（特种经济动物饲养专业论文）家蚕突变基因tub的SSR分子标记筛选与连锁定位分析.pdf

中文摘要 家蚕实验遗传图谱的研究历经近百年，已将3 0 0 多个突变性状定位在2 3 0 多个位点上。在酲南 大学家蚕基因库中保存有6 0 0 多种重要的突变体许多与生产、遗传育种和重要的基因功能相关。 一旦找到与之连锁的d n a 分子标记，便可以将这些突变基因定位于染色体上并进一步克隆有关性 状的基因，并有利于家蚕分子标记辅助育种的开展。家蚕遗传连锁图谱即是基础理论研究和实际 应用的中间桥梁，又家蚕资源、育种及分子克隆等许多研究的理论依据和基础。迄今已经发表了 包括经典连锁图谱和r f l p 、r a p d 、a f l p 和s s r 等分子遗传图谱，其中家蚕分子图谱和经典图谱 的整合成为目前研究的热点和难点。 本研究用家蚕的s s r 引物对家蚕的近等基因系材料进行遗传分析，筛选出与各连锁群标记基 因连锁的s s r 分子标记，进而用连锁的s s r 分子标记进行标记基因的定位。期望能探索并建立 一套基因的定位分析技术体系为今后家蚕基因的克隆、亲缘分析、品种鉴定、遗传改良、资源 保护、标记育种等相关研究奠定基础。主要结果如下： ( 1 ) s s r 分子标记的筛选：本实验采用s s r p c r 技术，利用3 2 9 个引物对家蚕6 个连锁群 的近等位基因系和回交亲本大造材料进行了s s r 分析，初步筛选出分别在近等基因系闯揭示多态 性的s s r 分子标记2 7 个，其中多态性标记较多的为第7 连锁群的q 基因的近等基因系和第1 6 连 锁群的c t s 基因的近等基因系，分别为t o 个和1 2 个：第2 连锁群的基因，第4 连锁群的l 基 因和第2 3 连锁群的t u b 基因的近等基因系分别筛选到1 个多态性标记。其中不同的碱基类型表现 出不同的多态性。二碱基的s s r 引物多态性水平较高。 ( 2 ) s s r 分子标记的连锁验证：将筛选得到的2 7 个s s r 引物分别用对应的近等基因系进行 连锁验证即先后进行亲本个体验证、系统验证、杂交验证及测序验证。首先将筛选获取的6 个 连锁群标记基因的s s r 分子标记进行重复验证3 次，均可得到稳定的结果。然后将筛选到的多态 性s s r 分子标记分别对各个亲本个体进行验证，结果发现除了第2 3 连锁群的近等基因系亲本个 体间无差异外，其它的连锁群均有一定程度的个体差异。这可能是因为所取近等基因系材料的遗 传背景并不是完全的相同，还是存在有个体差异所导致。将存在有个体差异的近等基因系亲本进 行杂合度分析表明，各近等基因系内的平均杂合度在0 1 6 0 0 0 3 3 9 1 之间。然后进一步用s s r 标 记p s s r f 0 3 进行系统验证，结果群体中表现为t u b 性状的个体扩增的带型与近等位基因系亲本带 型一致。其次对s s r 标记p s s r f 0 3 进行杂交验证。用家蚕2 3 连锁群的近等位基因系与c 1 0 8 品 种作为亲本，其f 1 代早与亲本回交产生b c i 代验证群体。利用s s r 标记p s s r f 0 3 对b c l 代有 t u b 性状个体和正常个体分别进行s s r 分析，结果说明，s s r 标记p s s r f 0 3 与第2 3 连锁群t u b 基因紧密连锁。最后对第2 3 连锁群t u b 基因的特异性片断进行回收测序，序列表明此段特异性序 列是包含一段a c 重复的微卫星序列。 ( 3 ) 第2 3 连锁群突变基因t u b 的连锁定位分析：用s s r 标记p s s r f 0 3 对培育的第2 3 连锁 群的近等基因系与c 1 0 8 杂交的b c l 定位群体( 利用f 1 代6 与亲本回交产生b c l 代) 进行s s r 分析，在3 0 9 个个体中，有1 4 9 个表现t u b 表型的个体，其中有1 2 个个体发生了单交换：另外 1 6 2 个正常个体中有1 1 个发生了单交换，其后代的交换率为7 4 4 ，即分子标记p s s r f 0 3 与t u b 西南大学硕士学位论文 基因间的距离为7 4 4 c m 。 ( 4 ) 对突变基因t u b 的相关信息分析：本研究结合家蚕全基因组序列信息，将p s s r f 0 3 标 记序列分剐在家蚕基因组序列、家蚕e s t 序列和家蚕c d s 序列数据库及g e n c b a n k 数据库中进行 同源检索，找到其对应的s c a f f o l d 4 6 5 8 ：然后将s c a f f o l d 4 6 5 8 在s o f t b e r r y 网站在线预测基因， 同时检索到最新研究完成的家蚕s s r 连锁图谱( p n a s , 2 0 0 5 ) 中第2 3 连锁群所包含的s s r 标记 分别对应的s c a f f o l d ，并分析了预测的基因，由此列出了家蚕第2 3 连锁群上已知的所有s c a f f o l d 。 与樽蚕( t u b ) 相关的基因还在进一步的验证分析之中。 