（生物化学与分子生物学专业论文）酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 乙醇对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用，对酿酒酵母乙醇耐性的分子 机制研究可为选育具有较强乙醇耐受性的酵母菌种提供理论基础。本文扩增了絮凝酵母 s p s c 0 1 的海藻糖6 磷酸合成酶基因豫鲥的启动子尸删一，与模式菌株$ 2 8 8 c 的豫熨 启动子比较发现，由于2 1 个碱基的插入，尸删一多了一个胁迫响应元件( s t r e s s r e s p o n s i v ee l e m e n t ，s t r e ) ，是一个新的启动子。利用p y e s 2 0 载体骨架，构建了p 删蹦 启动绿色荧光蛋白e g f p 标记基因的报告载体，并转化酿酒酵母a t c c 4 1 2 6 。对转化子 不同乙醇浓度，不同葡萄糖浓度，不同温度下e g f p 的表达情况进行荧光定量分析发现， p r p s ，删对乙醇浓度有特异响应，而对高温、高浓度葡萄糖不敏感，证明了p 册，删可用 于乙醇胁迫程度的特异响应研究。 锌离子对p 硎一活性的研究表明，锌离子的添加没有增强e g f p 在酵母转化子中 的表达量，说明锌离子在该条件下不能直接影响尸删一的活性，添加锌离子的转化子 胞内海藻糖含量和发酵终点的乙醇浓度没有显著提高，说明锌离子对酵母细胞乙醇发酵 和乙醇耐性的影响可能和酵母的遗传背景有关。对酵母群体响应信号途径的转录激活子 a r 0 8 0 的编码基因研究表明，a r 0 8 0 启动子不能启动绿色荧光蛋白的表达，对该基因 在乙醇胁迫中的作用还需要迸一步研究。 本论文的研究结果为进一步构建絮凝酵母s p s c 0 1 基因组启动子的报告载体文库， 研究不同基因启动子在絮凝酵母乙醇耐性分子机制中的作用奠定了基础。 关键词：絮凝酵母；海藻糖合成酶；绿色荧光蛋白；报告载体；乙醇耐性 酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究 c o n s t r u c t i o na n ds t u d i e so f s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ee t h a n o l r e s p o n s i v er e p o r t e rv e c t o r a b s t r a c t e t h a n o lp r o d u c e db yy e a s tf e r m e n t a t i o ni si n h i b i t o r yt ob o t hy e a s tc e l lg r o w t ha n d m e t a b o l i s m s ，r e s e a r c ho nt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fy e a s te t h a n o lt o l e r a n c ec a np r o v i d e b a s i sf o rb r e e d i n go fy e a s ts t r a i n s 、v i mi m p r o v e de t h a n o lt o l e r a n c e i nt h i ss t u d y ，t h e t r e h a l o s e 一6 一p h o s p h a t es y n t h a s eg e n e t p s l p r o m o t e rq r p s l $ s aw a sa m p l i f i e d f r o m s e l f - f l o c c u l a t i n gy e a s ts p s c 0 1 d u e t ot h e21b pi n s e r t i o nc o m p a r i n gw i t ht h e 死d 熨p r o m o t e r f r o mt h em o d e ly e a s ts t r a i n $ 2 8 8 c ，p 删渊h a r b o r so n em o r es t r e s sr e s p o n s ee l e m e n t ( s t r e s s r e s p o n s i v ee l e m e n t ，s t r e ) a n dt h e r e f o r ei san o v e lp r o m o t e r r e p o r t e rv e c t o rc o n t a i n i n gt h e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i ne n c o d i n g g e n ee g f pd i r e c t e db yp t p s l 啦啦w a sc o n s t r u c t e db a s e do n t h ep y e s 2 0p l a s m i d a n dt