（植物病理学专业论文）水稻WRKY63基因的克隆及水稻PR1基因诱导表达的研究.pdf

摘要 w r k y 类蛋白是广泛存在于植物中的一类转录因子，参与植物对病原物的防卫反应、非生 物胁迫以及某些生长发育的生理过程。本研究利用筛库的方法，从稻瘟菌激发予处理的水稻悬 浮细胞的基因文库中分离了全长的w r k y 6 3 基因。这个基因是w r k y 家族转录因子中的新成 员，它被推测编码含有4 3 5 氨基酸的蛋白质。利用农杆菌介导的方法，将该基因超表达后转入 烟草，得到转基因植株3 0 个株系。 病程相关蛋白( p r 蛋白) 是植物在防卫反应过程中诱导产生的一类蛋白，在植物的抗病抗 逆过程中发挥重要作用。本研究利用p c r 的方法克隆了水稻p r 基因的启动子，并且将该启 动予与g u s 报告基因相连，通过农杆菌的介导转入烟草，得到转基因植株2 8 个株系。利用 w r k y 8 9 和w r k y 6 3 转录因子诱导、机械损伤、紫外照射，植物激素等因素处理转基因烟草， 发现这些因素均不能诱导p 尼j 基因启动子活性发生显著变化。结果表明两种w r k y 蛋白不能 调节p r l 基因在烟草中的表达；艘基因的表达也不受机械损伤、紫外照射和植物激素等非生 物因素的诱导。 关键词：水稻w r k y 6 3 基因，烟草，水稻p r l 基因，g u s 活性 a b s t r a c t w r k yt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，w h i c ha p p e a rt oe x i s ti n p l a n t se x c l u s i v e l y , f i l ei n v o l v e di n r e s p o n s e st op a t h o g e n , a b i o t i cs t r c s $ ，a n di nr e g u l a t i o no fd i v e r s ed e v e l o p m e n t a lo rp h y s i o l o g i c a l p r o c e s s i nt h i ss t u d y , t h ew h o l el e n g t ho s w r k y 6 3g e n ew a si s o l a t e df r o ma r i c eg e n o m el i b r a r y , c o n s t r u c t e df r o mr i c es u s p e n s i o nc e l l s ( o o z as a t i v a , c u l t i v a ri r 7 2 ) t r e a t e dw i t hm a g n a p o r t h eg r i s e a c e l lw a l lf r a g m e n t sa se l i c i t o r sb yt h em e a n so f s c r e e n i n gt h ep h a g el i b r a r y t h eg e n ew a sp r e d i c t e dt o c o d eap r o t e i nc o n t a i n i n g4 3 5a m i n oa c i d s t h e n , t h i sg e n ew a st r a n s f o r m e di n t ot o b a c c ob y a g r o b a c t e r i g mm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o da f t e ri t so v e r e x p r e s s i o r l3 0t r a n s g e n i cl i n e sw m o b t a i n e d p a t h o g e n e s i s - r c l a t e d ( p r ) p r o t e i ni st h ek e ym e m b e ri n v o l v e di np l a n tr e s p o n s e st op a t h o g e n y i nt h i sr e s e a r c h , t h ep r o m o t o ro fd c op r lg a n ew a sc l o n e db ym e a n so fp c ra n dw a st r a n s f o r m e d i n t ot o b a c c ob ya g r o b a c t e r i u mm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o da f t e ri t sc o n s t r u c t e dw i t ht h er e p o r t g a n eg u s 2 8t r a n s g e n i cl i n e sw e o b t a i n e d t h e n , s t r e s sf a c t o r