关键词：家蚕近等基因系s s r 分子标记t u b 基因连锁定位 a b s t r a c t t h er e s e a r c ho ns i l k w o r me x p e r i m e n t a lg e n e t i cm a ph a sl a s tf o rn e a r l y1 0 0y e a r s ，a n dm o r et h a n 3 0 0m u t a n tc h a r a c t e r sh a v eb e e nl o c a t e di n2 3 0l o c ii n c l u d i n gm a n yi m p o r t a n tb i o c h e m i s t r yt r a i t s t h e r e a r em o r et h a n6 0 0s i l kw o r mm u t a t i o n sb r e e d si nt h eg e n ep o o lb a n ko ft h es o u t h w e a s tu n i v e r s i t y , w h i c hc o n t a i n sm a n yt r a i t sc o n c e r n i n gt op r o d u c t i o n ，g e n e f i c a lb r e e d i n ga n dv i t a lf u n c t i o n o n c ef o u n d f i n dt h ed n am o l e c u l a rm a r k e r sl i n k a g e dt ot h e s et r a i t s ，w ec a np r o b a b l yl o c a t e t h em u t a t i o n so n c h r o m o s o m e sa n df u r t h e rc l o n et h e m ；m e a n w h i l e ，t h i sw i l lh e l pt om a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o no fs i l k w o r r o t h ec o n s t r u c t i o no fg e n e t i cm a pc o n n e c l $ t h eb a s i ct h e o r ya n dp r a c t i c a la p p l i c a t i o n ，c a r la l s o p r o v i d ef u n d a t i o nt or e s e a r c h e so fs i l kw o r mr e s o u r c e ，b r e e d i n ga n dm o l e c u l a rc l o n e g e n e t i cm a p so f r f l p , r a p d ，a f l p , s s ra n dc l a s s i c a ll i n k a g em a po fs i l kw o r l nh a v eb e e np u n l i s b e d ，i nw h i c ht h e i n t e g r a t i o no f m o l e c u l a rm a pa n dc l a s s i c a lm a pi st h eh o tp o i n te l lr e s e a r c h i nt h i sr e s e a r c h ，w ea n a l y s e dt h en e a ri s o f e n i cl i n e so fs i l kw o r mu s i n gs s rp r i m e r s ，a n dp i c k e d o u ts s rm o l e c u l a rm a r k e r sl i n k a g e dt om a r k e rg e n e si nc o r r e s p o n s i v el i n k e dg r o u p s i nt h i sw a y , a t e c h n i cs y s t e mo fl o c a t i o no ff u n c t i o ng e n e sc a nb ee s t a b l i s h e d ，a n dp r o v i d ef u n d a t i o nt om a n y c o n c e r n i n gr e s e a r c h ，s u c ha sg e n ec l o n e 、a n a l y s i so fr e l a t i o n s h i p ，v a r i e t yi d e n t i f i c a t i o n ，g e n e t i c i m i p r o v e m e n t r e s o u r c ep r o t e c t i o na n dm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n t h em a i nr e s u l t sa sf o i l o w s ： ( 1 ) s c r e e n i n go fs s rm o l e c u l a rm a r k e r s ：u s i n gs s r - p c