（动物学专业论文）不同ca2浓度对斑节对虾光感受器的影响.pdf

淅i 】1 j 弛人学坝卜，似沦i 、川c 矿+ 浓性刈j i i f 竹肘m f 光感蹙赫的彬响 中文摘要 复眼是斑节对虾的主要感光器官。外界不同的光照条件可以影响其光感受器 细胞的生理状态。另外，在无脊椎动物的光转导过程中，经研究发现，钙离子可 能起着重要的作用，l is m a n 1 3 b r o w n 已经提出钙离子是光适应时的胞内信使”“。 但关于甲壳动物光感觉的研究多集中干生理方面，在超微结构方面的研究不是很 多。本文通过改变外界的光照条件和c a ”浓度的方法，在电子显微镜下研究了斑 节对虾光( p e n a e u sm o n o d o nf a b r i c i u ) 感受器超徽结构的变化及细胞i g c a2 + 储存 器中c a “含量的变化。结果如下所述。 1 光适应对斑节对虾超微结构的影响 应用戊二醛、锇酸双固定的电镜实验方法研究了斑节对虾复眼的形态以及在 不同光照条件下斑节对虾光感受器超微结构的变化。结果发现：组成复b e i ) 9 , j , i 目b 表形为长方形，从远端到近端分别由角膜、二个角膜生成细胞、四个晶锥及八个 小网膜细胞构成。光适应时感杆束的微纤毛的平均直径膨大，排列零乱，感杆束 的平均直径减小：腰下储泡囊平均直径减小：小网膜的细胞质中胞饮泡和小囊泡 数量较多；多囊体的平均直径减小，数量较少：板膜体较少，色素颗粒多，分布 于细胞的各个层面。暗适应时，感杆束的微纤毛排列整齐，感杆束平均直径增大： 多囊体数量较多，个体小：色素颗粒主要分布于细胞的远端：板膜体较多。研究 结果表明：在不同的光适应状态下，斑节对虾的光感受器的超微结构发生了变化， 从而影响其生理功能。 2 外界不同钙离子浓度对斑节对虾光感受器超微结构的影晌 用透射电镜研究了暗适应时斑节对虾的光感受器超微结构与外界c a ”浓度的 关系。结果显示出与培育在生理溶液中的光感受器相比，细胞外c a 2 + 浓度升高， 使得感杆束的平均直径急剧缩小，其微纤毛排列凌乱：感杆束周围胞质增厚，胞 饮泡及小囊泡增加，膜下储泡囊极度减小。胞质中多囊体、线粒体等细胞器的数 量减小。色素颗粒及板膜体数量增加，同时细胞内的色素颗粒分布在小网膜细胞 的远端。细胞的结构表现为类似光适应状态。与之相反，细胞外c a ”浓度降低时 小眼的感杆束的微纤毛大部分排列整齐：感杆束、膜下储泡囊和多囊体的平均直 径增加；胞饮泡数量下降：色素颗粒分布在细胞的近端。结果表明：外界c a ”浓 度可以通过影响斑节对虾的光感受器超微结构而改变其生理状态。 两帅范人学蛳i ! # 位沦i ) 己 小j 叫c a l 。浓脞对斑节对女f 光感受器的蟛j n 3 外界不同钙离子浓度对斑节对虾光感受器细胞内所储存的钙离子的影响 应用草酸一焦锑酸盐结合的沉淀技术研究斑节对虾光感受器细胞在不同c a ” 浓度条件下胞内储存的c a 2 + 变化，其电镜观察表明：在高钙溶液培育后，细胞内 的多囊体、色素颗粒、板膜体中都存在大量的焦锑酸钙沉淀的黑色颗粒，线粒体 中未发现沉淀；在生理溶液培育后，线粒体中出现沉淀，而其他c a ”储存器中焦 锑酸钙沉淀的黑色颗粒大量减少。低钙溶液培育后焦锑酸钙沉淀的黑色颗粒情况 与生理溶液条件下相似。本实验的研究证实细胞内储存的c a ”受到胞外c a ”浓度的 影响。 关键词斑节对虾复眼超微结构c a ”储存器c a “ 1 塑业些叁主塑i ：兰竺堡塞 ! ：型竺! ：堕堡塑坐王盟! ! = 垄壁竺竖塑堂堕 e f f e c t so fc a iciu mc o n c e n t r a tio no nt h ep h o t o r e c e p t o r in t h ep e n a e u sm o n o d o nf a i b ri ci u a b s t r a c t t h ei n f i u e n c eo fl i g h ta d a p t a t i o n o r it h eu l t r a s t r u c t u r eo ft h e p h o t o r e c e d t o r inp e n a e u sm o n o d o nf a b r i c i u t h ef o r ma n dt h efir l es t r u c t ur eo fc o m p o u n de y e si np e n a e u sm o n o d o n f a b r i c i u w e r es t u d ie db ye ie c t r o nm i c r o s c o p y t h er e s u i ts h o wt h eo m m a t id a t h a tf o r mt h ec o m p o u f i de y e inp e n a e u sm o n o d o nf a b r1ci uw e rec o m p o s e do f c o r n e a f o u rc o r ec e iis ，e i g h tr e t in u ia rc e ii sa n ds o m