ss u c ha sw r k y 8 9a n dw r k y 6 3 t r a n s c r i p t i o nf a c t o rr e g u l a t i o n 、m o c h a n i c a lw o u n d i n g 、u l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o na n dp l a n th o r m o n ew e r e 1 8 e dt od e t e c lt h ea c t i v 崎o ft h e 朋j sp r o m o t o r w ef o u n dt h a tl l o n ! o ft h e mc c a n s er e m a r k a b l e c h a n g eo f a c t i v i t yo f t h ep r j sp r o m o t o r k e y w o r d s ：o s w r k y 6 3g e n e ，t o b a c c o ，p r lg e n e ，g u sa c t i v i t y 独创性声明 本人声明所旱交的硷文足我个人在导师指导f 进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中回农业大学或其它教育机构的学位 或l 正书而使用过的材料。与找一同丁作的同忐对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 力移么 时间：以年f f 月弼日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复i = ：| j 件和磁盘，允许论文被套阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议1 研究生签名： 五观 时间：嘭年cr 月彤日 、x 导师签名：；毛硬恕 时间： 年i 、月“日 第一部分文献综述 中目农业大学硕 学位论文第一章w r k y 转录因子的介绍 第一章w r k y 转录因子的介绍 1 i 植物转录因子 1 1 i 概述 植物在长期的进化过程中，为了适应环境和满足各种生理需求，形成了复杂而精巧的调节机 制。内外环境的变化作为信号被感知后，通过一系列信号途径，引起相关基因的表达状态发生改 变，最终赋予植物在生理上的适应性。多数情况下，基因表达的调控发生在转录水平。转录因子 在特定的时间进入细胞核内，与特定基因启动子区域中的顺式作用元件互作或与其它相关蛋白互 作，实现基因的时空表达许多实验，诸如转录因子基因在各种条件下的诱导表达、c d n a 微阵 列分析和转基因分析，都证明了转录因子在基因的表达与调控中的重要性 转录因子( t r a n s c r i p t i 伽f a c t o r 。t f ) ，又称反式作用因子是指一些能够与真核基因启动子 区域中的顺式作用元件发生特异性结合的蛋白质分子，它的主要功能是保证目的基因以特定的 强度、在特定的时间与空间表达。转录因子在高等植物的生长发育以及对外界环境的反应中起 调控作用。当环境条件变化时，植物能通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因子与相应 的顺式作用元件结合后能够启动特定基因的转录表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信 号做出反应。 高等植物的转录因子一般有4 个功能区，即d n a 结合区( d n ab i n d i n gd o m a i n ) ，转录调 控区( t r a n s c r i p t i o nr e g i l l m i o nd o m a i n ) ，寡聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 和核定位信号( n u c l e a r l o c a l i z a t i o ns i z n a l ，n l s ) 转录因子的这些功能区决定转录因子的功能、特性、核定位和调控 作用。 一般情况下，转录因子的分类是根据保守的d n a 结合域进行的( l u s c o m b ee ta 1 2 0 0 0 ) 在 植物中，转录因子分成若干类型。表1 1 列出了一些常见的植物转录因子及其d n a 结合域的结构 特征。 2 中国农业大学硕卜学位论文 第一章w r k y 转录田子的介绍 表i 1 植物中主要转录因子家族的来源 b z i p6 0 - 8 0a t , 包括1 个2 5m 的富含 碱性氨基酸的区域和1 个l z z - c 2 h 23 0 a a 残基组成含两个保守的 c y 鲥 , e 或两个h i s 约5 6 a a 组成。