rt e c h n o l o g y , w ea n a l y s e d6l i n k e d g r o u p so fn e a ri s o f e n i cl i n e sa n db a c kc r o s sp a r e n td a z a o ，a n dp i c k e do u t2 7o f3 2 9p a i r ss s rp r i m e r s w h i c he x p o s ep o l y m o r p a h yi nn e a ri s o f e n i cl i n e s i nt h e s ep r i m e r s ，1 0a n d1 2l i n k a g e dt oqg e n ei n7 t h l i n k e dg r o u pa n dc f 8g e n ei n1 6 t hl i n k e dg r o u p ，1t o 矿g e n ei n2 t hl i n k e dg r o u p ，1t olg e n ei n4 t hl i n k e d g r o u pa n d1t ot u bg e n ei n2 3 t hl i n k e dg r o u p ( 2 ) t e s t i 母o fs s rm o l e c u l a rm a r k e r s ：c o r r e s p o n s i v e l yu e sn e a ri s o f e n i cl i n e st om s t i f yt h e2 7 p a i r so fs s rp r i m e r s ，t h i sm e a n sb yp a r e n ti n d i v i d u a l 、s e q u e n c i n g 、s y s t e m i ca n dh y b r i d i z a t i o nt e s t a t f i r s t ，3t i m e sr e p e a t st e s to ft h e s es s rm o l e c u l a rm a r k e r sc a l lg e tt h es a m es t a b l er e s u l t ，w h i c h d e m o n s t r a t et h es m a l le x p e r i m e n t a le r r o r t h e ni nt h et e s to f e a c hp a r e n ti n d i v i d u a l ，t h el i n k e dg r o u p sh a d s o m ed i s t i n c t i o n si nac e r t a i nd e g r e e ，e x c e p t2 3 t hl i n k e dg r o u po fn e a ri s o f e n i cl i n e s t h er e a s o nm a yb e t h er e m a i n dd i s t i n c t i o n si nn e a ri s o f e n i cl i n e si n d i v i d u a l n e x t ，s e e q u e n c e dt h es p e c i a lf r a g m e n to ft u b g e n ei n2 3 t hl i n k e dg r o u pa n df o u n daa cr e p e a t sm i c r o s a t e l l i t es e c q u e n c e ，i na d d i t i o n ，u s e ds s r m a r k e r tp s s r f 0 3t os y s t e m i ct e s t ，r e s u l tw a st h a tt h eb a n dt y p eo ft u bt r a i t e d - i n d i v i d u a lw a ss i m i l a rt o t h a to fn e a ri s o f e n i el i n e sp a r e n t t h i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h es s rm a r k e ri n2 3 t hl i n k e dg r o u pi s l i n k a g e dt ot u bg e n e f i n a l l y , t h eh y b r i d i z a t i o no ff 1g e n e r a t i o na n dp a r e n tn e a ri s o f e n i cl i n e si n d i c a t e d t h a ts s rm a r k e rp s s r f 0 3t i g h t l yl i n k a g e dt ot u bg e n ei n2 3 t hl i n k e dg r o u p ( 3 ) 。