r a n s f o r m e dt oy e a s ts t r a i na t c c 412 6 t h ee g f pf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo ft h et r a n s f o r m a n th a r b o r i n gt h er e p o r t e rv e c t o rw a sa s s a y e di nt h em e d i u m c o n t a i n i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fe t h a n o l ，g l u c o s ea n du n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sb y f l o wc y t o m e t r y t t l er e s u l t ss h o w e dt h a tp 删胖r e s p o n s e ss p e c i f i ct oe t h a n o l ，a n di s i n s e n s i t i v et oh i g h t e m p e r a t u r ea n dh i g hg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n ，a n dt h u sc a nb eu s e dt od e t e c t t h es t a t u so fe t h a n o ls t r e s s s t u d i e so nt h ee f f e c to fz i n co np 讦s l m 虻p r o m o t e ra c t i v i t ys h o w e dt h a ta d d i t i o no fz i n ct o t h ec u l t u r eo fa t c c 412 6t r a n s f o r m a n tc o n t a i n i n gt h er e p o r t e rv e c t o rd i dn o ta f f e c tt h e p 硎印p r o m o t e ra c t i v i t y ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e r ei sn od i r e c ti n t e r a c t i o no fz i n cw i t l l y p p s i 啦s cu n d e rt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n st e s t e d t h ea d d i t i o no fz i n ca l s od i dn o ta f f e c tt h e i n t r a c e l l u l a rt r e h a l o s ec o n t e n to ft h et r a n s f o r m a n ta n dt h ee t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，w h i c h s u g g e s tt h a te f f e c to fz i n co ne t h a n o lf e r m e n t a t i o na n de t h a n o lt o l e r a n c em a yb ei n f l u e n c e db y t h eg e n e t i cb a c k g r o u n do ft h ey e a s ts t r a i n s s t u d i e so na r 0 8 0 e n c o d i n gg e n ew h i c hi st h e t r a n s c r i p t i o nv e c t o ro ft h eq u o r u m s e n s i n gc i r c u i tr e v e a l e dt h a tt h ep r o m o t e ro fa r 0 8 0 c a n n o ti n d u c et h ee x p r e s s i o no fe g f pi nt h er e p o r t e rv e c t o ru n d e rt l l e e x p e f i m e n t a l c o n d i t i o n se m p l o y e di nt h i ss t u d y ，a n dt h ee f f e c to fa r 0 8 0i ny e a s te t h a n o lt o l e r a n c en e e d s t ob ef u r t h e re x p l o r e d t h i sw o r kp r o v i d e sb a s i cf o rf u r t h e rc o n s t