含有1 个k a - 螺旋和两个b 链 种子储存蛋白基因表达l 7 50 a k o b y , 2 0 0 2 ) 光形态建成；叶发育；花 发育：防卫反应；a b a 应答； g a 生物合成 花发育：开花时间；种子 发育；根节发育 d o f ：3 7 ；c o - l i k e , 3 3 ； g a l i 2 8 ；y a b b y ，6 花发育；果发育；开花时问； 1 0 7 ( p a x e n i c o v a 等2 0 0 3 ) 根发育 m y b 含有1 - 3 个由5 l 5 3 缸组成的呈 次生代谢；细胞形态建成； 螺旋- 转折- 螺旋构象的不完全重植物生长；生物或非生物胁追 复序列，每个重复含3 个保守的1 押 昼夜节律 a p 2 ， e r f b h l h 约6 0a a 组j 藐含有3 个平行的a 晰叠 和1 个双亲性b 螺旋 花发育；细胞增殖；生物或非生物 胁迫反应；a b a 、乙烯应答 1 8 0 1 4 4 含有两个相连的基本亚区，其中碱性花青素合成；光应答；1 1 3 ( h e r i n 等，2 0 0 3 ) a a 区与d n a 结合有关。螺旋环螺非生物胁迫； 旋区参与二聚体形成花发育 约6 0a a 组成的折叠成球形 结构域，古有3 或4 个m 螺旋 w r k y 约6 0a a 组成，n 端有保守的w r k y , c 端有c 2 h 2 或c 2 h c 锌指纹 a r f 由3 5 0 组成的类1 1 ；【b 3 的序列 - a u x i a a 叶、茎节、子房发育；细胞分化； 花青素合成；细胞死亡 生物或非生物胁迫反应；a b a 、g a 应答；表皮毛发育、鞣质合成； 糖代谢；种子休眠；倍半萜烯合成： 体细胞胚发育 生长素反应；发育和分生组织模式发育 n a c d 由2 个扭曲的反平行肛片层组虎胚、花和营养器官发育； 一端为伽螺旋另一端为短的螺旋防御与非生物胁迫反应 7 4 ( k a l d e 等, 2 0 0 3 ) a 陋2 3 a u x i a a , 2 7 1 0 9 a d e s c r i p t i o n so fc o n s e r v e dd o m a i ns t l u g t u r e sa n df u n c t i o n so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o rf a m i l i e sa l e a c c o r d i n gt ol i u , e ta ( 2 0 0 0 , i nc h i n e s e ) a n dr i e c h m a n n ( 2 0 0 2 ) , r e s p e c t i v e l y a a , a m i n oa c i d b p r e d i c t e dn u m b e r so f f a m i l ym e m b e r si na r a b i d o p s i s w u 酷i n d i c a t er e f e r e n c e ( s ) c i t e d o t h e r w i s e 。 p r e d i c t e dn u m b e r sa r ef r o mr i e c h m a n n ( 2 0 0 2 ) c t h ef u n c t i o n so f t h ef a m i l ym er e v i e w e di no l k e ra n ds o m s s i c h ( 2 0 0 4 ) d c o n s e x v c dd o m a i ns t r u c t u r ea n df u n c t i o n so ft h i sf m n i l ym d o c u m e n l li ne r n s t , e t 斌2 0 0 4 ) a n d o l s e n , e ta l ( 2 0 0 5 ) ，r e s p e 娟v e l y 3 中国农业大学硕卜学位论文第一章w r k y 转录因子的介绍 1 1 2 研究高等植物转录因子的方法 研究转录因子功能的方法主要有瞬间转化分析、突变分析，以及近年来发展起来的r n a 干涉 技术等。 植物转录因子的瞬间表达分析 瞬间表达分析可以快速提供转录因子的d n a 结合特性和转录调控特性( 激活或抑制转录) 等信息( s c h w e c h h e i m e re ta ，1 9 9 8 ) 植物转录因子的瞬间表达分析根据所用的材料不同可分为植 物细胞瞬间转化分析和酵母细胞瞬间转化分析两种。 植物细胞瞬间转化分析的通常做法是：构建两个载体，一个是转录因子高水平表达的效应载 体；一个是目标启动子与报告基因融合的报告载体。这两个载体共转化合适的植物细胞( l i ue ta 1 。 1 9 9 9 ) 。所表达的转录因子将与目标启动子互作，激活或抑制报告基因的表达，通过测定报告基因 的活性来反映转录因子与目标启动子的调节特性。通常都设一个不含目的基因序列的空载体共转 化对照。瞬间转化的具体方法有：植物组织的基因枪转化、原生质体的电转化、p e g c a c l 2 介导 的瞬问转化等。 植物细胞瞬间转化分析能快速地分析转录因子的有关特性，但也有一定的局限性当所研究 的转录因子是激活因子，而与其互作的目标启动子又是胁迫或伤诱导的时候，在上述瞬间转化分 析的组织准备过程中，目标启动子很难在转录因子等位基因存在的情况下保持沉默或低活性，通 常报告基因会因相应内源转录因子的作用而被激活( s a b l o w s l da n dm e y e r o w i t z , 1 9 9 8 ) 。