l i n k a g el o c a t i o n ma n a l y s i so f m u t a n tt u bg e n ei n2 3 t hl i n k e dg r o u p ：t h es s ra n a l y s i so nb c l g e n e r a t i o no f2 3 t hn e a ri s o f e n i cl i n e sm a dc 1 0 8s t r a i nb ys s rm a r k e rp s s r f 0 3s h o w e dt h a t1 4 9 i n d i v i d u a l sa m o n g3 0 9a p p e a rt u bt r a i ti n c l u d i n g1 2i n d i v i d u a l sw i t hs i n g l ee x c h a n g e ，t h eo t h e r1 6 2 u 西南大学硕士学位论文 n o r m a li n d i v i d u a l sc o n t a i n11i n d i v i d u a l sw i t hs i n g l ee x c h a n g e t h e r e f o r et h ee x c h a n g er a t ei s74 4 a n d m a pd i s t a n c ei s1 4 e m t h a tm e a n st h i sg e n ei s7 4 4 c ma w a yt om a r k e rp s s r f 0 3 “) ，b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f m u t a n tt u bg e n e ：h o m o l o g i c a tb l a s to fs s rm a r k e rp s s r f 0 3i ns i l k w o r mg e n o m e 、e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 、e d sa n dg e n e b a n kd a t ab a s ef o u n dt h ec o r r e s p o n d i n g s c a f f o l d 4 6 5 8 f u r t h e rp r e d i c t e dt h ec o r r e s p o n d i n gs c a f f o l d 4 6 5 80 ns o f t b e r yw e bn e t ，a n dg o tr e s u l tt h a t n ov a l u a b l eg e n e sr e l a t e dt ot u bg e n ea n dc o n f i r m e dt h ec o r r e s p o n d i n gs c a f f o l d so fs s rm a r k e r s l i n k a g e dt o2 3 t hl i n k e dg r o u pi nt h es i l kw o r m s s rm o l e c u l a rm a p ( p n a s ，2 0 0 5 ) ，s ow e s h o wa l lo f t h e s c a f f o l d si nt h e2 3 t hl i n k e dg r o u p w ea n a l y z e dt h ep r e d i c t e dg e n e b u tm o r ee x p e r i m e n t sa r ed o i n gt o a n a l y z et h eg e n e sr e l a t e dt ot u bg e n e k e yw o r d s ：s i l kw o r l n n e a ri s o f e n i cl i n e ss s rm o l e c u l a rm a r k e rt u bg e n e l i n k a g el o c a t i o n v 独创性声明 学位论文题目：塞蚕塞变基垦! 丝鲍墨曼星佥王拯迢篮造曼适毯定焦 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 身 的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 ， 学位论文作者：勿址嗽2 ，签字日期：u 卯6 年r 月订日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文 被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：臼不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：魏；l 出沙导师签名：爿器艿气， 签字日期：) 6 年6 月f 日签字日期：叼年月厂日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话：(2 邮编： 一文献综述 i i i 文献综述 遗传连锁图谱( g e n e t i cl i n k a g em a p ) 对于基因的定位具有举足轻重的作用，是指生物基因组内 染色体上的多态性基因或专一的多态性d n a 标记相对位置的图谱，由一系列己知间距和前后顺 序的遗传位点构成。