r u c t i o no fe t h a n o lr e s p o n s i v er e p o r t e rv e c t o r l i b r a r yf r o mt h eg e n o m eo fs p s c 0 1a n df u t u r es t u d i e so nt h em o l e c u l a rb a s i so fi m p r o v e d e t h a n o lt o l e r a n c eo fs e l f - f l o c c u l a t i n gy e a s t 大连理工大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：s e l f - f l o c c u l a t i n gy e a s t ；t r e h a l o s e 一6 一p h o s p h a t es y n t h a s e ( t p s l ) ；e n h a n c e d g r e e nf l u o r e s c e n ep r o t e i n ( e g f p ) ；r e p o r tv e c t o r ；e t h a n o lt o l e r a n c e i i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：堕蓥通幽圣醯由起拯垒氢翻坠垄逝巫瞳 作者签名： 毯拯篡。 日期：幽年1 月l 日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：豳舀醴圣磋蝈丕撮整兹继鱼担婆盘猛盎 作者签名： 丞拯姜 e l 期：幽旦2 年2 _ 月l 日 导师签名：工不上t 三毯一日期：掣年月上日 大连理工大学硕士学位论文 己i 言 丁1日 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是重要的工业微生物，其对环境胁迫因素的 反应一直是国内外学者研究的重点，提高酿酒酵母对环境胁迫因素的耐受性对食品、酿 酒等工业的生产具有重要的意义。近年来，以燃料乙醇为代表的生物质能源的生产在国 内外均成为热点，其中燃料乙醇作为可再生的清洁能源，已经率先实现大规模工业化生 产和应用。然而，发酵终点高浓度的乙醇对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强抑制作用， 而提高酵母菌的乙醇耐受性可以保证酵母菌发酵过程中较好的细胞活性和较高的发酵 性能，因此酵母菌的乙醇耐性重新成为世界范围内的研究热点。近年来，人们对酵母菌 乙醇耐性的生物化学和分子生物学机理进行了进一步的研究，发现了很多新的与酵母菌 乙醇耐性相关的基因，并在此基础上进行了相应的遗传工程操作，成功提高了酵母菌的 乙醇耐性。 目前研究酵母菌乙醇耐性的分子机制的方法，通常通过对乙醇短暂冲击，或发酵过 程不同阶段细胞的全局基因转录的芯片分析，发现与乙醇耐性相关的基因，而随着酵母 细胞的遗传背景的不同，乙醇冲击或者细胞培养的方法不同，所得到的结果并不相同， 提示酵母菌乙醇耐性的分子机制与细胞的遗传背景和生理条件有关。前期实验结果表明 絮凝酵母s p s c 0 1 与酿酒酵母相比具有更高的乙醇耐受性，但相关的分子机制尚不清晰， 我们尝试通过构建报告载体探明与乙醇耐受性相关的基因，并以p t p s l s p s c 为例检测这一 方法的可行性。 培养基中金属离子的含量对酵母菌的生长和乙醇的产生具有重要的影响。很多金属 离子可作为糖酵解途径中各种酶的辅酶参与糖的分解代谢；同时，某些金属离子，如钙 和镁离子，对酵母菌的絮凝和乙醇耐性提高有利，但对锌离子的研究还很少。本实验室 前期研究发现生长于添加锌离子的培养基中的絮凝酵母胞内海藻糖含量增加了2 倍，并 且絮凝酵母乙醇耐受性显著提高，但其分子机制尚不清晰，锌离子是否可直接作用于海 藻糖合成酶基因的启动子区域，增加酶分子的合成从而提高胞内海藻糖含量，最终导致 乙醇耐性的提高有待进一步探讨。 酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究 1文献综述 1 1燃料乙醇的生产背景及研究意义 燃料酒精作为可再生清洁能源，具有良好的发展前景，特别是在全球范围内石油供 需矛盾日益突出，石油机动车燃料大量消费导致生态环境不断恶化的背景下，可再生清 洁能源的重要性更加突出。我国政府在“十五”计划发展纲要中明确提出发展燃料酒精为 先导的生物能源产业【l j ，并制定了国家“十五”燃料乙醇发展和车用乙醇推广使用专项 规划，批准在吉林、河南和安徽试点建设三套大型燃料酒精装置。目前我国已成为第 二大燃料乙醇的生产和消费国，仅次于美国。2 0 0 8 年我国燃料乙醇的产量达到1 6 0 余万 吨。 1 2乙醇对酵母细胞的毒性 酵母在自然环境以及在工业发酵中，糖都是它利用的主要碳源和能源，乙醇是酵母 菌糖代谢的主要产品，乙醇的积累对酵母细胞产生负面影响，酵母对乙醇的敏感性决定 了发酵产量。