ep ig m e n tc e ils d u r in gi ig h ta d a p t a t io nt h earr a n g e m e n to fm i c r o v ii iu si nt h er h a b d o mw a s indjs o r d e r a n dt h ed ia m e t e ro fr h a b d o mw a sr e d u c e d a tt h es a m e a d a p t a t io nt h ea r e ao ft h ep erir h a b d o m a 1v a c u oiew a sr e d u c e da n dt h e n u m b ero ft h em u f t i v e s ic u ia r b o d y w a sin c r e a s e db e s i d e st h a tt h e d is tr ib u t i o na n dt h ea m o u n to ft h ep i g m e n tg r a n u ie ，t h ela m e iia rb o d yw e r e in f iu e n c e db y i ig h ta d a p t a t io nd u ri n gt h ed a r ka d a p t a t i o nt h er e s u i t c e n tr a s t e do nt h a to fi ig h ta d a p t a tio nt h er e s uits h o w e dt h a tdif f e r e n t lig h ta d a p t a tio nin flu e n tt h eu lt r a s t r u c t u r eo ft h ep h o t o r e c e p t o r e f f e c t so fd i f f e r e n tc a i c iu mc o n c e n t r a t i o n o nc a ”i n c a ”一s e q u e s t e r in go r g a n e iie so fp h o t o r e c e p t o rc eiiinp e n a e u sm o n o d o n f a b r i c u b y t h ec o m bin e do x aia t e 一p y r o a n tim o n a t et e c h niq u e w eo b s e r v e dt h e s u b c e ii u iard is t ri b u t i o no fc a ic iu mi nt h e 口h o t o r e c e p t o rc e ii so fp e n a e u s m o n o d o nf a b r i c i u s b yc h a n g in gt h ee x t r a c e ii u ia rc a ic iu mc o n c e n t r a t io n t h er e s u i ts h o w e dt h a t i nv i t r o , i np r e s e n c eo f5 0 m m o i i t h eq u a n t i t y o fc a ic i i j ma n t i m o n a t ed e p o s i t int h em u i t iv e s ic u ia rb o d ie s ，p i g m e n ta n d ia m eiia rb o d yw e r em o r et h a n t h a to fp h o t o r e c e p t o r in c u b a t e din 1o w e r c aj c i u r ns o i u t i o n w h i c hc o n t a j n e d5 0 m m o l i e g t a ，i n h i g h e r c a i c u m s o iu t i o n w ec c u ldn o tf in dt h ed e p o s i tint h em i t o c h o n d r ia b u ti nl o w e r c a ic iu ms o i u t i o n t h er ew a saii t t i ed e p o s i t int h em i t o c h o n d r iat h e 1 潍帅把人学f 啦i 学位论殳 小川c a 2 浓度对斑节对虾光感嘎措的影l 卿 r e s u i to fd e p o s i td is t r i b u t io nint h ep h y s i o i o g i c a is a iib ew a st h es a m e a si o w e rc a i c i u ms o lu t i o n e f f e c t so fd i f f er e n tc a i c i