要相关的科技工作者共同努力，大胆创新，深入研 究。 1 4 黄酮类化合物的分析测定方法【9 8 1 ( 1 ) 紫外分光光度法 主要利用黄酮分子结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系，对紫外光( ( 2 5 0 - a ：1 ) nm ) 有较强的特征吸收，且性质稳定，此法设备价廉，操作简便。 ( 2 ) 可见光分光光度法 许刚等1 7 0 采用n a n 0 2 、a i ( n 0 3 ) 3 、n a o h 溶液显色后，用7 2 1 分光光度计进行 分析，可得到以芦丁为标样的总黄酮含量。 ( 3 ) 薄层扫描法 1 4 第1 章引言 它是将样品液经薄层层析分离，然后在薄层扫描仪上的选定范围内扫描， 得薄层斑点的面积积分值，由回归方程计算出黄酮含量，该法不受其它成分干 扰，方法简便、准确。赵磊等【7 1j 采用双波长薄层扫描法测定木贼中三种黄酮苷 含量。结果回收率和线性关系良好。 1 5 枳犋总黄酮提取工艺的研究现状 在我国枳棂分布广、资源丰富。每1 0 0 克枳棋子含水分8 3 2 克，蛋白质0 9 克，脂肪0 5 克，纤维5 9 克，碳水化合物9 2 克，灰分0 3 克，硫胺素0 0 2 毫克，抗坏血酸6 0 毫克，钾3 2 5 毫克， 克，锌0 1 8 毫克，磷2 7 毫克。此外， 钠0 4 毫克，钙1 6 毫克，铁o 2 毫 还含有大量的苹果酸、草酸、乙酸等。 其中，葡萄糖、钙的含量较其他水果要高。枳棋作为传统中药材应用历史悠久， 已被卫生部药品标准收载。但目前枳楔仍属不常用中药材，市场上曾出现以其 假冒酸枣仁的情况。国外的研究工作者对枳棂的药理作用也进行了一些研究。 结果表明：枳棋具有保肝、抗肿瘤等药理活性，值得瞩目。研究工作显示：枳 棋能够解洒毒、保肝、抗肿瘤、抗乙肝病毒，对四氧嘧啶引起的高血糖也有拮 抗作用。 中药产品国际市场很大，但我国现有产品的市场占有率又很低( 约l ) 。 究其原因，老产品技术含量低，不易为外国人接受；剂型不能完全顺应外国人 的习惯；其功能也不全适应国外多数消费者的需要等。研制开发新产品在试验 设计时就应考虑到国际市场的需要，有针对性地开展研究工作。如品种可选择 易于发挥中医药优势针对当前国际上防治疾病的热点，重点开发具有特色的常 用药。 大部分中药的化学成分不完全明确，其中已知的化学成分往往不能代表中 药的全部疗效。中药和西药不同，一般而言，绝大多数西药是化学成分单一的 化合物或者是化学成分明确的混合物，这些化学成分的性质和数量决定了药品 的疗效，因此，定性和定量的控制这些化学成分，即可以全面地控制药品的内 在质量。故中药产品要进入国际市场，必需分离和提取中草药中有效成分，以 提取物的形式占据市场。 第1 章引言 虽然我国枳棋资源丰富，但对枳棋中有效成分提取的研究却相对较少，中 国的中药界正提出中药国际化的方针，做为中国传统中药材的一种，我们对枳 棋子的化学成分和开发利用有必要作进一步研究。 1 6 本论文的选题背景和主要研究内容 1 6 1 选题背景及研究意义 枳棋作为传统中药材应用历史悠久，已被卫生部药品标准收载。国外的研 究工作者对枳棋的药理作用进行了研究。结果表明：枳棋具有保肝、抗肿瘤等 药理活性，值得瞩目。国内学者的研究工作显示：枳棋能够解酒毒、保肝、抗 肿瘤、抗乙肝病毒，对四氧嘧啶引起的高血糖也有拮抗作用。提示对枳棋子化 学成分和药理作用有必要作进一步研究。但是目前对枳棋子的提取精制没有一 套完整成熟的工艺，现有的方法还存在不少问题。 从分析方法上看，分光光度计测定法具有操作方便、设备简单、成本低， 能直接测出枳棋子中总黄酮的含量等优点，但是也存在以下不足之处：在紫外 区有吸收的杂质对分析结果干扰大，有时会导致分析结果较大偏差，高效液相 色谱测定法结果比较准确，能准确定量甘草酸，但是操作较繁琐、成本较高。 从提取角度看，水作为提取剂的优点是便宜，对环境无害，缺点是提取率、 收率比较低，糖类、蛋白质等水溶性杂质溶出率高，造成过滤及除杂质等后处 理困难，提取时候需要高温，能耗比较高；使用乙醇提取的收率高，而且提取 过程提取出的杂质相对较少，减轻了后处理和精制的压力，乙醇提取的缺点是 溶剂