目前高浓度( v e r yh i g hg r a v i t y ，v h g ) 发酵是酒精发酵技术的另一个主要 研究方向，高浓度酒精发酵的糖浓度超过2 5 0g l ，发酵终点乙醇浓度达到1 5 ( v v ) 2 1 ， 超高浓度发酵之所以备受工业界青睐，不仅因为它可以节省发酵醪精馏操作的能耗，而 且可以减少废糟液总量，节省后续d d g s 装置运行的能耗，同时生产过程物料流总量减 少，液化和糖化过程加热和冷却的能量和动力消耗节省。但高浓度酒精对酵母细胞生长 和酒精生成具有强抑制作用，成为制约这一技术发展的最大屏障。提高酵母菌乙醇耐受 性，是提高发酵终点乙醇浓度的关键所在。因此，通过开展酵母菌耐酒精机制的研究， 可能是提高酒精发酵水平的有效途径。 实验室前期工作证实絮凝酵母s p s c 0 1 与酿酒酵母相比具有更高的乙醇耐受性，并 就乙醇耐性机制的生化机理作了大量研究，而关于这一菌株乙醇耐受性高的分子机制尚 不清晰。 1 3乙醇耐性的分子机制研究进展 酵母菌的乙醇耐性受多基因控制【3 ，4 1 ，这与乙醇表现出对酵母菌的多方位抑制和毒 害作用是相吻合的。2 0 0 6 年丹麦学者和日本学者分别通过观察在含有7 和1 0 乙醇的 培养基上酵母单基因突变体的生长的方法来鉴别与乙醇耐受能力相关的基因【5 ，6 1 ，得到 的与乙醇耐性相关的基因数目分别为4 6 个和1 3 7 个，而所揭示的基因在两个报道中不 大连理工大学硕士学位论文 完全一致。早期利用酵母在乙醇短暂冲击后的基因芯片分析研究与乙醇耐性相关的基因 也有报道 7 1 ，但与单基因突变体实验所得的结果也不一致。以上研究结果提示了酵母菌 乙醇耐性分子机制的复杂性。酵母菌的乙醇耐性可能与其遗传背景有关，而且也与检测 方法及乙醇胁迫的程度有关。最新的研究结果除了肯定以往的结果以外，还发现了一些 新的与酵母菌的乙醇耐性相关的分子机制。以下主要介绍几个主要的与酵母菌乙醇耐性 相关的分子机制的研究进展。 1 3 1热休克蛋白和海藻糖相关基因与乙醇耐性 酵母菌的耐乙醇性能与热休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n ) 和海藻糖的合成有关1 7 叫。 a l e x a n d r e 等【7 】报道了酿酒酵母在含有7 ( v v ) 乙醇的培养基中处理3 0 m i n 后，细胞全 局的基因转录分析；后续的另一项研究【8 】报道了酿酒酵母在加入5 ( v v ) 乙醇的培养 基中好氧培养的基因微阵列分析。两者的分析结果均表明，热休克蛋白基因h s p l 0 4 、 h s p 2 6 、h s p 3 0 、h s p 7 0 和h s p l 2 在乙醇胁迫下转录水平提高幅度较大。值得一提的是， a l e x a n d r e 等的基因芯片研究结果首次揭示了乙醇可诱导脚7 d 家族基因( s s a 、s s a 2 、 s s a 3 ，s s a 4 和s s e i ) 的表达 7 1 。在此之前，s a n c h e z l l o 】和s a l e s 1 1 】等利用缺失突变体实 验已经证实了h s p l 0 4 p 和h s p l 2 p 可以直接影响酿酒酵母的乙醇耐性：s a n c h e z 等测试了 z t h s p l 0 4 突变体的乙醇耐受性与亲本菌株的差别，结果证明热诱导后，亲本菌株可耐受 2 0 的乙醇，而突变株则不能承受该乙醇浓度；s a l e s 等发现d h s p l 2 缺失突变体在 1 0 0 o - , 1 2 的乙醇中2 4h 的生长速度小于野生型，而其他热休克蛋白虽然在乙醇胁迫下 表达量增加，但他们的缺失突变体是否对酵母细胞的乙醇耐受性产生直接作用尚不清 楚。 海藻糖合成相关基因口研、砰忱和t s l l 在乙醇胁迫下转录水平提高 7 1 ，与之前报 道的乙醇胁迫诱导海藻糖积累的结果一致【1 2 】。海藻糖合成酶基因孢卯的突变体在进行 热处理后【1 3 】，对热激和乙醇的耐性明显降低，显示了海藻糖合成酶基因对乙醇耐性的重 要性。j u n g m 】等利用反义r n a 技术干扰酸性海藻糖酶基因( a t h l ) 在酿酒酵母细胞内 的表达，降低了酸性海藻糖酶基因的表达量及酸性海藻糖酶活性，结果发现酿酒酵母发 酵性能有所提高；在含有3 0 ( w v ) 葡萄糖的y p d 培养基中，发酵时间由8 8h 缩短 为4 4h ，并且在8 ( v v ) 的乙醇浓度下存活率明显提高，大约为对照组( 未进行反义 r n a 干扰处理) 的1 5 倍。此外，作者对自絮凝酵母s p s c 0 1 的乙醇耐性的生化机制的 研究结果也表明了海藻糖的积累与乙醇耐性具有相关性【1 5 1 。然而值得指出的是，也有研 究报道海藻糖的积累与乙醇耐性无关【l6 1 ，这种不一致的结果是否与酵母菌不同菌种的遗 传背景相关尚不清楚。 一3 一 酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究 海藻糖是由两分子葡萄糖通过0 【一1 ，1 一糖苷键连接而成的一种双糖，它不仅是一种 贮存性物质，而且是一种潜在的抗胁迫( 包括酒精冲击、热冲击) 保护剂【l 。酿酒酵母 在不利生长条件下，例如高温，冻结，脱水和干燥，饥饿，高渗和乙醇胁迫【l 引，海藻糖 大量积累。当酵母细胞暴露在硫酸铜或过氧化氢中时，海藻糖也有所累积。