u mc o n c e n t r a t i o no nt h ef i n es t r u c t u r eo f d a r ka d a p t e dp h o t o r e c e d t o r sinp e n a e u sm o n o d o nf a b r i c i u t h er e ia t i o n s h i po fe x t r a c e ii u iar c ac o n t e n tr a t i o na n d t h ef in e s tr u c t u r eo fd a r k a d a p t e dp h o t o r e c e p t o r sint h ep e n a e u sm o n o d o nf a b r l c l u w a ss t u d ie dw i t he i e c t r o nm i c r o s c o p y t h er e s u i ts h o w e dt h a ti nv i t r o inp r e s e n c eo f5 0 m i n e i ic a i c iu m t h ed ia m e t e ro fr h a b d o m sa n dt h ed i m e n s i o n o fp e r ir h a b d o m a iv a c u o i e se x t r e m e i yr e d u c e dt h a nt h a to fp h o t o r e c e p t o r in c u b a t e d in p h y s i o i o g i c a i s a iin e t h ed i m e n s i o n o ft h e c y t o p ia s m i o c a t e da r o u n dt h e r h a b d o m ，i n c r e a s e d int h e h i g he x tr a c e li u iarc a s o iu t i o nm e a n w h ii e 。iik et h em o r p h o i o g ic a i s t r u c t u r eo ft h er e t in u iar c e iisd u r in gi i g h ta d a p t a t i o n t h ed ia m e t e ra n dn u m b e ro fm u i t i v e s ic u iar b e d i e sr e d u c e d w h ii e t h en u m b e ro f ia m e iia rb e d i e s i n c r e a s e d int h e r e t in u ia rt h ep ig m e n tg r a n u ie sw e r em o r ea n di o c a t e d ind is t o i p a r to f t h er e t in u iarc e ii h o w e v e r i np r e s e n c eo f5 0r f l m o i i e g t a ，t h ed ia m e t e r o ft h er h a b d o m s t h ed i m e n s i o no fp e r ir h a b d o m a i v a c u o ie sa n dt h en u m b e r o fm u i t iy e s i c u iarb e d ie sw a si n c r e a s e d b u tt h ep in o c y t o t i cv e s i c i e sw e r e f e wa n dt h ep ig m e n t g r a n u i e si o c a t e di nt h epr o x i m a i r e g i o n k e yw o r d s p e n a e u sm o n o d o n f a b r i c ，_ u , p h o t o r e c e p t o r c o m p o u n de y e ， c a ”c a “一s e q u e s t e ri n go r g a n e iie 4 4 、h 港搜坩i ：i e 竹埘m r 光感受嚣的彬响 第一章综述 一、感光器官 感光器官是动物的重要感觉器官之一，许多动物都是通过感光器来感知外界 多变的环境。感光器能将光能转化为生物电，从而使动物感受外界的光刺激。 ( 一) 脊椎动物的感光器官 大多数脊椎动物的感光器官比较发达。在脊椎动物中，研究发现视网膜中存 在有两种光感受器，这就是众所周知的视杆和视锥：它们是结构和功能特化的细 胞具有含光感性膜系统的外段、含代谢功能所必需细胞器的内段，及含有细胞 核与神经传导突触末端的尾部。”“内段在所有脊椎动物光感受器中都是相似的。 并且包含高尔基体、内质网和许多线粒体。一种非能动纤毛连接着内段和外段， 此纤毛具有基体和一种典型的九对微管环绕排列的结构。