因此，对于 这些情况，理想的检测组织应该来自于不表达该转录因子的突变体。 由于某些类型的转录调控域在植物体内和酵母体内都能介导转录调控活性，因此酵母细胞瞬 间转化分析也可提供植物转录因子d n a 结合特性及其转录调控特性的重要信息。酵母细胞瞬间 转化分析与植物细胞瞬间转化分析一样，也需要构建效应载体和报告载体，而且具体做法也类似。 但酵母细胞瞬间转化分析通常主要用来研究植物转录因子的d n a 结合特性或转录调控特性，因 而具体做法因其研究的侧重点不同而有所差异( y a n a g i s a w a , 2 0 0 1 ；p a r ke ta ，2 0 0 1 ；u n oe ta ， 2 0 0 0 ) 相对植物细胞瞬间转化分析而言，酵母细胞瞬间转化分折更加简便、快速。但有些类型的转 录激活域，如富含谷氨酸类，在酵母细胞中无活性( p o n t i c e l l i 盯a ，1 9 9 5 ) 。另外也发现某些植物转 录因子与酵母内源转录因子之间存在相互干扰作用( s c h m i d t e t a 。1 9 9 2 ) 总的来说，瞬间表达分析虽然能快速分析转录因子的d n a 结合特性和转录调控特性，但在 综合分析其功能方面具有一定的局限性，因此需要与植株体内功能分析相配合 突变体或转基因植株功能分析 植物转录因子的功能需要从植株表型、生理代谢、基因表达等方面进行综合分析，而植株表 型、生理代谢变化往往是由基因表达的改变引起的，因此分离确定植物转录因子调控的目标基因 是转录因子研究中很重要的内容。只要有合适的突变体。就可以从植株表型、生理代谢、基因表 达等方面的差异，分析该基因的功能，并且应用其他相关技术分离出下游基因。植物体内研究转 录因子功能基因的两大策略是缺失基因突变分析和功能获得突变分析 人工产生功能缺失突变体的常见方法有： 4 中国农业大学硕仁学位论文 第一章w r k y 转录田于的介绍 反义抑制和共抑制。反义抑制是指反向的基因全长或部分序列与高活性的组成型启动子或组 织特异性启动子融合，通过转化，获得转基因植株。转基因植株中该序列所表达的r n a 与其靶 r n a 相互作用，影响靶r n a 的正常修饰、翻译等过程，封闭或抑制内源基因的正常表达。共 抑制是指正向的基因序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得转 基因植株。转基因植株中该序列所表达的r n a 抑制同源性( 包括半同源) 基因的表达。反义抑 制和共抑制已经成功的鉴定了一系列转录因子的功能( l e ee t0 1 ，2 0 0 1 ；x i ee t0 1 ，2 0 0 0 ) 转座子和t - d n a 插入突变。这类方法可利用插入序列设计特异引物，用t a i l - p c r 等反向 遗传学技术获得插入失活的基因。早在1 9 9 9 年，m e i s s e n e r 已经用这个办法分离鉴定了一批拟 南芥转录因子m y b 基因家族的突变体( m e i s s n e re t0 1 。1 9 9 9 ) 。 r n a 干涉( r n a i n t e r f e r e n c e , r n a i ) 。这种方法是指同一基因序列的正义和反义r n a 所形 成的双链r n a 结构，引起细胞质内同源r n a 降解及细胞核中同源d n a 的甲基化，从而干扰 同源基因的表达，引起目标基因沉默。虽然具体机理还不是十分确定，但这项技术的应用却是热 点。c h u a n g 和m e y e r o w i t z 已经利用r n a i 技术获得t a g ( a g a m o u s ) 和a p l ( a p e t a l ad 功能缺失 突变体，而这两个基因编码的正是参与拟南芥花发育的m a d s 类转录因子a g 和a p l ( c h u a n g a n dm e y e r o w i t e ，2 0 0 0 ) 利用基因功能缺失突变体分析转录因子功能，虽然已经有很多成功的例子，但也存在一个问 题：即许多转录因子只是其基因家族的成员之一，而家族成员间存在功能冗余，一个基因的纯合 突变体由于其它成员的功能补偿而很难确定其功能特征( p e l a ze t0 1 ，2 0 0 0 ) 。因此需要与基因功能 增加型突变体分析相结合。 转录因子功能获得突变分析主要方法有基因超表达合基因诱导表达( s a b l o w s k ia n d m e y e m w i t z , 1 9 9 8 ) 。 超表达是指目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异性启动子构建在一起，通过转化 获得该基因产物大量表达的植株。超表达已成功鉴定了一系列植物转录因子的功能( p a r ke ta 1 2 0 0 1 ；x i ee t 0 1 ，2 0 0 0 ) 。但基因的过量表达可能导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应，很 难从表型中鉴定出所需的转基因植株。