高海藻糖含 量的酵母在啤酒发酵的初始阶段细胞活力得到改善，碳水化合物利用增加。同样，海藻 糖含量的下降与酵母细胞胁迫耐受性的下降相关。s o t o 1 8 j 发现不能合成海藻糖的毕赤酵 母突变体对温度，冻融，脱水，氯化钠和乙醇都非常敏感。这些作者推断，海藻糖为一 般性胁迫反应中的关键因素。 海藻糖在胁迫耐受性上的确切作用依然未知，虽然有人认为在外界胁迫下它可以稳 定蛋白，保护细胞膜的完整性。h o t t i g e r 侈j 研究了纯化的葡萄糖六磷酸脱氢酶在体外的 热稳定性。0 5m 海藻糖补充至一系列含有葡萄糖6 脱氢酶的溶液中，然后从4 0 0 c 至6 0 0 c 温度范围内热击八分钟。冷却后，测酶活并和同样方式处理，但没有补充海藻糖的对照 组进行比较。经过5 5 0 c 的热击的经海藻糖处理的酶活比对照组大6 0 【1 9 】。这表明，海藻 糖增加了蛋白在体外的热稳定性；这一发现与d ev i r g i l i o 【2 0 】的发现是一致的。 对海藻糖具有上述了解之后，其他研究人员提出的证据表明海藻糖未必在胁迫条件 下对细胞有保护作用。参与海藻糖生物合成途径的酶基因有豫鲫( 海藻糖6 一磷酸合成 酶) ，t p s 2 ( 海藻糖六磷酸酶) 和t s l l t p s 3 ( 海藻糖6 磷酸合成酶的调节亚基) ，其 合成途径如图1 1 所示。突变的刀峪j 基因，使酵母细胞无法合成海藻糖，并且其热敏感 性增加【2 0 j ，然而，m 暇，基因( 负责海藻糖降解) 的缺失突变体，积累了高水平的海藻 糖，但他们极热条件下的生存能力反而下降【2 1 1 。这和其他工作导致在热胁迫下海藻糖具 有保护细胞的作用遭到质疑。但应指出，该n t h l a 突变体可能积累了过多的海藻糖，这 些海藻糖可能干预了其他细胞功能，包括对胁迫耐受性起着重要作用的分子伴侣的活 动。作者认为，当细胞遭受热胁迫时，早期快速积累海藻糖只需要很短的时间来稳定蛋 白的天然状态，其次是迅速降解海藻糖，有必要细胞在热胁迫下的全面复苏。事实上， 海藻糖作为胁迫条件下酵母细胞蛋白和质膜的稳定剂和保护剂早有证实【2 2 】。 大连理工人学硕士学位论文 罢獬；“置“tj善盏)l-(；lucoscl l iv ? ( ；r u r o 型黑。一， 一“。忘、弛曷”“j 捌 一1 ”“= 一 ：踹器 1 3 2 细胞能量代谢相关基因与乙醇耐性 a l e x a n d r e 等1 7 i 和c h a n d l e r 等嘲确定了糖酵解相关基因g l k l 、h x k l 、t d h i 、a l d 4 和p g m 的转录水平也在乙醇胁迫后得到提高。a l e x a n d r e 还同时发现了其他与产能相关 的基因( g p d i 、h o r 2 、g r e 3 、h o r 7 和d a k i ) 也存在受到乙醇胁迫时表达量增加的 现象阴。在最新的报道中，对sc e r e v i s i a e 发酵过程中细胞内及发酵液中a t p 、a d p 和 ( 【a t p + 05 a d p ) ( 【a t p 】+ a d p + 【a m p 】) 的维持依赖于葡萄糖甙的主动运输， 反之，葡萄糖的主动运输也依赖于能荷的维持。当发酵液中的葡萄糖甙浓度很低，不能 维持细胞的能荷时，细胞活性将急剧下降，说明了细胞能量代谢与乙醇耐性的重要关系 删。这些研究也提示，在发酵过程中循环使用酵母的时候，需要考虑酵母细胞的能荷状 态，发酵后期酵母细胞的能荷很低，只有发酵早期的酵母适合循环使用。 1 33 氨基酸合成及转运相关基因与乙醇耐性 s h i o y a 等2 4 1 的m i c r o a r r a y 分析结果表明，在乙醇耐性高的s a k e 酵母中，色氨酸合 成途径相关的基因表达量较高。进一步研究表明，色氨酸合成酶基因( t r p 2 和t r p 5 ) 和色氨酸透性酶基因( t a t 2 ) 的过量表达可以有效赋予酵母细胞良好的乙醇耐性。向含 有5 l 醇的培养基罩添加1 0 0 9 m l 色氨酸后，细胞的生长速率明显提高。这说明色氨 酸的添加也足赋予酵母细胞乙醇耐性的有效途径。作者的研究表明，向培养基中添加异 亮氨酸( 10e , l ) ，甲硫氨酸( 0 5 班) 和苯丙氨酸( 20g l ) 时，自絮凝酵母s p s c 酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究 于3 0 0 c 在2 0 ( v v )乙醇冲击下的存活率得到明显提高，其中添加氨基酸混合液的 实验组存活率为5 7 ，而对照组为o ，表明添加氨基酸能显著提高菌体的耐乙醇能力【2 5 1 。 日本学者s e k i n e l 2 6 1 发现编码酿酒酵母y 谷氨酰蛋白激酶的基因p r 0 1 的点突变 ( d 1 5 4 n ) 导致细胞对脯氨酸的反馈抑制减弱而过量积累脯氨酸，同时这种酵母突变体 的乙醇耐性提高，显示了胞内较高的脯氨酸含量对提高酵母细胞乙醇耐受性起到一定作 用。通过易错p c r 得到了朋d 的突变体文库，得到了更多由于p r 0 1 基因突变而导致 脯氨酸反馈抑制不敏感的突变体，同时发现，敲除尸矾基因( 与脯氨酸的分解利用有 关) ，并替换野生型的p r 0 1 为突变型的p r 0 1 ，所得到的突变体细胞内脯氨酸含量比 对照高5 倍，同时乙醇耐性得到提高【2 6 】。 