在两种类型的脊椎动物 光感受器中，细胞外段的组织是不同的。我们发现在视锥中，一系列的光感膜折 叠成许多薄层( 1 0 0 0 以上) ，扩大了膜面积，所有部分都与胞外空间接触。视杆 外段包括两种独立的光感膜系统：围绕细胞的质膜和内盘。”2 ”j 这些扁平的膜囊 具有几乎15 n m 的厚度，它们一层层地堆叠起来，相邻两层之间距离大约为15 n m 。 盘状膜( 也是质膜) 是一种含整合蛋白和外在蛋白的脂双层膜，厚度约35 r i m ”4 7 5 ”3 。对盘的内腠进行电镜研究( 包括冷冻断裂技术) 发现均匀分布的颗粒平均 赢径5 - 7 n m ，密度接近3 0 0 0 m 。，大部分这类结构都代表膜中的感光分子：视紫 红质。近来在对牛的视杆外段的研究中发现一种构成盘和质膜的特殊蛋白。在 两种结构中，仅视紫红质是相似的，盘状膜都具有5 0 - 6 0 b , * j 质膜成分”。 ( 二) 无脊椎动物的感光器官 无脊椎动物感光器官多种多样，有的非常原始，如原生动物的眼点，只能感 受外界光刺激的强弱，表现趋光性：有的很发达，如昆虫的复限和头足类的折射 眼等，能在眼中形成像，可识别外界的物体。据研究发现，无脊椎动物的眼包括 各种形态的视细胞”。一种普遍的类型是节肢动物的微绒毛光感受器，如鲎”“。 这个细胞被分为与脊椎动物光感受器的内段和外段相似的两部分。一部分包含核 与许多内质网，但没有感光膜( a - l o b e ) ，另一部分包含感光膜，折叠成指状微 绒毛( r - l o b e ) 。在鲎腹光感受器细胞中这两部分分化明显：光敏感的a - l 和支 湘帅池凡学坝l ：哥位l 迁小hl 膏球慢对斑竹埘虾光孵受群的彬响 持微绒毛的r l 。这些折叠状的指状膜增加了细胞表面积，典型的平均直径在 5 0 9 0 n m ，长1 15 n m 。在鲎腹神经光感受器细胞中，估计有1 0 5 微绒毛( 每个表 面积接近03um 2 ) 每个细胞的感光膜总面积约6 0 0 0um 2 。在其它节肢动物复眼 的细胞中( 如昆虫) ，这些部分不是独立的：长形感受器细胞( 一个小眼上7 8 个) 呈环状排列，并且沿小眼纵轴排成一列。部分依附在排列中心的细胞构成光 敏感的感杆小体，并支持微绒毛”。在这些细胞的交叉部分形成契形的微绒毛感 杆束顶部和感杆束基部。甲壳动物的光感受器细胞就属于这种类型。 ( 三) 甲壳动物的感光器官 基本结构 甲壳动物的感光器官为复眼。复眼又由许多小眼组成组成。甲壳动物复眼的 小眼的超微结构从外到内可分为折光系统、感光系统和色素细胞几部分。折光系 统包括角膜、角膜生成细胞、晶锥。小眼的外表面即角膜，也j f j , j q r 面，由透明 几丁质物质构成。角膜由其下方的两个三角形的角膜生成细胞分泌而成，它由十 几层或几十层小层构成，其胞质中含内质网及分泌颗粒“。再下方是由晶体细 胞组成的晶锥。昆虫的每个小跟有四个晶体细胞，甲壳动物则因种类而异。如等 足目、磷虾目等种类的晶体细胞为2 个，枝角类为5 个“1 ，无甲目有3 5 个。在 中华绒螯蟹和p a a e m o n e t sp u g i o 中，则是角膜生成细胞延伸成鞘，围在晶锥 外周。“。至于晶锥类型，甲壳动物属真晶锥眼。1 。 甲壳动物的感光系统由感光细胞即小网膜细胞突起的微纤毛组成。小网膜细 胞为细长形，核不规则。依据其功能的不同可以分为感光部、细胞体部和轴突三 部分。细胞体部含较多近端色素颗粒、内质网、多囊体和线粒体。线粒体可维持 光感受器的结构完整和正常的功能。在许多例子中，粗面和光滑内质网在细胞核 区很发达，胞质中还有许多游离的核糖体，这暗示着细胞体有高水平的合成运动。 另外据推测，线粒体除提供能量外，线粒体酶所催化的代谢过程有促进光诱导冲 动的产生和放大。甲壳动物的小网膜由七或八个小网膜细胞构成，而昆虫则大多 有八个细胞。小网膜细胞在中国对虾、罗氏沼虾、蜘蛛蟹、糠虾目中的新糠虾属 ( n e o m y s i s ) 与红糠虾属( e r y t h r o p s ) 等种类中仅7 个”“。而中华绒螫蟹、糠 虾目中的p r a u n u s 属、拟糠虾属( 修s i d o p s i s ) 与节糠虾属( s i r i e i a ) 及长尾 类的螯虾属( a s t a c u s ) 、c h e r a x 属等多数种类还有一个特化的第8 个小网膜细 小阳c a 。浓度埘城竹研虾光感受器的影响 胞”“，被认为是一个弱光感受器，它可参与感杆束的形成。 甲壳动物的色素细胞包围在折光系统与感光系统四周。处于折光系统中的有 远端色素细胞及反射色素细胞，这两类色素细胞均位于晶锥的远端。近端色素主 要分布于小网膜细胞内。远近端色素均为黑色屏蔽色素。色素可随光适应状态而 发生移动，其移动受到激素及内在因素的调控。 光照和c a ”对光感受器的影响 在不同条件下，甲壳动物的光感受器的结构会发生变化。据电生理的研究发 现，节肢动物的光感受器在不同光适应时呈现出不同的生理状态。“3 电镜研究显 示，在光适应与暗适应两种不同的状态下，光感受器的超微结构会发生变化。这 些变化主要表现在感杆束的平均直径、膜下潴泡囊的体积、微纤毛基部的胞饮泡 数量、色素样颗粒的位置以及有无脂滴、板膜体和溶酶体等。