即使得到转基因植株，也会因为转录因子的超表达而与不 相关启动子中低亲和力的结合位点结合，激活一些不相关基因的表达，很难评价超表达链中各个 基因的调控关系( l i ue ta 1 ，1 9 9 9 ；z h a n g , 2 0 0 3 ) 。 而基因诱导表达可以较好地实现基因表达的时问、空间和数量控制( o a t z 1 9 9 7 ) 为了避免内 源基因的干扰作用，可诱导系统是以非植物成分为基础构建的。在非诱导条件下，所转化的基因 不表达或表达但其产物没有活性，不会干扰植物的正常发育，也不会导致多重效应一旦给予诱 导，基因将迅速表达或其产物迅速被激活，并在一定时间内保持稳定。在植物转录因子研究中， 常用的诱导表达系统是利用鼠的糖皮质激素受体( g l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o r , g r ) 进行翻译后诱导 ( a o y a m aa n dc h u a , 1 9 9 7 ) 。通过这个系统，玉米调控蛋白r 在拟南芥半透明种皮突变体中 ( t r a n s p a , 吲t e s t ag l a b r a , u g ) 诱导表达，从表型变化鉴定其功能( l l o y de ta 1 。1 9 9 4 ) 。拟南芥 a p e t a l a 3 ( a p 3 ) 与p i s t i l l a t a 0 i ) 同时在a p 3 3 突变体诱导表达，从表型变化鉴定了a p 3 的 功能a p 3 是m a d s 类转录因子，是调控花瓣形成的( s a b l o w s k ia n dm e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ) 1 1 3 小结 5 中国农业大学硕十学位论文第一章w r k y 转录田了的介绍 最近几年对高等植物转录因子的研究进展迅速，特别是在转录因子的结构与功能研究上。其 研究成果对农作物性状的改良具有总要的意义。可以通过改变转录因子的表达活性来提高植物抗 逆、修饰植物的形态发生、调控生长发育。随着转基因技术和遗传分析方法的结合，将会鉴定出 更多对植物改良有重大意义的转录因子。 1 2w r k y 类转录因子 1 2 1 概述 w r k y 类蛋白首先由l s h i g u r o 和n a k a m u r a 从甘薯中发现，当时他们把这种新的d n a 结 合蛋白命名为s w e e t p o t a t o f a c t o r i ( s p f l x l s h i g u r o a n d n a k a m u r a , 1 9 9 4 ) 紧接着在各种植 物中发现了相似的蛋白，如野燕麦的a b f i 和a b f 2 ( r u 妯t o ne ta l ，1 9 9 5 ) 、拟南芥的z a p i ( d e p a t e r e t 以，1 9 9 6 ) 和欧芹的p c w r k y l ，2 ，3 ( r u s h t o n e t a 。1 9 9 6 ) 。这些蛋白的共同结构特征是， 都有一个高度保守的、含w r k y g q k 的d n a 结合域，称w r k y 结构域。含有该结构域的蛋 白因而统称为w r k y 蛋i ；l ( r u s h t o ne t 以，1 9 9 6 ；e u l g e m e t a ，2 0 0 0 ) 。据初步统计，到目前为止， 大约有2 0 余种植物发现有w r k y 蛋f l ( w ue ta l 。2 0 0 5 ) 。w r k y 蛋白在高等植物中构成一个基 因超家族( g e n es u p e r f a m i l y ) 。拟南芥中有7 4 个成( k a l d ee t 以，2 0 0 3 ) 。水稻中有1 0 0 余个成 员( w ue t a l 。2 0 0 5 ；z h a a g e t a l ，2 0 0 5 ) 。近年来，许多实验表明，w r k y 蛋白参与植物对生物和 非生物胁迫反应和一些生理发育过程。 1 2 2w r k y 的结构域( w r k y d o m a i n ，w d ) w r k y 蛋白结构的共同的特点是各成员中都含有1 - 2 个w d 该结构域包含大约6 0 位a a 残基，n 端的七肽w r k y c , q k 十分保守，c 端有一个q h 2 或c 2 h c 的锌指纹结构根据w d 的数目和锌指纹结构的类型，拟南芥w r k y 蛋白分成3 组( e u l g e me t a 。2 0 0 0 ) 。第1 组含2 个w d ， 锌指纹结构模式为g _ x “一x n f 弭- x 书，如最早识别的w r k y 蛋白s p f l ( 1 s h i g u r oa n d n a k a m u r a , 1 9 9 4 ) 、a b f l ( r u s h t o ne t a ，1 9 9 5 ) 、z a p i ( d e p a t e r e t a ，1 9 9 6 ) 和p c w r k y ! ( r u s h t o n e t a 。