b t n 2 p 负责酿酒酵母胞内蛋白转运，与氨基酸的运输、p h 调节和离子平衡有关。敲 除b t n 2 基因导致酿酒酵母对高乙醇浓度耐性的降低，而这种缺陷可以通过在培养基里 补充精氨酸、赖氨酸和谷氨酸来克服【2 7 1 ，显示了氨基酸的动态平衡与乙醇耐性的相关性。 1 3 4 细胞壁及细胞质膜成分合成相关基因与乙醇耐性 y a z a w a 等1 2 驯通过筛选酿酒酵母二倍体纯合子的缺失突变体库( 购买于i n v i t r o g e n ) ， 筛选到2 个单基因缺失的突变体a u r a 7 和a g a l 6 ，其在含8 ( v v ) 乙醇的培养基中 的生长速度明显高于野生型。u r a 7 编码c t p 合成酶，负责磷脂的生物合成及嘧啶的从 头合成。g a l 6 编码氨基肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族。这两种缺失突变体均对细胞 壁溶解酶( p 1 ，3 葡聚糖酶) 的抗性增强，说明了细胞壁的完整性与其乙醇耐性相关。 这两种突变体对白色荧光染料c a l c o f l u o r ( c f w ) 的敏感性不同，由于c f w 抑制细胞 壁的合成，说明这两种突变体内细胞壁完整性的改变机制是不同的。作者推测，z i u r a 7 的乙醇耐性提高与u r a 7 参与磷脂的合成有关，而根据以往的报道，a g a l 6 中热击蛋白 基因h s p l 2 和h s p 2 6 的转录水平分别提高4 3 倍和3 3 倍，这可能是该突变体乙醇耐性 提高的原因。 酿酒酵母的去饱和酶基因o l e j 编码位于细胞质膜上的去饱和酶，这种酶可以通过 氧化作用和依赖n a d h 的去饱和过程催化酵母细胞的棕榈酸和硬脂酸转化为棕榈油酸 和油酸。y o u i 刀j 用昆虫的膜去饱和酶基因t n i n p v e 对o l e l 基因的突变体进行互补，由 于昆虫的这个酶基因具有立体选择性和底物链长特异性，互补菌株的膜脂肪酸饱和度得 到了定向的改变。研究结果表明，油酸是使酿酒酵母具有乙醇耐性的有效不饱和脂肪酸， 表达昆虫去饱和酶基因的转化子乙醇耐性最强，这个转化子在不含乙醇的y p d 液体培 养基中培养至对数后期时油酸产量是棕榈酸的2 倍，在含有5 ( v v ) 乙醇的y p d 液 体培养基中油酸和棕榈酸产量的比例提高了4 倍，说明了油酸在乙醇耐性中的重要作 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 用，以及通过对细胞油酸合成的定向改造可以提高乙醇耐性。此研究结果与早期在 酿酒酵母中过量表达拟南芥脂肪酸去饱和酶f a d 2 后乙醇耐性明显提高的研究相 符【3 们。 本研究在对批式流加发酵的自絮凝酵母s p s c 0 1 进行乙醇耐性的生化机制研究过程 中，发现油酸与絮凝酵母的乙醇耐性不存在显著的相关性，棕榈油酸和棕榈酸与絮凝酵 母的乙醇耐性存在一定相关性，而硬脂酸与絮凝酵母的乙醇耐性存在显著的相关性p ， 这与早期在摇瓶培养过程中发现棕榈酸是增强絮凝酵母耐乙醇性能的结论矛盾，这体现 了培养条件的不同对酵母细胞生理特性的影响，突显了环境条件对乙醇耐性分子机制研 究的重要性。 1 3 5 糖转运蛋白与乙醇耐性 s a n t o s 等【3 2 】的研究发现，乙醇强烈抑制葡萄糖的转运，而且这种抑制似乎与遗传背 景无关，因为测试的7 种酵母都得到了同样的结果。但是抑制程度的不同直接影响了发 酵效率，抑制程度在5 0 以下的酵母能更有效的发酵，而抑制程度大于等于5 0 的酵母 菌种在同样的时间内不能完成发酵。这暗示着乙醇的耐性可能与糖的转运以及糖转运蛋 白对乙醇的耐受性有关【3 2 1 。研究结果发现，不同的酵母在乙醇存在下葡萄糖的运输能力 不同，显示了质膜转运蛋白对乙醇的耐性不同。可以设想，如果提高质膜转运蛋白对乙 醇的耐性，则可以保证足够的葡萄糖运输入细胞内，从而保证细胞在乙醇存在时的 活性。a l e x a n d r e 等【7 】和c h a n d l e r t 8 】等确定了高亲和力己糖转运蛋白基因h x t 6 和h x t 7 的转录水平在乙醇胁迫后得到提高。这些研究结果表明了葡萄糖转运蛋白对酿酒酵母 乙醇耐受性的作用，提示了可通过对葡萄糖转运蛋白的改造提高酿酒酵母的乙醇耐性。 然而酵母细胞存在多种葡萄糖转运蛋白【3 3 】，目前对这些转运蛋白和乙醇胁迫的关系还 很不清楚。 1 3 6 其他 d u 和t a k a g i 发现n 乙酰转移酶m p r l 能够降低酿酒酵母胞内的活性氧分子水平， 保护细胞在各种胁迫环境下的活性，如氧化胁迫、热胁迫、冻融等【3 引。m p r l 和m p r 2 的缺失突变体对乙醇胁迫高度敏感，而m p r l 在酵母细胞内的表达可以使酵母细胞获得 乙醇耐受性。此研究还发现，当酵母细胞暴露在乙醇中时，其活性氧分子浓度提高，提 示m p r l 可通过降低酵母细胞的活性氧分子浓度保护细胞免受乙醇的毒害。