遗传连锁图谱的构建对于搞清基因的功能、定位及分离克隆新基因、排列d n a 片段、研究染色体上基因的排列顺序等起到不可估量的作用。 遗传标记“1 ( g e n e t i cm a r k e r ) 指的是任何一种可随染色体、染色体某一节段、某个基因座位在 家系中传递的遗传特性。它具有两个基本特征：可遗传性和可识别性，是作物遗传育种的重要工具。 它包括四种类型，即形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r ) 、细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 、生化标记 ( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) t 1 分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 。前三种标记都是基因表达型的标记，易受环 境条件和发育阶段的影响，可利用的多态位点较少。从2 0 世纪8 0 年代开始，由于分子生物学的 e 速发展，出现了多种多样的分子遗传标记( m o l e c u l a rg e n e t i cm a r k e r ) ，突破了表达型标记的局 限性，其变异只来源于基因d n a 序列的差异，具有稳定性高、信息含量高、不同层次和类群之 间，“泛可比等优越性，它是基因型特殊的易于识别的表现形式，是生物分类、育种学、遗传学和 物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。应用分子标记对一些重要性状的基因定位直是遗 传连锁图谱的直接应用之一心。基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的标记【”。 1 1 基因定位 基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的遗传标记。高密度分子遗传图谱的 构建极有利于基因定位工作。基因定位是获得有利基因的重要条件，对一些常规方法不能克隆的 基因需要用到定位克隆技术。标记目标性状基因，可以用的群体主要有两种：一是利用近等基因系 ( n i l ，n e a r - i s n g e n i cl i n e ) ，二是利用分离群体分组分析( b s a ，b u l k s e g r e g a n ta n a l y s i s ) 。近等基因系是 指只有目标性状基因有差异，其它性状基因相同的两个群体。近等基因系通过不平衡杂交获得。 b s a 法的具体做法是：将分离群体中研究的目标性状根据其类型( 如抗病、感病) 分成两组，将每组 内一定数量的个体d n a 等量混合，形成两个池，这两个池除在目标性状( 抗病性) 上有差异外。其 余遗传均相同。利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因 连锁。再用分离后代个体，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。另外，还 可利用己有的连锁图进行标记，一旦发现某一目标基因被定位在某一染色体上，就可以选择分散 在染色体不同位点上的标记，进行染色体步行( c h r o m o s o m ew a l k i n g ) ，直至找到目标基因。 基因和q t l 的定位克隆中通常用的是s s r 标记和c a p s 标记，它们重复性好，操作简便【4 】。 利用s s r 标记与某些基因或q t l 间的连锁关系，可将一些功能基因或q t l 定位在染色体上或连 锁群中吼有些分子标记本身就来自于数据库中己知序列的e s t ，对该标记的定位就是对该基因 的定位”l 。 基因定位和基因图谱对遗传学、医学和人类及生物进化的研究都有十分重要的意义。通过多 态位点标记进行连锁分析获得物理图谱的位置有助于遗传作图，同时通过连锁分析( 部分有减数分 裂的交换) 又能指导物理作图，使基因定位更为精细。 西南大学硕士学位论文 i i i i 鲁皇! 曼曼暑皇皇| 皇鼍鼍皇曼蔓曼 1 ，1 ，1 形态标记定位 形态标记是指动植物的外部形态特征，既包括一些肉眼可见的外部特征，如植物的矮秆、色 素、抗病虫性等，动物的体形、生理特性、生殖特性等有关的一些特性。这类标记简单直观经济方 便，但在动植物遗传育种中的应用是有限的，主要表现在：多数标记性状是由突变产生的， 而且在一个杂交群体后代中可检测到的突变体有限，花费时间较长；数量是有限的且多态 性较差，作为遗传标记的表型性状受环境条件的影响，常有一些标记与不良性状连锁：标记 性状的基因互作( 如上位性效应) 使得同一性状的表型在不同的遗传背景下常表现不同：应用此 类标记建立经典遗传图谱周期长，所含标记少，饱和度低。 t ，t ，2 细胞学标记定位 细胞学标记指动植物细胞染色体的变异。它包括染色体核型( 如染色体数目、结构、随体有无、 着丝粒位置等) 和带型( 如c 带、n 带、g 带等) 的变化。