1 9 9 6 ) 等；第1 i 、m 组均含1 个w d ，前者锌指纹结构模式与第一组相同，后者仅在组成锌指 纹的氨基酸有变化，为c - x r c - x 2 2 - 2 3 - h - x - c 。水稻w r k y 根据锌指纹的组成分类，更能体现进 化关系( w ue ta l ，2 0 0 5 ；z h a n ga n dw a n g , 2 0 0 5 ；x i ee t 耐，2 0 0 5 ) 。第1 组的大部分含2 个w d ， 锌指纹结构为c - x 4 - c - x 2 2 u h x h ；第1 i 组含1 个w d ，锌指纹结构为c x r c 一) 匕- h x h ；第1 i i 组含1 个w d ( o s w r k y 9 3 、9 4 有2 个w d ) ，该组成员的锌指纹差异大。在前两个c 之间以及第2 个c 与 h 之间的氨基酸间隔变化范围颇大如果将锌指纹模式表述为c - x m - c - x n - h x h c ，那么m 的值可 以是4 8 ，n 的值可以是2 2 2 9 ，甚至3 3 一般说来，i l i a 为c - x r c - x2 3 - h x c ，i i i b 为c - x r c - x 6 中国农业大学硕卜学位论文第一章w r k y 转录因子的介绍 i it , 1 i 卜h x c ( n ；2 4 ) ( w ue ta 1 ，2 0 0 5 ) - w r k y 中两个w d 的功能不一样。c 末端的w r k y 域( c - t e r m i n a lw r k yd o m a i n ，c t w d ) 对 w r k y 蛋白的功能是必需的，负责与d n a 元件结合。n 末端的w r k y 域( n - t e r m i n a lw r k y d o m a i n ，n t w d ) 的功能不祥。或许与c t w d 旁侧的其它序列一道参与蛋白与目标位点间的结合 过程，增加结合的亲和力或特异性；或者提供这些蛋白与其它蛋白互作的接触界面( e u l g e m e t a l ， 2 0 0 0 ) 。也有可能在形砌：y 基因进化过程中，n t w d 的功能被专门的辅助因子所替代( w ue ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。此时w r k y 蛋白行使功能时并不需要n t w d ，因而n t w d 在进化的过程中被丧失。有意 思的是，对水稻、拟南芥和其它原始种类( 如衣藻，粘菌) w r k y 蛋白中w d 进行比对发现， o s w r k y 8 6 和9 5 含2 + n t w o ，解析这些w r k y 蛋白的功能将为n 阿d 确切的生物学意义提供 有价值的线索o v ue ta 1 2 0 0 5 k 起先认为w 砌吖域t ：p w r k y g q k 七肽是不变的( e u l g e me ta 1 ，2 0 0 0 ) 。事实上，w r k y g q k 中 氨基酸残基并非完全保守。s t s p ( h u a n ga n d d u m a n , 2 0 0 2 ) 的c 末端w r k y 域为w p k y g q k ( 第二 残基由n p ) 对推定的水稻和拟南芥w r k y 蛋白进行分析( w ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 表明， r k ( 第3 位和第7 位) 、g 和q 都有变化的例子。o 在大多情况下变成e 或k ；r 在水稻中变成l 、k 或s ，而在 拟南芥中变成q 。m a e o 等( 2 0 0 1 ) 认为，w 、r 、k 、y 和锌指纹基元上的任何变化都会降低、甚至 完全丧失w r k y 蛋白与d n a 的结合活性。上述w r k y g q k 区域发生变化的蛋白能否与d n a 元件 结合，对证明它们是否仍然具有生物学功能具有重要意义。不过上面提及的s t h p 仍能与含w 盒 的z a p - 1 c 元件结合( h u a n ga n dd u t n a l l ，2 0 0 2 ) 。 另一个重要的特征是，第1 组w r k y 蛋白的c t d 和其余两组的w d 所对应的基因序列含有内含 子。其位置高度保守( w ue ta l ，2 0 0 5 ) 。总的说来，水稻w d 中有两种类型的内含子：一种与拟南 芥类似，在r 的密码子内的p h a s e - 2 ：g 含子，称r 型，分布在w d 的第1 组、c 、i i d 亚组和第1 i i 组； 第二种位于锌指纹c 2 h 2 中第- - - - + c 之后、v 密码子之前，属p h a s e * 内含子，称v 型。v 型在w d 的 第l l a 和i i b 亚组。而第l 组w r k y 的n 哪d 和一些w r k y 中没有内含子，如拟南芥的w r k y 5 3 , 栊， 一酊和水稻的w r k y 3 。- 8 , 2 0 ，- 5 3 等( w ue t a t ，2 0 0 5 ) 。内含子的丧失是册瑾因进化过程中的重 要事件 内含子存在的意义不清楚，可能与转录后的加工，如选择性拼接( a l t e r n a t i v es p l i c i n g ) 有关。 