此外，v o o r s t 等【5 】和b e t z 等【3 5 】的研究表明，a s r l p ( a l c o h o l _ s e n s i t i v e _ r i n g p h df i n g e rl _ 1 2 r o t e i n ) 也可 能与乙醇耐受性有关。这种蛋白质在细胞核和细胞质之间穿梭，但当细胞暴露于乙醇中 时，a s r l p 则会积聚在细胞核中。而且a s r l p 只有当受到乙醇胁迫时才会在细胞核中积 酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究 累，其他胁迫条件，如氧化、渗透、养分限制和热胁迫 3 5 】都不会使得a s r l p 积累。推测 在乙醇胁迫下，a s r l p 在核内积累的原因可能是核输入加强或核输出受到抑制，同时 a s r l p 可能参与一个复杂的信号转导途径，使酵母适应乙醇胁迫。 表1 总结了近年来报道的与乙醇耐性相关的主要基因。 表1 1 近年报道的酵母乙醇耐性相关基因 t a b l e1 1e t h a n o lt o l e r a n c e r e l a t e dg e n e si ny e a s tr e p o r t e di nr e c e n ty e a r s g e n eg e n ep r o d u c ta n df u n c t i o nf u n c t i o n a la n a l y s i s l i s p l 2 t p s l t p s 2 t s l l 觚h l h x t 6 h 7 t r p 2 t r p 5 删刀 p r o l p u t l 删7 g 三6 h e a ts h o c kp r o t e i np r o t e c t i n gm e m b r a n e s f r o md e s i c c a t i o n s y n t h a s e s u b u n i t o f s y n t h a s e p h o s p h a t a s ec o m p l e x d h s p l 2g r e ws l o w e rt h a nw i l dt y p ey e a s t u n d e r1 0 1 2 e t h a n o l t r e h a l o s e t r a n s c r i p t i o n l e v e li m p r o v e du n d e r e t h a n o ls h o c k a c i dt r e h a l a s er e q u i r e df o ru t i l i z a t i o no f e x t r a c e l l u l a rt r e h a l o s e g l u c o s et r a n s p o r t e ro ft h em a j o rf a c i l i t a t o r s u p e r f a m i l y a n t h r a n i l a t es y n t h a s e ，c a t a l y z e st h ei n i t i a ls t e p o f t r y p t o p h a nb i o s y n t h e s i s t r y p t o p h a ns y n t h a s ei n v o l v e di nt r y p t o p h a n b i o s y n t h e s i s t r y p t o p h a na n dt y r o s i n ep e r m e a s e g a m m a - g l u t a m y lk i n a s e ，c a t a l y z e st h ef i r s t s t e pi np r o l i n eb i o s y n t h e s i s p r o l i n eo x i d a s e c t p s y n t h a s ei s o z y m e i n v o l v e di n p h o s p h o l i p i db i o s y n t h e s i s c y s t e i n ea m i n o p e p t i d a s e m p r la c e t ) 7 l t r a n s f e r a s er e d u c i n gi n t r a c e l l u l a rr o s d e c r e a s e d t r a n s c r i p t i o n o fat h l i m p r o v e de t h a n o lt o l e r a n c e t h ee x p r e s s i o ni m p r o v e da f t e re t h a n o l s h o c k t h e o v e r e x p r e s s i o r l o f t r y p t o p h a n b i o s y n t h e s i s a n d t y r o s i n ep e r m e a s e c o n f e r r e dy e a s tc e l l se t