它与形态标记比较具有能进行一些主要基 因的染色体或染色体区域定位的优点。由于减数分裂过程的异骺，容易造成特定染色体上基因的 分离与重组发生偏离，因而可以作为一种遗传标记来检测基因所在的染色体及其相对位置。1 9 1 3 年，s t u r t e v a n t 和m o r g a n 将果蝇的5 个基因经连锁分析定位在性染色体( x ) 上，从此确立了遗 传学的染色体理论和遗传作图的基本原理，这标志着细胞学标记的诞生。但其材料的培育费力费 时，难度很大：某些物种对染色体变异反应敏感；有些变异用细胞学方法检铡较疆难。应用细胞杂 交和染色体显带技术已绘制出了人类的细胞遗传学图，并有相当数目的基因被定位在2 4 个不周 的染色体上。 1 1 3 生化标记定位 生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指个以上基因座位编码的酶的不同形 式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。它与前两种标记相 比具有以下优点：表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；直接反映了基因产 物差异，受环境影响较小。1 9 5 9 年，m a r k e r t 和m o i l e r 根据对几种动物乳糖脱氨酶l d h 的多种 形式的研究提出同工酶( i s o z y m e ) 概念。通过适当方式将编码酶的基因定位于染色体上。隧着同 工酶定位座位数的增加，就可以利用它作为一种遗传标记来迅速确定未定位的其它基因。自今， 已发现了5 0 0 多种具有不同分子形式的同工酶【s i 。 1 t 4 分子标记定位 利用分子标记进行基因定位在遗传育种中有很大的应用价值。利用分子标记进行基因定位通 常有三种方法。( 1 ) 近等基因系法。这种方法是用大量的分子标记对d p ( 供亲) n i l ( 近等基因 系佩p 饽回亲本) 作多态性筛选，若某一标记在d p 和n i l 间带型一致，而同时在n i l 和r p 之间 不同，则表明该标记所对应的染色体区段与近等基因性状可能连锁。近等基因系可直接用于染色 体定位，但其建立需要长期的育种工作。( 2 ) 在近等基因系的基础上，1 9 9 1 年m i c h e t m o r e 等设计 的集团混合分离分析法( b u l k e ds e g r e g a t a n ta n a l y s i s ，b s a ) 9 】。该方法根据f 2 代个体中目标基因的 2 一文献综述 墨量量皇曼量量曼! 鼍曼毋皇曼皇皇皇曼邕鼍曼_ i ii i _ 岂皇罡暑量舅皇邕曼量| 曼量e 曼蔓皇皇舞量曼鼍量鼍邕单 分离将f 2 分成两组，分别提取d n a 并等量混合构成两个d n a 库，由于这两个d n a 库在目标 基因所在区域完全不同，而其它区域则近似相同，这样通过分子标记筛选即可找出与目标区域相 连锁的分子标记。利用b s a 法进行基因定位可省去繁重的遗传材料的创建工作，任何可得到分离 群体的物种都可利用此方法。高密度连锁图为未知产物基因的克隆提供了可能的途径。( 3 ) 极 端集团一隐性群法是对群分法的发展，即在分离群体中选出性状表现型为两个极端的个体，构成 两个极端集团，对极端集团作分子标记分析找出两个集团间呈多态性的分子标记位点( 即阳性标 记位点) ，然后对表现型为隐性的极端类型个体用阳性标记分析。该法的优点是不需对整个群体作 表现型的划分，可避免由于将一些类型不太典型的单株勉强分组所造成的误判，对表型极端的个 体组群，可提高检测的灵敏度，对重组值计算的效率较高。 1 1 4 1 r f l p 在基因定位上的研究 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 标记即限制性片段长度多态d n a 标记 由b o t s t e i n 等【1 1 j 作为绘制连锁图的标记而提出的。在大麦和小麦中应用比较广泛。h i n z e 等【l2 1 应 用n i l s 定位了大麦抗自粉病基因( m 1 ) 。g r a n e r 等( 1 9 9 3 ) ”那在3 h l 上找到了与抗大麦温型黄花 叶病毒( b a m m v ) 基因( y m 4 ) 连锁的r f l p 标记m w g i o 。该标记与y m 4 之间的遗传距离只有1 2 c m 。 b a u e r 等( 1 9 9 7 ) 1 4 1 在4 h s 上为新的抗b a m m v 基因y m & y m 9 和y m l l 找到了r f l p 标记。s a e k i 等( 1 9 9 9 ) ”“通过r f l p 分析，在5 h s 上基因r y m 3 ( x 寸丈麦黄花叶病毒的所有毒系都具有抗性) 的两倒，找到 了两个标记m w g 2 8 和a b g 7 0 5 a ，与r y m 3 的遗传距离分别为7 2 c m 和1 1 7 c m 。w i l l i a m 等( 1 9 9 9 1 【l ”利用r f l p 方法，把抗网斑病基因( r p t 4 ) 定位在7 h l 上，并找到了与r p t 4 的遗传距离为6 9 c m 的分子标记x p s r l l 7 。