事实上，在水稻中，w r k y 基因存在转录后的选择性拼接现象，如o s w r k y 3 5 的一个拼接变异体 仍保留第4 个内含子( 8 8 n t ) c 端的5 4 m ，这样就比推定的蛋白多了1 8 个氨基酸，提示选择性的拼 接可能参与w r k y 蛋白功能的调节i e “以，2 0 0 5 ) 。 1 2 3w r k y 域与w 盒 在所有研究过的可能受w r k y 蛋白调节的基因启动子中，都能发现( t ) t g a c ( c ，r ) 这样 的保守序列，成为w 盒，它是w r k y 蛋白特异的d n a 结合区( r u s h t o ne ta 1 ，1 9 9 6 ；y a n ge ta 1 ， 1 9 9 9 ) 已确认的w r k y 蛋白目标基因中，绝大多数都是基于能与w r k y 蛋白特异结合的特性而 识别出来的，因此，w 盒成为识别盒筛选w r k y 目标基因的必要条件大多数目标基因启动子中 都含有多个w 盒，它们之间的位置相近，或同向或呈回文结构捧列如皱叶欧芹的p c w r k y i 启 动子中有3 个w 盒，位置靠近，其中2 个呈回文排列( e u l g e me t 以，1 9 9 9 ) 虽然w r k y 蛋白总是与 7 中国农业大学硕j 。学位论文 第一章w r k y 转录因子的介绍 目标基因启动子中的w 盒结合，且w 盒的组成是崮定不变的，但是w r k y 家族中各个不同w r k y 因子参与基因表达调控却是特异性的，造成这种现象的可能原因是w 盒的数量、排列方式、间距 以及侧翼序列等不同。 关于w r k y 蛋白与w 盒相互识别及结合的分子机制还不是很清楚。一些实验的结果表明，分 离纯化的w r k y 蛋白以及经病原菌或防卫信号分子诱导的植物细胞核抽提物都能与w 盒结合 ( i s h i g u r oa n dn a k a m u r a , 1 9 9 4 ；r u s h t o ne ta ，1 9 9 5 ；r u s h t o ne ta 1 ，1 9 9 6 ；m a e oe t 以。2 0 0 0 。另外如 果w 盒中的核心序列t g a c 中的任一核苷酸被替换，w r k y 蛋白与之结合的能力就大幅下降或完 全消失，说明这中结合是非常特异的( d ua n dc h e r t , 2 0 0 0 ) 。这种结合还需要金属离子参与，用金 属络合荆如e d t a 处理可阻断其结合。最有可能的金属离子是z n 2 + ，这与w r k y 蛋白中含有锌指 结构的现象是一致的。另外，w r k y 蛋白与w 盒的结合还需磷酸化，因为用碱性磷酸酶预处理强 烈抑制这种结合( m a e oe fa 。2 0 0 1 ) 。 1 2 4w r k y 转录因子的起源与进化 一直以来，w r k y 类转录因子被认为是植物所特有的类型( e u l g e me ta 。2 0 0 0 ) 。最近，在非 光合生物粘菌( d i c t y o s t e l i u md l s c o i d e w n ) ( a a 0 5 2 3 3 1 ) 和鞭毛虫( g i a r d i al a m b l i a ) ( e a a 4 0 9 0 1 ) 一种单细胞的原生动物发现了编码w r k y 样蛋白的序列。在单细胞的绿藻 ( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d a i ) 中也发现了一个聊隧玛因( w u e t a ，2 0 0 5 ；2 抽i l g a n d w a n g , 2 0 0 5 ； 0 1 k e ra n ds o m s s i c h , 2 0 0 4 ) 。这些生物中的w r k y ( 样) 蛋白均含两个w d ，属于第1 组，暗示第l 组w p k r j a 因可能代表最原始的基因形式这些基因发源于1 5 2 0 亿年前的真核生物，此时植物界 尚未从真核生物界分歧出来( 0 l k aa n ds o m s s i c h , 2 0 0 4 ) 。另外，从较低等植物苔藓( p h y s c o m i t r e l l a p a t e n s ) 中分离了一些w r k ye s t ，有趣的是，在这些e s t 所代表的聊y 中，还没有发现第1 i i 组 的成员( o l k e r a n ds o m s s i c h , 2 0 0 4 ) ，提示w r k y 第1 i i 组的基因分歧是该家族进化的后期事件 基因重复( d u p l i c a t i o n ) 、结构域重组( r e c o m b i n a t i o n ) 和序列分歧( s e q u e n c ed i v e r g e n c e ) 是基因进化的主要源泉( o h n o ，1 9 7 0 ；c h o t h i ae ta l ，2 0 0 3 ) 。拟南芥和水稻基因组测序的完成为分析 w m c h j a 因家族的进化提供了十分便利的平台。