其中感杆束的变化 最为明显。感杆束是光感受器细胞的感光部分，关于光感受器的进化规律，e a k in ” 在19 6 8 年提出光感受器演化的两条线路理论，即纤毛线路和感杆线路。动物从 原生动物起分别向着纤毛型感光线路和感杆型感光线路方向演进。甲壳动物属于 感杆型的。早壳动物的感杆束与昆虫相比具有耳月显不同的结构。对于同一个小网 膜细胞来说，其发出的微纤毛并不连续，留有裂隙，在这些裂隙中有来自其他细 胞的微纤毛。来源不同的微纤毛彼此垂直相间排列，并都垂直于小眼长轴。其排 列方式在甲壳动物中有一定的变异性。感杆束在甲壳动物的小眼中聚集成一椭圆 形( 横切面) ，在昆虫中则形状多变”6 ”。在不同光适应时，对罗氏沼虾和日本沼 虾的研究发现，在光适应时，感杆束平均直径小，微纤毛大部分排列凌乱，且部 分呈分解状，在微纤毛基部的细胞质中可发现许多小囊泡。并且，在光适应状态 下，小网膜细胞内色素颗粒较多，分布于整个细胞。多囊体分布于细胞的各个层 面，线粒体和板膜体数量较少，膜下潴泡囊不明显。而在暗适应下，感杆束平均 直径大，微纤毛大部分排列整齐，横切面微纤毛呈晶格状。多曩体数量少，色素 颗粒较少，分布于细胞远端。膜下潴泡囊大而明显。另外，在同一种适应状态下， 不同的昼夜光周期，光感受器细胞的结构也会发生变化。中午、夜晚时的结构和 黎明、傍晚时的结构相比变化很大。这也说明光感受器在昼夜光周期中有着自己 的节律。 此外，改变外界的钙离子浓度，也会使光感受器的结构发生变化。暗适应时， 舟帅池人学悯卜，似 仑迎 、i 川( a “浓什剐斑竹对虾光，亭置器j 影响 在高钙离子条件下，细胞的结构表现为类似光适应状态特征：雨在低钙离子条件 下，则表现为暗适应的结构特征。研究也表明，光适应或暗适应时光感受器细胞 内的钙离子浓度不同，光照可引起鲎腹神经光感受器中钙离子浓度的成倍上升 【8 1 0 】 二、c a ”是细胞内的重要信使 c a ”是细胞内的重要信使。几乎所有的生理活动都受钙离子的调控。在植物 细胞中，c a ”调节着离子运输、细胞运动、糖类代谢、细胞分裂、细胞分泌以 及基因表达等等生理活动。近年来的研究表明，c a ”在植物细胞的信号转导过程 中一直起着非常重要的作用。在动物细胞中，c a ”在生命的开始就触发受精过程， 控制细胞发育和分化成为特定类型的细胞，然后调节细胞的各种生理活动，最后 参与细胞凋亡过程。近期的研究发现，钙离子参与了广泛的生理过程，如生物膜 通透性及细胞兴奋性的控制、细胞代谢、细胞形态的维持、细胞周期的调控等。 由于要综合多方面的功能，钙信号必然是非常灵活，同时又要受到严格的控制。 在静息细胞中，细胞中自由钙离子浓度大约为1 0 m 1 。如此低的静息浓度导致了 当钙离子浓度发生一个小的改变就足以使细胞的生理功能发生很大变化。另外， 钙离子可以在不同的时间和空间上以不同幅度起作用。这也就使钙离子可以在不 同的生理活动中起作用。 最近几年的研究成果主要反映在以下几个方面：对c a ”所参与的生理过程更 深入的研究：对c a 2 + 信号传递系统各组分的分离鉴定以及对其生化性质的研究， 包括用经典的生化方法和最近兴起的分子生物学手段：c a ”信号与其他信号系统 的相互作用；c a ”信号系统中新的信号传递方式。 ( 一) 钙运输系统 质膜钙通道 胞质内的钙离子有两种来源，即近乎无限的的外钙内流和相对有限的胞内钙 库。 外钙内流的途径主要有三种：电压门控的钙通道( v o c ) 、受体门控的钙通道 ( r o c ) 和钙库控制的钙通道( s o c ) 。其中，s o c 的产生机制还不清楚，对m o o 的机制了解的比较多。 v o c 活动受膜电位变化的影响，升高胞外钾离子浓度使细胞膜去极化，可使 ，、( o 浓螋刘崩节对m f 光感受群的始响 v o c 开放。v o c 对膜电位变化的敏感性还与通道蛋白的磷酸化去磷酸化状态以及 g 蛋白的作用密切相关。通道复合体中存在c a ”、c a m p 、和p k c 依赖的磷酸化位 点，通道蛋白磷酸化作用的加强或去磷酸化作用的抑制，都可增强其对膜电位变 化的敏感性。g 蛋白对v o c 也有调节作用。对于大多数可兴奋细胞，细胞外钙主 要通过v o c 进入细胞：对于一些非可兴奋细胞，细胞外钙主要通过r o c 进入细胞 【13 】 v o c 和r o c 的特性是在短时间内产生大量的钙内流，而s o c 则是产生较小的、 持续的钙内流。 钙库钙通道 细胞兴奋时，钙以5 p m o m s 的速度进入细胞。要维持胞内钙离子浓度的平 衡，除了借助于胞内的钙缓冲系统外，还必须有钙外流将钙离子排出细胞外。行 使钙外流功能的是存在于细胞膜上的两种蛋白：钙泵和n a + c a 2 + 交换子。细胞处 于静息状态，钙外流由钙泵承担，当细胞受刺激使钙离子内流增加后，n a + c a 2 + 交换子的作用加强。” 细胞膜上的钙泵不同于细胞内钙库膜上的钙泵，它是种分子量为1 4 0 k d 的 蛋白，其活性受c a c a m 复合体和p k c 的调节。当细胞内游离钙离子浓度升高时， c a c a m 复合体激活钙泵两增强其对钙的敏感性和对钙的转运效率。p k c 可使钙泵 蛋白磷酸化，进一步提高对钙的转运效率。