b m n n e r 等( 2 0 0 0 ) 1 1 7 在3 h s 上鉴定出与抗叶锈病基因( 勘 7 j 距离为3 2 c m 的r f l p 标记。s t r a e k e 等( 1 9 9 8 ) “”用r f l p 方法将控制大麦光周期反应的基因( d 7 ) 定位在6 h 的着丝点附近，分别距离该基因两侧的分子标记x m w 9 2 2 和x m w 9 9 1 66 7 e m 和1 3 0 c m 。t a n g 等( 1 9 9 9 ) l i ”发现大麦的耐铝害基因( 爿t p ) ，恰恰位于和小麦同源的4 h l 上，并鉴定出3 个r f l p 标记x b e d l l l 7 ，x e 9 4 6 4 和x c d 0 1 3 9 5 。然而r f l p 需要的d n a 量较大，检测方法较为繁琐，周期 长，多态检出效率低，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信息有限。 1 1 4 2r a p o 在基因定位上的研究 r a p d 技术由w i l l i a m s 和w e l s h 分别提出，是利用一个随机序列的寡核普酸作引物，通常 为l o 个核普酸，以生物的基因组d n a 作模板进行p c r 扩增反应，经琼脂糖凝胶电泳来检测d n a 序列的多态性。由于r a p d 比r f l p 更加经济实用，所以受到越来越多的重视。目前已在水稻1 2 0 i 、 白菜口”、西瓜口等多种作物上构建了r a p d 图谱。通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判 断目标基因是否存在，这种f 示记辅助选择”的方法不受环境和其他基因效应的影响，可缩短育 种周期，提高育种效率。如：许勇分别找到了与西瓜野生种质耐冷基因、抗枯萎病基因连锁的r a p d 标记，其遗传距离分别为6 9 8c m 和3 , 0e me ”“。王晓武也找到了与甘蓝显性雄性不育基因等许 多基因连锁的r a p d 标记阱i 。田苗英等采用r a p d 方法获得了一个与番茄t m v 抗性基因( t r n 2 n v ) 连锁的标记【2 6 】。s c h i e m a r m 等( 1 9 9 6 ，1 9 9 7 ) 【2 7 ，2 8 】分别为抗大麦温型黄花叶病毒( b a m m v ) 基因y m 4 和v m 9 ，找到了r a p d 标记o p z 0 4 a 和o p m 0 4 。o r d o n 等( 1 9 9 7 ) ”也发现y m 4 的r a p d 标记。 西南大学硕士学位论文 但是r a p d 标记为显性标记，不能有效鉴别杂台子：易受反应条件的影响，稳定性较差。解决的办 法之一是以测序扩增区段( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s c a r ) 标记取代r a p d ，即对特 异r a p d 条带进行克隆并测序，以测出序列的一端l o 一2 0 b p 加以r p d 引物的l o b p 合成出寡聚 核昔酸引物，以此引物进行基因组常规p c r 扩增分析。刘红彦( 1 9 9 9 ) p0 j 发现3 个与y r 8 ( 小 麦抗条锈病基因) 连锁的标记o p a s l 7 2 i b ，o p a t 7 3 6 3 和o p a t 9 。将o p a t 7 3 6 3 和o p a t 9 5 4 5 两个标 记经克隆、测序和引物设计转化成了s c a r ( 测序扩增区段) 标记。 1 143a f l p 在基因定位上的研究 a f l p 是z e b e a u 等发明的一项技术。其基本原理是将d n a 用可产生粘性末端的限制性内切 酶消化产生大小不同的酶切片段，与含有共同粘末端的人工接头连接，作为进一步扩增的模板。 因为获取多态性标记的速度快，a f l p 因丽缩短了获取目的基因的进程。与分群分析法( b u l k e d s e g e r a t i o na n a l y s i s ，b s a ) 相结合，或者立足于已构建的分子图谱，可以很容易找到与目的基因紧密 连锁的a f l p 标记。以此为起点，通过染色体步行或其他方法，可以帮助研究者定位克隆某些重 要基因，定向地对动植物进行遗传操作和改良。目前己有许多利用a f l p 技术进行基因标记和 定位的实例。王新望等【3 l 】报道了3 个与小麦抗白粉病p r 0 2 0 基因连锁的a f l p 标记，它们分别位 于该基因的一端2 6c m 和1 1 6c m ，另一端3 6c m 处。m e k s e mk i ”j 鼹道了8 个与马铃薯v 染色 体上抗p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s 基因连锁的a f l p 标记位于r f l p 标记g p 2 1 和g p l 4 7 之间，最小 遗传距离仅为0 8c m 。张峰等p 目利用a f l p 一银染法筛选到一个与抗甘蓝黑腐瘸基因连锁的标记。 陈友订等1 3 4 】也利用了a f l p 技术初步研究了与水稻光合作用光保护有关基因连锁的分子标记。