h a n o lt o l e r a n c e m u t a t i o no f 尸：r 0 1i m p r o v e de t h a n o i t o l e r a n c e t h ee t h a n o lt o l e r a n c e 尸唧m u t a n t w a si m p r o v e d u r a 7d i s r u p t a n tg r e wb e t t e ri np r e s e n c e o fe t h a n o l g n l 6d i s r u p t a n tg r e wb e t t e ri np r e s e n c e o fe t h a n o l t h en u l lm u t a n to ft h em p r la n dm p r 2 g e n e ss h o w e dh y p e r s e n s i t i v i t y t oe t h a n o l s t r e s s ，a n dt h ee x p r e s s i o no ft h em p r l g e n e c o n f e r r e ds t r e s st o l e r a n c e 1 4 金属离子添加对乙醇耐性的影响 探讨细胞不同组分和结构与菌体耐酒精的关系是从内因这个角度来研究酵母菌的 耐酒精机制，而外界因素如金属离子可能通过一定方式作用于细胞的某一成分或结构从 而影响菌体的耐酒精性能，这种从外因及外因与内因相互作用的角度研究酵母菌耐酒精 机制的工作报道尚罕见。而开展这些工作，对于系统揭示酵母菌的耐酒精规律可能具有 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 一定价值。本课题组在长期的乙醇发酵研究中，做了许多通过添加金属离子提高乙醇耐 性的探索。胡纯铿博士用2 0 ( v v ) 的乙醇冲击9 小时后，添加m 9 2 + 或c a 2 + 的存活率 分别为5 3 和5 0 ，对照组存活率为0 t 3 6 1 。但是，有关锌离子影响酵母菌耐酒精的作用 机制研究尚罕见j 本实验是通过向培养基中添加不同浓度硫酸锌，研究锌离子对酵母菌 发酵性能的影响，结果发现当培养基中锌离子浓度为0 0 5g l 时，乙醇产量与对照组相 比高出8 4 【3 7 1 。r a f f a e l e 3 8 】等人从内因的角度揭示了酿酒酵母在转录水平上对锌离子做 出的响应，结果表明，酿酒酵母中含有锌离子特异性调节子z a p l p ，该调节子由2 6 个 基因组成，并且它们含有锌离子响应共有序列。并且该实验室第一个发现依靠锌离子调 节的基因参与调节贮存糖类的代谢途径，如海藻糖代谢。关于锌离子对海藻糖代谢的调 节，该实验室研究结果显示，当培养基中锌离子缺乏时，参与海藻糖生物合成与代谢的 酶基因t p s l t p s 2 t p s 3 的表达量均被下调，胞内海藻糖含量大幅度下降。但是参与海 藻糖代谢的这些基因不含有锌离子响应元件z r e ，说明这些基因的转录调节不依赖于调 节子z a p l p 。他们推测这种下调作用的发生可能依赖于压力响应元件s t r e ，但作者却 没有在t p s l t p s 2 t p s 3 基因的启动子区域发现s t r e 。 1 5 酵母所受压力胁迫及其响应元件s t r e 介绍 在酿酒酵母发酵过程中，酵母生产株必须应对外界环境中溶解氧浓度，p h 值，渗 透压，乙醇浓度，营养供应和温度的波动【3 9 1 。酵母菌株依赖于他们自身的调节能力，以 适应这些变化，特别是在酵母批次发酵过程涉及到发酵液的回收和酵母细胞的再利用 时，酵母对外界环境的调节适应能力显得尤为重要。现代工业生产中进行的超高浓度发 酵及制备干酵母进行接种，增加了酵母细胞遭受的环境胁迫种类。酵母对这些不利条件 的积极响应能力不仅对于发酵特定产物是必须的，而且还有利于保持酵母细胞活性用于 随后的发酵1 3 9 。 一9 一 酿酒酵母乙醇响应报告载体的构建和研究 。湖口t i 、cs t r e s s 隧滋函滋溺溺溺溺图 。翻n o b c 或m s s 勉麓， 一：7 、? z 一、。 a n a c r o h h ：s h i f tc o l ds h o c k c o l ds h o c k 么函函函滋凰豳圈豳豳翻髓豳豳豳琵琵豳 o x i d a t h 。c o s m o t i cs t r e s sn u t r a i o n a l e t h a n o ls t i s s e d l a n o | t o x i c 醇 豳豳蕊盔盔慧o = 2 。= = = = ：盈盈豳圜豳隧豳滋滋盈函函豳圜 t i m e c e l l d c l i s 醣一。一。楚鲫 e d 髓n o l 。w o r t # a s 吟t c m p c r a t u r c 图1 2 酵母在生长，发酵和贮存时所受的环境胁迫示意图p j f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h et e m p o r a la n ds e q u e n t i a ln a t u r