钙泵对钙的亲和力高，但转运效率低。 细胞中最主要的钙库是内质网肌浆网。钙库以两种方式释放钙离子：i p 。 受体介导的钙释放和电压介导的钙释放。在外分泌腺细胞膜上发现有对钒酸盐敏 感的钙泵和h + c a ”交换。钙库通过它们摄入钙离子。” ( 二) 钙调节机制 细胞外细胞内自由钙离子c a ”是一种经典的胞内第二信使，但早就发现 它在胞外也有重要的功能，如血液凝固、细胞粘连、神经、肌肉兴奋、骨豁肌形 成等，正像胞内c a ”处于恒稳态是其作为第二信使的基础一样，人们发现胞外c a ” 是浓度也是处于严格的控制之中。n e m e t h 等在最初研究牛甲状旁腺细胞p t h 分泌 与胞内外c a 2 + 关系时发现，胞外c a ”的增加常引起胞内c a ”增加。在检验中意外的 是，即便不发生跨质n c a ”内流时也可检出细胞质的c a ”增加，因而提出假设：存 在对胞外c a ”敏感的细胞表面c a ”受体二 c a ” 。通过与其受体结合导致非c a 2 其他 上海蛔范大学碘十学位论文 不同c f + 浓度对斑节对虫 光感受器的蟛响 信使ip 。、d g 等变化之后，首次提出c a 2 + 可能是胞外第一信使的观点。” 胞外c a 2 + 作为第一信使直接作用于质膜上受体，与其进入胞内后作为第二信 使是完全不同的角色，因此前者必然拥有其受体之后的跨膜及胞内信号转导途 径。曾报道，c a ”变化会很快引起i p 。与d g 增加”，预示双信使系统中p l c 可能分 解p i p ：产生i p ，而i p ，则作用于胞内钙库导致c a ”外流使胞质中c a ”增加。此外， c a ”增加还会抑制c a m p 产生“”，预示着o a r g l 起c a m p 信号途径变化理论上，此二 信号途径都可通过g 蛋白与受体偶联，但目前仍缺乏直接证据。 c a 2 + 作为胞内的第二信使主要通过两釉受体系统起作用。细胞内游离钙主要 贮存于内质网( e r ) 肌浆网( s r ) 中，有三磷酸肌醇( 1 p ，) 敏感钙池和i r y r 敏感钙池 两类，分别由l p 。受体系统和r y a n o d i r e ( 斯里兰卡肉挂碱) 受体系统( r y r ) 调控。 ip 3 受体系统作为第二信使在控制内钙释放和外钙进入方面起着重要作用。它本 身就是内质网膜上的一种c a ”通道。l p ，通过产生钙信号来控制许多细胞活动，它 通过分子量和物理特性与r y r 相似的受体起作用，细胞内钙通道家族通过c a ”引起 c a 2 + 释放产生钙渡和钙振荡而起作用，这釉动态过程控制着许多细胞活动，如受 精、细胞生长、转移、分泌、平滑肌收缩、感党、知觉和神经信导。1p 。的两个 不同基因已经克隆外界刺激引起细胞的c a “动员是一个极其复杂的过程，一般 认为胞质中c a 2 + 的来源有二：一是1 只引起胞内e r 中e a ”的释放，另一来源则是通 过质膜_ e c a ”通道胞，l c a ”的内流在多数情况下，引起定生理效应需要以上两 种情况同时发生，两种c a ”释放的时空关系，一直是令人非常感兴趣，但乃为一 悬而未决的问题。内质网上的c a 2 + 通道( j p 。受体) 与质膜上e a 镥道在细胞g a ”动员 时，必然存在一种默契通讯方式，：而这种信号分子可畿为一种在细胞膜与内质网 膜之间扩散的因子，对其本质仍在猜测阶段，有些证据表明小分子量g 蛋白 ( s m a i g _ _ p r o t e i n ) 可篚与之有关。研究发现眼1 脑、肾综合征就是调节i p 。代谢 的酶的基因缺乏造成的。外界信号作用于膜表面受体启动i p 。通路。现已发现不 仅在骨胳肌，而且在多种细胞内普通存在r y a n o d j n e 受体调节c a “。r y r 为跨膜蛋 白，其g 末端四叶式结构形成钙离子通道，游离于胞浆中的x 末端上有c a ”结合位 点。 在生理条件下，细胞质中c a ”浓度在1 0 l o o n m o i l ，而细胞外和胞内钙库c a 2 + 浓度则高达f m m o t t ，为了维持这样的浓度差和胞浆中 g a ” i 相对稳定，细胞有 街帅范人儿i # 仉谁也小叫c n “浓j 丝刘崩1 i 剥mr 光感一置器的影i 向 一套精致的装置控制c a ”在质膜、线粒体内膜、钙库膜之间的流动。经典钙信号 模型认为：当胞外信号引起质膜钙通道打开或释放时，使胞质 c a ” i 迅速上升， 钙结合蛋白( 主要是c a m ) 与c a 2 + 结合形成复合物，再与其他蛋白作用而发挥生物 功能；当c a ”浓度下降时，c a 2 与c a m 分离，系统关闭。在该过程中，c a ”仅是传递 胞外信号至胞内的开关，表现为一次性反应。但更多的细胞发生的不仅是一次性 反应，而是持久反应。”“因而生物学家又提出了钙循环模型：胞外信号引起钙跨 质膜循环是细胞内信使，使细胞内c a “浓度变化局限在质膜下的局部区域。质膜 上的钙泵受c a ”一c a m 复合体和p k c 的调节。当外源信号引起胞质中 o a ” i 升高时， 该复合体激活钙泵，提高钙泵y , d c a ”的敏感性和泵钙效率。