周 充晨等口”( 2 0 0 1 ) 用荧光原位杂交技术鉴定了一个来自小滨麦的抗条锈病基因，将其命名为y r l m ， 进一步采用2 4 对t a qi ( t 1 t 4 ) p s t ( p t r p 6 ) 目l 物组合对抗感亲本及f 2 分离群体进行a f l p 分析，筛 选出一个与抗条锈病基因y r l m 连锁的a f l p 分子标记。经克隆和测序，该标记片段长度为2 0 5 b p ， 定名为p i t 3 2 0 5 ，邵映田等【3 6 ( 2 0 0 1 ) 以抗条锈病基因( y r l o ) 的供体亲本m o s o 作参照，用6 个p s t i 和1 0 个t a qi 端引物对抗条锈病基因( y r l o ) 的近等基因系和轮回亲本a v o c e ts 进行了a f l p 分 析，发现了特异条带p t 0 0 2 与y r l o 基因连锁，将该片段进行回收、克隆、测序转化为s c 2 0 0 一s c a r 标记，经过后代连锁分析，测得s c 2 0 0 与y r l 0 的连锁距离为o 5 c m 。 1 1 4 4s i s 在基因定位上的研究 s t s ( s e q u e n c e t a g g e ds i t e 序列标签位点) 是由一般长度为2 0 0 5 0 0 b p 的序列所界定的位点。 在基因组中只出现一次。任何单拷贝的多态性标记都可作为基因组的界标转变为s t s 标记。它是 根据单拷贝的d n a 片段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组d n a ，从而产生能够界定基因 组的特异位点。晟富多态性的s t s 标记可能是扩增带有微卫星重复序列的d n a 区域所得到的s t s 标记。s t s 标记的突出优点是共显性遗传方式，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记转移。 在人类基囡组作图中已获得了2 1 0 0 0 个s t s ，它们是将遗传图谱和物理图谱整合的有力中介i j “， 这在基因组作图上具有非常重要的作用。 4 一文献综述 p i i i i l i 皇l 鼍寡邕皇鼍曼宴詈自墨曼曼曼曼鼻鼍舅置舅舅皇吕鼍舅曩量皇皇笪皇量曼皇舅蔓皇曼皇置皇曼曼曼皇鲁曼曼 1 1 4 5i s s r 在基因定位上的研究 1 s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) ，其扩增的引物通常为1 6 1 8 个碱基序列，由1 4 个碱基 组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组d n a 中s s r 的5 或3 ， 末端结合，通过p c r 反应扩增s s r 之间的d n a 片段，用于i s s r 扩增的引物不需要预先的d n a 钡序，具有丰富的多态性。k o j i m o 等首次以 s s r 标记与r a p d 标记建立了一个包含7 个小麦品 种的遗传连锁图，其中有9 个i s s r 位点被定位在第5 条染色体上【3 8 】。 1 1 4 6o t l 定位的研究 对于一些重要的数量性状诸如产量、品质、成熟期及抗逆性等有大量的增效或减效作用基因 ( 或称徽效多基因) 控制，这样的基因位点称之为数量性状位点( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ，q t l ) ，而这些 性状的表现型值为连续变异称为多基因性状。许多基因性状并不象质量性状那么直观，q t l 很难 确定。因而怎样描述一群q t l 的平均表现方法是非常有用的p 。早期的方法是依据在分离群体 中标记基因型之间的数量性状的平均值是否存在差异i 4 或根据在分离群体中频率分布的两尾中 某个标记的频率是否有差异【4 1 】，从而判断该标记是否与某个q t l 连锁，如p o w e l l 等( 1 9 9 2 ) ”2 悃 大麦品种b l e n h e i m xe 2 2 4 正反交经花培获得的含5 9 个正交家系和5 6 个反交家系组成的一个d h 群体研究了r d n a 多态性与一系列数量性状的关系。 以后发展起来的区间作图和复合区间作图法就成为较为有效的q t l s 定位方法。在大麦中取 得了较为明显的成就 4 3 + 4 4 , 4 5 , 4 6 , 4 7 , 4 5 1 。t i n k e r 等( 1 9 9 6 ) 用两个大麦品种h a r r i n g t o n 和t r 3 0 6 杂交 构建的一个含1 5 0 个家系的d h 群体，测定了产量、粒重等性状的q t l 的主效应及其与环境的互 作效应，共检测到5 6 个q t l s ，t e f e r i e s ( 1 9 9 9 ) ”1 用d h 群体，发现在2 h 上的k s u f l 5 和b c d 2 2 1 的标记区间，与危害的叶部症状表现有关，3 h 上的w g 9 4 0 到a w w m i 和4 h 上的a b c 3 0 5 。在 大麦病害的水平抗性上，t o o j i n d a 等( 2 0 0 0 ) s u 分别在2 h 的r f l p 标记e 4 2 m 4 7 和e b m a c