水稻和拟南芥w r k y 的w d 聚类分析表明，w d 的 在染色体上重复，丢失和获得( 1 0 s sa n dg a i n ) 是导致这类基因在基因组中大量扩增( a m p l i f i c a t i o n ) 和产生多样性( d i v e r s i f i c a t i o n ) 的原因( w ue ta l ，2 0 0 5 ) o s w r k y 9 3 和- 9 4 均含有2 个w d ，这4 个 w d 聚类在一起，提示w d 发生了重复。不仅如此，同一染色体或不同染色体间的某一区段间也可 发生片段重复( s e g m e n t d u p l i c a t i o n ) 在1 l 和1 2 号染色体间，这种现象非常典型。o s w r k y 8 7 - 9 1 和o s w r k y 9 6 - 1 0 0 分别位于1 l 号染色体的o s j n b b 0 0 0 4 8 0 5 和1 2 号的o s j n b b 0 0 2 7 8 0 7 两个b a c 克 隆上在这2 个基因簇中，每一基因都有一个相对于着丝粒相反位置的旁系同源基因，说明发生 了染色体间的倒转片段重复( i n v e r t e df r a g m e n td u p l i c a t i o n ) 另外，w d 的重捧( a r r a n g e m e n t ) 是导致翮獬蓓因分歧的重要原因聚类分析表明，o s w r k y 4 1 和一1 0 1 之间以及伪聊t 嗣留6 和7 j 之 间发生了明显的结构域重捧，导致了这些基因的分歧。明蠛因进化过程中还存在结构域的丢 失现象。拟南芥w r k y l 0 只含一个c 1 w d ，属于w d 的i b 亚组o v ue ta 。2 0 0 5 ) ，可能是由于丢失 了n t w d ：在水稻中，o s w r k y 8 3 ( 只有一个w d ) 的n 刑d 、8 6 9 5 的c 1 3 v d ( 只有一个w d ) 分别与o s w r k y 7 6 的2 个w d 在结构上非常相近，可能是o s w r k y 7 6 在结构域重捧过程中w d 发生 8 中国农业大学硕卜学位论文第一章w r k y 转录冈了：的介绍 了分裂( f s i o n ) ，其中一个w d 被丢失，分别产生了o s w r k y 8 3 、8 6 9 5 。还有一个不容忽视的 进化细节是，重复基因w d 外的序列因发生碱基突变、插入或缺失，是这些基因产生分歧的原因。 如o s w r k y 2 9 和o s w r k y 4 3 的w d 几乎一样，但w d 的侧翼序列差异很大( w ue la 2 0 0 5 ) 。非常 有意思的是，基因融合( g e n ef u s i o n ) 也可能是基因进化和基因获得新功能的一种方式。在拟南 芥中，w r k y 5 2 的n 、c 端分别拥有一个t i r - n b s - l r r 基元和w d ，编码该蛋白的基因进化出一 个新的抗病基因( r e s i s t a n tg o n e ，r ) ，目前该基因作为一个隐性的足基因( r r s i - r ) 被分离，赋 予对r a l a t o n i as o l a n a c e a r w n 病原菌的抗性( d e s l a n d e se l 以，2 0 0 2 ) 。水稻o s w r k y 5 和- 6 8 也有 n b s - l r r 基元( w ue la ，2 0 0 5 ) 水稻和拟南芥w r k y 蛋白进化树分析与w d 类似( w ue la ，2 0 0 5 ) 两者的第1 、i i 和第1 l i a 的部 分成员分别紧凑地聚类在一起；而i l l b 却没聚类在一起，提示这些基因的大部分是在单子叶和双 子叶植物分歧时或晚些时候发生的重复基因。另外，水稻中l l l b 成员数量的扩张，从侧面说明了 w r k y 第1 i l 组的进化比第1 组和i l 组更活跃。各组、亚组或亚亚组间的一些过渡类型基因也为w r u f 基因的进化提供了有价值的线索。综合上述发现以及x i e 等( 2 0 0 5 ) 、z h a n g f l w a n g ( 2 0 0 5 ) 的资料。 翮贼因的进化路线逐渐清晰起来：第1 组作为晟原始的w r k y 类型，通过w d 的丢失或分裂， 过渡到第1 i 组；第1 i 组可能通过锌指纹中h i s - - - 屺y s 残基变换产生第l i i 组，其中的l i l a ( x i e 等，2 0 0 5 中的l b ) 可能是由该亚组w e ) 的重复产生的至于最原始的w r k y 是否为一个w d 的蛋白、然后由 基因重复产生具2 个w d 的w r k y ，由于在粘菌、鞭毛虫和农藻中各只发现一个朋噬y e s t ，还不 能下结论。不过，在同一个基因中同时爆发2 个相同类型的w d 的编码序列，其几率远远小于一个 w d 的情况。 1 2 5w r k y 蛋白的功能 彤r 置1 ，基因的表达模式 职k y 基因的表达受生物或非生物胁迫诱导真菌、细菌、病毒侵染、激发子、植物防卫反 应的信号分子一s a 及其类似物、h 2 0 2 处理导致一些w r k ，基因的表达上升( r u s h t o ne la ，1 9 9 6 ； e u l g e me l 以，1 9 9 9