p k c 通过磷酸化钙泵而 增强其泵钙效率，从而维持钙内流和外流的平衡，使钙循环得以维持。” 三、钙离子在无脊椎动物光转导中的作用 以细胞c a ”浓度变化为基础的c a ”信号系统，所参与的生理过程非常广泛，如 c a ”与细胞有丝分裂、c a ”； b c a m 在细胞运动和行为中的调控作用、c a ”和c a m 在细 胞核中的功能等等。在肌肉、神经轴突及各种不可激活的细胞中，内质网是通过 i p 。受体系统或蓝呢啶受体系统方式释放c a ”的c a 2 + 储存器当中的主要一种。蓝呢 啶或咖啡因通过r y r 释放c a ”，它受c a c a m 调节。r y r 对细胞内的c a 2 1 升高有反应， 因而调节着c a ”诱导b g c a ”释放。 在无脊椎动物中，钙离子被认为是光适应的信使”8 ”。l is m a n 和b r o w n 已 经提出钙离子是光适应时的胞内信使”“。他们已经证明在向鲎v n p s 中注入钙离 子降低了光反应的强度。这个假说有九组证据证明。光适应引起了胞内自由钙离 子浓度的短暂增加，使细胞变得不敏感。相反，向胞内注入阻止钙离子增加的缓 冲液有助于使光反应消失。鲎v n p s 的光适应也被细胞外钙离子浓度影响。增加 胞外钙离子浓度同时也增加了光照引起的光适应的强度。这种钙离子依赖的适应 也可由一个大的反应刺激强度曲线的位移来解释。但是暗适应的曲线几乎不被外 不钙离子浓度影响。由于一个更高的钙离子浓度，由光适应引起的更高的刺激强 度的位移更大。这些结果可以表明：胞内钙离子浓度在暗适应水平低于一个一定 的域值。而光诱导增加的钙离子浓度由于跨膜的更高的钙离子梯度而变得更大。 一些电生理证据也表明，c a ”浓度的变化影晌了感光器的光适应。在鲎腹神 经光感受器中发现，当向细胞内注入钙离子时，光适应可被加强。，或者当 洵帅范大学硕+ 学位论文 不同c a p 浓度对斑节对虾光感受器的影响 注入钙离子螫合剂时，光适应被抑制”。删。在细胞的感光部分瞬时注入钙离- 子z ；i 起了细胞光敏感性的降低。3 2 ”1 。在对各种不同的无脊椎动物种类的研究中，用 小的光点作为刺激源有选择地刺激细胞的各个部分或强行把钙离子注入感光部 分，结果显示光适应发生的区域是位于吸收光子的地方。4 “2 ”。在暗适应的细胞 中，细胞内钙离子浓度大约为0 6 6um o i l 2 8 2 强烈地光照后，在光感受器的感 光部分其浓度上升至3 0 - 4 0 um o i i 2 “矧。这些证据都证明钙离子可能影响或调节 转导机制。在鲎v n p s 电压钳实验中所示“，钙离子似乎也参与了光激活的离子 通道的门控。这个结果与s t i e v e 和b r o w n s 所描述的模型是一致的叫。在这个模 型中，鲎光感受器中光激活的离子通道的门控是被钠离子和钙离子竞争结合的负 作用位点控制的。开启和关闭光激活的离子通道由钙离子调节。在黑暗条件下， 钙离子结合于细胞膜上控制结合位点，通道关闭，这个假说表明，光刺激引起钙 离子对结合位点亲和力的瞬间降低，这使钠离子代替钙离子结合，打开通道。 因此，强有力的证据表明钙离子是无脊椎动物光感受器光适应时的内部信 使。而且，钙离子被认为作为内部终端信使打开了光激活的阳离子通道，并可能 参与了这些通道的门控。 另外，在无脊椎动物的光转导也受i p ，受体系统和r y a n o d j r e ( 斯里兰卡肉挂 碱) 受体系统( r y r ) 调控。研究已发现，果蝇的光转导是通过磷酸肌醇调节的信号 转导系统发生的，光诱导了c a ”从c a 2 + 储存器中释放，这个过程可能是果蝇光转 导的一个步骤，而c a c a m 复合物调节了这个过程。在对鲎的光感受器的研究 中也发现，把i p 3 注入腹神经光感受器的感光部分而不是非感光部分，结果引起 了去极化。这和光反应相似。“。另外，i p 3 诱导产生的内电流的负电压与光反 应时的是相同的。这表明被光打开的通道和被i p 3 打开的是等同的。i p 3 也引起 了一个明显的光感受器对于进一步加入的ip 3 和接下来闪光的可逆性的不敏感， 这归因于细胞内钙离子浓度的瞬时升高。增加鲎腹神经腹眼中细胞内i p 3 浓度使 钙离子浓度增加。这已通过向鲎v n p s 中注入ip 3 而证实。然而注入细胞的非感 光部分引起了细胞内钙离- t - - 浓度的增加，但不能引起细胞的去极化和脱敏。这就 形成了一个假设，即l p 3 感受器的不同类型可能调节两个不同部分的钙离子释放。 一个是在感光部分，它受反馈抑制的调节，而另一个在非感光部分，它不受高钙 离子浓度的抑制或受很小的抑制。3 “。 小川c a ：浓芷列啦；j ，州m 光懋受器的影响 同时，蓝昵啶和咖啡因敏感的c a ”储存器及c a ”诱导的e a ”释放也存在于蜜 蜂的感光器中。”“钙离子诱导的钙离子释放表现出在光反应时调节细胞质内钙离 子浓度的上升。当钙离子浓度升高时，它会使受体对钙离子的敏感性上升，增强 通道的开放机率，促进钙离子的进一步释放，即产生钙诱发的钙释放过程：而一 旦钙离子浓度上升到一定程度时，它就会反过来抑制钙离子的释放，从而保证释 放出来的钙离子数量足以触发生理功能而叉不损伤细胞。 在无脊椎动物光感受器细胞中，膜下潴泡囊( 内质网) 、线粒体、色素颗粒、 多囊体都被认为是c a ”储存器。在对螫虾o r c o n e e t e sl m o s n s 的光感受器细胞 的钙离子储存器的研究中也发现其光感受器细胞包含三种钙离子储存器：膜下储 泡囊( 内质网) 、线粒体及色素颗粒。”：高钙浓度在蟋蟀的视网膜的色素部分被 发现”“；在鲎、螫虾、绿头苍蝇及蜜蜂的膜下储泡囊中在a t p 存在的情况下可以 观察到草酸钙的积累。这表明钙可能通过c a a t p a s e 的作用被活跃地运输至s r c 中”3 “。 四、钙离子的研究方法 ( 一) 定量研究方法 细胞内的钙以三种方式存在：( 1 ) 牢固地结合在细胞结构成分或大分子上。 ( 2 ) 以离子形式自由状态存在干细胞中，即细胞内游离钙。( 3 ) 与高容量低亲和的 钙结合蛋白松弛的结合而存于质网、线粒体等胞内钙库中，当信号传来时能将钙 释放入胞浆中成为游离钙。”正常细胞内游离钙浓度 c a 2 + i 为5 0 一15 0 n m o l l ，与 胞外钙离子浓度相差近1 00 0 0 倍。然而就是这极少量的游离钙却对细胞功能的调 节起着极其重要的作用。病理状态下细胞内钙超载将造成一系列代谢紊乱，直至 细胞坏死或凋亡，所以近年来大量的研究都涉及到细胞内游离钙的变化。最初人 们一直难以找到好的方法测定 c a 2 + i ，这主要是由于细胞内游离钙浓度很低：且 没有合适的探针既可导入细胞和c a ”很好地结合叉不损伤细胞。第一次测定活细 胞 c a “ i 是6 0 年代用水母发光蛋白测定巨肌肉细胞中的 c a 2 + i 。7 0 年代出现了两 类方法：双偶氮吸光染料法和钙选择性微电极法”“。19 8 2 年出现了荧光法：随后， 荧光染料不断更新，各种方法不断增多。这的确为我们提供了方便，但倘若选择 方法不恰当，将影晌实验的准确性：因此在研究时选择合适的测定方法显得尤为 重要。从理论上讲测定细胞内c a ”浓度的方法应符合以下要求：首先，所使用的 c a 2 + 指示剂必须对c a ”有很强的专一性：其次灵敏度高能测定1 氐浓度的c a ”：第 三，对c a2 + 水平改变的反应必须比细胞内c a ”信号引起的相关生理反应快：第四， 不会破坏细胞内的正常生理反应过程。目前常见的检测方法有c a ”活化的发光 蛋白法、钙离子选择性微电极测定法、偶氮染料法、放射示踪法、核磁共振法、 荧光标记法。其中用的较多的是荧光标记法。最近，新的荧光c a ”指示剂，特别 是运用f u r a 2 ”，和装备了一个低光水平的t v 照相机及一个数字图象加工处理器 的荧光显微镜检测了数量快速增长的细胞中c a ”浓度的不一致性“。利用光敏蛋 白一水母发光蛋白及增强基因，在唾液腺细胞“3 、鱼卵”4 1 及鲎属中鲎的腹神经感 光细胞“54 6 1 中测量到钙离子浓度梯度。用砷三酸盐，在神经轴突的周边”、体细 胞“84 、培养的神经元的各部分”o ”1 及鲎的感光细胞“”中检测到细胞内钙离子 浓度的定点变化。离子选择的微电极也可运用于此种测量，通过它成功的检测了 雨虎属神经元“”非洲爪蟾属卯“”及鲎感光细胞“中一个动态区域内细胞内钙离 子的不一致性。 ( 二) 定位研究方法 c a ”是细胞内一种重要的电解质，它在细胞的生理、生化活动过程中起着非 常重要的作用。目前在细胞超微结构水平检测c a 。分布的方法主要有三种 5 5 ： ( 】) 新鲜组织块快速冷冻固定，j 令冻超薄切片，然后由电子探针x - 射线微区分析 ( e d s ) 或电子能量损失谱仪( e e l s ) 分析。( 2 ) 新鲜组织快速冷；东固定，冷；东 置换，树脂包埋，超薄切片后由e d s 或e e l s 分析( 3 ) 由无机化学试剂与新鲜组 织中c a 2 + 反应，产生不溶性的高电子密度的沉淀，在电子显微镜下直接观察并由 e d s 或e e l s 分析。这些技术在活体细胞的钙动力学研究方面已经显示出了很大 的实用性。但它们并不完全适用于组织水平的研究，在单一细胞和小群体细胞研 究方面更受限制。而且利用这些技术所得的图像分辨率低，因而限制了亚细胞分 布研究的应用。多年以来，一般都是采用经典的细胞化学方法来用于细胞内钙离 子定位，它是一种沉淀的方法。在为电镜作化学固定时，钙离子沉淀的阴离子随 组织反应，随后，组织以常规的电镜观察方法作处理，即脱水、渗透和包埋。这 种沉淀的方法除了较好地保存细胞结构外，还试图通过使钙离子成为一种电子不 透明的反应产物而去固定且稳定钙离子。在电镜中，沉淀在含钙离子昂较高的部 位能被看见。焦锑酸”6 ”、草酸。3 、氟化物5 ”等作为沉淀离子已被运用于大量 【：海师范大学埘一l 学位论文 不同c a - 浓度对斑节对虾光感受器的影响 极大成功。 以蕈酸根作为沉淀离子为例，为了得到钙离子进入细胞内的通道，细胞的胞 质膜应先被选择性的通透，通常，皂苷被用作化学透化剂，它是一种植物糖苷和 胆固醇形成的水不溶性络台物，由于细胞膜胆固醇含量高于内质网膜或线粒体 膜“，皂苷使得质膜成为可通透的，而留下含低胆固醇量的内膜及整个的线粒 体膜。试剂的p h 值对结构来说并不是关键，但对于生理来说却很关键，因 为它影响了c a ”和e g t a 的亲和力，并因此影响了在溶剂中的自由c